Mintaelőkészítési folyamat tervezése mikrofluidikai eszközön végzett diagnosztikai vizsgálatokhoz

Mintaelőkészítési folyamat tervezése mikrofluidikai eszközön végzett diagnosztikai vizsgálatokhoz

Gyurik Lívia Réka Témavezető: Dr. Iván Kristóf Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai és Bionikai Kar Info-bionika mérnöki MSc Budapest, 2016

Alulírott Gyurik Lívia Réka, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai és Bionikai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a diplomatervet meg nem engedett segítség nélkül, saját magam készítettem, és a diplomatervben csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Ezt a diplomatervet más szakon még nem nyújtottam be.

_______________________ a hallgató aláírása

2

Tartalomjegyzék Tartalmi összefoglaló.................................................................................................................. 4 Abstract ...................................................................................................................................... 6 1. Bevezetés ................................................................................................................................ 8 2. Előzmények ............................................................................................................................ 9 2.1. A folytonos mikrofluidika lehetőségei és korlátai ....................................................... 9 2.2. Mikrofluidikával megvalósított diagnosztikai eszközök ........................................... 10 2.3. Nukleinsav-vizsgálatok ...............................................................................................11 2.4. Nukleinsav-vizsgálatok mikrofluidikai chipeken ...................................................... 16 2.5. A Listeria monocytogenes baktérium vizsgálatának módszerei ................................ 18 2.6. Élelmiszervizsgálatokhoz szükséges mintaelőkészítési feladatok mikrofluidikai megvalósíthatóságának vizsgálata .................................................................................... 20 3. Tervezés és kivitelezés.......................................................................................................... 27 3. 1. Anyagok és eszközök ................................................................................................ 27 3. 2. Az eszközgyártás lépései .......................................................................................... 31 4. Eredmények .......................................................................................................................... 35 5. Értékelés ............................................................................................................................... 40 6. Összefoglalás ........................................................................................................................ 42 7. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................. 44 Irodalomjegyzék ....................................................................................................................... 45

3

Tartalmi összefoglaló Dolgozatomban a diagnosztikai feladatokat ellátó olcsó, hordozható, szakértelmet nem igénylő eszközök megvalósításához teszek lépéseket. Egy diagnosztikai eszköz akkor használható egyszerűen, ha a mintavétel után automatikusan működik, míg egyértelmű és könnyen értelmezhető eredményt nem ad. Munkámban meghatározott reakciókhoz való mintaelőkészítéssel foglalkozom. Az élelmiszerminta Listeria monocytogenes baktériummal való fertőzöttségének megállapítása egy releváns és népegészségügyi szempontból is fontos feladat. A fertőzöttség nukleinsav-vizsgálattal határozható meg, a vizsgálat markeréül a patogén DNS-ének egy jellemző nukleotidsorrendjét használjuk. A nukleinsav-vizsgálathoz amplifikáló eljárásokat kell alkalmazni, melyek közül két jól ismerthez, a polimeráz láncreakcióhoz (PCR-hez) és a hurkos izoterm sokszorozási eljáráshoz (LAMP-hoz) illeszkedő mintaelőkészítési lépések megvalósítását terveztem meg. A diagnosztikai feladatokhoz elengedhetetlen az analitikum ismerete, ezért a dolgozatban foglalkozom azzal is, hogy hogyan kerül az élelmiszerminta a bemenetre olyan állapotban, hogy a folyamaton végig tudjon menni. A natív anyagok teljes mintaelőkészítése chipen munkámban még nem megoldott. A homogenizálást és az elődúsítást követő szelektív táptalajon tenyésztés elvégzése makroméretben, mikrobiológiai laboratórium eszközeit, gépeit felhasználva olyan sejteket termel, amiknek génállományát vizsgálva kideríthető a fertőzöttségvizsgálat negatív vagy pozitív kimenetele. A Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudományi Karának Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszékével együttműködve a mikrobiológiai lépéssor makroméretben történő elvégzése is munkám része lehetett. Az előfeldolgozásból nyert sejtek felépítése fontos és érintett témakör a dolgozatomban, hiszen mintaelőkészítő eszközeim bemenetét azok desztillált vizes szuszpenziója adja. Az élelmiszerbiztonsági célok mellett más DNS-vizsgálatot igénylő tesztek alapját is képezhetik a munkámban leírt eredmények. A tervezett eszközöm a hordozhatóság és az eszközigény minimalizálásának jegyében vákuumpumpás vezérléssel működik. A dolgozat bevezetőjében bemutatom a mikrofluidikát mint eszközt a felmerült problémák, megvalósítandó feladatok megoldásához, majd leírom a technikában rejlő lehetőségeket és korlátokat. Megmutatom néhány komplex diagnosztikai feladat megoldását is mikrofluidikai eszközökkel különös tekintettel a nukleinsav-vizsgálatokra. Definiálom a vizsgálathoz szükséges mintaelőkészítési lépéseket a sejtfeltárás és DNS-extrakció megvalósítására. Ezek folytonos mikrofluidikai rendszeren való implementálásának lehetséges módjait is leírom és értékelem a szakirodalom alapján. A saját eszköz tervezéséhez a lehetőségeket figyelembe véve döntöttem egy kémiai sejtfeltáró módszer és egy szűréses DNS-tisztítás mellett. Az anyagokat és eszközöket kiválasztva

4

megterveztem és létrehoztam PDMS-ből gyors prototipizálási eljárással (lézervágó gép segítségével) a célfeladatot ellátó mikrofluidikai chip prototípusait. Az eszközök 40 perces vákuumos előkészítést igényelnek, a mintaelőkészítési folyamat pedig körülbelül 15 perc alatt megy végbe. Emberi beavatkozásra csak a minta és a reagens bemenetre illesztéséhez van szükség, illetve a folyamat végeztével a kimenet kinyeréséhez. Az elkészült chipek használatba vétele és a kinyert kimenet mérései után megállapítottam, hogy az eszköz működéséhez hatékonyabb sejtfeltáró puffert kellene alkalmazni. A dolgozatot néhány további technikai javaslattal zárom, melyek az eszközfejlesztés következő lépéseihez adhatnak ötleteket.

5

Abstract In this thesis steps toward cheep, portable devices which not require professional knowledge from their users for diagnostic purpose has taken. A diagnostic device is called user-friendly when it runs automatically after the sample intake, and gives easily understandable and concrete result. In this work I deal with sample pretreatment for given reactions. Determination of food sample infection with Listeria monocytogenes is a relevant and important healthcare problem. A nucleic acid assay is needed for the determination. We use a characteristic nucleic acid sequence of the DNA of the foodborne pathogen as a marker for the assay. An amplification process is also needed. Plans of sample preparation steps fitted to two frequently used methods – polymerase chain reaction (PCR) and loop-mediated isothermal amplification method (LAMP) – has done. Knowing the sample is a necessity, so the thesis tells about the way of the raw sample to be able to go through the preparation process. The total on-chip pretreatment of the native samples has not solved in this thesis yet. Digestion, homogenization and enrichment with the use of devices and tools in macrosized microbiological laboratory results cells which genome can be used to detect the infection of the sample positive or negative. A part of my work was able to be sorted out together with the Corvinus University of Budapest, Faculty of Food Science, Department of Microbiology and Biotechnology, where the microbiological steps were done. The structure of the cells gained from the pretreatment steps is also an important topic in my thesis, while their suspension with distillated water gives the input of my sample preparation devices. The results written in this thesis could be used not only for food safety purposes but also in other application fields’ tests based on DNA-examination. The planned device is degas driven to fulfill portability and minimize the needed equipment. In the preface I introduce microfluidics as a tool for solution of the technical problems and the tasks to be implemented. The possibilities and limitations of the technique have described. The thesis shows some microfluidic solution of complex diagnostic tasks based on study of earlier researches, especially nucleic acid tests. The steps of sample preparation for cell lysis and DNA extraction are defined. Their possible methods of microfluidic implementation is expounded and evaluated with the help of the literature. For implementation of my own chip a chemical lysis method and a filtration DNA extraction technique has chosen. After selection of the tools and materials I have designed and produced the prototypes of the sample preparation chips from PDMS fabricated with a laser cutter. The devices need 40 minutes vacuum treatment, and the sample preparation process needs app. 15 minutes. Human interaction is needed only to place the sample and the reagent into the inlets, and to gain the product when the process is finished. The ready chips were tried out and from

6

the measurements of the outlet it has been identified that a more effective lysis buffer should be used for the proper operation of the sample preparation device. The thesis is finished with some further technical advices which could give ideas for the next steps of the device development.

7

1. Bevezetés A XXI. század első évtizedeiben a kutatás és fejlesztés egyik sajátosan új területe az információs technológia és az élettudományok összekapcsolódása mentén jött létre. Ennek eredményeképpen fokozatosan új orvostechnológiai berendezések, eszközök kerülnek használatba, ahogyan a környezetvédelem, élelmiszerbiztonság területén is rohamos a fejlődés. Az egyik ilyen új irányt a laborvizsgálatok miniatürizálása jelenti. A hagyományosan egy egész laboratóriumnyi helyet elfoglaló eszközök, melyek egy diagnosztikai feladat lépéssorát végzik, egyetlen kisméretű chipbe való integrálásához milliméter alatti tartományban kell dolgoznunk. Ennek technikai kihívásaival érdemes felvenni a küzdelmet, mert a hordozhatóság, a robosztusság és a stabil megismételhetőség olyan előnyök, amelyek mindenképp és egyre inkább kívánatosak a piac és a kutatás szempontjai alapján is. Egy gyorsteszt legfontosabbnak tűnő része a detektálást végző részegység, de az integráció megvalósulásához ugyanilyen fontosak a reakciótér elemeinek megtervezése és a minta előkészítése is. Ez utóbbi magában foglalja a natív anyagok és a reakcióhoz szükséges egyéb reagensek megfelelő elkeverését és olyan állapotba hozását, amiben a reakció végbe tud menni. A dolgozat témája a diagnosztikai feladatokat ellátó biochipek mintaelőkészítési folyamatának megvalósíthatósági vizsgálata különös tekintettel a DNS-alapú tesztekre, illetve speciális esetekben, konkrét feladatokra a folyamat megvalósítása a Kar laboratóriumában rendelkezésre álló eszközökkel. Munkámat azzal kezdtem, hogy a rendelkezésre álló szakirodalmat – benne a legfrissebb eredményekkel – feldolgoztam, áttanulmányoztam a témában megismerhető kutatásokat, kísérleteket, fejlesztéseket. Ennek nyomán a dolgozatban betekintést adok a mikrofluidikával megvalósított diagnosztikai eszközök világába. Bemutatok néhány nukleinsav-vizsgáló eljárást, ami után megvizsgálom, melyiket hogyan oldották meg korábbi kutatócsoportok. Mivel az élelmiszervizsgálat az egyik célterülete a gyorsdiagnosztikának, ezért nagyobb hangsúlyt fektetek a Listeria monocytogenes nevű ételmérgező patogénre. A mérnöki munka megvalósításhoz előbb a sejtfeltárás és a DNS-tisztítás lépéseit, megvalósítási lehetőségeit tekintem át. Az analitikum megismerése elengedhetetlen, ezért röviden bemutatom a baktériumok sejtfalának szerkezetét is, külön hangsúlyt fektetve azokra a módszerekre, amik annak felbontását eredményezik. Ezt követően a saját eszköz elkészítéséhez szükséges anyagokat, megmunkáló eszközeit és megmunkálási módjaikat ismertetem, majd képet adok a megtervezett és a kiválasztott anyagokból és eszközökkel legyártott geometriákról. A tervek megvalósításához a rétegtechnológiás módszert választottam. A chipek elkészülte után tesztelem azokat, mérve a kimeneti és bemeneti paramétereiket. A dolgozatot az eredmények értékelésével és a továbblépési lehetőségek felvetésével zárom.

8

2. Előzmények A különféle (orvosi, mérnöki, matematikai és természettudományos) diszciplínák összefonódása révén létrejött létrehozott tudományterület, a mikrofludika mikrométeres skálán működő csatornarendszereket alkalmaz. Ezeken a csatornarendszereken alapuló ún. „laboratórium egy chipen” (Lab-On-a-Chip, LOC) eszközök kutatási célú (gyógyszerhatóanyag burkolás, sejtes elem szétválasztás stb. [1]), vagy akár ipari célú (terrorelhárítási, környezetvédelmi stb. [2]) feladatokat láthatnak el. Azokat a mikrofluidikai megoldásokat, melyeknél a fluidum – gáz vagy folyadék – megszakítás nélkül, egységes oszlopban áramlik a csatornákban összefoglaló névvel folytonos mikrofluidikának („continous microfluidics”, CMF) nevezzük. A rendszer meghajtásához legtöbbször aktív elem szükséges, egy külső eszköz, amelynek működtetése független a mikrofluidikai chiptől. A leggyakrabban használt áramlást biztosító eszközök a piezoelektromos pumpa és a fecskendőpumpa valamint a pneumatikus rendszerek, de vannak úgynevezett passzív pumpák is, amelyek valamilyen fizikai törtvényszerűség alapján külső aktív pumpák nélkül valósítják meg az áramlást [3][4]. A mikrofluidika az 1980-as évek elején alakult ki külön tudományágként. A köznapi életben legtöbbször a tintasugaras nyomtatók használata során találkozhatunk vele, mely szép példája annak, hogy a mikroliteres méretekkel operáló mikrofluidikai rendszerek milyen okos megoldásokat tudnak kínálni hétköznapi feladatokra is. A múlt század végén megfigyelhető trendnek, és az akkor elérhetővé vált technikának köszönhetően nagy erővel tört elő a mechanikai eszközök miniatürizálása („Micro-ElectroMechanical Systems”, MEMS technológia). Ez lehetővé tette többek közt mikroérzékelők gyártását és egy rendszerbe integrálását [5]. Innen már csak egy lépés a számtalan megnyíló lehetőség alkalmazása. Azonban a lehetőségeket csak az tudja alkalmazni, akinek az ismerete sokfelé ágazik, és figyelme rá tud terelődni egy valós igényre. Egy infobionikus mérnök rendelkezik azzal a sokrétű tudással, ami lehetővé teszi ezt a komplex munkát. Szerteágazó ismereteinek és képességeinek mederbe terelésére adott lehet egy szempont, egy piaci igény, például molekuláris biológiai műveletek elvégzésére alkalmas eszköz tervezésének gondolata. Ennek megvalósításához ígéretes eszköznek bizonyul a mikrofluidika.

2.1. A folytonos mikrofluidika lehetőségei és korlátai A milliméter alatti átmérőjű csatornákban az áramlás legtöbbször lamináris, aminek előnye, hogy kvázi determinisztikus – kvantitatívan előre jó közelítéssel meg tudjuk mondani az áramlás viselkedését [6]. Turbulencia viszont nem alakul ki benne, ami segítené a keveredést. Az áramlásokat egy dimenzió nélküli, úgynevezett Reynolds számmal is jellemezhetjük, mely

9

a tehetetlenségi (térfogatra ható) és a viszkózus (felületi) erők arányáról nyújt információt:

ahol ρ a fluidum sűrűsége, u az átlagos sebessége, L a csatorna karakterisztikus átmérője, μ pedig a fluidum dinamikai viszkozitása. Általában ha a Reynolds szám 2000 alatt van, akkor beszélünk lamináris áramlásról [6]. A mikrofluidikai „laboratórium egy chipen” eszközök előnye, hogy a vizsgálandó és a vizsgálathoz szükséges egyéb anyagokból is elegendő néhány mikroliter, így a költségek csökkenthetők. Az automatikus működés révén minimalizálhatók az emberi munkából fakadó hibák, egyúttal az alkalmazotti költségek is. A gazdasági tényezőkön túl környezetvédelmi szempontból is előnyös lehet, ha adott esetben veszélyes kémiai anyagokból csak keveset használunk fel, kevesebb hulladék termelődik [7].

2.2. Mikrofluidikával megvalósított diagnosztikai eszközök Az orvosbiológiai kutatások egyik fő szegmense a labordiagnosztika. Minden további orvosi (vagy élelmiszerbiztonsági, egyéb biztonságtechnikai stb.) beavatkozást meg kell, hogy előzzön a diagnózis felállítása, ezért ez kiemelt fontosságú. A következőkben érintőlegesen bemutatok néhány ilyen célra készült, mikrofluidikát részben vagy egészében alkalmazó eszközt. Optometriás módszerrel viszonylag egyszerűen detektálhatók a színreakciót eredményező analitikai

tesztek,

melyek

a

diagnosztikai

rendszereknél

a

teszt

kimenetelének

megállapításánál kulcsszerepet kapnak. Ilyen a legtöbb vércukorszint-mérő is, de például a mintában fellelhető foszfor jelenlétét is megállapíthatjuk egy LED–fotodióda párossal. Foszfor jelenlétében a kémiai reakció lejátszódása során sárga színű termék keletkezik, ami adott UV fénnyel való gerjesztésre adott hullámhosszúságú fényt emittál. Ezt tudja érzékelni és elektromos jellé átalakítani a fotodióda. [8] Egy passzív pumpás önálló integrált mikrofluidikai véranalizáló rendszer különféle, öt különböző tesztet képes elvégezni mindössze tíz perc alatt. Ezzel szinte egy komplett vérképet kaphatunk egy csepp vérből. Dimov és munkatársai cikkükben egy szteptavidin-biotin teszt példáján mutatták be az eszköz működését [4]. A chipnek öt bemenete van, ahová teljes vért cseppentve indíthatjuk el a tesztet. Első lépésként ülepítéssel szétválik a vérplazma és a sejtes elemek, ezután a reakció helyszínére érkezik az előkészített minta, ahol egy levehető üveglapra vitt reagensekkel lép reakcióba. A fehérjekötődések kialakulása után a minta a szívókamrákba

jut,

aminek

végére

érve

10

megszűnik

a

mozgatást

eredményező

nyomáskülönbség. Az üveglapon a fehérjekötődések helyét fluoreszcens fény jelzi. Nemrég díjat is nyert (Medical Design Excellence Award, 2009) az a rétegtechnológiával készült mikrofluidikai chip, ami a warfarinra 1 való érzékenységet tudta megállapítani a CYP450 2C9 és a VKORC1 gének vizsgálatával. [9] Az Osmetech (a 2010-es névváltoztatás óta GenMark) cég eSensor XT8™ nevű eszköze a vérminta DNS-ének azon szakaszait sokszorozza, ahol a keresett gén (vagy mutációja) található. A cisztás fibrózisra – ami egy örökletes tüdőbetegség – is létezik az eszköznek egy tesztpanele, ami a betegségre vonatkozó genotípust határozza meg 23 gén vizsgálatával [10]. Egy másik panelt 14 féle légúti vírus – köztük több influenzavírus – detektálására fejlesztettek ki [11]. Trombofíliára való hajlamot is képesek megállapítani négy genetikai marker vizsgálatával. A diagnosztikai reakciók kiértékelését elektrokémiai módszerekkel végzi el. [12]

2.3. Nukleinsav-vizsgálatok A nukleinsav-vizsgálatok a labordiagnosztikának azon nagy területébe tartoznak, amik mikrobiológiai mintákról, sejtekről adnak információt, annak genetikai állományának felhasználásával. A nukleinsavak nukleotidokból felépülő makromolekulák. Fontos sejtalkotók, melyek nagy része a sejtmagban található – innen kapták a nevüket. Legfontosabb nukleinsavaink a dezoxiribonukleinsav (DNS) és a ribonukleinsav (RNS). A nukleinsavvizsgálatokhoz a kérdéses szekvenciát – egy sejt genomjának egy szakaszát – sokszorozni kell. Erre a feladatra a polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction, PCR) egy bevett módszer [13]. Míg ez adott hőmérsékleti ciklusok egymásutánjában működik, addig egy másik, ugyancsak amplifikálásra szolgáló módszer fő előnye az izoterm működés. Laborunkban egy olyan DNS vizsgálatra alkalmas chip készült, ami a kérdéses szekvencia felszaporítását a hurkos izoterm – azaz egyetlen hőmérsékleten végbemenő – sokszorosítási eljárás („loopmediated isothermal amplification”, LAMP) módszerét használva végzi el [14]. Minden nukleinsav teszt három jól elkülöníthető részből tevődik össze: a mintaelőkészítésből, a sokszorosítás fázisából és a detektálásból. A sokszorosítás módja az, ami meghatározza a két szélső feladat – a mintaelőkészítés és a detekció – részleteit, módszereit, igényeit. Mielőtt bemutatom a legfontosabb nukleinsav-sokszorozó eljárásokat, a teljesebb kép érdekében néhány mondatban összefoglalom a detekció feladatának lehetséges megoldásait. Típusait tekintve két ága van a detektálásnak. Az egyik az, amikor az analízis a sokszorosító reakció után történik, a másik pedig amikor folyamat közben. Értelem szerűen egyszerűbb megvalósítani a reakció lefutása utáni kiértékelést, míg a real-time megoldás nagyobb 1

A warfarin a véralvadásgátló gyógyszerek egyik hatóanyaga.

11

technikai kihívást jelent. A valós idejű fluoreszcens detektálás megvalósulhat olyan festékkel, ami akkor lép működésbe, mikor a bekötődés megtörténik, olyan oligonukleotidokkal, amik a reakció hatására hasadnak, vagy olyan primerekkel, amik megváltoztatják konformációjukat, amikor a célszekvenciát amplifikálják. Ezek a módszerek a PCR eljáráshoz illeszkednek, de az izoterm sokszorosítási eljárásoknak is megvan a maguk real-time detektáló módszerei. A 2.3.2. pontban bemutatandó LAMP reakcióban úgy működik a valós idejű detektálás, hogy a DNS szintézis melléktermékei, a foszfát ionok kicsapódnak a fém kationok jelenlétében, ami az egész minta opálosodásához vezet. LAMP elvén működő eszközökben biolumineszcenciás kiolvasást is alkalmaznak, aminek lényege, hogy pirofoszfát termelődése összekapcsolódik a luciferáz enzim generálta fénykibocsátással [13]. Az opálosodás jelenségét a reakció lejátszódása után is vizsgálhatjuk, sőt egy bevált módszer szerint kalcein festéket használva a fluoreszcenciával kiegészítve detektálhatjuk a termékben létrejött eredményt. [13] Hidroxil naftolt keverve a termékünkhöz színreakciós detektálást is elérhetünk – lilából égszínkékre vált a minta színe [15]. 2.3.1. A polimeráz láncreakció A polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction, PCR) egy hőstabil DNS polimeráz, a Taq polimeráz enzim alkalmazásával képes adott DNS szekvenciákat több cikluson át replikálni, így a keresett genomszakasz exponenciális mértékben sokszorozódik. A PCR azért hasznos, mert a módszerrel olyan nagy mennyiségű DNS-t lehet felszaporítani akár néhány sejtből kiindulva, ami további molekuláris vizsgálatokat tesz lehetővé. A PCR reakció három lépés 20-40 cikluson keresztüli ismétlését jelenti, amelyhez kereskedelmi forgalomban kapható, programozható PCR készülékek állnak rendelkezésünkre. Az egyes lépések a következők: Az amplifikálandó (cél) DNS denaturálása: A denaturáció a reakcióelegy 94-95 °C-ra való felmelegítése során játszódik le. A denaturálás a reakció elején néhány percig tart, a ciklusok között azonban 1 perc alatti időtartam is elegendő erre, mivel ekkor már csak a rövid PCR termékeket kell denaturálni. Az oligonukleotid primerek (indító szekvenciák) kötődése a célgénhez: Ebben a lépésben a 15-35 nukleotid hosszúságú egyszálú DNS primerek hibridizálnak a felszaporítandó, denaturált cél DNS két szálának végein lévő homológ szekvenciákkal. Ebből következően legalább a primer kötődés helyének nukleotid sorrendjét ismerni kell, a közrefogott szakasznál azonban erre nincs szükség. A primerek bekötődéséhez a hőmérsékletet le kell csökkenteni arra az értékre, ahol a bázispárosodás már teljes mértékben végbemehet. Ez a hőmérséklet függ a primerek guanin (G) és citozin (C) tartalmától és hosszától. Általános szabályként elmondható, hogy a primerek olvadáspontjától (Tm értékétől) 5 °C-kal alacsonyabb

12

hőmérsékletet (kb. 45-55 °C-ot) ajánlott alkalmazni. A primer kötés hőmérsékletét úgy kell megválasztani, hogy azok csak a teljesen homológ helyekre kötődjenek be, és a kötődés minden bázispárnál megtörténjen. Ha az optimálisnál alacsonyabb a primer kötés hőmérséklete, akkor nem homológ helyekre is bekötnek a primerek, ezáltal nem kívánt PCR termékek is létrejönnek, amelyek a további ciklusokban cél DNS-ként funkcionálnak. Magasabb hőmérséklet esetén a PCR reakció nem megy végbe. DNS polimerizáció (elongáció): A primerektől kiindulva a közrefogott DNS szakasz kiegészítő szálainak enzimes szintézise történik ebben a lépésben. A polimerizáció hőmérsékletét a hőstabil DNS polimeráz (a már említett Taq polimeráz) működésének 72 °Cos optimumához kell igazítani. A reakcióelegyhez adott dezoxiribonukleotid-trifoszfátok (dNTP-k: dATP, dTTP, dGTP, dCTP) beépítésével mindkét DNS szál mellett új, kiegészítő DNS szálak jönnek létre, amelyek újabb templát molekulaként szolgálnak a további ciklusokban. Ennek a három lépésből álló ciklusnak 20-40-szeres ismétlése során a cél DNS szakasz mennyisége közel exponenciálisan nő, így a reakció végére a PCR termékek az eredeti cél DNS-nek mintegy milliószorosát teszik ki. A PCR készülék működése közben a denaturáció, a primer kötés és a DNS polimerizáció hőmérséklete változik ciklikusan, a készülék programozása során ezeket a hőmérsékleteket és időtartamukat kell beállítani (1. ábra).

1. ábra. A PCR hőmérsékleti ciklusa és az egyes lépéseken végbemenő reakciók. A ciklus lépései: 1.: denaturáció 94 °C-on, 2.: primer bekötés 45-55 °C-on, 3.: elongáció 72 °C-on [16]

13

A keletkezett PCR terméket legegyszerűbben agaróz gélelektroforézissel választhatjuk el, majd etidium-bromiddal való festés után UV fényben tehetjük láthatóvá. [16] Ha a létra várt hosszúságot jelző fokán erősödik a jelzés, az azt jeleni, hogy a mintánkban jelen volt a keresett DNS szakasz. 2.3.2. A hurkos izoterm sokszorosítási eljárás A hurkos izoterm sokszorosítási (LAMP, loop-mediated isothermal amplification) eljárás során a kívánt DNS-szakasz kétféle polimerizációs reakcióban, azonos hőmérsékleten valósul meg. Az egyik a templát önpolimerizációja a hurokstruktúra száránál, a másik az új primerek kötése és polimerizációja a hurok régióhoz. A reakciókhoz ún. belső és külső primer párok szükségesek. A belső primereknek előrefutó párja az egyszálú cél DNS 5’ végére tapad, a hátrafutó pár a 3’ végére. A külső primerek által jön létre a súlyzó alakú, egyszálú DNS, amint a hurkok kivételével a szár komplementer bázispárjai szerint polimerizálnak. Ez a kiinduló alak indítja el az amplifikáló reakciók ciklusát. A belső primerek újra kötődnek a felismert helyre, és a reakció kezdődik elölről (2. ábra). [17] A folyamatot megelőző lépésekhez tartozik a négy primer mintához adása, a DNS szál denaturálása magas hőmérsékleten, majd a minta gyors lehűtése jégen. Ezt követően adják hozzá a DNS polimeráz enzimet, amivel aztán egy órán belül, 65 ˚C-on 109 darabra sokszorozódik a keresett DNS-szakasz [18].

14

2. ábra. A LAMP reakció kétféle polimerizációs folyamata.[18] A hurok reakció során az egyik a templát önpolimerizációja megy végbe, mellyel kialakul a jellegzetes hurok struktúra. A szár reakcióban az új primerek polimerizációjának következtében hosszabbodik a kettős polimerszár struktúra. A folyamat végén a sokszorozódott DNS-szakaszok sűrűn egymás mellett vannak jelen a termékben, méretük meghaladja a látható fény hullámhosszának méretét, ezért a fény megtörik rajta, a minta szemmel láthatóan opálossá válik, mutatva a vizsgálat pozitív eredményét. Ezt festési módszerekkel is szokás erősíteni.

2.3.3. Egyéb nukleinsav-sokszorozó eljárások A szakirodalomban RT-PCR-ként emlegetett visszafele átíró (Reverse Transcriptase, RT) polimeráz láncreakció eljárás az RNS kifejeződés nyomon követésére specializálódott. Komplementer DNS (cDNS) átiratokat alkalmaz, melyeket az RNS-ből nyernek. Az expresszálódott gének létrejövéséért felelős RNS-eket visszaírják a cDNS-ükbe a reverz-

15

transzkriptáz enzim segítségével, ezután pedig sokszorozzák a cDNS-eket a PCR megszokott módszerével. A számszerű (kvantitatív) polimeráz láncreakciót gyakran összekeveredik a visszafele átíró polimeráz láncreakcióval, hiszen a qPCR (quantitative Polimerase Chain Reaction) rövidítés mellett még a real-time (RT) PCR is használatos, azonban a két eljárás lényegét tekintve más. A számszerű PCR a DNS-szakasz amplifikálódásának mértékét tudja megmondani azáltal, hogy a sokszorozódás közben fluoreszcens fénykibocsátás mutatja az újonnan létrejött nukleinsav-sorozatot. [19] A visszafele átíró és a számszerű PCR ötvözeteként számszerű RNS meghatározásra is lehetőség adódik. Ezt a módszert RT-qPCR-nek rövidítik a leggyakrabban. A Northern-blot RNS-szám meghatározó eljárásnál is érzékenyebb a PCR alapú, ezért gyakran használják betegségek meghatározásához is, hiszen egyetlen vagy több egyidejűleg kifejeződött gén vizsgálható vele. [20] A helikáz-függő sokszorosítás (Helicase-dependent amplification, HDA) során a helikáz enzim enzimatikusan bontja ketté a DNS kettős spirálját, utána pedig a PCR ciklusainak megfelelő lépések mennek végbe, azzal a különbséggel, hogy ez az eljárás izoterm, tehát nem kell a változó hőmérsékletű lépések ciklusát követni. [21] Egyszálú kötőfehérjék stabilizálják a kettévált szálakat, így ehhez a lépéshez sem kell hőmérsékletet váltani. Hasonló elven működik a rekombináz-polimeráz sokszorosítás (Recombinase polymerase amplification, RPA) is. [22] A valós idejű hurkos izoterm sokszorosítási eljárás esetén is sokszor összezavaró az RT-LAMP rövidítés, ami szintén jelentheti a visszafele átíró (tehát az RNS amplifikálására szolgáló) módszert és jelezheti a valós idejű detektálást is. Az első esetében a RT-PCR-hez hasonlóan az eljárás reverz transzkriptázt használ az RNS cDNS-sé „fordításához”, amit aztán a megszokott DNS polimeráz enzimmel sokszorosítani tudunk. Az RT-LAMP-ot gyakran használják vírusok kimutatásához. Kínai kutatók például ezzel a módszerrel tudták gyorsan és hatékonyan kimutatni az Akabane vírust [23].

2.4. Nukleinsav-vizsgálatok mikrofluidikai chipeken A mikrofluidika tudományágának kutatóinak az érdeklődését a nukleinsav-vizsgálatok automatizálása is felkeltette. Számos cikk foglalkozik azzal, hogy hogyan próbálnak megküzdeni az általunk is megismert kihívásokkal: a kis mérettel, mikroliteres mennyiségekkel, a biológia minták problémás kezelésével, stb. Egy koreai kutatócsoport nukleinsav-vizsgálat lekicsinyítése céljából lab-on-a-disc (laboratórium egy lemezen) eszközt tervezett [24]. Ami az eszköz technikáját illeti, a mi hagyományos „laboratórium egy chipen”

16

készülékeinkkel ellentétben – ahol mindenképp kell aktív vagy passzív pumpát alkalmaznunk – a folyadékmozgatást a centrifugális erő kihasználásával éri el. A célfeladatát tekintve élelmiszerfertőző baktériumok teljes nukleinsav-vizsgálatát végzi az eszköz, minden fontos lépést – a mintaelőkészítést, a reakciót és a detekciót – helyben, a lemezen elvégezve. Az integráltság mellett az eszköz másik vonzó eredménye, hogy 30 perces működési idővel dolgozik, tehát a minta bemenetre illesztésétől a végeredmény kiolvasásáig ennyi időre van szükség. Rane és munkatársai cseppenként áramoltatott rendszert hoztak létre, amelyen a LAMP reakciót futtatták nukleinsav-vizsgálat céljából. Az eszköz PDMS-ből készült, öntőformaként mikromegmunkált szilíciumot használtak. [25] Szintén LAMP reakcióval végzi a nukleinsavvizsgálatot az a mikrochip, amelyik vérplazmából cellulóz-alapú nukleinsav-kötő membránt alkalmazva szilárdfázisú DNS-t nyer ki, majd az izoterm sokszorozási eljárást hajtja végre. Ennek eredményét valós időben mutatja is fluoreszcens megoldással. [26] Az eszköz plexiüvegből (poli(metil-metakrilát)-ból, röviden PMMA-ból) készült CO2 lézervágóval. Különlegessége, hogy a mintát az egymást követő reakcióterekbe egy csúsztatható elemmel juttatja el. A bemenetre a már lizált Salmonella sejtszuszpenzió kerül, ami első lépésként a nukleinsav-kötő membránnal érintkezik. A csúszkával továbbmozgatva a LAMP reakciótérbe, az ott várakozó reagensek megkezdik munkájukat és a DNS-sokszorozás végbemegy. Az eredmény megjelenítéséhez fluoreszcens festéket használtak, a mutatott mintázatot pedig MATLAB-os képfeldolgozási eljárásokkal vizsgálták tovább. Wu és Kado olyan mikrofluidikai eszközt tervezett és valósított meg, ami tejből szűri ki az Escherichia coli baktériumsejteket így a mintaelőkészítést megoldva készen áll a minta a PCR sokszorozáshoz. 0,45 μm-es pórusokkal rendelkező szűrőmembránon folyattak át tejet, majd a szűrőt lízisoldatba merítették. Ezt 10 percen keresztül 95 ˚C-on inkubálták, ezalatt a DNS kiszabadult. [27] A szűrés azért is fontos, mert a tej tartalmaz néhány PCR inhibitort is (pl. proteináz, kalcium ionok) [28][29]. Egy

másik

kutatócsoport

PMMA

alapanyagú

mikrochipet

készített

emberi

vér

mintaelőkészítésére és nukleinsav-sokszorozásra az egyik véralvadási faktor génjének kimutatása céljából PCR-sokszorozó módszerrel. Az eszközben mindösszesen 8-9 μl folyadék mozgott, amiből a vér csak 3 μl volt. [30] Fecskendőpumpával áramoltattak át ezen a diagnosztikai rendszeren 100 μl PCR elegyet (2-2 μl primer, 10 μl reakciópuffer, 2 μl nukleotid-trifoszfát, 1 μl DNS polimeráz és 83 μl víz). A chip egy hőszabályzó panelen feküdt, ami a PCR-hez szükséges hőmérsékleti ciklusokat irányította. Kezdésnek 95 ˚C-ra melegítették öt percen keresztül, majd 40 cikluson át a következők szerint változtak a hőmérsékletek: egy percig 94 ˚C-on (denaturáció), egy percig 60 ˚C-on (primerek bekötése), majd egy percig 72 ˚C-on (elongáció) tartották a chipet. A 40 ciklus lejárta után még 5 percig

17

72 ˚C-on tartották az elegyet. Egyetlen reakciókamrát kialakítva is mutattak már megoldást nukleinsav vizsgálatra mikrofluidikai chipen. Habár a lízisoldatot chipen kívül kevertették a mintával, az etanolos mosás (DNS kicsapás), cellulózszűrőre kikötés, majd kimosás az eszközön történik az izoterm sokszorosítási eljárással egyetemben. Ennek első lépéseként egy parafinréteg megolvad, ami kiszabadítja azt a réteget, ahol az enzimek, a fluoreszcens festék és az amplifikáláshoz szükséges reagensek liofilizált állapotban várakoztak. Egy LED-ből érkező kék színű gerjesztőfény hatására a DNS-termék mennyiségével arányos fluoreszcens jel generálódik, amit a gerjesztőfény zavarásának elkerülése érdekében egy szűrőn keresztül CCD kamerával detektáltak. A cikk szerint azért is praktikus az egész elképzelés, mert a detektálás egy okostelefon kamerájával is megvalósulhat. [31]

2.5. A Listeria monocytogenes baktérium vizsgálatának módszerei A Listeria monocytogenes baktérium élelmiszerekben – többnyire tejben és sajtban, de jégkrémben, nyers húsokban, nyers és füstölt halakban és zöldségekben is – gyakran előforduló, jó sótűrésű és széles hőmérsékleti skálán megélő patogén, mely liszteriózist okoz. Ez a betegség évente körülbelül 1600 embert betegít meg, ebből 500-600 halálos kimenetelű [32]. Béta hemolizint termel, ami tönkreteszi a vörösvértesteket. A kórokozót az 1920-as években írták le először, de részletesebb felfedezése a ’80-as években teljesedett ki [33]. Ami a morfológiáját illeti, a L. monocytogenes baktérium pálcika alakú, körülbelül 0,4-0,5 μm átmérőjű és 1-2 μm hosszú. A Gram-festés alapján a Gram-pozitív baktériumok közé sorolják, ami azt jelenti, hogy sejtfalában vastagabb rétegben van peptidoglikán, ami miatt ellenállóbb az antibiotikumoknak. Mint minden élelmiszervizsgálathoz, a L. monocytogenes kimutatásához is 25 ml vagy 25 g élelmiszermintára van szükség, sőt a napjainkban érvényben lévő rendelet szerint „az elemi minta mennyisége csomagolt élelmiszernél általában egy csomagolási egység, egyéb élelmiszernél általában 100-250 g vagy cm3” [34]. Ezt stomacher készülékben, mely a gyomrot hivatott helyettesíteni, pepszin enzim hozzáadásával homogenizálják és előemésztik – mechanikai ingereknek téve ki –, majd jellemzően Fraser levesben elődúsítják. Ez utóbbi folyamat 48 órán át tart: a beoltás után előbb 24 órán át 30 ˚C-on, majd még 24 óráig 37 ˚C-on kell inkubálni az elegyet. A Fraser levest tápporból készítik desztillált víz hozzáadásával. Az így nyert dúsító közeg a Listeria fajok növekedéséhez szükséges tápanyagok mellett eszkulint is tartalmaz, amit a Listeria β-D-glükozidáz enzim glükózra és eszkuletinre hidrolizál. Az eszkuletin vas-ammónium-citráttal reagálva fekete csapadékot hoz létre, így megváltoztatja az eredetileg sárga leves színét. Az egyéb baktériumok növekedését a leves lítium-klorid tartalma

18

akadályozza meg. Az elődúsított mintát oltókaccsal széleszteni kell egy megfelelő táptalajjal kiöntött petri-csészére, majd a beoltott lemezeket 24 órán keresztül 30 ˚C-os inkubátorba kell helyezni [16]. A szelektív táptalajoknak több fajtája is van, Listeria baktériumok tenyésztéséhez többnyire Aloa, Oxford és Palcam agarokat használnak, melyek lényege, hogy olyan antimikrobás anyagokat tartalmaznak, amik a Listerián kívül más sejtek növekedését meggátolja. A baktérium DNS-ének vizsgálatához a sejteket lizálni kell, majd ki kell vonni a DNS-üket, hogy a sokszorozó eljárások valamelyikét alkalmazni tudjuk a már ekképpen előkészített mintánkra. A mintaelőkészítés egyik lehetséges útja a kereskedelemben kapható sejtfeltáró és DNS tisztító készletek protokolljának követése a készlet anyagainak felhasználásával. A félév során a Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudományi Karának Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszékén dr. Belák Ágnes segítségével végeztünk kísérleteket. Két különböző Listeria törzset (L. monocytogenes és L. innocua) hibernált sejtkultúrákból – melyek -20 ˚C-on, olajjal fedett agaron vannak tárolva – Tryptone Soya Agar (TSA) növesztő közegre oltva 18-24 órán át 37 ˚C-on inkubáltunk. Ennek eredményeként másnapra szemmel is láthatók lettek a táptalajon kinőtt sejttelepek. A sejteket a MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification

Kit

készlet

anyagaival,

annak

protokollja

szerint

kezeltük

a

következőképpen. 1. 2 db Eppendorf csövet, 1 db tartórekeszt és desztillált vizet előkészítettünk, majd 1-1 ml desztillált vizet mértünk az Eppendorf csövekbe. 2. A petri-csészébe öntött agar táptalajon kinőtt sejttenyészetről oltókacsokkal felszedtük a sejteket, majd a megfelelő Eppendorf csövekbe helyeztük azokat. Az oltókacsokat a mérés előtt, kultúránként, majd mérés után is nyílt láng fölött sterilizáltuk (a gázláng alsó egyharmadába tartva izzítottuk 10-15 másodpercig, majd az egész fém részt lassan végig égettük – vigyázva, hogy esetlegesen ne fröccsenjen le a pálcán ragadt sejttenyészet). 3. A desztillált vízbe belemosott sejteket tartalmazó csöveket 5 percig 14000-es fordulaton (rpm, percenkénti fordulat) centrifugáltuk. 4. A felülúszót óvatosan eltávolítottuk úgy, hogy összesen 25 μl maradjon az Eppendorf csőben. 5. A maradékot 10 másodpercen keresztül vortexeltük. 6. 1 μl 50 μg/μl koncentrációjú Proteinase K-t (fehérjebontó enzimet) kevertünk össze 300 μl Tissue and Cell Lysis Solution-nel, majd hozzáadtuk a mintákhoz. 7. 15 percig 65 ˚C-on inkubáltuk az oldatot 5 percenként 10-15 másodpercig vortexelve.

19

8. 2 μl 5 μg/μl koncentrációjú RNAse A-t mértünk mindkét Eppendorf csőbe, majd alapos vortexelés után 37 ˚C-on 30 percig inkubáltuk. 9. 5 percig -20 ˚C-on inkubáltuk a mintákat. 10.150 μl MPC Protein Precipitation Reagent-et adtunk a mintákhoz. 11.10 másodpercig vortexeltük a csöveket. 12.10 percig 14000 fordulattal centrifugáltuk. 13.2 új Eppendorf csövet készítettünk elő, majd a felülúszót óvatosan, 200 μl-es vékony hegyekkel leszívtuk és átmértük az új Eppendorf csövekbe. A régi Eppendorf csövek kidobhatók. 14.500 μl isopropanolt rámértünk az oldatra, majd 40-szer kézzel átforgattuk. 15.4 ˚C-on 10 percig centrifugáltuk. 16.Az isopropanolt nagyon óvatosan – vigyázva a cső alján lévő DNS-re – eltávolítottuk. 17.Kétszer öblítettük 200 μl 70%-os etanollal. 18.2 percig centrifugáltuk 14000-es fordulaton, majd pipettával eltávolítottuk a megmaradt etanolt. 19.35 μl TE Buffer-t (eluáló puffert) rámértünk a kitisztított DNS-ünkre. A sejtfeltárás és a DNS extrakció eredményét spektrofotométerrel ellenőriztük (1. táblázat). A nukleinsavak jellemzően a 260 nm-es fényt nyelik el, míg a fehérjékre a 280 nm-es fényelnyelés jellemző. A DNS tisztaságáról spektrofotométer egyik adata a 260/280 arány, ami tökéletesen tiszta minta esetén 1,8.

1. táblázat. A DNS-tisztítás eredményét a 260/280 oszlop értékei mutatják. A C1 törzs (L. monocytogenes) esetében az arány megközelíti a teljesen tiszta oldatnál várható 1,8-at, a C6 (L. innocua) törzs esetében viszont nem hozta a művelet a várt tisztaságot.

2.6.

Élelmiszervizsgálatokhoz

szükséges

mintaelőkészítési

feladatok

mikrofluidikai megvalósíthatóságának vizsgálata A nukleinsav-vizsgálatok mintaelőkészítésének mikrofluidikai megvalósítása nehéz feladat, hiszen a biológiai minták előfeldolgozása, dúsítása és tenyésztése időigényes, és a szükséges mennyiség is nagyságrendekkel nagyobb, mint amikkel szakterületünkön, technológiánkkal

20

számolhatunk [35]. A cél az, hogy automatikusan működő, zárt rendszerben valósuljon meg a mintaelőkészítés, lehetőleg költségkímélő megoldásokkal. A hordozhatóság és az emberi beavatkozás miatt előforduló pontatlanság minimalizálása a fő motivációnk. Mivel a nyers élelmiszerminta teljes előkészítése mikrofluidikai chipen rendkívül nagy feladat, ezért a műveletek on-chip implementálásának megoldási javaslatait onnantól kerestem, hogy az élelmiszermintát megemészttettük pepszin enzimmel, dúsító oldatba tettük, és szelektív táptalajon kitenyésztettük a baktériumsejteket. Eszközünk bemenetén tehát a kinőtt, élő sejtek vannak (desztillált vizes szuszpenzióban). A mintaelőkészítési lépés paramétereit a célbaktérium tulajdonságaihoz mérten kell beállítani. Megoldandó feladatnak a sejtek feltárását és a DNS tisztítását tűztem ki, ami a nukleinsavsokszorozó diagnosztikai eljárást közvetlenül megelőző lépés. A következőkben bemutatom a lehetséges mikrofluidikai sejtfeltáró módszereket, majd a tisztítást megvalósító eljárásokról adok egy áttekintést. 2.6.1. A sejtfeltárás Az eukarióta sejteket sejtmembrán határolja, melyet transzmembrán fehérjéket is tartalmazó kettős foszfolipid réteg alkot. A foszfolipid molekulák hidrofób végei egymás felé fordulva alkotják a membrán belső rétegét, a hidrofil, poláros végek pedig a membrán azon részei, melyek a sejt extra- illetve az intracelluláris terével érintkezésben vannak. A prokariótáknak, a növényi és gombasejteknek különféle fehérjékből és szénhidrátokból felépülő sejtfaluk van. A baktériumok mind prokarióták, de sejtfaluk összetételében nagy diverzitás mutatkozik. Egyedül a baktériumok sejtfalában van peptidoglikán, ami a sejtek szilárdságát adja, és ami meghatározza az alakjukat. A baktériumok három fő alakcsoportba sorolhatók: pálcika alakúak csoportjába, a gömb alakúakéba és spirálalakúakéba. A baktériumokat Gram-festésük alapján is osztályozhatjuk. A Gram-festés a sejtfal összetételéről árulkodik. A Gram negatív sejtek sejtfalának külsején van még egy, foszfolipidekből és lipopoliszacharidokból álló réteg, míg a Gram-pozitv sejtek sejtfala vastagabb peptidoglikán réteggel rendelkezik. A DNS minden esetben a sejten belül található, ezért a nukleinsav-vizsgálatokhoz szükséges a sejteket lizálni. A sejtfeltárásnak négy alapvető módja lehet: a mechanikai, kémiai, hőátadásos illetve az elektromos módszerekkel történő lízis [7]. 2.6.1.1. Mechanikai módszerek Ez a módszercsalád talán a legegyszerűbb: mechanikai erőt alkalmaznak a sejtekre, aminek következtében a sejtmembrán felnyílik. Egy szűrőn átáramoltatva a mintát, a szűrő rései szűkössége miatt a sejtek annyira összenyomódnak, hogy membránjuk/sejtfaluk felhasad [36]. Az áramlási csatorna falából kiálló éles akadályok is kipukkaszthatják a sejteket, ám ilyen

21

csatornát főleg csak a hagyományos, szilícium alapú mikromegmunkálás során tudnak létrehozni [37]. Bár a módszer egyszerűnek tűnik, nem szabad elfelejtenünk, hogy a mikrofluidikai csatornákban a Reynolds szám alacsony értékéből következően az áramlás lamináris, lassú folyás mellett a mechanikai erők nem tudnak hatékonyan működni, nehéz kiváltani erős, sejthatárolót rongáló mechanikai hatásokat. A legegyszerűbbnek tűnő módszer tehát valójában csak a legkevésbé eszközigényes. Tovább vizsgálva a mechanikai módszereket, a nyomás hatására is felnyílhatnak a sejtek. 25 kPa-on már kezdenek felnyílni a sejthatárolók, 30 kPa-on pedig teljesen végbemegy a lízis [7]. Kemény részecskékkel ütköztetés is eredményezheti a sejtek feltárását. Ilyen, üveggyöngyöket alkalmazó sejtfeltáró lab-on-a-disc chipet terveztek Kim és munkatársai [38]. Egy másik formája a mechanikai sejtlízisnek a szonikálás. Ultrahangos gerjesztésre nyomáshullámok alakulnak ki, amik sejtlízishez vezetnek [39]. A mechanikai módszerek közé sorolandó a fókuszált lézernyaláb használata is. A lézer indukált plazma sokkhullámot és kavitációs buborékokat okoz, ami megnő majd kipukkad, ezzel érve el a sejtek feltáródását [40]. 2.6.1.2. Kémiai módszerek A kémiai módszerek lízisoldatokat használnak a cél eléréséhez. Különféle sejt-típusokhoz különféle oldat tartozik. Például a vörösvértestet a legtöbb esetben ammónium kloriddal tárják fel [41]. Az ionos és nem-ionos detergensek kioldják a membránból a fehérjéket és a lipideket, így ki tud folyni a beltartalom. A Triton X az egyik leghíresebb nem-ionos oldószer, az ionosok közül pedig a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) a leggyakrabban használt [42]. Ez utóbbit Sodium Lauryl Sulfate-nak, azaz SLS-nek is szokták nevezni. Sok sampon, tusfürdő, fogkrém tartalmazza habképző tulajdonsága miatt, lehetséges bőrirritáló és akár még súlyosabb hatásaitól tartva azonban egyre többen keresik az olyan kozmetikai és tisztítószereket, amik összetevőiben nincs SLS [43]. A lízisoldatok a sejtmembrán fehérjéit denaturálják, viszont a baktériumok sejtfalát nem tudják felbontani, így azokat lizoszómákkal is kezelik. Az úgynevezett kaotróp sók is gyakori szereplői a mintaelőkészítésnek [44]. Nagy koncentrációban a guanidinium tiocianát és a guanidinium klorid is lizálja a sejteket, mert feloldja a fehérje molekulák közötti másodlagos kölcsönhatásokat (például a H-híd kötéseket) [45]. Stachowiak munkatársaival olyan baktériumlizáló eszközt fejlesztett, ami bétamerkaptoetanollal működik, ez a vegyület ugyanis lebontja a diszulfid hidakat, melyek a fehérjék szerkezetében levő fontos kovalens kötések [46]. Egy másik kutatócsoport Escherichia coli sejteket ejtett hidrogél-csapdába, majd megfestette őket. A baktériumsejtek fölött átfuttatott egy 1%-os SDS oldatot 20 percen keresztül. Az ellenőrzés úgy történt, hogy a

22

fluoreszcenciát figyelték, ugyanis a lizált sejtek fluoreszkáltak. [47] A lizozim hasonló szerkezetű enzimek egy csoportja, amely a Gram-pozitív baktériumok lízisét képes előidézni sejtfaluk roncsolása révén. Tehát a lizálás megvalósítható úgy is, ha lizozimet keverünk a sejtszuszpenziónkhoz [48]. 2.6.1.3. Hőátadásos módszerek Magas hőmérsékleten a fehérjék (így a membránfehérjék is) denaturálódnak, ami a sejthatároló megbomlása által a sejt líziséhez vezet. A leggyakoribb hőkezelési eljárás során forrásban levő vízbe merítik a mintát, és 40 percen át ott tartják. Ennél tovább nem szabad benntartani, mert akkor a DNS is károsodhat. Ez nem tipikusan mikrofluidikai eljárás, de az egyre gyakoribb PCR alapú vizsgálatok miatt egyre egyszerűbb a hőkezeléses módszer, hiszen a PCR ciklusai miatt amúgy is be van építve egyfajta fűtőegység. Azonban csak egy-egy mintára jók, az áramlásos rendszerek idáig csak makroskálán lettek implementálva [49]. Egy másik hőátadásos technika a lézer energiáját használja ki. Cheong kutatócsoportja azzal kísérletezett, hogy egy 808 nm-es hullámhosszal gerjesztő lézer milyen oldalarányú aranypálcikák esetén okozza a fémrudak akkora hőtermelését, hogy az elegendő a sejtfeltáráshoz [50]. Ezt a módszert alkalmazva Cho munkacsoportja meg is valósított egy Lab-on-a-Disk eszközt [51]. A „laboratórium egy lemezen” eszközök előnye, hogy a centrifugálás műveletét is meg lehet rajtuk valósítani. Konstrukciójukkal Hepatitis B vírussal és E. colival beoltott emberi vérből tudtak kinyerni patogén-specifikus DNS-t. A vizsgálat egyetlen emberi beavatkozást, a 100 μl teljes vér bemenetre illesztését igényli, és mindössze 12 perc működési idő után eredményt ad. A készülék DNS extrakciót végez mágneses gyöngyök és antitestek felhasználásával. 2.6.1.4. Elektromos módszerek A sejtek felbomlanak erős elektromos mező hatására is. Ezt úgynevezett pulzáló elektromos mezővel érik el (pulsed electric fields, PEFs). A szükséges térerősség függ a sejt típusától, a méretétől és átmérőjétől. A sejt líziséhez akkor jutunk, ha a membránpotenciál eléri átlagosan az 1,1 voltot [52]. Ezt körülbelül 20 kV/cm térerősségű elektromos mezővel lehet elérni [52]. Az impulzusok száma és időtartama is fontos paraméter. Ez utóbbi E. coli baktérium kezelése esetén 4,5 μs. [52] Sokféle elektródelrendezést terveztek eddig, többük szilíciumalapú chiphez alkalmazkodik. Egy PDMS chip rezervoárjába is helyeztek platina elektródszálakat, ami működött is, bár a kívánt térerősség eléréséhez 500 voltra volt szükség. Cserébe a minta E. coli baktériumainak mindegyikénél elérték a sejtek lízisét. [53] Az elektromos módszerekhez tartozik az is, hogy feszültség hatására hidroxid-iont fejlesztünk. Ez lehasítja a zsírsav-csoportokat feltörve ezzel a sejteket. [31][54]

23

A négyféle bemutatott módszert a jobb áttekinthetőség kedvéért Kim és munkatársai cikke alapján [7] egy táblázatba foglalom (2. táblázat). Módszer mechanikai kémiai hőátadásos elektromos

A chip megmunkálási technológiája mély reaktív ionmarás (DRIE) lézervágóval megmunkált vagy fotolitográfiás mikromegmunkálás litográfia, elektród leválasztás, üvegkötés

Szükséges vezérlések áramlás, ultrahang

A lízis időszükséglete 30 s – 10 min

áramlás, hőmérséklet

30-190 s

hőmérsékletszabályozók, áramláskontroll feszültség/áram vezérlés

2-5 min <50 ms – 20 min

2. táblázat. A sejtek lizálásának módszerei és időigényei. A mechanikai módszerek előnye, hogy jól használhatók különféle sejttípusokhoz, a hátránya viszont az, hogy mikrofluidikai rendszereken nehezen megvalósíthatók. A kémiai módszerek hátránya, hogy minden sejthez más oldat kellhet illetve hogy reagensek drágák is lehetnek, előnye, hogy könnyű a kivitelezése – csak egy jó geometriájú keverőcsatorna kell hozzá. A hőátadásos módszer alkalmazásakor jó, ha figyelembe vesszük, hogy a nyomás növelésével meggyorsíthatjuk a lízist, mivel magasabb hőmérsékleten kezd el csak forrni. Az elektromos módszerekkel történő lizálás időigénye az elektromos mező erősségétől függ.[7]

2.6.2. DNS izolálás A DNS izolálás során a mintánkból elválasztjuk a DNS-t a sejttörmelékektől és a sejtközötti állománytól. Ez azért szükséges, hogy a nukleinsav-alapú diagnosztikai eljárásokat alkalmazni tudjuk, ugyanis a mintában előfordulhatnak olyan inhibitorok is, melyek a DNS-polimeráz enzim gátlásával megakadályozhatják mind a PCR, mind a LAMP reakció megfelelő lefutását. Az elválasztás egyik hagyományos módszere a centrifugálás, amely során az edény tengelye körüli forgatásával a gravitációs erőhöz annak akár többszörösét is elérő centrifugális erő adódik, ezzel az ülepedés folyamata felgyorsul. A nagyobb sűrűségű oldatösszetevők az edény aljára, míg a felülúszóba a kisebb sűrűségű komponensek kerülnek. Ez a módszer jól alkalmazható makroméretekben, de mikrofluidikai rendszerekben gondolkodva ez nehezen megvalósítható. Nem csupán az ülepedés meggyorsítása lehet a centrifugálás eredménye. Az 1950-es években kezdték használni az izopiknikus gradiens centrifugálást a részecskék sűrűség szerinti szétválasztására nagy sűrűségű oldatból (pl. céziumkloridból) készült gradiens alkalmazásával. [55] A céziumklorid-oldatra alkalmazott ultramagas centrifugális erő sűrűséggradienst hoz létre, mivel a cézium-ionok nagyobb sűrűségűek a vízmolekuláknál. A nukleinsavak a gradiensben mozogva elfoglalják a felhajtóerő által megszabott helyüket az

24

izopiknikus pontjukon. [56] Ez a módszer nagyon jó tisztaságú DNS-kinyerést eredményez, és nem is költséges. Még kromoszomális DNS, plazmid DNS, rDNS és mitokondriális vagy kloroplasztban lévő DNS tisztítására is jól használható, mert mindegyik külön sávot alkot a gradiensben. Hátránya viszont az, hogy ultracentrifuga szükséges hozzá, 24-48 órán át tart a művelet, és etidium-bromidot is használ jelölőmolekulaként, ami mutagén anyag. Fenolkloroformmal is elérhetünk egy fázis szeparációt [57]. A fenol-kloroform denaturálja a fehérjéket, ezzel létrehoz egy fehérjés fázist, a vizes fázis pedig a DNS-sel együtt a felülúszót fogja alkotni a centrifugálást követően. Ennek a módszernek is van azonban hátulütője, ugyanis a fenol mérgező, és például várandósok nem dolgozhatnak vele. [56] Újdonságnak számított 1989-ben, hogy a folyadékokkal történő elválasztás helyett szilárdfázisú elválasztást fejlesztettek ki. [58] Egy réteg fenolt, aminek erős affinitása van a fehérjékhez, kémiailag az eszköz falához kötöttek. Ez a módszer lényegét tekintve olyan, mint a fenol-kloroformos, csak szilárd fázisban, ezért kevésbé veszélyes, továbbá azért is jobb módszer, mert a kontaminálódás veszélye csökken azáltal, hogy a szilárdfázisú anyagok nem oldódnak a vizes pufferokban. Ennek a szilárd fázisú extrakciónak a lényege, hogy a DNS az oldatban marad, míg a fehérjék lekötődnek a szilárd fázishoz. Általánosságban a szilárd fázisú extrakció három lépésből áll: a mintafelvitelből, aminek során a minta érintkezve az abszorbens anyaggal a szilárd fázis felületéhez kötődik, a mosásból, amivel eltávolítják azokat a lekötődött molekulákat, amiket nem szeretnének megtartani, végül az elúcióból, amikor azt a molekulacsoportot, amit visszamaradt a szilárd fázishoz kötve, feloldják egy eluáló pufferrel. Az abszorbens anyagokat úgy kell elképzelni, mint egy nagynyomású folyadékkromatográf (High Pressure Liquid Chromatograph, HPLC) oszlopát. Az oszlop anyaga legtöbbször szilika-gyöngy (szilícium dioxid), de kísérleteztek már mágneses gyöngyökkel is. [59] A centrifugáláson kívül is vannak még olyan DNS-elválasztó módszerek, amik nem a szilárd fázisú extrakcióhoz sorolhatók. Ilyen megoldás még az az enzimatikus út is, ami egy antarktiszi vulkán kráterében talált hőtűrő baktériumból nyert enzimmel működik. Ez az úgynevezett EA1 proteináz enzim az alapja a hőmérsékleti ciklusokkal működő ZyGEM™ nevű DNS-kinyerő eljárásnak. 75 ˚C-on az enzim aktív, 95 ˚C-on pedig inaktiválódik. Bár a módszer szabadalmaztatott [60], előnye, hogy nem túl eszközigényes, és kis mennyiségekkel is működtethető. [61] Ioncserélő membránok alkalmazása is a DNS izolálás egy lehetséges útja. Mivel a DNS molekula erősen negatív töltésű, a sejttörmelék fehérjéi pedig pozitív és negatív töltésűek is, ezért egy negatív töltésű szűrőanyagon történő átfolyatás közben a fehérjék pozitív töltései abszorbeálódnak majd deszorbeálódnak, a DNS molekulák viszont abszorpció nélkül továbbhaladnak. Ezzel a szétválasztás megvalósul. A Chelex nevű kelátképző ioncserélő gyantát a bűnüldözésben is használják nukleinsav-vizsgálatokat előkészítendő DNS-

25

kinyerésben [62]. Méret szerinti szeparálást tudunk elérni olyan speciális membránokkal, melyekben garantált méretű pórusok vannak kialakítva. Elgort kutatócsoportja emberi vérmintából nyert ki DNS-t 0,1 μm pórusátmérőjű alumínium-oxid membrán alkalmazásával. [63] Ugyanezen módszerrel Kim és munkatársai is eredményt értek el, ráadásul sikerült mikrofluidikai chipre is integrálniuk a szűrőegységet. [64] A 3M gyártotta membránok között vannak különféle anyagból: nylonból, teflonból és poliéterszulfonból előállítottak is. Ezeket rétegtechnológiás eljárással mikrofluidikai chipekbe lehet integrálni, amin a mintát átáramoltatva megtörténik az elválasztás. A szűrőn fennakadnak a nagyobb részek – sejttörmelékek, fehérjék, épen maradt sejtek – míg a DNS-t tartalmazó oldat továbbfolyik. Ezzel megvalósul a DNS izolálás.

26

3. Tervezés és kivitelezés Figyelembe véve laborunk felszereltségét és egyetemközi kapcsolatainkat a következő munkatervet tűztük ki célul. Az élelmiszerbiztonság szempontjából jelentős Listeria monocytogenes sejtek nukleinsav-vizsgálatra előkészítésének mikrofluidikai rendszeren megvalósítható lépéseinek tervét készítem el és valósítom meg kémiai lizálással és ioncserélő szűk pórusú membránszűrős DNS elválasztással. Az eljárásokhoz a bemenet a mikrobiológiai laborban, megfelelő táptalajon kinövesztett sejttenyészet szuszpenziója, amit egyetlen oltókacsnyi sejtenyészetből és 500 μl desztillált vízből készítettem. Az élelmiszerminták tenyésztést megelőző feldolgozó lépéseit is chipen kívül elvégzettnek tekintem. A tervezett műveletekhez az alábbiakban ismertetett anyagokat és eszközöket használom fel.

3. 1. Anyagok és eszközök 3.1.1. Dimetil-polisziloxán A dimetil-polisziloxán vagy másképp írva poli(dimetil-sziloxán), melyből ismert és elterjedt rövidítése, a PDMS adódik, egy szilícium alapú lánc alakú polimer (3. ábra).

3. ábra: A PDMS kémiai struktúrája. A szilícium és oxigén képezte sziloxánhoz két metilcsoport kapcsolódik, s ez a modul ismétlődve tetszőleges hosszúságú láncot hoz létre. Az önmagában nagy viszkozitású folyadék térhálósító ágens hozzáadásának hatására körülbelül egy nap alatt szilárd, rugalmas, víztisztán átlátszó anyaggá válik. A szilárdulási folyamatot 30 percen keresztüli 80 ˚C-on történő inkubálással gyorsítani lehet. A kész, mikrofluidikai chipek esetében legtöbbször 2 vagy 4 mm-es vastagságú lapnak öntött alapanyag kiválóan megmunkálható különféle eljárásokkal. A fejezet későbbi pontjában bemutatásra kerülő lézervágó gép egy alkalmas eszköz PDMS felületén csatornák, reakcióterek kialakítására. A PDMS-t mind hajlékonysága, mind átlátszósága, olcsó költségei és könnyű megmunkálhatósága kedveltté tették a mikrofluidikai iparágban is [65]. A PDMS felülete hidrofób, ami azt jelenti, hogy egy csepp víz görbületi sugara a felülettel tompaszöget zár be. Térhálósodott állapotában szivacsos szerkezet jellemző rá, ami lehetővé teszi a vákuumkezelés utáni energiatárolást, amivel a csatornában folyadékoszlopokat tudunk

27

mozgatni. Jó a hőtartó tulajdonsága, ezért a hőmérsékleti változásokra lassan reagál. A laborunkban használt PDMS-t és térhálósító anyagát a Sylgard nevű cég gyártja. 3.1.2. Szűrőmembránok A szűrés lényege az elválasztás. Ez történhet kémiai tulajdonságok – például negatív vagy pozitív töltöttség –, illetve fizikai jellemzők – például méret, sűrűség – alapján. Az ivóvíz tisztításában is használatos ioncserélő gyanták lényege, hogy negatív vagy pozitív töltöttségüknél fogva ioncserére kényszerítik a pozitív illetve negatív töltésű, folyadékfázisban áthaladó molekulákat. A nukleinsav-vizsgálatok szempontjából mérvadó anyag, a DNS egy olyan kettős szálú molekula, ami erősen negatív töltésű, szemben a fehérjékkel, amik vegyesen tartalmazhatnak pozitív és negatív ionokat is. Ezért a lizált sejteket tartalmazó mintának egy aniongyantán való átfuttatása azt eredményezné, hogy a DNS fennakadás nélkül átmenne a szűrőn, míg a fehérjék vagy egyéb sejtalkotók több ideig a szűrőben tartózkodnának az ionjai kicserélése következtében. Kísérleteimhez a 3M kiváló minőségű, megbízható és egyenletes pórusátmérőjű membránjait használtam, amivel fizikai tulajdonság alapján szelektálhatunk. Az egyik szűrőlap, amivel kísérleteztem, nylonból készült és 0,45 μm átmérőjű pórusokat tartalmaz. Készítettem eszközt még 0,2 μm-es pórusokat tartalmazó, Teflonból készült membrán integrálásával, és a legsűrűbb, a 0,1 μm pórusátmérőjű, poliéterszulfon szűrővel is próbálkoztam. 3.1.3. Kétoldalú ragasztórétegek A 3M gyártótól mintaképpen kapott ragasztólapokat már korábban, többek között az egyik önálló laboratóriumi munkám során is felhasználtuk rétegtechnológiás eszközök gyártására. A minél kisebb méret felé törekvést jól támogatja az az elképzelés, hogy a csatornák egymás fölött is elhelyezkedhetnek. Két PDMS réteg között – az általunk ismert és elérhető termékek közül – a legmegfelelőbb a 9628FL kódszámú akril típusú ragasztólap. Ennek előnye, hogy teljesen átlátszó és viszonylag könnyen le lehet választani hordozójáról csipesz segítségével. Próbálkoztam még a 9731-es kódszámú ragasztóréteggel is, ám mind az optikai tulajdonsága (tejüveg-szerűen áttetsző) mind a kezelésében tapasztalt nehézségek miatt az előzőt használtam. 3.1.3. Epilog Zing lézeres anyagmegmunkáló gép Az egyetem mikrofluidika laborja néhány évvel ezelőtt új felszereléssel gazdagodott, egy Epilog Zing 16 Laser System nevű lézervágó berendezéssel. A 30 W-os készülék CO2 lézersugár segítségével különféle anyagok gravírozására és vágására alkalmas. PDMS

28

alapanyagú mikrofluidikai chipeket már nagy rutinnal tudunk készíteni, körülbelül 200 μm-es csatornaátmérővel. A készülékkel hatékonyan munkálunk meg PMMA-t és papírt is. Nagy előnyét látjuk a gyors prototípusgyártásban, habár a pontossága nem tud vetekedni a hagyományos, szilícium alapú, litográfiás eszközgyártási eljárásokéval. Hartdégen Márton egyetemünkön folytatott munkássága során dokumentálta az általam is használt paraméterek melletti csatornaalakítási eredményt (4. ábra) [66].

200 μm

4. ábra. PDMS-be vágott csatorna 1000 Hz, 1000 DPI, 90% sebesség és 10% energia melletti beállításokkal. A pixelszámot a Gimp® rajzprogrammal határoztuk meg, továbbá korábbi mérésekkel megállapítottuk, hogy egy pixel 4 μm-nek felel meg, így a képen látható ,,v" alakú struktúra felső része kb. 300 μm, míg az alsó része kb. 80 μm. A felvételt uEye ® programcsomaggal, négyszeres nagyítás mellett készítettük.[66]

A lézervágó

egy

külső

nyomtatóként

csatlakoztatható

a

számítógéphez,

ami

a

tervezőprogramhoz (pl. Corel Draw vagy AutoCAD) beépülő nyomtatási beállítások menüvel rendelkezik. Itt beállítható az anyagmegmunkáló lézersugár frekvenciája, teljesítménye és sebessége, valamint az egy collra (inch-re, hüvelykre) jutó képpontok száma. Két fő működési módja van a gépnek, a vector mód, amivel vonalakat készítünk, és a raster mód, ami egybefüggő felületeket mintáz meg. A vector mód (vektorozás) a legáltalánosabb használt mikrofluidikai chipek gyártásakor, hiszen a vágást és a csatornákat is egy vékony vonal mentén tervezzük. Raster módot ritkábban használunk, ha nagyobb tér kitöltésének szándéka vezet. Ilyen eset például akkor fordul elő, amikor valamilyen tartályt tervezünk, vagy egy-egy beillesztendő vendéganyag (pl. különféle membránszűrők) helyét készítjük elő. A megmunkálási mód neve után a műveletet raszterezésnek neveztük el, a továbbiakban ezt használom. 3.1.5. NanoDrop 2000 spektrofotométer A Thermo Scientific által gyártott NanoDrop 2000 nevű készülék egy csepp mintából képes

29

spektrofotométerhez hasonló diagnosztizáló munkát végezni. Például 2 μl-nyi DNS izolátumból meg tudja mondani az oldat tisztaságát az abszorbeált UV-fény alapján. A nukleinsavak jellemzően a 260 nm-es fényt nyelik el, míg a fehérjékre a 280 nm jellemző. A DNS tisztaságáról a spektrofotométer egyik adata az A260/A280 arány, ami tökéletesen tiszta minta esetén 1,8 (RNS esetében 2). Az egyéb (nem fehérje) szennyeződések elnyelése 230 nm-en történik, ezért a másik beszédes arányszám a 260/230, aminek 2,0-2,2 körüli értéke esetén mondható tisztának a DNS [67]. A készüléknek kell viszonyítási alap, így először mindig desztillált vízzel mérünk, ezután a kezeletlen mintáink jönnek, majd a különféle eljárásokon átesettek. 3.1.6. Hőszabályozó panel Eppendorf csövek meghatározott hőfokon való inkubációjához használatos melegítőeszközt használtam a chipeken történő hőátadásos folyamatok végrehajtására. Az 5. ábrán látható a készülék, melyen a kívánt hőmérséklet előre megadható (maximum 100 ˚C), majd működés közben az aktuális hőmérsékletről a hétszegmenses kijelző folyamatosan tájékoztat. Ellenőrzésképpen egy analóg hőmérő higanyszálát is figyelhetem. A fűtőegység a csöveket tartja megadott hőmérsékleten, azonban a 2,5 cm x 7,5 cm-es eszközünket csak a tetejére helyezhettük, így a hőből is kevesebb érte. Az aktuális értéket analóg hőmérőről tudtuk leolvasni. Az inkubátor maximum hőereje a felszínen körülbelül 74 ˚C-ot biztosított, amit céljaim szempontjából elegendőnek gondoltam.

5. ábra. A kísérlet hőszabályozását biztosító eszköz a Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudományi Karának Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszékén. Az Eppendorf csövekre tervezett fűtőegység felszíni hőmérsékletét ellenőriznünk kellett, mert a készülék a belső hőmérsékletet mutatta. Kísérletképpen egy másik hőátadó eszközt is használtam, egy fűtőlapot (6.A ábra). A 6.B ábrán hőkamerával készített kép látható. A jó hőszigetelő tulajdonságú PDMS chip

30

hőmérséklete is a kívánt fokra emelkedett.

B

A

6. ábra. Chipünk melegítése (A) és annak eredményének ellenőrzése hőkamerás felvétellel (B). A baloldali képen a chipet piros ellipszissel emeltem ki.

A fűtőlapon magasabb hőmérsékletet is el tudunk érni, ám a polimerizálódott PDMS 100 ˚C fölött üvegessé kezdett válni, és a 6. A ábrán is látható módon az alakja is megváltozott.

3. 2. Az eszközgyártás lépései Chipjeim működtetéséhez a vákuum-vezérelt meghajtási technikát választottam, mert a jövendőbeli célok egyikét, az eszközigény minimalizálását ez valósítja meg legjobban, tekintve, hogy csak egy vákuumszivattyú szükséges a chip működésbe lépéséhez. A jövőben még ez is kiküszöbölhető gyári vákuumozással és vákuumtartó csomagolásban szállítással. A meghajtási technika befolyásolja az eszköz geometriáját is. A vákuum-pumpás eszközöknek csak bemenetük lehet, hiszen a csatornába kényszerítő erő „kiszökne”, ha lenne kimenet is. Az egyik, nagy példányszámban (6 db) elkészített prototípus rétegeinek tervét a 7. ábra mutatja. Az eszköz a 7. ábrán is látható három rétegből áll össze. Az első egy PDMS-lap, amiben a bemeneteket és a keverőegységet alakítottam ki. Erre rá kerül egy 3M által készített 9628FLes ill. 9731-es kódszámú kétoldalú ragasztólap-réteg. Ennek közepén a kivágás helyére illesztettem a szűrőmembránt, ami szintén a 3M gyártmánya, de anyaga nylon, teflon illetve poliéterszulfon, rendre 0,45, 0,2 és 0,1 μm pórusátmérőkkel. A harmadik réteg szintén PDMSből készült, melyben raszterezéssel kialakított gömbszelet alakú tartály és egy csatorna van. A gömbszelet alakot az eredményezte, hogy a tervben a tartályt középről halványodó színátmenetes kitöltéssel terveztem meg. Ezt az alakot azért gondoltuk megfelelőnek, hogy az anyagkigyűjtés könnyebb legyen. Az eszközt a sérülés elkerülése és a könnyebb

31

megfoghatóság érdekében üveg tárgylemezre rétegeztem.

A

B C

7. ábra. A mintaelőkészítést végző többrétegű mikrofluidikai chip egyes rétegeinek mintázata. A) felső, keverős réteg a két bemenettel. B) a középső, ragasztólap rétege. A réteg közepén látható körforma a szűrőmembrán helyének készített kivágást mutatja. Annak helyére pontosan oda illeszkedő membránt vágtam. C) alsó réteg a tartállyal. Ide fut be a nukleinsavvizsgálathoz szükséges, előkészített minta. A színátmenetes kitöltés a raszterezéses anyagmegmunkálás során gömbszelet alakú mélyedést eredményezett. A rajzokat a Corel Draw X5 tervezőszoftverrel készítettem. Méterük 210 mm x 297 mm. A csatornákhoz fekete színű, „hairline” vastagságú vonalakat használtam, a tartályt színátmenetes kitöltéssel megadott körlap raszterezéses megmunkálási módjával oldottam meg, ami ezáltal egy gömbszelet formáját mélyítette a PDMS-be. A rétegek – PDMS, ragasztólap, szűrőmembrán – megmunkálásra használt Epilog Zing Laser eszköznek adott paramétereket a 3. táblázatban foglaltam össze. A megfelelő beállítások kipróbálásában a laborunkban dolgozó hallgatók segítettek. Munkájuk eredményeképpen jól kereshető módon összegyűjtöttük a laborban előforduló anyagok megmunkálási paramétereit.

32

Anyag

PDMS

PDMS

PDMS

Nylon

Teflon

Poliéterszulfon

9731

9628FL

Mód

Vector

Vector

Raster

Vector

Vector

Vector

Vector

Vector

Felbontás

1000 DPI 90%

1000 DPI 90%

1000 DPI 40%

500 DPI 75%

500 DPI 75%

500 DPI 75%

500 DPI 25%

1000 DPI 90%

10%

60%

6%

6%

5%

8%

20%

1000 Hz

–

5000 Hz

2500 Hz

2500 Hz

2500 Hz

1000 Hz

Sebesség

Teljesítmény 100% Frekvencia

1000 Hz

3. táblázat. A lézervágó készüléknek adandó paraméterek listája, amelyek a különféle felhasznált anyagok alakításához szükségesek. Az anyagtól és a céltól – pl. bemenet, csatorna vagy tartály – is függ, hogy milyen értékeket adunk a változtatható tulajdonságoknak. A rétegek összeillesztése komoly kihívást jelentett. A kétoldalú ragasztó nehezen vált le a második hordozójától. A PDMS-re illesztést csipesz segítségével oldottam meg. A többrétegű eszközt a könnyebb megfoghatóság és szilárd alap adásának érdekében üveg tárgylemezre helyeztem. Mivel a ragasztóréteggel való munka sok nehézségbe ütközött, kialakítottunk egy olyan elrendezést is, amihez elegendő két PDMS réteg. A szűrőmembrán helyét a lézervágó raszterezéses anyagmegmunkálásával alakítottuk ki, amibe egyszerűen be kellett helyezni a megfelelő méretre vágott szűrőmembránt. A tartály kialakítása is változott: a könnyebb termékkinyerés és a tartály térfogatának növelése érdekében egyenes aljú tartályt vágtam az anyagba (8. ábra).

A B

B

8. ábra. A második széria layout terve. A és B mintázatát PDMS-ben alakítottam ki. A középen kialakított 3 mm átmérőjű fészek a szűrőmembrán helye.

Az elkészült eszközöket használat előtt 40-60 percig vákuum alatt tartottam, ami alatt a pórusos anyag jól kiürült, felkészülve ezzel a telítődésre. A bemenetekre helyezett 30-30 μlnyi oldatok 10-15 perc alatt áthaladtak a csatornarendszeren, a szűrőmembránon és a tartályban gyűltek össze. A kimenet összegyűjtéséhez az eszköz két rétegét külön kell választani, vigyázva, hogy a termék ne vesszen el a PDMS-lapok felületén. A tartályból

33

pipettával egyszerűen kinyerhető a minta az ellenőrző (pl. spektrofotométeres vagy mikroszkópos) vizsgálathoz, a távlati célokat tekintve pedig a diagnosztikai művelet következő lépéséhez, a nukleinsav-sokszorozás reakcióterébe való továbbításához.

34

4. Eredmények A célfeladatokra megterveztem Corel Draw X5 grafikai szerkesztőszoftverrel a megfelelő geometriát. Ezt a kísérletes eredmények láttán többször újragondoltam. PDMS-ből lapokat öntöttem, lézervágó géppel megmunkáltam, majd üveg tárgylemezeken a köztes (ragasztó-) réteggel és a betétanyaggal összeillesztettem a többrétegű mikrofluidikai chipeket. Összesen tíz példányt gyártottam az első kísérleti elrendezésből. A 9. ábrán látható chipen a sejtek lizálását végeztem. A sejtfeltárás módszerei közül a hőkezeléses eljárást választottam a költségkímélő és könnyen megvalósítható kísérleti berendezés miatt. A 24 órán át tenyésztett, Listeriához hasonlóan Gram-pozitív Enterococcus faecalis baktériumtelepekből 500 μl desztillált víz hozzáadásával sűrű szuszpenziót készítettünk, amit a mintafeldolgozó egység bemenetére pipettáztam. A 40 percen keresztül vákuum alatt tartott PDMS chip anyagának cellái kiürültek, ezért normál légköri nyomás alá helyezve az eszköz passzív pumpaként működött, a rácsöppentett mintát a csatornába, majd a tartályba szívta (9. ábra).

1 cm

9. ábra. A festékes víz a bemenettől a tartályig jutott kizárólag a PDMS vákuum utáni levegőfeltöltődése következtében létrejövő nyomás hatására. A vákuumpumpás rendszerek a külső pumpát igénylő rendszerekhez képest kevésbé eszköz- és helyigényesebbek.

Ez az úgynevezett száraz melegítési eljárás legtöbbször csak a sejtek halálát (anyagcseréjének leállását) okozza, de a sejtfal nem szakad fel. A hőátadásos módszerek hatékonyabb változata a forralásos módszer, aminek során 10 percen keresztül 100 ˚C-on forró vízfürdőben kezeljük a mintánkat. Ezt azonban mikrofluidikai körülmények között csak nehezen lehet kivitelezni. A kémiai sejtfeltáró módszer könnyebben megvalósítható egy keverőegység beiktatásával, ezért új csatornamintázat tervezése után új chipgarnitúrát gyártottam (10. ábra). Az anyagmegmunkálás technológiája segít a keverésnél, ugyanis a lézerfény impulzusai kicsiny krátereket hoznak létre az anyagban, és ezek sűrű egymásmellettisége adja a csatornát. Az egyenetlen csatornaalj miatt apró örvénylések lépnek föl az áramlás közben, ami előmozdítja a keveredést.

35

1 cm 10. ábra. A chip jobboldalán látható két bemenet közül egyik a mintának, másik a lizáló oldatnak lett tervezve. A kanyarokkal vezetett csatornában végbemegy a keveredés, a szűrőmembránon áthaladva pedig a DNS extrakció, míg a baloldalon látható tartályba kerül a tiszta DNS oldat. Az ábrán a szemléltetés kedvéért sejtszuszpenzió és lízispuffer helyett festékes oldatok vannak. Az eszköz egyik bemenetére 30 μl vizes alapú kék ételfestéket, másik bemenetére 30 μl sárga festéket pipettáztam. A csatornában végigáramlott a folyadék, a keveredés is végbement. A sejtekkel való kipróbálás előtt mikroszkóp alatt megfigyeltem magát a sejtszuszpenziót (12. A ábra). Egyetemünk Mikrobiológiai Laboratóriumának jóvoltából Escherichia coli baktériumok DH5alpha törzsével dolgozhattam, lízispuffernek pedig SLS tartalmú háztartási detergenst használtam 1:10 arányú desztillált vizes hígításban, ami a Gram-pozitív baktériumok sejtfalát feltételezésünk szerint hathatósan bontja. A chipbe épített szűrőmembránokon átáramlott minta valószínűsíthetően a csatornából kimosott hamuval, korommal és a megmunkálás során szerzett egyéb anyagokkal szennyeződött. A 11. ábrán a chip kimenetének mikroszkópos

képe

látható a

szennyeződésekkel.

10 μm 11. ábra. A 0,45 μm-es pórusátmérőjű szűrőmembránt építettem abba a chipbe, aminek a kimenetén a bemenet tiszta sejtes oldata illetve a sejtmentes lízisoldat ellenére a képen látható szennyeződések jelentek meg – feltehetően a csatorna falából kimosódott hamu miatt.

36

A körülbelül 0,5 μm x 2 μm-es méterű, pálcika alakú E. coli baktériumokat egyik szűrőmembránunk sem engedheti át. Egy 0,8 μm-es pórusátmérőjű szűrőn keresztül azonban néhány sejt átjutott (12. B ábra). A chipen átáramoltatott sejtek membránon való átszökése az új, ragasztóréteg nélküli chipeken a membránnak kialakított hely mélysége és a szűrő vastagsága közötti különbség miatt is lehet. Ennek ellenére kaptam olyan eredményem is, ami tökéletesen kiszűrte a sejteket.

A

B

10 μm

12. ábra. Escherichia coli baktériumok DH5alpha törzsének inverz mikroszkópos képe a szűrés előtt (A) és 0,8 μm-es pórusátmérőjű szűrőn átjuttatva (B). A mintaelőkészítő chipem szűrői várhatóan még a képen látható néhány sejtet sem engedi át.

A különféle szűrőmembránok, amiket alkalmaztam, pórusátmérőjét tekintve 0,1, 0,2 és 0,45 μm-esek, így azok a baktériumsejtek, amelyek nem lizálódtak, nem mehettek át. Az elvárásaim alapján a legtöbb sejttörmeléket is képes felfogni a szűrőréteg. Az eredményeket tekintve

azonban

nem

lett

tisztább

az

oldat.

Spektrofotométerrel

ellenőrizve

a

szűrőmembránon való áthaladás után a 260/280 mutató alacsony, a bemenetéhez képest alig jobb értéket mutatott (4. táblázat).

37

4. táblázat. A NanoDrop spektrofotométer által mért adatok. A chipbe épített szűrőmembránon áthaladva a számok alapján nem történt meg a tisztítási művelet. Az utolsó oszlop mutatja a tisztasági értéket. Elvárásom szerint az 1,8-at kellene közelíteni, ehelyett az inputtól is szennyezettebb, 1,38 közeli értéket számolt a program.

A membránokat a lézervágó géppel alakítottam olyan méretűre, ami épp illeszkedik a PDMSben kialakított helyére (3 mm átmérőjű kör). A vágás következtében korom keletkezett a lézer munkája mentén. A szennyeződést ez is okozhatta a csatornából kimosódó hamu mellett. Egy újabb sorozat chipbe már lyukasztókéssel kialakított membránt helyeztem, így szemét már nem került a kimenetre, sejt se a szűk pórusok miatt – ezt mikroszkóp alatt ellenőriztem is –, de DNS sem. Ez utóbbi az 5. táblázat adataiból látszik. A ng/μl egységekben mért koncentráció a DNS esetében 280 nm-en elnyelt fényből számítva a bemeneteken sokkal magasabb érték, mint a feltételezett lízis után. Ebből arra következtetek, hogy a sejtfeltáródás nem történt meg, aminek oka lehet, hogy a detergens koncentrációja nem volt megfelelő a lízispufferben. A keveredéssel nem lehetett probléma, ugyanis mind a mikrofluidikai keverőn való áthaladás, mind a makroméretben elvégzett vortexes keverés után szűréssel vagy centrifugálással szétválasztott mintában egyformán alacsony DNS koncentráció értéket kaptam hasonló tisztasági értékekkel. A mintakinyerést könnyebben meg tudtam valósítani azokon a chipeken, amelyeken a tartály alját egyenesre mintáztam.

38

5. táblázat. A vágással kialakított membránok széléről már nem kerülhetett szennyeződés a kimenetre, a tisztasági mutató azonban továbbra is alacsony maradt. A koncentrációértékeket figyelembe véve arra következtetek, hogy nem történt meg a sejtfeltárás. A diagram x tengelyén a hullámhossz szerepel nanométerben, az y tengely pedig az elnyelődés mértékét mutatja. Tiszta DNS oldat esetén a grafikonon a 260 nm sávjában nagyobb kiemelkedés lenne látható.

A mikrofluidikai megvalósítás eredményességének vizsgálatához makroméretben elvégzett kísérletsor eredményeit használtam kontrollként. A lízishez Eppendorf csőbe mértem 30-30 μm sejtoldatot és lízispuffert, vortex keverőn kevertettem, majd spektrofotométerrel vizsgáltam az eredményt. A 260/280 hányados nem javult, viszont a koncentráció hozzávetőlegesen a felére csökkent. A DNS-extrakció műveletét pedig a hagyományos centrifugálásos eljárással végeztem el úgy, hogy a lizált mintát 13500 rpm-en 5 percen keresztül centrifugáltam. Ennek eredménye az lett, hogy a felülúszóban hasonló tisztasági értékkel sokkal alacsonyabb nukleinsav-koncentrációt kaptam. A cső aljáról vett minta viszont nagy koncentrációt és ugyanúgy 1,26 körüli 260/280 érétket adott.

39

5. Értékelés Az eredmények egy része az elvárásoknak megfelelően alakult, azonban kaptam olyan eredményt is, amire nem számítottam. Az eszköztervezés és kivitelezés megfelelően ment, a munka során sok gyakorlati tapasztalatot szereztem, minden úgy működött, ahogy a leírás és a korábbi tapasztalatok alapján várni lehetett. A tervezésben tapasztalt zsákutcák is értékelhetők úgy, mint hasznos tanulságok mind a szoftverhasználat, mind a manuális műveletek közt gyakran megjelenő hibalehetőségek terén. A vákuumvezérlés megvalósítása is megtörtént. Ennek hatékonyságának javítása érdekében a PDMS rétegvastagságát növeltem (2 mm-ről 4 mm-re), így a minta hamarabb végigáramlott a csatornarendszeren. A „száraz” hőátadás lehetőségeinek próbálgatása abból a szempontból volt hasznos, hogy ha a jövőben egy olyan kémiai lízist szeretnénk megvalósítani, ami a normál hőmérsékletnél magasabb fokon működő enzimet használ, akkor a kikísérletezett módszerek valamelyikét a tapasztalt feltételek megvalósulását figyelembe véve pontosabban, egyszerűbben lehet tervezni. Érdemes számolni a hőmérsékletváltoztatás lehetőségével már a mintaelőkészítés feladatainak tervezésében is, hiszen a sokszorozási eljárás miatt hőszabályzó panel feltételezhetően a mintaelőkészítést, a reakciót és a detektálást integráló chipben amúgy is jelen lesz. A keveredés eredményessége megmutatta, hogy a gyors prototípusgyártás megmunkálási módszerei megfelelőek, hozzásegítenek a keveredéshez. A későbbi, sorozatgyártásban használt megmunkálási módszerek alkalmazása előtt figyelembe kell venni, hogy a lézermegmunkálás sajátossága a tömeggyártás módszerében nem feltétlenül jelenik meg. A szűrésben tapasztalt eredménytelenség oka lehet a szűrőmembrán szennyezettsége. A jövőben ezt steril lapokkal vagy másféle megmunkálási eljárással lehetne kiküszöbölni. A lézeres megmunkálás közben a csatornában maradt hamu folyadékba oldódása, keveredése is zavarhatta a kimenet tisztaságát. A csatornák tisztítását a rendszer működésbe állítását megelőzően, a gyártási művelet utolsó lépéseként kellene megvalósítani, esetleg acetonos mosással, ami poláris és apoláris oldószer egyben, így várhatóan több szennyeződést tud eltávolítani, mint a finomszálú kefével segített, detergenst tartalmazó tisztítószer alkalmazása. Figyelembe kell venni azt is, hogy a lézeres anyagmegmunkálás csak prototípusok gyártásához alkalmazandó, így ez a probléma a tömeggyártásban fel sem merül. A membrán elhelyezése is változott az eszközkialakítás fejlődése során. A végső változatban a membrán számára kialakított hely mélysége többszöröse a membrán vastagságának, így a minta ki is kerülhette a szűrőt. Ennek megoldására kisebb intenzitású raszterezéssel sekélyebb, a membrán vastagságához illeszkedő mélységű tartályt lenne célszerű kialakítani a PDMS-ben.

40

A lízis eredménytelensége megmutatta, hogy az alkalmazott puffer nem megfelelő. Az SDS tartalmú szert nagyobb koncentrációban kell használni, vagy más puffert kellene kipróbálni. A kereskedelemben kapható sejtspecifikus lizáló pufferoldatok egy lehetséges alternatívát jelenthetnek. Sok kísérlettel és a körülmények paramétereinek változtatásával saját lizálószert is ki lehetne fejleszteni konkrétan a célsejtre.

41

6. Összefoglalás A diplomaterv témájának célja a megoldandó mintaelőkészítési feladatok mikrofluidikai megvalósíthatóságának körüljárása volt. A technikai kihívások jó ösztönzők arra, hogy a mérnöki munka tervezési, megvalósítási és ellenőrzési műveleteit kipróbálhassuk, jártasságot szerezzünk benne. Erre lehetőség nyílt a diplomaterv feladatainak végzése során is, mivel sok megoldandó problémával találkoztam. Az irodalomkutatás rávilágított arra, hogy mennyien próbálkoztak már különféle módszerekkel. A dolgozatban összegyűjtöttem a főbb nukleinsavvizsgálatokat, és áttekintést adtam ezek mikrofluidikai megvalósulásairól. A kutatások egyik irányvonala az élelmiszerbiztonság, ami izgalmas kérdéseket vet fel, és feladatok elé állítja a mikrofluidikai iparágat. A kórokozók detektálása is DNS-vizsgálattal valósul meg, így kapcsolódik ez a céltevékenység is a mintaelőkészítés általános feladataihoz. Ezek közül dolgozatomban kettőre fókuszáltam, a sejtlízisre és a DNS tisztításra. Bemutattam a sejtlízis módszereit, megvizsgáltam a megvalósíthatóságukat a mi lehetőségeinket figyelembe véve, és választottam egy ionos detergenst alkalmazó kémiai módszert, amit a tervezett és elkészített eszközön ki is próbáltam. DNS izolálás módszereiről is adtam egy rövid átfogó képet, és ezek közül is választottam egy egyszerűt – szűrőmembránok chipbe applikálását –, aminek megvalósításával próbálkoztam. Az eszközök elkészültek és működésbe is léptek. Az első néhány prototípust a továbbiakban követhetik hatékonyabb eszközök is, ahogyan a műveletek elméletét és az anyagok tulajdonságait jobban megértve át tudjuk gondolni a terveket. Az integrált élelmiszervizsgáló chip elkészítése még sok belefektetett energiát igényel, aminek egy előkészítése ez a diplomaterv. Munkám eredményeként létrejöttek olyan rétegtechnológiás mintaelőkészítő chipek, melyek PDMS-ből és abba ágyazott szűrőmembránból készültek lézervágó gép segítségével. Passzív pumpás vezérlésükhöz 40 perc vákuumkezelés szükséges. Ezután az egy-egy cseppnyi, bemenetre helyezett minta és reagens a mintaelőkészítési folyamaton körülbelül 15 perc alatt végigmegy. A terméket a chipből pipettával kinyerve vizsgálhatjuk. Ezen a ponton kell megtervezni a reakciót végző modullal való összekötést. A diagnosztikai célú chipek három moduljának (mintaelőkészítés, reakció, detekció) egyike ekképpen – még ha a teljes folyamatot nem is képes végrehajtani – létrejött. A mérésekkel igazolt eredményeket tekintve összefoglalásul megállapítható, hogy a mintaelőkészítés egy részének megoldása megvalósult. A tervezett chipek működnek, a keverési és a szűrési lépéseknek az eszköz felépítése és geometriája eleget tesz. A sejtfeltárás azonban a lízispuffer hatástalansága miatt nem sikerült, ezért a tisztítási művelet hiába működött az elvárások szerint. A jövőben új kémiai módszert kell alkalmazni új sejtfeltáró oldattal, és a mintaelőkészítés teljesebbé tételén kell munkálkodni. Az élelmiszerminták

42

hosszú előfeldolgozó (homogenizáló, szelektáló, dúsító) folyamatait időben rövidíteni kellene, és az eszközt is alkalmassá kell tenni a komplexebb, inkubálásokat is integráló feladatokra. Munkám során tehát ismertettem a DNS-alapú diagnosztikai vizsgálatokhoz szükséges mintaelőkészítési feladatok mikrofluidikai implementációit, definiáltam a LAMP-PCR DNS sokszorozáshoz szükséges mintaelőkészítési folyamat mikrofluidikai chipen megvalósítandó lépéseit, terveztem a fent definiált lépéseket megvalósító biológiai minta előkészítésére alkalmas mikrofluidikai chipet, létrehoztam gyors prototipizálási eljárással a tervezett eszközt, végül elvégeztem a tervezett eszközök mérését és a mérési eredmények kiértékelését.

43

7. Köszönetnyilvánítás Munkám során sok segítséget kaptam dr. Iván Kristóftól, a témavezetőmtől, aki idejét nem sajnálva még munkaidőn kívül is készségesen magyarázott vagy éppen összeszerelt nekem egy mikroszkópot, egy kamerát vagy amit éppen nem tudtam – köszönet érte! Hartdégen Mártonnak is köszönöm az ötletadó beszélgetéseket, a kapcsolatépítésben nyújtott segítséget és a tapasztalatainak az átadását. Köszönöm dr. Gáspári Zoltánnak és Szenthe Borbálának, hogy az ITK Mikrobiológiai Laborjának egy-egy eszközét rendelkezésemre bocsátották, illetve köszönöm, hogy a feltett kérdéseimre válaszoltak, köszönöm a sejttenyésztésben nyújtott segítséget. Hálás vagyok dr. Belák Ágnes adjunktusnak a Budapesti Corvinus Egyetemről, aki az Élelmiszertudományi Kar Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék laboratóriumának világába bevezetett, és lehetőséget adott dolgoznom az anyagaikkal, eszközeikkel. Köszönöm Leelőssyné Tóth Eszter gondos korrektori munkáját, amivel figyelemmel kísérte a dolgozat alakulását. Az irodalomkutatásban is az ő tanácsait követve jutottam eredményhez. Markia Nóra és dr. Laki András József ötletei és technikai segítségei is hozzájárultak a dolgozat elkészültéhez. A hőkamerás felvételekhez az eszközt a Robotika Labortól kaptuk kölcsön, köszönöm a bizalmat. Végül pedig köszönet illeti a családtagjaimat és a barátaimat, akik végig bátorítottak a munkában, és ösztönöztek akkor is, amikor már fel akartam adni.

44

Irodalomjegyzék [1] X. J. Li and Y. Zhou, Microfluidic Devices for Biomedical Applications. Elsevier, 2013. [2] B. Lin, Microfluidics: Technologies and Applications. Springer, 2011. [3] E. Lagally, Microfluidics and Nanotechnology: Biosensing to the Single Molecule Limit. CRC Press, 2014. [4] I. K. Dimov, L. Basabe-Desmonts, J. L. Garcia-Cordero, B. M. Ross, A. J. Ricco, and L. P. Lee, “Stand-alone self-powered integrated microfluidic blood analysis system (SIMBAS),” Lab Chip, vol. 11, no. 5, pp. 845–850, 2011. [5] T.-R. Hsu, MEMS and Microsystems: Design, Manufacture, and Nanoscale Engineering. John Wiley & Sons, 2008. [6] A. Folch, Introduction to BioMEMS. Boca Raton, FL, USA: CRC Press, 2013. [7] J. Kim, M. Johnson, P. Hill, and B. K. Gale, “Microfluidic sample preparation: cell lysis and nucleic acid purification,” Integr. Biol., vol. 1, no. 10, p. 574, 2009. [8] M. Bowden, O. Geschke, J. P. Kutter, and D. Diamond, “CO2 laser microfabrication of an integrated polymer microfluidic manifold for the determination of phosphorus,” Lab. Chip, vol. 3, no. 4, p. 221, 2003. [9] C. C. Lee, G. A. McMillin, N. Babic, R. Melis, and K.-T. J. Yeo, “Evaluation of a CYP2C19 genotype panel on the GenMark eSensor® platform and the comparison to the Autogenomics InfinitiTM and Luminex CYP2C19 panels,” Clin. Chim. Acta, vol. 412, no. 11–12, pp. 1133–1137, May 2011. [10] M. R. Reed and W. A. Coty, “eSensor®A Microarray Technology Based on Electrochemical Detection of Nucleic Acids and Its Application to Cystic Fibrosis Carrier Screening,” in Microarrays, K. Dill, R. H. Liu, and P. Grodzinski, Eds. Springer New York, 2009, pp. 247–260. [11] V. M. Pierce and R. L. Hodinka, “Comparison of the GenMark Diagnostics eSensor Respiratory Viral Panel to Real-Time PCR for Detection of Respiratory Viruses in Children,” J. Clin. Microbiol., vol. 50, no. 11, pp. 3458–3465, Nov. 2012. [12] R. S. Liao, “Evaluation of the GenMark Diagnostics eSensor Thrombophilia Risk Test to Detect and Genotype MTHFR Polymorphisms C677T and A1298C,” J. Mol. Diagn., vol. 14, p. No. 6., 2012. [13] A. Niemz, T. M. Ferguson, and D. S. Boyle, “Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases,” Trends Biotechnol., vol. 29, no. 5, pp. 240–250, May 2011. [14] G. Huszka, “Implementation of a nucleic acid amplification process into microfluidic environment Témavezető / Supervisor: Dr. Iván Kristóf PPKE-ITK Info-bionika mérnöki MSc szak Info-bionics engineering MSc program 2014,” PPKE-ITK, 2014.

45

[15] M. Goto, E. Honda, A. Ogura, A. Nomoto, and K.-I. Hanaki, “Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue,” BioTechniques, vol. 46, no. 3, pp. 167–172, Mar. 2009. [16] “Gyors és molekuláris biológiai módszerek alkalmazása élelmiszerek mikrobiológiai vizsgálatára - Gyakorlati kézikönyv|Digital Textbook Library.” [Online]. Available: http://www.tankonyvtar.hu/en/tartalom/tamop425/0011_2A_6_modul/820/index.html. [Accessed: 07-Aug-2015]. [17] T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino, and T. Hase, “Loop-mediated isothermal amplification of DNA,” Nucleic Acids Res., vol. 28, no. 12, p. e63, Jun. 2000. [18] T. Notomi, Y. Mori, N. Tomita, and H. Kanda, “Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects,” J. Microbiol., vol. 53, no. 1, pp. 1–5, Jan. 2015. [19] R. Higuchi, G. Dollinger, P. S. Walsh, and R. Griffith, “Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences,” Biotechnol. Nat. Publ. Co., vol. 10, no. 4, pp. 413– 417, Apr. 1992. [20] J. D. Dean, P. H. Goodwin, and T. Hsiang, “Comparison of relative RT-PCR and northern blot analyses to measure expression of β-1, 3-glucanase inNicotiana benthamiana infected withColltotrichum destructivum,” Plant Mol. Biol. Report., vol. 20, no. 4, pp. 347–356, 2002. [21] M. Vincent, Y. Xu, and H. Kong, “Helicase-dependent isothermal DNA amplification,” EMBO Rep., vol. 5, no. 8, pp. 795–800, Aug. 2004. [22] O. Piepenburg, C. H. Williams, D. L. Stemple, and N. A. Armes, “DNA Detection Using Recombination Proteins,” PLoS Biol., vol. 4, no. 7, Jul. 2006. [23] J. Qiao, J. Wang, Q. Meng, G. Wang, Y. Liu, Z. He, H. Yang, Z. Zhang, X. Cai, and C. Chen, “Rapid detection of Akabane virus by a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay (RT-LAMP),” Virol. J., vol. 10, p. 288, Sep. 2013. [24] T.-H. Kim, J. Park, C.-J. Kim, and Y.-K. Cho, “Fully Integrated Lab-on-a-Disc for Nucleic Acid Analysis of Food-Borne Pathogens,” Anal. Chem., vol. 86, no. 8, pp. 3841–3848, Apr. 2014. [25] T. D. Rane, L. Chen, H. C. Zec, and T.-H. Wang, “Microfluidic continuous flow digital loop-mediated isothermal amplification (LAMP),” Lab Chip, vol. 15, no. 3, pp. 776–782, 2015. [26] D. Varapula, S. Gutta, M. G. Mauk, and C. Liu, “A highly-simplified nucleic-acid microfluidic test device based on capillary wicking action for point-of-care diagnostics,” in Biomedical Engineering Conference (NEBEC), 2015 41st Annual Northeast, 2015, pp.

46

1–2. [27] S.-J. Wu and C. I. Kado, “Preparation of milk samples for PCR analysis using a rapid filtration technique,” J. Appl. Microbiol., vol. 96, no. 6, pp. 1342–1346, Jun. 2004. [28] H. a. Powell, C. m. Gooding, S. d. Garrett, B. m. Lund, and R. a. Mckee, “Proteinase inhibition of the detection of Listeria monocytogenes in milk using the polymerase chain reaction,” Lett. Appl. Microbiol., vol. 18, no. 1, pp. 59–61, Jan. 1994. [29] J. Bickley, J. k. Short, D. g. McDowell, and H. c. Parkes, “Polymerase chain reaction (PCR) detection of Listeria monocytogenes in diluted milk and reversal of PCR inhibition caused by calcium ions,” Lett. Appl. Microbiol., vol. 22, no. 2, pp. 153–158, Feb. 1996. [30] P. K. Yuen, “Microchip Module for Blood Sample Preparation and Nucleic Acid Amplification Reactions,” Genome Res., vol. 11, no. 3, pp. 405–412, Mar. 2001. [31] J. T. Nevill, R. Cooper, M. Dueck, D. N. Breslauer, and L. P. Lee, “Integrated microfluidic cell culture and lysis on a chip,” Lab. Chip, vol. 7, no. 12, pp. 1689–1695, Dec. 2007. [32] B. Gellin and C. Broome, “Listeriosis,” JAMA, no. 261, pp. 1313–20, 1981. [33] D. Liu, Handbook of Listeria Monocytogenes. CRC Press, 2008. [34] “4/1998. (XI. 11.) EüM rendelet - az élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések

megengedhető

mértékéről.”

[Online].

http://net.jogtar.hu/jr/gen/hjegy_doc.cgi?docid=99800004.EUM.

[Accessed:

Available: 28-Nov-

2015]. [35] K. Williamson and K. Masters, Macroscale and Microscale Organic Experiments. Cengage Learning, 2010. [36] H. Takamatsu, R. Takeya, S. Naito, and H. Sumimoto, “On the mechanism of cell lysis by deformation,” J. Biomech., vol. 38, no. 1, pp. 117–124, Jan. 2005. [37] D. D. Carlo, K.-H. Jeong, and L. P. Lee, “Reagentless mechanical cell lysis by nanoscale barbs in microchannels for sample preparation,” Lab. Chip, vol. 3, no. 4, pp. 287–291, Nov. 2003. [38] J. Kim, S. Hee Jang, G. Jia, J. V. Zoval, N. A. Da Silva, and M. J. Madou, “Cell lysis on a microfluidic CD (compact disc),” Lab. Chip, vol. 4, no. 5, pp. 516–522, Oct. 2004. [39] T. C. Marentis, B. Kusler, G. G. Yaralioglu, S. Liu, E. O. Haeggström, and B. T. KhuriYakub, “Microfluidic sonicator for real-time disruption of eukaryotic cells and bacterial spores for DNA analysis,” Ultrasound Med. Biol., vol. 31, no. 9, pp. 1265–1277, Sep. 2005. [40] K. R. Rau, P. A. Quinto-Su, A. N. Hellman, and V. Venugopalan, “Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects,” Biophys. J., vol. 91, no. 1, pp. 317–329, Jul. 2006. [41] X. Bossuyt, G. E. Marti, T. A. Fleisher, and others, “Comparative analysis of whole blood

47

lysis methods for flow cytometry,” Cytometry, vol. 30, no. 3, pp. 124–133, 1997. [42] E. Cadman, J. R. Bostwick, and J. Eichberg, “Determination of protein by a modified Lowry procedure in the presence of some commonly used detergents,” Anal. Biochem., vol. 96, no. 1, pp. 21–23, Jul. 1979. [43] C. M. de Jongh, M. M. Verberk, S. W. Spiekstra, S. Gibbs, and S. Kezic, “Cytokines at different stratum corneum levels in normal and sodium lauryl sulphate-irritated skin,” Skin Res. Technol., vol. 13, no. 4, pp. 390–398, Nov. 2007. [44] M. M. Rahman and A. Elaissari, “Nucleic acid sample preparation for in vitro molecular diagnosis: from conventional techniques to biotechnology,” Drug Discov. Today, vol. 17, no. 21–22, pp. 1199–1207, Nov. 2012. [45] J. Hunger, R. Neueder, R. Buchner, and A. Apelblat, “A Conductance Study of Guanidinium Chloride, Thiocyanate, Sulfate, and Carbonate in Dilute Aqueous Solutions: Ion-Association and Carbonate Hydrolysis Effects,” J. Phys. Chem. B, vol. 117, no. 2, pp. 615–622, Jan. 2013. [46] J. C. Stachowiak, E. E. Shugard, B. P. Mosier, R. F. Renzi, P. F. Caton, S. M. Ferko, J. L. Van de Vreugde, D. D. Yee, B. L. Haroldsen, and V. A. VanderNoot, “Autonomous microfluidic sample preparation system for protein profile-based detection of aerosolized bacterial cells and spores,” Anal. Chem., vol. 79, no. 15, pp. 5763–5770, Aug. 2007. [47] J. Heo and R. M. Crooks, “Microfluidic biosensor based on an array of hydrogelentrapped enzymes,” Anal. Chem., vol. 77, no. 21, pp. 6843–6851, Nov. 2005. [48] S. A. Ballal, P. Veiga, K. Fenn, M. Michaud, J. H. Kim, C. A. Gallini, J. N. Glickman, G. Quéré, P. Garault, C. Béal, M. Derrien, P. Courtin, S. Kulakauskas, M.-P. Chapot-Chartier, J. van H. Vlieg, and W. S. Garrett, “Host lysozyme-mediated lysis of Lactococcus lactis facilitates delivery of colitis-attenuating superoxide dismutase to inflamed colons,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 112, no. 25, pp. 7803–7808, Jun. 2015. [49] K. Zhu, H. Jin, Y. Ma, Z. Ren, C. Xiao, Z. He, F. Zhang, Q. Zhu, and B. Wang, “A continuous thermal lysis procedure for the large-scale preparation of plasmid DNA,” J. Biotechnol., vol. 118, no. 3, pp. 257–264, Aug. 2005. [50] K. H. Cheong, D. K. Yi, J.-G. Lee, J.-M. Park, M. J. Kim, J. B. Edel, and C. Ko, “Gold nanoparticles for one step DNA extraction and real-time PCR of pathogens in a single chamber,” Lab. Chip, vol. 8, no. 5, pp. 810–813, May 2008. [51] Y.-K. Cho, J.-G. Lee, J.-M. Park, B.-S. Lee, Y. Lee, and C. Ko, “One-step pathogen specific DNA extraction from whole blood on a centrifugal microfluidic device,” Lab. Chip, vol. 7, no. 5, pp. 565–573, May 2007. [52] T. Grahl and H. Märkl, “Killing of microorganisms by pulsed electric fields,” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 45, no. 1–2, pp. 148–157, Mar. 1996.

48

[53] H.-Y. Wang, A. K. Bhunia, and C. Lu, “A microfluidic flow-through device for high throughput electrical lysis of bacterial cells based on continuous dc voltage,” Biosens. Bioelectron., vol. 22, no. 5, pp. 582–588, Dec. 2006. [54] D. Di Carlo, C. Ionescu-Zanetti, Y. Zhang, P. Hung, and L. P. Lee, “On-chip cell lysis by local hydroxide generation,” Lab. Chip, vol. 5, no. 2, pp. 171–178, Feb. 2005. [55] “Molekuláris

sejtbiológia|Digital

Textbook

Library.”

[Online].

Available:

http://www.tankonyvtar.hu/en/tartalom/tamop425/2011_0001_528_Szeberenyi_Molekular is_sejtbiologia/ch08.html. [Accessed: 28-Nov-2015]. [56] C. W. Price, D. C. Leslie, and J. P. Landers, “Nucleic acid extraction techniques and application to the microchip,” Lab. Chip, vol. 9, no. 17, p. 2484, 2009. [57] J. F. Regan, M. R. Furtado, M. G. Brevnov, and J. A. Jordan, “A Sample Extraction Method for Faster, More Sensitive PCR-Based Detection of Pathogens in Blood Culture,” J. Mol. Diagn., vol. 14, no. 2, pp. 120–129, Mar. 2012. [58] R. M. McCormick, “A Solid-Phase Extraction Procedure for DNA Purification,” Analytical Biochemistry, pp. 66–74, 1989. [59]P. R. Levison, S. E. Badger, J. Dennis, P. Hathi, M. J. Davies, I. J. Bruce, and D. Schimkat, “Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification,” J. Chromatogr. A, vol. 816, no. 1, pp. 107–111, Aug. 1998. [60] R. M. Daniel and D. J. Saul, “Thermostable proteinases from thermophilic bacteria,” US7547510 B2, 16-Jun-2009. [61] D. Moss, S. A. Harbison, and D. J. Saul, “An easily automated, closed-tube forensic DNA extraction procedure using a thermostable proteinase,” Int. J. Legal Med., vol. 117, no. 6, pp. 340–349, Dec. 2003. [62] P. S. Walsh, D. A. Metzger, and R. Higuchi, “Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material,” BioTechniques, vol. 10, no. 4, pp. 506–513, Apr. 1991. [63] M. G. Elgort, M. G. Herrmann, M. Erali, J. D. Durtschi, K. V. Voelkerding, and R. E. Smith, “Extraction and amplification of genomic DNA from human blood on nanoporous aluminum oxide membranes,” Clin. Chem., vol. 50, no. 10, pp. 1817–1819, Oct. 2004. [64] J. Kim, K. V. Voelkerding, and B. K. Gale, “Patterning of a nanoporous membrane for multi-sample DNA extraction,” J. Micromechanics Microengineering, vol. 16, no. 1, p. 33, 2006. [65] E. Berthier, E. W. K. Young, and D. Beebe, “Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia,” Lab. Chip, vol. 12, no. 7, pp. 1224–1237, Mar. 2012. [66] M. Hartdégen, “Vákuum-vezérelt passzív pumpákkal működtetett mikrofluidikai rendszerek analízise,” PPKE-ITK, 2014.

49

[67] “NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer V1.0 User Manual.” Thermo Fisher Scientific Inc., 2009.

50