Milieurisicoanalyse bij de aanvraag IM Datum: 12 oktober 2012

Milieurisicoanalyse bij de aanvraag IM 12-001 Datum: 12 oktober 2012 De milieurisicoanalyse is onder verantwoordelijkheid van het Ministerie van Volkshuisvesting Ruimtelijke Ordening en Milieubeheer uitgevoerd overeenkomstig bijlage II van de Richtlijn 2001/18/EG inzake de doelbewuste introductie van genetisch gemodificeerde organismen in het milieu en het richtsnoer 2002/623/EG ter aanvulling van deze bijlage II. Daarbij is rekening gehouden met de uitwerking op het milieu van de geïntroduceerde organismen en het milieu waarin wordt geïntroduceerd. De milieurisicobeoordeling neemt zowel directe als indirecte, de onmiddellijk en de vertraagd optredende risico’s voor de menselijke gezondheid en het milieu in beschouwing, die de doelbewuste introductie met zich mee kan brengen. Bij de milieurisicobeoordeling moeten de potentiële schadelijke effecten van geïdentificeerde kenmerken van het GGO worden vergeleken met die van het ongemodificeerde organisme waaruit het GGO is afgeleid. Daarbij worden de omstandigheden van het voorgenomen gebruik in aanmerking genomen. De beoordeling moet per geval worden uitgevoerd, wat betekent dat de vereiste informatie kan verschillen afhankelijk van het betrokken GGO en het voorgenomen gebruik daarvan. Opgemerkt moet worden dat voor studies met mensen niet primair het risico voor de patiënt wordt getoetst. Deze toets wordt sinds het in werking treden van de Wet medisch wetenschappelijk onderzoek met mensen beoordeeld door de Centrale Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO). Voor studies met dieren geldt dat het welzijn van de dieren en de hiermee verband houdende ethische overwegingen getoetst wordt door de Commissie Biotechnologie bij Dieren (CBD). De milieurisicoanalyse van de aangevraagde werkzaamheden bestaat uit de volgende delen. Deel 1 bevat een samenvatting van de gegevens zoals die zijn aangeleverd door de aanvrager. Deze gegevens dienen als basis van de milieurisicoanalyse van het dossier zoals deze volgt uit de kenmerken van de GGO’s en de voorgestelde wijze van introductie. Deel 2 geeft de milieurisicoanalyse voor de introductie in het milieu van het GGO. Hierbij wordt per sequentie bepaald hoe de nieuwe kenmerken van het GGO eventueel schadelijke effecten kunnen hebben voor het milieu. De milieurisicobeoordeling wordt uitgevoerd conform de Europese Richtlijn 2001/18/EG, volgens de methodologie beschreven in bijlage II van deze Richtlijn. De Richtlijn geeft een overzicht van de kenmerken die beoordeeld moeten worden om de schadelijke gevolgen voor het milieu in kaart te brengen. De Richtlijn is algemeen gericht op de introductie in het milieu, en niet specifiek bedoeld voor klinisch onderzoek met GGOs bij mens of dier. De Richtlijn bevat daardoor beoordelingskenmerken die voor een GGO voor klinische toepassing niet of minder relevant zijn. Voordat invulling wordt gegeven aan de milieurisicobeoordeling van een GGO dat toegepast wordt in een klinische studie bij mens of dier wordt een overzicht gegeven van kenmerken uit bijlage II van de Richtlijn die hiervoor relevant worden geacht. In onderdeel C2 van bijlage II van de Richtlijn wordt een aantal mogelijke schadelijke effecten opgesomd. Hieronder wordt een kort overzicht gegeven van de in de Richtlijn genoemde aspecten. Hierbij wordt in algemene bewoordingen beschreven of het genoemde kenmerk al dan niet van belang is bij de beoordeling van de werkzaamheden. Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 1 / 32

In dit document volgt een nadere toelichting op de beoordelingsaspecten waarbij de Richtlijn en de bijbehorende toelichting fungeren als startpunt.

I.

Ziekten bij de mens, met inbegrip van allergische en toxische effecten. Het is van belang na te gaan in hoeverre de toepassing van het GGO kan leiden tot het ontstaan van ziekten. Hierbij moeten de ziekteverwekkende eigenschappen van het GGO worden vergeleken met die van het uitgangsorganisme. Van de meeste ziekteverwekkende organismen is de pathogeniteit bekend. De pathogeniteit van het uitgangsorganisme is een belangrijk uitgangspunt. Omdat de ziekteverwekkende eigenschappen van een GGO niet enkel worden bepaald door de pathogeniteit van het uitgangsorganisme worden ook de genetische modificatie en de toepassing in beschouwing genomen. In de Richtlijn worden diverse beoordelingsaspecten genoemd welke de ziekteverwekkende eigenschappen van een GGO kunnen beïnvloeden. Deze beoordelingsaspecten worden later in deze notitie nader toegelicht.

II. Ziekten bij dieren en planten, met inbegrip van allergische en toxische effecten. Omdat in klinische studies toegepaste GGO’s veelal zijn afgeleid van uitgangsorganismen die niet in staat zijn een plantaardige gastheer te infecteren wordt verondersteld dat deze GGO’s bij planten geen ziekten kunnen veroorzaken. Mochten er in een voorkomend geval toch overwegingen zijn bij de combinatie gastheer/gekloneerde genen die betrekking hebben op de plantpathogeniteit, dan worden deze alsnog in beschouwing genomen. Voor ziekten bij dieren geldt een overeenkomstige argumentatie als verwoord onder het kopje ziekten bij de mens. In de notitie worden ziekten bij de mens en ziekten bij dieren gezamenlijk behandeld.

III. Effecten op de populatiedynamiek van soorten binnen het milieu en effecten op de genetische diversiteit van elk van die populaties. Effecten op patiënten of proefdieren welke optreden ten gevolge van de toediening van een GGO behoren niet tot het wettelijke kader waarbinnen de milieurisicobeoordeling wordt uitgevoerd. Effecten op patiënten of proefdieren vallen onder de medische verantwoordelijkheid van de behandelend (dieren)arts en worden in het geval van klinische studies bij mensen beoordeeld door de CCMO. Echter, effecten op mens en dier in de omgeving van patiënt of proefdier (niet doelpopulaties) kunnen afgeleid worden uit de effecten die mogelijk kunnen optreden bij de patiënt / proefdier. Daarom worden effecten op de doelpopulatie in de overwegingen betrokken waarbij in vervolgens nagegaan moet worden in hoeverre derden met het GGO in contact komen en als dit het geval is wat de kans is dat effecten optreden.

IV. Gewijzigde gevoeligheid voor ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van besmettelijke ziekten wordt vergemakkelijkt en/of nieuwe reservoirs of vectoren worden gecreëerd. Gevoeligheid voor ziekteverwekkers is van groot belang bij de beoordeling van genetisch gemodificeerde planten en andere hogere organismen. De gevoeligheid voor ziekteverwekkers van micro-organismen is niet van toepassing bij de beoordeling van genetisch gemodificeerde virussen, virale vectoren en bacteriën.

V. Het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische medische en veterinaire behandelingen. Als voorbeeld noemt de Richtlijn hierbij het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische medische, veterinaire of plantenbeschermingsbehandelingen, door het ontstaan van antibioticumresistentie door genoverdracht. Ten aanzien van de genoemde plantbeschermingsbehandelingen gelden dezelfde overwegingen als die werden genoemd in het kader van ziekten bij planten, in paragraaf II. Om deze reden worden effecten op plantenbeschermingsbehandelingen niet in de milieurisicobeoordeling opgenomen. Het in gevaar brengen van medische en veterinaire behandelingen wordt later uitgewerkt voor specifieke aspecten behorend bij de betreffende studie.

VI. Effecten op biogeochemische cycli. Met betrekking tot de effecten op biogeochemische cycli moet met name ingegaan worden op recycling van koolstof en stikstof uit organisch materiaal in de bodem. Van een GGO dat in een klinische studie bij mens of dier wordt toegepast kan over het algemeen uitgesloten worden dat zij gedurende langere tijd buiten een gastheer overleven in het milieu. Alleen indien overleving gedurende langere tijd mogelijk is en er een interactie kan plaatsvinden met organismen in de bodem die een rol spelen in deze processen zou dit aspect in de beoordeling van belang moeten zijn. Organismen die toegepast worden in klinische studies die langere tijd overleven buiten een gastheer en een interactie hebben met organismen in de bodem zijn niet eerder toegepast in klinische studies. Bij de beoordeling van de risico’s voor mens en milieu van GGO’s zal dit beoordelingsaspect over het algemeen niet uitgewerkt worden.

Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 2 / 32

In de bovenstaande onderdelen I tot en met VI wordt een overzicht gegeven van de beoordelingsaspecten zoals deze uit Richtlijn 2001/18/EG zijn afgeleid. Niet alle beschreven onderdelen zijn van belang bij de beoordeling van klinische studies met mensen of dieren. De relevante onderdelen worden hieronder nader uitgewerkt en vertaald naar de beoordelingspraktijk van klinisch onderzoek. Hiertoe zijn sommige onderdelen samengevoegd en wordt toegelicht welke nadere invulling bij de beoordeling aan deze onderdelen gegeven wordt. Ziekten bij mens en dier (toelichting op onderdeel I, II en IV) De onderstaande uitwerking gaat in op de aspecten die van belang zijn voor de beoordeling van de mogelijke schadelijke effecten van een GGO op mens en milieu, waarbij de nadruk ligt op ziekten bij mens en dier. Uitgangspunt is dat ziekten bij patiënt of proefdier die ten gevolge van toepassing van het GGO kunnen ontstaan in beginsel geen deel uit maken van de beoordeling. Bij de beoordeling wordt wel ingegaan op schadelijke effecten die op kunnen treden bij de patiënt of het proefdier (de ‘doelpopulatie’), maar dan alleen omdat de effecten die in de doelpopulatie worden waargenomen indicatief zijn voor effecten die buiten de doelpopulatie kunnen optreden als verspreiding van het GGO in het milieu plaatsvindt. Het is niet vanzelfsprekend dat effecten op de doelpopulatie ook in het milieu kunnen optreden. In dit kader zijn verspreiding in het milieu en blootstelling van derden van belang. Als verspreiding in het milieu en dus blootstelling niet kan plaatsvinden is het zeer onwaarschijnlijk dat de toepassing een gezondheidsrisico vormt voor mens en milieu. In zo’n situatie worden de ziekteverwekkende eigenschappen die eventueel waargenomen worden in de studiepopulatie minder zwaarwegend. Als verspreiding in het milieu en blootstelling kan plaatsvinden dan moet beoordeeld worden welke effecten ten gevolge hiervan kunnen optreden. In zo’n situatie is een effect op de studiepopulatie indicatief. In het geval dat verspreiding in het milieu en blootstelling niet uitgesloten kan worden, worden verschillende aan de levenscyclus van het GGO verbonden kenmerken in beschouwing genomen. Het betreft de volgende kenmerken: pathogeniteit en virulentie, infectiviteit, gastheerbereik en tropisme, replicatie en transmissie en toxigeniteit en allergeniteit. Pathogeniteit en virulentie (onderdeel A in Tabel 2) Pathogeniteit van de uitgangsorganismen vormt een uitgangspunt voor de beoordeling van het pathogene potentieel van een GGO. Pathogenese omvat de mechanismen waarmee organismen zoals bijvoorbeeld virussen of bacteriën bepaalde celpopulaties in een specifieke gastheer en een bepaald weefsel kunnen beschadigen waardoor ziekteverschijnselen in deze gastheer kunnen ontstaan. Het vermogen van een pathogeen organisme om een ziekte te veroorzaken in een gastheer noemt men virulentie. Pathogenese en virulentie zijn twee nauw samenhangende begrippen die bij een beoordeling uitgesplitst worden in verschillende factoren die pathogeniteit en virulentie beïnvloeden. In principe kan alle nieuwe genetische informatie een effect hebben op de pathogeniteit en de virulentie. Om deze reden wordt van een GGO elke toegevoegde dan wel gedeleteerde sequentie bij de beoordeling betrokken. Infectiviteit (onderdeel A in Tabel 2) Infectiviteit neemt in de milieurisicobeoordeling van een GGO een belangrijke plaats in. Bij de beoordeling van de mogelijke schadelijke effecten die op kunnen treden in het milieu wordt eerst beoordeeld in hoeverre het GGO eigenschappen bezit die mogelijk een effect hebben in een geïnfecteerde gastheer. Als deze effecten niet geïdentificeerd kunnen worden is de beoordeling van de infectiviteit minder van belang. Als schadelijke effecten op kunnen treden in de patiënt of het proefdier en verspreiding van het GGO in het milieu kan niet uitgesloten worden, dan is beoordeling van de infectiviteit van belang. Gastheerbereik en tropisme (onderdeel A in Tabel 2) Wanneer een donorsequentie wordt ingebracht, kan een eiwit tot expressie komen dat een effect heeft op het tropisme en het gastheerbereik van het GGO in vergelijking met gastheerbereik en tropisme van het uitgangsorganisme. Dit kan tot gevolg hebben dat het tropisme en het gastheerbereik van het uitgangsorganisme veranderen. In gevallen dat een dergelijk scenario niet uitgesloten kan worden, dan moet in de risicobeoordeling rekening gehouden worden met een additioneel risico. Vervolgens moet nagegaan worden of een eiwit dat tot expressie komt ook daadwerkelijk functioneel is in de (virale) vector. Indien niet uitgesloten kan worden dat er een verandering optreedt in het gastheerbereik en tropisme van de vector, zal dit niet automatisch betekenen dat er ook sprake is van een gewijzigde pathogeniteit. Wel moet het risico in beschouwing genomen worden dat mogelijk andere cellen, weefsels, organen of zelfs gastheren geïnfecteerd kunnen worden en hierdoor schadelijke effecten ondervinden die normaal gesproken niet mogelijk zou zijn geweest zonder de toepassing van genetische modificatie.


Pagina 3 / 32

Replicatie en transmissie (onderdeel A in Tabel 2) Onder replicatie en transmissie verstaat men respectievelijk vermeerdering en verspreiding. Bij de beoordeling van de risico’s voor mens en milieu moet nagegaan worden of het GGO dat aan patiënt of proefdier wordt toegediend kan repliceren. In eerste instantie moet beoordeeld worden of de vector autonoom kan repliceren. De meeste vectoren die worden toegepast in klinische studies zijn replicatiedeficiënt . Replicatiedeficiënt ie berust veelal op de afwezigheid van een essentieel genproduct waarvan de sequentie in de vector ontbreekt of niet (functioneel) tot expressie komt. Nagegaan moet worden of de replicatiedeficiënt ie kan worden hersteld bijvoorbeeld door homologe recombinatie met in de patiënt aanwezige organismen. Als replicatie kan optreden moet nagegaan worden of de vector zich kan verspreiden. In dit kader zijn gegevens over biodistributie van belang. Tot slot moet beoordeeld worden via welke transmissieroutes verspreiding in het milieu kan plaatsvinden en in welke mate dit kan plaatsvinden. Verspreiding in het milieu is een noodzakelijke stap op weg naar blootstelling van derden en het milieu. Als schadelijke effecten op kunnen treden in de patiënt of het proefdier en verspreiding van het GGO in het milieu kan niet uitgesloten worden, dan is beoordeling van de replicatie en transmissie van belang. Toxigeniteit en allergeniteit (onderdeel D in Tabel 2) Indien verspreiding van het GGO in het milieu kan optreden is het van belang te evalueren welke schadelijke effecten kunnen optreden. Hierbij moet nagegaan worden in hoeverre het GGO schadelijke sequenties bezit en tot expressie kan brengen. Belangrijke ijkpunten hierbij zijn toxiciteit en allergeniteit van het genproduct. Genoverdracht naar andere organismen (onderdeel C in Tabel 2) Erfelijke informatie van een GGO kan overgedragen worden op andere in het milieu aanwezige organismen die direct of indirect in contact komen met het GGO. Bij de beoordeling wordt nagegaan in hoeverre erfelijke informatie van het GGO overgedragen kan worden op andere micro-organismen (bijvoorbeeld een aan de vector verwant organisme). Zo’n proces kan plaatsvinden middels homologe recombinatie. Daarnaast moet beoordeeld worden in hoeverre erfelijke informatie van het GGO via de kiembaan overgedragen kan worden op het nageslacht. Overdracht van erfelijke informatie op zichzelf hoeft niet altijd te leiden tot een gevaar voor mens en milieu. Als overdracht kan optreden maar er geen negatieve effecten geïdentificeerd kunnen worden is er geen sprake van een milieurisico. De overheid heeft besloten dat overdracht via de kiembaan op het nageslacht in alle gevallen voorkomen moet worden, onafhankelijk van de vraag of er daarbij schadelijke effecten kunnen optreden.

Veranderingen van populatiedynamiek in natuurlijke milieu’s (toelichting op onderdeel III) Genetisch gemodificeerde organismen die in klinische studies toegepast worden kunnen ook een effect hebben op het voorkomen van andere (hogere) organismen en zodoende een effect hebben op de populatiedynamiek. Een illustratief voorbeeld betreft een doelbewuste introductie in het milieu van een virulent myxomavirus in de gevoelige populatie van Europese konijnen in Australië. Aanvankelijk waren de gevolgen desastreus voor de konijnenpopulatie. Maar uiteindelijk ontstonden er virusvarianten met een verminderde virulentie maar ook konijnen met een verhoogde resistentie tegen het virus. Dit voorbeeld illustreert dat een verandering van in de natuur aanwezige micro-organismen ook een effect kan hebben op de gastheer (konijn). Ook een veranderde eigenschap van het gastheerorganisme ten gevolge van genetische modificatie zou een dergelijk effect kunnen veroorzaken. Op deze aspecten wordt, indien het voor de specifieke beoordeling relevant is, ingegaan in onderdeel G van Tabel 2.

Het in gevaar brengen van preventieve of therapeutische behandelmethoden (toelichting op onderdeel V) Veranderde eigenschappen van een organisme ten gevolge van genetische modificatie kan mogelijk tot gevolg hebben dat dit organisme ziekte kan veroorzaken. Als hierdoor de op dat moment geldende medische praktijk direct of indirect niet meer toegepast kan worden voor behandeling van deze ziekten, of wanneer preventieve behandeling niet meer werkt is er sprake van een negatief effect voor het milieu. Daarom moet, als vastgesteld wordt dat een GGO mogelijk ziekteverwekkende eigenschappen bezit, in beschouwing genomen worden welke therapeutische behandelmethoden beschikbaar zijn om de ziekte te bestrijden of te voorkomen. Indien de genetische modificatie de therapeutische behandeling van de ziekte bemoeilijkt of zelfs in gevaar brengt, moet dit in de risicobeoordeling meegewogen worden. Er kan tijdens de beoordeling ook vastgesteld worden dat het ontstaan van ziekte onwaarschijnlijk is, in dat geval kan mogelijk afgezien worden van een beoordeling van de mogelijke effecten op preventieve en therapeutische behandelmethoden. Op deze aspecten wordt ingegaan in onderdeel H van Tabel 2.


Pagina 4 / 32

In de Richtlijn 2001/18/EG wordt, na de vaststelling van de beoordelingsaspecten, een methodologie voor de risicoanalyse ontwikkeld. Deze methodologie wordt gevolgd in de tabellen in deel 2. De mogelijk schadelijke effecten die samen kunnen hangen met de nieuw ingebrachte sequenties worden toegelicht. Daarbij worden de verschillende stappen in de “oorzaak-gevolg” relaties tussen de genetische modificatie en het eventuele schadelijke effect verduidelijkt. Zo wordt bepaald welke effecten eventueel toe te schrijven zijn aan de genetische modificatie. Vervolgens volgt de evaluatie van de eventuele omvang en de waarschijnlijkheid van de schadelijke gevolgen. Redenen voor het niet verder in de milieurisicoanalyse beschouwen van mogelijke schadelijke effecten worden verduidelijkt. In Deel 3 vindt tenslotte de bepaling van het algehele risico van het GGO plaats. Deze bepaling wordt gedaan op basis van de risico’s die in Deel 2 zijn geïdentificeerd, waarbij rekening wordt gehouden met de mogelijkheid dat er stapeling van risico’s plaatsvindt, in het bijzonder als de risico’s niet onafhankelijk van elkaar zijn.


Pagina 5 / 32

Milieurisicoanalyse behorend bij aanvraag IM 12-001 Titel aanvraag: MVA-based recombinant influenza vaccines encoding influenza virus hemagglutinins. DEEL 1. KENMERKEN VAN DE IN DEZE AANVRAAG GEBRUIKTE GGO’S EN HUN INTRODUCTIE Samenvatting van de gegevens zoals die zijn aangeleverd door de aanvrager. Deze gegevens dienen als basis voor de milieurisicoanalyse van de aangevraagde werkzaamheden en bestaan uit de relevante technische en wetenschappelijke details van de GGO’s en de voorgestelde wijze van introductie. Hierbij wordt rekening gehouden de informatievereisten zoals genoemd in bijlage III en in het bijzonder bijlage IIIA van Richtlijn 2001/18/EC. De vindplaats van de informatie in het dossier is tussen haakjes aangegeven. Informatie van bureau GGO is met een asterisk (*) aangegeven. A. Het ouderorganisme, i.c. de gebruikte virale vector 1. De recombinante vectoren die zullen worden toegepast zijn gebaseerd op de pokkenvirus vector Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) (A1.3). 2. MVA heeft een historie van veilig gebruik in zowel klinische en vaccinatiestudies. Tot op heden is MVA nog niet met ernstige bijwerkingen in deze studies geassocieerd. MVA is in het verleden aan meer dan 120.000 personen toegediend als pokkenvaccin en is veilig gebleken (A3.1) 3. MVA is een verzwakte vorm van het koepokkenvirus Chorioallantoic vaccinia virus Ankara (CVA) die is ontstaan door CVA 516 maal te passeren op kippen embryonale fibroblasten (CEF cellen) (A2.7). 4. MVA-F6 betreft een clonaal isolaat van MVA verkregen op passage 580 in CEF cellen vanuit een standaard zaaivirus stock (passage 572 van MVA) (A2.1, A2.7). 5. MVA-F6-sfMR is verkregen door het seriel passeren van MVA-F6 onder serum-vrije condities (A2.1, A2.7). 6. MVA is niet pathogeen voor mensen en zoogdieren, zelfs wanneer deze immuungecompromitteerd zijn (A2.3, A2.8, A3.1). 7. MVA toediening is veilig gebleken in HIV geïnfecteerden, kankerpatiënten (ook in combinatie met andere therapieën) en in personen met een al een bestaande immuniteit tegen MVA (A3.1). 8. In Nederland worden handelingen met genetisch gemodificeerd MVA op ML-I inperkingsniveau ingeschaald (A1.3, A2.12). 9. Het Duitse comité voor biologische veiligheid staat het gebruik van MVA onder Biosafety level 1 toe. Voor bepaalde recombinante MVA virussen geldt hierbij de voorwaarde dat de replicatiedeficiëntie in humane cellen wordt bevestigd door laboratorium groei assay van het virus in Hela cellen (Hela Block assay). Deze test is niet nodig voor structurele virale antigenen die niet afkomstig zijn pokkenvirussen, aangezien het zeer onwaarschijnlijk is dat deze replicatie-deficientie van MVA zullen beïnvloeden (A2.3, A2.12). 10. Het Vaccinia virus heeft een dubbelstrengs DNA genoom van ongeveer 192 kilobasen (kb) (*). 11. Ten opzichte van CVA virus heeft MVA ongeveer 15% van het genetische materiaal verloren. Het gedeleteerde materiaal is gekarakteriseerd en bestaat uit 6 grote deleties en meerdere kleine deleties met een totale grootte van ongeveer 31 kilobasen (A2.7). 12. Als gevolg van deze deleties is het virus replicatie-deficient en apathogeen en door de aard en grootte van de deleties kan het virus niet meer terugveranderen naar een replicatie-competent fenotype (A2.4, A2.7). 13. De natuurlijke en oorspronkelijke gastheer van het vaccinia virus (koepokkenvirus) is onbekend. Vaccinia virus kan repliceren in runderen en de mens. Het vaccinia virus komt in Europa voornamelijk voor in Engeland. Het virus duikt sporadisch en seizoensgebonden op in met name koeien en katten. In West-Europa vormen knaagdieren zoals de bruine rat een mogelijk natuurlijk reservoir voor het koepokkenvirus. Er zijn voor vaccinia virussen geen gegevens over een specifiek weefsel- of celtropisme (*). Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 6 / 32

14. Infectie met het vaccinia virus worden meestal goed verdragen. Vaccinia virussen die in eerste instantie zijn gebruikt als vaccin tegen het pokkenvirus waren replicatie-competent in de mens. Een normale reactie op vaccinatie met vaccinia virus bestaat uit het ontstaan van papuleuze laesie in 3-4 dagen, die een blaasje wordt in 5-6 dagen. Na 12 dagen ontstaat een korst en na ongeveer 3 weken is de laesie genezen. Andere reacties die kunnen optreden zijn pijn en erytheem rond de vaccinatieplaats, malaise, locale lymfadenopathie, myalgie, hoofdpijn, koude rillingen, misselijkheid, moeheid en koorts. In uitzonderlijke gevallen kunnen ernstige en soms levensbedreigende complicaties optreden, zoals encefalitis (hersenvliesontsteking), Vaccinia Necrosum (progressieve necrose bij de vaccinatieplaats) en Eczema Vaccinatum (een ernstige bijwerking in personen met een historie van eczeem) (A3.1, *). 15. MVA heeft een zeer beperkt gastheerbereik en kan in tegenstelling tot CVA, niet repliceren in de meeste humane, zoogdieren vogel cellen en cellijnen (A2.2, A2.7, A3.1). 16. Pokkenvirussen inclusief MVA hebben een envelop. De zogenaamde “primaire intracellulaire virions” worden gevormd met één lipide membraan en verkrijgen in het trans-Golgi netwerk en het endosoom van de cel twee additionele lipide membranen. De aldus gevormde “intracellulaire enveloped virions” worden naar de periferie van de cel getransporteerd en fuseren met de celmembraan waarbij de buitenste membraan van het partikel wordt verloren en de uiteindelijke extracellulaire enveloped partikels met een dubbele membraan vrijkomen (A2.12). 17. In tegenstelling tot het normale vaccinia virus ontbreken in MVA belangrijke immuunonderdrukkende genen (zoals het K1L gen), waardoor het virus gemakkelijk door het immuunsysteem kan worden herkend en het de antivirale werking van bijvoorbeeld interferon type I of II niet kan tegenwerken. Hierdoor kunnen zich in een geïnfecteerde cel geen nieuwe viruspartikels vormen (A2.2, A2.3, aanvullende informatie 14-02-2012). 18. Het replicatie-defect in de meeste zoogdiercellen wordt gekarakteriseerd door een blokkade van de virale morfogenese door tenminste twee verschillende moleculaire mechanismen (A2.2, A2.3). 19. In de baby hamster nier cellijn BHK-21 kan MVA repliceren vanwege het ontbreken van de benodigde antivirale gastheermechanismen (innate immuunrespons) die MVA morphogenese blokkeren. Er bestaat gezien de replicatie van MVA in BHK-21 cellen een theoretisch risico dat MVA kan repliceren in hamsters. In een tweede goed gekarakteriseerde cellijn van hamster-oorsprong, Chinese Hamster Ovary cells (CHO), kan MVA echter niet repliceren. MVA repliceert dus in slechts 1 van de 2 hamster-afgeleide cellijnen en dan ook nog eens in de cellijn met verzwakt innate immuunsysteem. Het is dus hoogst onwaarschijnlijk dat MVA repliceert in hamsters die immuuncompetent zijn. (A2.2, aanvullende informatie 14-022012 en 20-03-2012). 20. In de konijnen niercellijn RK13 is replicatie van MVA in een vroeg stadium geblokkeerd, maar deze blokkade kan worden opgeheven door expressie van het vroege virale eiwit K1L (A2.2, aanvullende informatie 14-02-2012). 21. In humane cellen is een van de mechanismen achter de blokkade van virale morphogenese gekoppeld aan de antivirale acties van type I interferon (A2.3). 22. MVA is replicatiecompetent in CEF cellen en ook in cellijnen afgeleid van kippen-embryo fibroblasten (bijvoorbeeld zogenaamde DF-1 cellen) (A.2.2). 23. Er is aangetoond dat E3L een gen is dat het gastheer tropisme voor het MVA virus in kippen bepaald. Als dit gen, dat normaal aanwezig is in MVA wordt verwijderd is het virus niet meer in staat te repliceren in kippencellen (aanvullende informatie 14-02-2012). 24. Pluimvee is de meest waarschijnlijke gastheer voor MVA om in te repliceren en om ziekte te veroorzaken. Er is weinig bekend over replicatie en uitscheiding van MVA door kippen en andere vogelsoorten, maar het lijkt dat MVA ook in deze dieren (gedeeltelijk) replicatiedeficiënt is, gezien de beschikbare preklinische data met betrekking tot toepassing van (recombinant) MVA in kippen (A2.6, aanvullende informatie 14-02-2012). 25. Persistente vaccinia virus infecties in mensen zijn nog niet beschreven en genoom integratie van genetisch materiaal van welk vaccinia virus dan ook zijn nog niet eerder beschreven ondanks dat vaccinia wereldwijd op zeer grote schaal is toegepast (aanvullende informatie 14-02-2012). Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 7 / 32

26. Pokkenvirussen inclusief MVA kunnen niet in het genoom integreren. Dit vanwege het feit dat pokkenvirussen geen DNA integratiemechanismen bezitten en door de fysieke scheiding van het humane genoom (bevind zich in de kern) en het MVA genoom (bevind zich in het cytoplasma) in een geïnfecteerde cel. (A4.1, aanvullende informatie 14-02-2012) 27. Na injectie met MVA worden cellulaire en humorale immuniteit tegen het virus geïnduceerd (A1.3). 28. Bijwerkingen die zijn opgetreden na vaccinatie met MVA zijn over het algemeen mild en duren hoogstens enkele dagen. Bijwerkingen die na MVA vaccinatie zijn gemeld zijn roodheid, gevoeligheid, verharding of pijn van de injectieplaats en milde systemische symptomen zoals malaise, hoofdpijn, koorts, vermoeidheid, misselijkheid en braken (A2.13, A4.2). 29. Op de plek van intramusculaire injectie induceert MVA celdood van geïnfecteerde cellen vanwege het feit dat het virus de cellulaire transcriptie en daarmee de eiwitproductie tegenwerkt. Dit leidt tot milde myocyte degeneratie, necrose en regeneratie van spierweefsel (A3.1). 30. De beschikbare behandelmethode voor replicatie-competente pathogene vaccinia virussen is cidofivir. (A2.4, A2.13). 31. MVA kan zich in de mens niet vermenigvuldigen, waardoor geen actieve verspreiding van het virus in het lichaam kan optreden. Hierdoor is de kans op verspreiding naar en infectie van derden gereduceerd (A2.5, A2.14). 32. MVA kan mensen of dieren alleen via wondjes in de huid infecteren. Indien MVA in contact komt met de intacte huid kan geen infectie optreden (A4.3, aanvullende informatie 14-02-2012). 33. Vaccinia virussen inclusief MVA kunnen buiten de gastheer op oppervlakken 24 uur overleven (A2.6) 34. In aerosolvorm is bij kamertemperatuur en een relatieve vochtigheid van 48-51% de infectieuze titer van deze virussen na 6 uur met 50% gereduceerd (A2.6) 35. Desinfectie van besmette oppervlakken met 70% alcohol is een effectieve inactivatie methode voor pokkenvirussen zoals MVA (A2.6, aanvullende informatie 14-02-2012). B. De genetische modificatie: 36. Vervaardiging van de recombinante vectoren gebeurt door infectie van CEF cellen met MVA-F6-sfMR en transfectie van geïnfecteerde cellen met het plasmide pMKIIIred met daarin gekloneerd één van de subtypes van het HA gen. Het recombinant MVA ontstaat door homologe recombinatie waarna zuivering optreedt door positieve selectie (op basis van marker-gen expressie) en negatieve selectie (op basis van CPE zonder marker-gen expressie). Het eindproduct is zuiver recombinant MVA zonder marker-gen (aanvullende informatie 20-03-2012). 37. De insertie in de recombinante MVA vector bestaat uit een synthetische promoter, stuffer DNA en een structureel HA gen die aanwezig zijn tussen de flankerende regio’s van deletie III van het MVA genoom (A2.9). 38. In de recombinante MVA vectoren is de coderende regio van het HA gen aanwezig dat codeert voor het hemagglutinine eiwit van één van de influenza A subtypes H1-H16. Deze HA subtypes worden gevonden in influenza virussen die afkomstig zijn van watervogels. Per recombinant MVA-HA virus zal één individueel HA gen aanwezig zijn (A1.2, A1.3, A2.9). 39. Het stuffer DNA omvat een Kozak sequentie die de translatie van het HA eiwit bevordert. De sequenties in het stuffer DNA zullen niet tot expressie komen (A2.9). 40. De HA genen en de daardoor gecodeerde HA eiwitten zijn buiten de context van een influenza virus onschadelijk. De HA eiwitten zullen niet structureel dan wel functioneel ingebouwd worden in het MVA virus (A2.9, aanvullende informatie 14-02-2012). 41. Transcriptie van HA staat onder controle van een korte synthetische promoter die is ontworpen voor vroege en late expressie van genen onder de controle van het virale RNA polymerase complex. De promoter komt niet van nature in pokkenvirussen voor, maar kan uitsluitend expressie reguleren Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 8 / 32

in pokken-virus geïnfecteerde cellen onder controle van het virale RNA polymerase complex van pokkenvirussen (A2.9, aanvullende informatie 14-022012). 42. De synthetische promoter psynII heeft geen homologie met pokkenvirussen of andere virale sequenties (aanvullende informatie 14-02-2012).

Tabel 1. vaststelling van de bij de genetische modificatie ingebrachte of verwijderde sequenties

Sequenties gebruikt voor genetische modificatie

Herkomst

Plaats in de vector

Aanwezigheid in proefpersoon komt niet tot expressie

Eén van de volgende HA genen: HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15 of HA16 Rechter Stuffer DNA met Kozak sequentie

influenza A (watervogels)

Tussen deletie III flankerende regio I van MVA en het HA gen Tussen linker en rechter stuffer DNA

Tussen HA gen en PsynII promoter

PsynII promoter

Synthetische promoter

Stimuleert translatie van HA eiwit Reguleert expressie van HA

Linker Stuffer DNA

Tussen rechter stuffer DNA en deletie III flankerende regio II van MVA

Codeert voor hemagglutinine eiwit

C. Het GGO: 43. Wanneer het GGO via de intramusculaire route wordt toegediend zal het recombinante DNA myocyten infecteren en zal het influenza eiwit tot expressie komen. Het HA eiwit zal in zijn natuurlijke conformatie worden geproduceerd en het grootste gedeelte zal op het cel oppervlakte tot expressie komen; een deel van de eiwitten zal door het proteasoom worden afgebroken. Antilichamen zullen tegen het HA eiwit worden gevormd en tevens kan hierdoor activatie van T-cellen plaatsvinden (A1.3, A2.12, A3.1). 44. In de proefpersonen kan residueel virus zich vanuit de injectieplaats naar het bloed of de lymfe verspreiden. Uit eerdere studies in non-humane primaten met MVA is gebleken dat MVA infecties zelflimiterend zijn, aangezien geen MVA uit enig orgaan kon worden geïsoleerd. Uitscheiding van recombinant MVA virus vanuit de proefpersonen naar derden kan uitsluitend plaatsvinden vanuit de injectieplaats. De aangebrachte modificaties hebben geen invloed op deze verwachte verspreidingsroute en deze verspreidingsroute is identiek aan het uitgangsvirus (A2.14). 45. Infectie van derden kan uitsluitend optreden na lekkage van het GGO uit de injectieplaats. De eventuele dosis MVA waaraan derden of dieren blootgesteld worden door lekkage vanuit injectieplek van proefpersoon zal echter zeer laag zijn. (A2.5, A2.14, A4.1, aanvullende informatie 20-032012). 46. Vervolgens kan na verspreiding alleen infectie van derden optreden via wondjes in de huid. Blootstelling van derden aan het virus kan leiden tot een locale infectie die kan resulteren in een milde locale reactie zoals eerder waargenomen in de klinische studies (A4.2, A4.3). 47. Het virus kan dieren uitsluitend via wondjes van de huid infecteren. Als het virus met de intacte huid in contact komt kan geen infectie optreden. Blootstelling van dieren door infectie via kleine wondjes in de huid kan resulteren in soortgelijke locale reacties zoals beschreven voor de mens. Als Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 9 / 32

48.

49.

50. 51.

52. 53.

54.

55.

56.

57.

kippen geïnfecteerd raken kan MVA mogelijk in deze gastheer repliceren, maar dit zal niet leiden tot schadelijke effecten, aangezien is aangetoond dat een opzettelijke hoge dosis van MVA niet resulteerde in ziekte in deze dieren. Indien andere dieren geïnfecteerd raken, kan geen virus replicatie optreden, afgezien van het theoretische risico dat virus replicatie in hamsters zou kunnen optreden (vanwege het feit dat MVA kan repliceren in BHK21 cellen). Aangezien zelfs in de meest vatbare gastheer, kippen, infectie met een relatief hoge dosis MVA geen pathogeen effect teweegbrengt, is het echter zeer onwaarschijnlijk dat MVA in hamsters pathogeen zal zijn (aanvullende informatie 14-02-2012 en 20-03-2012). In Nederland zijn meerdere endogene pokkenvirussen te vinden zoals myxoma virus (genus: leporipox) ecthyma contagiosum (genus: parapox) en fowlpox en canarypox virussen (genus: avipox). Deze virussen zijn genetisch gezien zeer afwijkend van het genus: orthopoxvirussen (waartoe MVA behoort) vandaar ook dat ze in andere genera zijn ingedeeld. Op basis van de genetische diversiteit tussen de verschillende genera (orthopoxvirussen hebben o.a. een substantieel lagere GC content dan andere genera) zijn de mogelijkheden tot recombinatie dan ook vrijwel zeker beperkt tot virussen binnen één en hetzelfde genus (aanvullende informatie 20-03-2012). Voor recombinatie van MVA met wildtype pokkenvirussen zijn de enige realistische kandidaten andere orthopoxvirussen (apenpokken- en koepokkenvirussen). Deze virussen kunnen mensen infecteren, maar infecties in de mens zijn in de afgelopen 50 jaar slechts voor koepokkenvirus sporadisch beschreven (gemiddeld minder dan 1 persoon per jaar in Nederland) (A4.1, aanvullende informatie 20-03-2012). Co-infecties van MVA en koepokkenvirussen zijn uitsluitend bij in vitro studies beschreven en bij aanwezigheid van een hoog aantal virusdeeltjes per cel (5 deeltjes van elk virus per aanwezige BHK-21 cel, Hansen et al., 2004) (A4.1). De kans dat een persoon deelneemt aan de studie en tegelijkertijd met het koepokkenvirus geïnfecteerd raakt is 1/16.000.000 (de kans dat een persoon in Nederland met koepokkenvirus geïnfecteerd raakt) x 150/16,000.000 (de kans dat een persoon deelneemt aan de klinische studie) = 6x10-13 (A4.1). De meeste humane infecties met koepokkenvirus gebeuren via het oog terwijl de MVA injectie in de bovenarm zal worden toegediend. Hierdoor zijn de potentiële infectieplaatsen fysiek gescheiden waardoor het vrijwel onmogelijk wordt dat beide virussen dezelfde cel zullen infecteren (A4.1). Het risico van incorporatie van het influenza gen in wildtype influenza virussen door recombinatie of reassortment is verwaarloosbaar klein vanwege het feit dat uitsluitend de coderende regio van het HA gen in MVA is geïncorporeerd. De niet-coderende regio’s zijn noodzakelijk voor het inpakken van het gen in een influenza partikel. Bovendien zijn er fysieke obstakels aangezien injectie van MVA-HA in de bovenarm plaatsvindt en influenzavirussen zich in de luchtwegen bevinden. Daarbij bevinden de RNAs van de MVA en influenza virussen zich respectievelijk in het cytoplasma en de kern van de cel waardoor recombinatie tussen deze virus genomen niet mogelijk is (A4.1). De vorming van de envelop van influenzavirussen en pokkenvirussen zoals MVA verloopt op zeer verschillende wijze. In het influenza virus is de virale envelop afkomstig van het cellulaire membraan van de gastheercel waarin de oppervlakte eiwitten HA en NA zijn geïncorporeerd. De functie van het HA eiwit is toegespitst op de incorporatie in de plasmamembraan (A2.12). De vorming van met HA gepseudotypeerd MVA virus is niet mogelijk aangezien eiwitten die zijn geïntegreerd in het plasmamembraan zoals het HA eiwit niet specifiek zullen worden getarget of geïncorporeerd in de MVA partikels. Daarbij komt dat de viruspreparaten met name naakte virions zullen bevatten. De fragiele buitenste membramen van de extracellular enveloped virions worden namelijk tijdens de opzuivering van het vaccin verloren (A.12). Aangezien het HA eiwit niet zal worden geïncorporeerd in de MVA virale envelop en het zeer onwaarschijnlijk is dat de additie van het structurele HA eiwit invloed zal hebben op de blokkade van morphogenese in zoogdiercellen, is het gastheerbereik van het GGO ongewijzigd ten opzichte van het gastheerbereik van de uitgangsvector (A2.12). Indien het HA eiwit zou worden ingebouwd in het membraan van het MVA virus partikel, zal geen effect op het tropisme worden waargenomen aangezien het tropisme van MVA al zeer breed is (A2.12).


Pagina 10 / 32

58. Selectie van de verschillende HA subtypes is niet van invloed op de risicobeoordeling van de recombinante HA virus. De verschillende HA varianten hebben in de natuurlijke context een volkomen identieke functie, namelijk binding van het virus-partikel aan de gastheercel en membraan fusie van de virus membraan en de endosomale membraan (A2.9, aanvullende informatie 14-02-2012)

D. Milieugerelateerde gegevens afkomstig uit eerdere experimenten 59. Clonaal isolaat MVA-F6 is al gebruikt voor de vervaardiging van meerdere vectoren die in eerdere klinische studies zijn toegepast (A2.1). 60. MVA is in studies aan meer dan 3400 mensen toegediend zonder dat bijwerkingen zijn gerapporteerd. Ook zeldzame bijwerkingen aan het hart die bij immunizatie met conventionele vaccinia virus vaccins optraden zijn bij toepassing van MVA niet waargenomen, ondanks uitgebreide monitoring (A2.3). 61. MVA ondergaat op dit moment klinische tests voor registratie als vaccin in patiënten met HIV en huidziekten (A2.3). 62. Uit eerdere klinische studies met op MVA gebaseerde recombinante vaccins met genen van bijvoorbeeld HIV of influenza is gebleken dat deze vaccins goed worden getolereerd en dat geen ernstige bijwerkingen worden waargenomen. Bijwerkingen waren identiek aan bijwerkingen waargenomen met wildtype MVA (A2.13, A3.1). 63. In preklinische studies in muizen en makaken is vaccinatie van wildtype MVA en MVA met een HA insertie van influenza A veilig bevonden. Vaccinatie met MVA-HA induceerde immuniteit tegen homologe en heterologe influenzastammen in muizen en makaken (A2.13, A3.1). 64. Een relatief hoge dosis (108 plaque forming units (p.f.u.) intramusculair, Veits et al., 2008) van een experimenteel MVA vaccin met insertie van het H5 eiwit van de H5N1 influenza stam werd goed verdragen door kippen en leidde niet tot hoge replicatie en/of ziekte (A2.6, aanvullende informatie 14-022012). 65. In eerdere klinische studies met DNA coderend voor HA van verschillende subtypes (H3, H5) als vaccin is aangetoond dat zowel DNA-H3 en DNA-H5 veilig, goed te verdragen en immunogeen zijn (aanvullende informatie 14-02-2012). 66. Bij intradermale, intranasale en intramusculaire inoculatie van al dan niet immuungespresseerde makaken met MVA zijn geen van de (histopathologische) afwijkingen gevonden die normaal worden waargenomen bij infectie met het vaccinia virus (A3.1). 67. Gegevens over de biodistributie na inoculatie van een hoge dosis wildtype MVA (109 p.f.u. verdeeld over drie plaatsen, te weten intradermaal, intranasaal en intramusculair, Stittelaar et al., 2001) in al dan niet immuungesuppresseerde makaken laten zien dat virale genomen kunnen worden gedetecteerd in epitheliale cellen van de pharynx, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) en drainerende lymfeklieren tot twee weken postinjectie. Het feit dat geen levend virus uit organen of de keel van de dieren kon worden geïsoleerd toont aan dat geen virus-replicatie plaatsvindt en dat de infectie strict zelflimiterend is. De kans op verdere verspreiding vanuit het bloed is hierdoor minimaal (A2.14, A3.1, A4.1). 68. Na intramusculaire vaccinatie van proefpersonen met een recombinant MVA (doseringen vergelijkbaar met de doseringen zoals beschreven in de aanvraag) konden geen viraal DNA en MVA virus op 1 uur en 8 dagen na vaccinatie in bloed of urine worden aangetoond (aanvullende informatie 1402-2012).

E. Proefpersoon of proefdiergebonden aspecten: 69. Het algemene doel is de ontwikkeling van nieuwe influenza vaccins die gebruikt kunnen worden in geval van een influenza pandemie of als universele influenza vaccins die tegen verschillende influenza subtypen bescherming bieden (A1.7).


Pagina 11 / 32

70. De fase I studie heeft primair als doel om veiligheid van MVA gebaseerde influenza vaccins te verifiëren. Secundair wordt in deze fase I studie ook gekeken naar de immunogeniciteit in gezonde individuen. Hierbij wordt gekeken naar de inductie van virus-specifieke antilichamen en T-cellen (A1.3, A1.8). 71. Voor een periode van 8 jaar zal 1 studie per jaar worden uitgevoerd met een maximum van 150 proefpersonen per studie, verdeeld over twee groepen die dan wel met het GGO dan wel met de controle vector worden gevaccineerd. De studie zal worden uitgevoerd tussen 1 september 2012 en 1 september 2020 (A1.4, A3.5, aanvullende informatie 14-02-2012). 72. In de vaccinatiestudies wordt het vaccin intramusculair toegediend in de deltoid regio van de bovenarm via bolusinjectie. De proefpersonen zullen een, twee of drie injecties ontvangen (met tussenpozen va 3-4 weken) met een standaard dosis van 108 p.f.u, of een 10 of 100 maal lagere dosis (107 of 106 pfu). Verschillende klinische studies hebben de veiligheid en immunogeniciteit van een dosis van 108 pfu MVA aangetoond (A1.3, A3.6, A3.7, A4.6). 73. MVA-F6-sfMR zonder insertie zal als controle vector in de klinische studies gebruikt worden. De toepassing van deze niet gemodificeerde vector maakt geen deel uit van de vergunningaanvraag (A1.3, A2.7, aanvullende informatie 14-02-2012).

F. Informatie over plannen voor beheersing, controle, follow-up en afvalbehandeling: 74. De aanvragers geven aan dat geen van de gehanteerde inclusie- en exclusiecriteria van invloed zijn op de milieuveiligheid (A4.5, aanvullende informatie 14-02-2012). 75. Verspreiding van het GGO zou kunnen optreden door morsen vanuit een open intacte of beschadigde ampul, via een prikaccident, door lekkage vanuit de injectieplaats of door blootstelling aan besmet afval (A2.14, A4.4). 76. Het GGO wordt toegediend door getraind medisch personeel waardoor de kans op prikaccidenten verkleind is (A4.4). 77. Bij intramusculaire injectie is de kans dat het GGO uit de injectieplaats lekt nihil (aanvullende informatie 14-02-2012). 78. De injectieplaats wordt voor toediening twee maal afgenomen met 70% alcohol, het gebied rondom de injectieplaats wordt met chirurgische sheets afgedekt (A3.7). 79. Een injectiespuit wordt vanuit de injectieflacon gevuld waarna de toediening in de bovenarm plaatsvindt (A3.7). 80. Na toediening wordt de injectieplaats twee maal gedesinfecteerd met 70% alcohol, waardoor inactivatie van eventueel gelekt GGO plaatsvindt. 10 minuten na vaccinatie wordt de injectieplaats afgeplakt met een watervast verband om verspreiding van het vaccin door lekkage te voorkomen. Dit verband moet 24 uur bevestigd blijven (A3.7, A4.7, A4.1, aanvullende informatie 14-02-2012). 81. MVA zal geen vaccinia-laesie induceren, zelfs niet bij intradermale toediening, omdat het virus replicatiedeficient is. Bij intramusculaire toediening zal er slechts een milde ontstekingsreactie zijn maar de huid zal intact blijven en er zal geen virus tot uiting komen op de intacte huid nadat de injectieplaats is gesloten. Zodra de injectieplaats geheeld is (binnen enkele uren tot een dag) kan dus geen verspreiding van het GGO via de injectieplaats meer plaatsvinden (A4.1, aanvullende informatie 14-02-2012). 82. Bloedmonsters worden afgenomen voor de vaccinatie en op z’n vroegst 1 uur na de vaccinatie. Deze monsters zullen voor opslag en analyse van klinisch-chemische en immuunparameters naar een laboratorium worden gebracht en als normale humane klinische bloedsamples worden behandeld (A1.3, A3.8, A4.11, aanvullende informatie 06-04-2012). 83. Het is zeer onwaarschijnlijk dat bloedmonsters die 1 uur na vaccinatie worden genomen het GGO zullen bevatten. Na intramusculaire vaccinatie van proefpersonen met een recombinant MVA konden geen viraal DNA en MVA virus op 1 uur en 8 dagen na vaccinatie in bloed of urine worden Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 12 / 32

84.

85.

86. 87. 88.

aangetoond. Bovendien betreft het een zelfdovende infectie waarbij geen nieuwe virusdeeltjes zullen worden gevormd (A3.8, A4.11, aanvullende informatie 14-02-2012, aanvullende informatie 06-04-2012). Afvalmaterialen die het GGO (in potentie) kunnen bevatten (waaronder injectiespuit, naalden, ampullen, handschoenen, chirurgische sheets en doekjes die gebruikt zijn voor decontaminatie) worden verzameld in een container voor biologisch afval en afgevoerd volgens bijlage 9 van de regeling GGO (A4.14). De klinische trial unit is een ziekenhuiskamer waarin grotendeels de ML-I werkvoorschriften gevolgd. Dit houdt in dat behandelend personeel handschoenen en een overjas over de normale medische kledij draagt. In geval van morsen worden contactoppervlakken gedesinfecteerd met 70% alcohol en na 10 minuten incubatie afgenomen. De overjas wordt in de unit achtergelaten. Kleding die met het GGO in aanraking komt wordt gesteriliseerd of gedesinfecteerd met 70% alcohol, voordat deze wordt gewassen. Na afloop van de werkzaamheden worden alle werkoppervlakken gedesinfecteerd met 70% alcohol. Na afloop van de werkzaamheden worden de handschoenen verwijderd en de handen met hand alcohol (tenminste 30% ethanol) gedesinfecteerd. Ook voor het verlaten van de unit worden de handen met handethanol gedesinfecteerd. (A4.4, A4.8, A4.14, A4.15). In de klinische trial unit zijn maximaal 6 proefpersonen en 3 personen behorende tot de medische staf tegelijkertijd aanwezig (A4.15). Proefpersonen worden na toediening van het vaccin 1 uur geobserveerd in de klinische trial unit, maar worden niet in het ziekenhuis opgenomen (A1.3, A3.9, A4.15, aanvullende informatie 19-06-2012). Het verband zal 24 uur na vaccinatie door de proefpersoon worden verwijderd. De verbanden worden in een sealbag gedaan, besprenkeld met 70% alcohol en vervolgens wordt de gesloten sealbag door de proefpersoon bij het normale afval gegooid. De proefpersoon zal na het afnemen van de pleister de injectieplaats desinfecteren met 70% ethanol en na al deze handelingen de handen afnemen met 70% alcohol en vervolgens wassen. In het onwaarschijnlijke geval van lekkage vanuit de injectieplaats bij de proefpersoon thuis op kleding of bedlinnen, dient dit te worden gewassen. Als de lekkageplaats zichtbaar is kan deze met 70% ethanol gedesinfecteerd worden voordat het textiel wordt gewassen (A4.8, A4.1, A4.14, A4.15, aanvullende informatie 14-02-2012).

G. Productie en Batch 89. Het vaccin wordt niet in Nederland geproduceerd. Productie van Good Manufacturing Practice (GMP) batches van de MVA vectoren zal plaatsvinden door IDT, Dessau, Duitsland. Het productieproces maakt geen onderdeel uit van de vergunningaanvraag (A1.3, A3.2). 90. De uitgangsvector wordt gekweekt op CEF cellen. Het genetische materiaal dat aanwezig is in CEF cellen kan geen interactie aangaan met de virale vector (A2.10) 91. De CEF cellen die bij de productie worden toegepast zijn geïsoleerd uit eieren van SPF (specific pathogen free) kippen die vooraf zijn getest op de afwezigheid van virussen die in kippen kunnen voorkomen, waaronder het endogene pokkenvirus fowlpox (genus: avipox) (A3.3, aanvullende informatie 20-03-2012) 92. Gedurende het productieproces vindt een uiteindelijke kwaliteitscontrole plaats op het eindproduct (bulk drug substance). Deze wordt o.a. getest op steriliteit, zuiverheid, potentie, influenza HA eiwit expressie (door middel van western blot en immunohistochemie op CEF cellen geïnfecteerd met de BDS), genetisch profiel (DNA fingerprint gebaseerd op zes primersets voor zes plaatsen van het MVA genoom), genetische stabiliteit en replicatiedeficientie (A3.3). 93. De genetische stabiliteit van het GGO wordt getest door 5 passages op CEF cellen uit te voeren en de laatste passage te testen op het genetische profiel van MVA en expressie van HA (A3.3). 94. De replicatiedeficiëntie van het MVA zaaivirus batch en de klinische batches zal worden getest in de Hela Block assay die als extra controle wordt uitgevoerd (A2.12, A3.3, aanvullende informatie 14-02-2012). Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 13 / 32

95. De Hela Block assay geeft een bevestiging van het behoud van replicatiedeficiëntie van het recombinant virus en is gebaseerd op het feit dat in HeLa cellen (humane celllijn) MVA virus niet kan repliceren. Om na te gaan of de inbouw van een gen dat codeert voor een ‘vreemd’ eiwit geen invloed heeft op de replicatie deficiëntie wordt het recombinant virus 72 uur op HeLa cellen gekweekt. De gevoeligheid van de assay wordt bepaald door de concentratie virus waarmee gestart wordt. Op t=0 uur en t=72 uur worden monsters genomen waarvan tevens de titer bepaald wordt. De ratio van de t=72 titer / t=0 titer wordt bepaald en mag niet hoger zijn dan 5. Deze ratio van 5 die aangehouden wordt voor de HeLa Block assay is een arbitraire waarde die is afgeleid van de variatie binnen de assay die proefondervindelijk is vastgesteld. De variatie binnen de assay resulteert in een arbitraire range van 1:5 tot 5:1. Er is geen sprake van replicatie bij een ratio van 5 (=5:1). Als positieve controle voor de replicatie wordt het MVA virus ook gebruikt om CEF cellen te infecteren. Er is vastgesteld dat infectie van CEF-cellen met MVA resulteert in replicatie en een ratio van ongeveer 18.000 na 72 uur (aanvullende informatie 14-02-2012 en 20-03-2012). 96. De batch zal worden afgewezen indien het GGO replicatiecompetent is geworden, indien sprake is van een onzuiverheid van meer dan 10% (wat inhoudt dat in 10% van partikels in het MVA preparaat het recombinant gen niet kan worden aangetoond) en/of wanneer het GGO toxiciteit vertoont in toxiciteitsstudies in konijnen die door een contract onderzoek organisatie (CRO) zullen worden uitgevoerd (A1.3, A3.4, aanvullende informatie 14-022012). 97. Na productie en kwaliteitscontrole wordt het vaccin van IDT naar de ziekenhuisapotheek van het Erasmus MC getransporteerd, alwaar het wordt opgeslagen voordat het in de klinische studie zal worden toegepast. (A1.3, A4.8). 98. Transport van het GGO binnen het Erasmus MC zal plaatsvinden conform het gestelde in Bijlage 9 van de Regeling GGO (aanvullende informatie 2003-2012). * voor informatie van BGGO toegepaste bronnen: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5010a1.htm, http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/msds160e-eng.php http://www.cogem.net/index.cfm/nl/publicaties/publicatie/fase-i-klinische-studie-met-een-genetisch-gemodificeerd-mva-virus-gericht-tegen-hiv-b, http://en.wikipedia.org/wiki/Cowpox Fenner, F.Poxviruses. In B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley (Ed.).Fields Virology (3th ed., pagina 2673-2702). Philadelphia, New York: Lippincott-Raven.


Pagina 14 / 32

DEEL 2. MILIEURISICOANALYSE VAN DE AANGEVRAAGDE WERKZAAMHEDEN Per sequentie wordt geïnventariseerd welke nieuwe eigenschappen en effecten mogelijk het gevolg zijn van de nieuw ingebrachte sequenties. De “oorzaak-gevolg” relaties tussen de genetische modificatie en het eventuele schadelijke effect worden verduidelijkt. Daarna volgt de evaluatie van de eventuele gevolgen en de waarschijnlijkheid. De milieurisicoanalyse van de aangevraagde werkzaamheden wordt afgesloten met een deelrisicoschatting per eigenschap en sequentie.

Tabel 2.1 milieurisicoanalyse van de regulerende sequenties (psynII promoter): Zoals uit de tabel blijkt gaat het hier om indirecte effecten. Daarom wordt in deze tabel wordt niet de gebruikelijke indeling gevolgd in de beoordelingsaspecten A – H, die wel relevant is in Tabel 2.2.

Bepaling van eigenschappen die schadelijke effecten kunnen hebben (Identificatie en toelichting “oorzaak-gevolg” relaties)

Evaluatie van de mogelijke gevolgen van elk schadelijk effect, indien dit optreedt, en evaluatie van de waarschijnlijkheid van het optreden

Schatting van het risico dat aan de betreffende eigenschap van het GGO verbonden is

(rekening houdend met de wijze van introductie en het introductie milieu)

De promoter heeft een functie bij de regulatie van de genexpressie. Een promoter is een specifieke DNA sequentie waaraan RNA polymerase kan binden om vervolgens stroomafwaarts gelegen coderende sequenties af te lezen. Een promoter op zichzelf kan geen schadelijk effect veroorzaken. Echter, de mate waarin een promoter actief is, is van invloed op de mate van expressie van genen die door de promoter worden gereguleerd. De mate van activiteit van een promoter kan afhankelijk zijn van de omstandigheden. Een constitutieve promoter heeft een vaste mate van activiteit, die niet of nauwelijks wordt veranderd door de omstandigheden. Bij een induceerbare promoter wordt de activiteit bepaald door de aan- of afwezigheid van signaalstoffen in de cel. De activiteit van een promoter kan ook afhankelijk zijn van het cel- of weefseltype waarin de promoter zich bevindt.

I. Evaluatie van mogelijk gevolgen, indien ze optreden De schadelijke effecten die op kunnen treden als gevolg van de aanwezigheid van de expressie regulerende sequenties kunnen alleen worden geëvalueerd in relatie tot de schadelijke effecten van het HA genproduct waarvan de mate van productie wordt gereguleerd door deze promoter en de Kozak sequentie, rekening houdende met het verwachte expressiepatroon. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Eventuele geïdentificeerde schadelijke effecten zullen op kunnen treden in alle door MVA geïnfecteerde cel- en weefseltypen.

I. Mogelijke gevolgen: De mogelijke gevolgen van de promoter op zich zijn nihil; de gevolgen zijn afhankelijk van de uitkomst van de risicoanalyse van HA (zie tabel 2.3), rekening houdende met het verwachte expressiepatroon. II. De waarschijnlijkheid: Eventuele geïdentificeerde schadelijke effecten zullen kunnen optreden in alle door MVA geïnfecteerde cel- en weefseltypen. III. Het risico: Het risico is afhankelijk van de uitkomst van de risicoanalyse van de HA sequentie (tabel 2.3).

De synthetisch geconstrueerde psynII promoter is ontworpen voor vroege en late expressie van genen onder de controle van het virale RNA polymerase complex. De promoter komt niet van nature in pokkenvirussen voor, maar kan uitsluitend expressie reguleren in pokken-virus geïnfecteerde cellen onder controle van het virale RNA polymerase complex van pokkenvirussen. De synthetische promoter psynII heeft geen Ministerie van IenM IM 12-001/00

Pagina 15 / 32

homologie met pokkenvirussen of andere virale sequenties. In het GGO reguleert de psynII promoter de expressie van de geinserteerde HA sequentie Naast de promoter bevat de vector als nieuw ingebrachte regulerende sequentie een Kozak sequentie die de translatie van het HA eiwit bevordert. Of de mate van expressie en het expressiepatroon van een promoter een schadelijk effect heeft wordt niet direct door een promoter veroorzaakt, maar alleen door het genproduct dat door de promoter tot expressie komt.


Pagina 16 / 32

Tabel 2.2 milieurisicoanalyse van de uitgangsvector (MVA): Bepaling van eigenschappen die schadelijke effecten kunnen hebben (Identificatie en toelichting “oorzaak-gevolg” relaties)



(rekening houdend met de wijze van introductie en het introductie milieu) A. Persistentie en invasiviteit Bij de bepaling van het milieurisico van veranderde persistentie en invasiviteit van een GGO toegepast in medisch en veterinair onderzoek gaat het om de bepaling van mogelijke effecten van de genetische modificatie op het gastheerbereik, de infectiviteit, en de pathogeniteit en virulentie voor potentiële gastheren (mensen en dieren) in het milieu. Van een hogere persistentie en invasiviteit van een virale vector (i.e. het GGO) ten opzichte van het natuurlijk voorkomende wildtype virus waarvan het is afgeleid, kan sprake zijn indien het GGO na toediening aan een proefpersoon langer dan het wildtype virus in een actieve vorm aanwezig kan blijven, en er vervolgens shedding kan plaatsvinden van infectieuze deeltjes. Deze shedding kan leiden tot infectie van andere organismen. Daarbij moet in beschouwing genomen worden dat het GGO door de genetische modificatie veranderd kan zijn in zijn weefseltropisme, gastheerbereik, en in de mate van infectiviteit en virulentie. Hierbij spelen onder andere de mogelijkheden voor replicatie en transmissie een rol. Deze veranderingen kunnen leiden tot een gewijzigd ziektebeeld in gastheren die vatbaar zijn voor infectie door het wildtype virus, of tot uitbreiding van de ziekte naar nieuwe gastheren. De gebruikte vaccinvector MVA is ontwikkeld door het vaccinia virus, stam Ankara, zo’n 570 maal te passeren in kippen embryonale fibroblast cellen (CEF cellen). Ten gevolge van deze passages is de attenuatie van MVA ontstaan. MVA bezit ten opzichte van het vaccinia virus zes grote deleties in het genoom met een totale grootte van 31 kilobasen. Hierbij is het de vraag of de, door de passages in CEF cellen, ontstane deleties in het genoom leiden tot een verandering in persistentie en/of invasiviteit in vergelijking tot het wildtype Ministerie van IenM IM 12-001/00

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt De natuurlijke en oorspronkelijke gastheer van het vaccinia virus is onbekend. Het vaccinia virus kan repliceren in de meeste zoogdieren vogelcellen. Infectie met het vaccinia virus worden meestal goed verdragen. Een normale reactie op vaccinatie met vaccinia virus bestaat uit het ontstaan van papuleuze laesie in 3-4 dagen, die een blaasje wordt in 5-6 dagen. Na 12 dagen ontstaat een korst en na ongeveer 3 weken is de laesie genezen. Andere reacties die kunnen optreden zijn pijn en erytheem rond de vaccinatieplaats, malaise, locale lymfadenopathie, myalgie, hoofdpijn, koude rillingen, misselijkheid, moeheid en koorts. In uitzonderlijke gevallen kunnen ernstige en soms levensbedreigende complicaties optreden, zoals encefalitis, Vaccinia Necrosum, Eczema Vaccinatum. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect MVA is ten opzichte van het vaccinia virus sterk geattenueerd als gevolg van vele passages in CEF cellen. Hierbij zijn in het genoom van MVA zes grote stabiele deleties van in totaal 31 kilobasen ontstaan. Het gastheerbereik van MVA is daardoor ten opzichte van het vaccinia virus sterk verminderd. De vaccinstam MVA is niet meer instaat om te repliceren in de onderzochte humane en animale cellen of cellijnen, met uitzondering van Baby hamster kidney cellen (BHK-21) en kippencellen (CEF). Hierdoor is de kans op verspreiding naar en infectie van derden gereduceerd. De kans op verspreiding van MVA is het grootst als kort na de vaccinatie het vaccin zou lekker uit de injectieplaats. De vector is in staat andere cellen te infecteren, dit effect is echter uitdovend aangezien de vector niet kan repliceren in humane cellen. Gegevens over de biodistributie na inoculatie van een hoge dosis MVA in al dan niet immuungesuppresseerde makaken

I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van een eventueel verhoogde persistentie of invasiviteit van het GGO kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: Door ruim 570 passages in CEF cellen en de hierbij opgetreden deleties in het genoom is de ontstane vaccinstam MVA gewijzigd in persistentie en invasiviteit. MVA is niet instaat om te repliceren in humane en zoogdier cellen of cellijnen en heeft daardoor een sterk verminderd gastheerbereik. De waarschijnlijkheid dat het leidt tot verhoogde persistentie of invasiviteit is te verwaarlozen. III. Het risico: Het risico van verhoging van de persistentie of de invasiviteit bij toepassing van de uitgangsvector is verwaarloosbaar klein.

Pagina 17 / 32

vaccinia virus.


laten zien dat virale genomen kunnen worden gedetecteerd in epitheliale cellen van de pharynx, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) en drainerende lymfeklieren tot twee weken post-injectie. In het plasma werd tot maximaal 4 dagen na infectie alleen MVA DNA teruggevonden en geen levend virus. Na intramusculaire vaccinatie van proefpersonen met (recombinant) MVA konden geen viraal DNA en MVA virus op 1 uur en 8 dagen na vaccinatie in bloed of urine worden aangetoond. Het feit dat geen levend virus uit geïnfecteerde dieren of proefpersonen kon worden geïsoleerd toont aan dat geen virus-replicatie plaatsvindt en dat de infectie strict zelflimiterend is. De kans op verdere verspreiding vanuit het bloed is hierdoor minimaal. Er is geen reden aan te nemen dat de overleving buiten een gastheer van MVA ten opzichte van vaccinia virussen zou zijn gewijzigd. De vaccinstam MVA is wereldwijd toegediend aan meer dan 120.000 personen voor pokkenvaccinatie zonder dat daarbij melding is gemaakt van ernstige complicaties. Bijwerkingen die na MVA vaccinatie zijn gemeld zijn: pijn of jeuk op injectieplaats, lokale roodheid of kleurveranderingen rondom injectieplaats, kleine blaartjes gevuld met vocht of bloed of een harde zwelling van de injectieplaats. Verder zijn ook koorts, koude rillingen, moeheid, spierpijn, hoofdpijn, misselijkheid en braken gemeld als bijwerking na een vaccinatie met MVA. Deze bijwerkingen verdwijnen vanzelf na enkele dagen. In zowel immuungecompromitteerde proefpersonen en proefdieren (makaken) is MVA avirulent gebleken. In een aantal landen in de Europese Unie wordt MVA geclassificeerd als een organisme te hanteren op het niveau van Biosafety level 1. De verloren functies van MVA kunnen in theorie gecomplementeerd worden indien vaccinia virus in dezelfde cel aanwezig is als de vector. De expressieproducten van het wildtype virus kunnen in dat geval gebruikt worden door de vector, wat de vector de mogelijkheid biedt te repliceren. De waarschijnlijkheid dat een dergelijke gebeurtenis zich voordoet is echter klein. Het vaccinia virus (koepokvirus) komt in Europa voornamelijk voor in Engeland. Het virus duikt sporadisch en seizoensgebonden op in koeien en katten. In West-Europa vormen knaagdieren een mogelijk reservoir. Co-infecties van MVA en koepokkenvirussen zijn uitsluitend bij in vitro studies beschreven en bij aanwezigheid van een hoog aantal virusdeeltjes van elk virus per cel. Infecties in de mens met het koepokkenvirus zijn de afgelopen 50 jaar slechts sporadisch beschreven (gemiddeld minder dan 1 persoon per jaar in Nederland). Hierdoor is het zeer onwaarschijnlijk dat mensen geïnfecteerd raken met zowel het vaccinia virus als de MVA vaccinstam en dat de vector met een wildtype vaccinia virus kan recombineren of gecomplementeerd kan worden. Pagina 18 / 32

Door de stabiele deleties van in totaal 31 kilobasen in het genoom, is MVA niet instaat om te repliceren in humane cellen of cellijnen en de meeste zoogdier cellen of cellijnen en heeft daardoor een sterk verminderd gastheerbereik. De waarschijnlijkheid dat het leidt tot verhoogde persistentie of invasiviteit is verwaarloosbaar klein.

B. Selectieve voordelen Voor de milieurisicoanalyse van een GGO toegepast in medisch of veterinair onderzoek zijn die selectieve voordelen relevant die leiden tot verhoogde persistentie en invasiviteit. De oorzaak-gevolg relaties die hierbij een rol spelen zijn behandeld onder A. Hierbij is het de vraag of de, door de passages in CEF cellen, ontstane deleties in het genoom, leiden tot een selectief voordeel dat een verandering geeft in weefseltropisme, gastheerbereik en de mate van infectiviteit en virulente van de vector in vergelijking tot het wildtype vaccinia virus.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Evenals onder A geldt dat indien verhoogde persistentie of invasiviteit, of een uitbreiding van het gastheerbereik van de vector aanleiding zou geven tot ziektebeelden dan zouden de gevolgen groot kunnen zijn, maar alleen indien het ziektebeeld gepaard gaat met significante hinder of klachten. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Zoals reeds is aangegeven onder onderdeel A van deze tabel, is het uiterst onwaarschijnlijk dat de zes deleties in het genoom van MVA van in totaal 31 kilobasen een positief effect hebben op de virusbiologie van de vector. Een toegenomen virulentie en het optreden van een mogelijk schadelijk effect is dan ook zeer onwaarschijnlijk.

I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van selectieve voordelen kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat de zes deleties van in totaal 31 kb leiden tot selectieve voordelen is te verwaarlozen. III. Het risico: Het risico van selectieve voordelen bij toepassing van de MVA vaccinvector is verwaarloosbaar klein.

C. Kans op genoverdracht op andere soorten en de kans dat hierdoor selectieve voor- of nadelen op deze soorten worden overgedragen Van genoverdracht op andere soorten kan alleen sprake zijn indien (homologe) recombinatie heeft plaatsgevonden. Op de eerste plaats wordt in beschouwing genomen of er overdracht plaats kan vinden van het GGO naar andere virussen. Die kans is op de eerste plaats afhankelijk van de aanwezigheid van een verwant virus (dat homologieën vertoond met de vector) binnen hetzelfde celcompartiment waarin het GGO zich bevindt. Vervolgens zijn de kans op recombinatie en de eigenschappen van het gevormde product afhankelijk van de genetische opbouw van het GGO. Van een mogelijk gevormde recombinant moet vervolgens worden nagegaan in hoeverre hieruit selectieve voor- of nadelen voortvloeien. De vraag is of de deleties geheel of gedeeltelijk kunnen worden overgedragen naar nadere virussen en of dit vervolgens voor deze virussen kan leiden tot een selectief voor- of nadeel. Selectieve voor- of nadelen kunnen alleen optreden als de deleties op een of andere manier een interactie hebben met de virale levenscyclus. Tevens wordt hier nagegaan in hoeverre integratie van MVA in het genoom van de gastheer kan leiden tot een genoverdracht middels kiembaantransmissie. Ministerie van IenM IM 12-001/00

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Homologe recombinatie tussen de vector en vaccinia virus zal alleen resulteren in reciproke uitwisseling. Aan een dergelijke uitwisseling zijn geen gevolgen verbonden, omdat de erbij ontstane virussen identiek zijn aan de uitgangsvirussen. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect De waarschijnlijkheid van het optreden van recombinatie is laag. Voor het optreden van recombinatie is op de eerste plaats nodig dat de vector een wildtype vaccinia virus ontmoet en dat beide zich in dezelfde cel te bevinden. Co-infecties van MVA en koepokkenvirussen zijn uitsluitend bij in vitro studies beschreven en bij aanwezigheid van een hoog aantal virusdeeltjes van elk virus per cel. Infecties in de mens met het koepokkenvirus zijn de afgelopen 50 jaar slechts sporadisch beschreven (gemiddeld minder dan 1 persoon per jaar in Nederland). Hierdoor is het zeer onwaarschijnlijk dat mensen geïnfecteerd raken met zowel het vaccinia virus als de MVA vaccinstam en dat deze virussen met elkaar kunnen recombineren. De meeste humane infecties met koepokkenvirus gebeuren bovendien via het oog terwijl de

I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van genoverdracht kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. Overdracht van de deleties hebben geen gevolgen aangezien dit resulteert in een reciproke uitwisseling. II. De waarschijnlijkheid: De deleties kunnen niet naar andere virus- of gastheersoorten worden overgedragen III. Het risico: Het risico is verwaarloosbaar klein.

Pagina 19 / 32

MVA injectie in de bovenarm zal worden toegediend. Hierdoor zijn de potentiële infectieplaatsen fysiek gescheiden waardoor het vrijwel onmogelijk wordt dat beide virussen dezelfde cel zullen infecteren. Het risico van co-infectie en dat hierdoor recombinatie van MVA met wildtype vaccinia virussen optreedt, is verwaarloosbaar klein. Vaccinia virussen zijn de enige DNA virussen die repliceren in het cytoplasma van de cel. Aangezien vaccinia, en dus ook MVA, niet in de celkern terecht kunnen komen is integratie in het genoom uitgesloten. Het optreden van kiembaanoverdracht (verticale transmissie) ten gevolge van de vector is daardoor uiterst onwaarschijnlijk.


Pagina 20 / 32

D. Effecten op doel en niet doel populaties Effecten op de proefpersonen die aan de studie deelnemen (doelpopulatie) vallen niet onder het toetsingskader van de milieuregelgeving en worden om die reden hier niet direct in beschouwing genomen. De effecten op de proefpersoon vallen onder de medische verantwoordelijkheid van de behandelend arts. Effecten op niet doelpopulaties zullen alleen op kunnen treden indien er sprake is van verspreiding van de vector in de omgeving van de proefpersoon. Een aantal aspecten betreffende pathogene effecten is al in beschouwing genomen onder A. In dit onderdeel worden de eventuele effecten van het GGO beoordeeld op mensen en dieren in de omgeving van de proefpersoon. Bij de beoordeling moet rekening worden gehouden met de te verwachten blootstellingsweg en mate van blootstelling.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Het vaccinia virus kan repliceren in de mens en in runderen. Infectie met het vaccinia virus in de mens worden meestal goed verdragen. Reacties die kunnen optreden zijn pijn en erytheem rond de infectieplaats, malaise, locale lymphadenopathie, myalgie, hoofdpijn, koude rillingen, misselijkheid, moeheid en koorts. Zoals in onderdeel A vermeld kunnen in uitzonderlijke gevallen ernstige en soms levensbedreigende complicaties optreden. In runderen zijn de symptomen van een infectie met vaccinia virus vergelijkbaar als bij mensen. In katten zijn de symptomen onder andere laesies in het gezicht, hals, voorpoten en klauwen, en soms infectie van de bovenste luchtwegen.

De vraag is welke effecten de deleties kunnen hebben op de niet-doelpopulatie. Gezien het gastheerbereik worden hieronder dieren en mensen verstaan, met uitzondering van de behandelde proefpersoon.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect De MVA vector is ten opzichte van het vaccinia virus sterk geattenueerd en heeft zes grote deleties in het genoom. Hierdoor is het gastheerbereik van MVA sterk verminderd en kan MVA niet repliceren in humane en de meeste zoogdiercellen. De vector is in staat andere cellen te infecteren, dit effect is echter uitdovend aangezien de vector niet kan vermenigvuldigen in de meeste cellen.

Met effecten worden schadelijke en niet-schadelijke effecten bedoeld, zoals eventuele toxische en allergene effecten. Specifieke gezondheidseffecten voor de mens worden onder onderdeel E besproken. Hiervoor moet worden nagegaan wat er bekend is over de effecten die de deleties kunnen hebben op de mens.

I. Mogelijke gevolgen: Deleties in het genoom van MVA kunnen niet leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat de deleties in het genoom van MVA leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten op doel en niet doel populaties is verwaarloosbaar klein. III. Het risico: Gezien het feit dat de deleties in het genoom van MVA niet leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten, is de kans dat de beschreven gevolgen in het milieu optreden verwaarloosbaar klein.

De kans op verspreiding van de MVA is het grootst als kort na de vaccinatie het vaccin zou lekker uit de injectieplaats. Verspreiding van MVA virus van een gevaccineerde naar derden of dieren is onwaarschijnlijk aangezien infectie uitsluitend via wondjes in de huid plaatsvinden. Als het virus met de intacte huid in aanraking komt kan geen infectie optreden. Bij intramusculaire toediening is de kans op lekkage van het vaccin uit de injectieplaats minimaal. De dosis waaraan doel en niet-doel populaties zullen worden blootgesteld is hierdoor en als gevolg van het replicatiedeficiënte karakter van de vector in de mens, laag in vergelijking met de dosis die aan de proefpersoon toegediend wordt. MVA heeft een historie van veilig gebruik in zowel klinische en vaccinatiestudies. De vaccinstam MVA is wereldwijd aan meer dan 120.000 personen toegediend voor pokkenvaccinatie zonder dat daarbij melding is gemaakt van ernstige complicaties of dat andere mensen of dieren geïnfecteerd zijn geraakt. MVA is in klinische studies aan meer dan 3400 mensen toegediend zonder dat bijwerkingen zijn gerapporteerd. Ook zeldzame bijwerkingen aan het hart die bij immunizatie met conventionele vaccinia virus vaccins optraden


Pagina 21 / 32

zijn bij toepassing van MVA niet waargenomen, ondanks extensieve monitoring. MVA is niet pathogeen voor mensen en zoogdieren, zelfs wanneer deze immuungecompromitteerd zijn. Het MVA vaccin kan in de mens lichte allergische reacties opwekken, zoals pijn of jeuk op injectieplaats, lokale roodheid of kleurveranderingen rondom injectieplaats, kleine blaartjes gevuld met vocht of bloed of een harde zwelling van de injectieplaats. In dieren zoals muizen en (al dan niet immuungecompromitteerde) makaken is MVA avirulent gebleken. Ook in kippen waarin MVA mogelijk gedeeltelijk kan repliceren, induceerde een hoge dosis van MVA geen schadelijke effecten. Indien andere dieren geïnfecteerd raken, kan geen virus replicatie optreden, afgezien van het theoretische risico dat virus replicatie in hamsters zou kunnen optreden (vanwege het feit dat MVA kan repliceren in BHK-21 cellen). Een tweede goed gekarakteriseerde cellijn van hamster-oorsprong: Chinese Hamster Ovary cells (CHO) is echter niet ontvankelijk voor MVA. MVA repliceert dus in slechts 1 van de 2 hamsterafgeleide cellijnen en dan ook nog eens in de cellijn met verzwakt innate immuunsysteem. Het is dus hoogst onwaarschijnlijk dat MVA repliceert in hamsters die immuuncompetent zijn. Aangezien zelfs in de meest vatbare gastheer, kippen, infectie met een relatief hoge dosis MVA geen pathogeen effect is het zeer onwaarschijnlijk dat MVA in hamsters pathogeen zal zijn. Indien een dier via een wond in huid geïnfecteerd zou raken kan een soortgelijke locale reactie zoals beschreven voor mensen optreden. Samengevat zijn de risico’s voor derden en dieren van uitscheiding van MVA door proefpersonen na vaccinatie via de injectieplaats of via andere routes verwaarloosbaar klein.


Pagina 22 / 32

E. Mogelijke effecten op menselijke gezondheid Aspecten gerelateerd aan de pathogeniteit van het GGO zijn reeds aan de orde geweest in onderdeel A. Daar werd de vraag gesteld of de deleties in het genoom van MVA leiden tot verandering in weefseltropisme, gastheerbereik, en in de mate van infectiviteit en virulentie van de virale vector in vergelijking met wildtype vaccinia virus Aspecten gerelateerd aan toxiciteit of allergeniteit en andere gezondheidsgerelateerde effecten zijn hier aan de orde. Daarbij worden de eventuele toxische en allergene effecten van het GGO beoordeeld op mensen in de omgeving van de proefpersoon. Elementen die daarbij in beschouwing genomen moeten worden zijn toxiciteit of andere schadelijke effecten zoals een effect van het GGO op het immuunsysteem, en allergeniteit van het genproduct. Bij de beoordeling moet rekening worden gehouden met de te verwachten blootstellingsweg en mate van blootstelling. De vraag is welke effecten de deleties in het genoom van MVA kunnen hebben op de gezondheid van de niet-doelpopulatie (mens). Gezien het gastheerbereik worden hieronder mensen verstaan, met uitzondering van de behandelde proefpersoon. Hiervoor moet worden nagegaan wat er bekend is over de effecten die de deleties kunnen hebben op de mens.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt In onderdeel A is geconcludeerd dat het vaccinia virus kan repliceren in runderen en mens. Infectie met het vaccinia virus worden meestal goed verdragen, maar kunnen in uitzonderlijke gevallen leiden tot ernstige en soms levensbedreigende complicaties. Indien verhoogde persistentie of invasiviteit, of een uitbreiding van het gastheerbereik van de vector aanleiding zou geven tot ziektebeelden dan zouden de gevolgen groot kunnen zijn, maar alleen indien het ziektebeeld gepaard gaat met significante hinder of klachten.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Onder D is geconcludeerd dat er geen schadelijke effecten van de MVA vector kunnen optreden. Blootstelling van derden aan het virus kan leiden tot een locale infectie die kan resulteren in een milde locale reactie zoals eerder waargenomen in de klinische studies. De MVA vector heeft ten gevolge van de deleties een sterk verminderd gastheerbereik ten opzichte van wildtype vaccinia virus. De deleties hebben als gevolg dat de vector niet kan repliceren in humane cellen.

I. Mogelijke gevolgen: Deleties in het genoom van MVA kunnen niet leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat de deleties in het genoom van MVA leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten op doel en niet doel populaties is verwaarloosbaar klein. III. Het risico: Gezien het feit dat de deleties in het genoom van MVA niet leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten, is de kans dat de beschreven gevolgen in het milieu optreden verwaarloosbaar klein.

De kans op verspreiding van de MVA is het grootst als kort na de vaccinatie het vaccin zou lekker uit de injectieplaats. De dosis waaraan een derde wordt blootgesteld is in vergelijking met de dosis die aan de proefpersoon toegediend wordt laag als gevolg van het replicatiedeficiënte karakter van de vector en de geringe verspreiding uit de proefpersoon. Bij intramusculaire toediening is de kans op lekkage van het vaccin uit de injectieplaats minimaal. Infectie van derden kan bovendien uitsluitend optreden via wondjes in de huid. Daardoor zal een infectie van een persoon in de omgeving van de proefpersoon veel inefficiënter verlopen dan indien het vaccin direct in het lichaam geïnjecteerd wordt. De vector is in staat andere cellen te infecteren, dit effect is echter uitdovend aangezien de vector niet kan vermenigvuldigen in humane cellen. De kans dat blootstelling aan geringe hoeveelheden MVA zal leiden tot een productieve infectie in derden is derhalve verwaarloosbaar klein.


Pagina 23 / 32

F. Mogelijke effecten op menselijke en diergezondheid ten gevolge van consumptie Er zal uitsluitend sprake van consumptie zijn indien het een toepassing op dieren betreft, en de proefdieren na afloop van het experiment voor menselijke consumptie of als diervoeder worden aangeboden. Alleen in dat geval wordt dat aspect in beschouwing genomen. Daarbij moet worden nagegaan in hoeverre consumptie van de tot expressie gebrachte genproducten kunnen leiden tot gezondheidsschade voor mens of dier.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Er is geen sprake van consumptie. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Het is uitgesloten dat er schadelijke effecten optreden.

I. Mogelijke gevolgen: Niet van toepassing. II. De waarschijnlijkheid: Niet van toepassing. III. Het risico: Niet van toepassing.

G. Effecten op microbiële populaties in mens, dier of milieu In het algemeen wordt hieronder verstaan de negatieve effecten die GGO’s kunnen hebben op (micro-) organismen die voorkomen als commensalen, of die verantwoordelijk zijn voor kringlopen van nutriënten of afbraak van organisch materiaal. De vraag is hier of de deleties in de MVA vector een effect kunnen hebben op andere microbiële populaties in mens, dier of het milieu. MVA infectie kan alleen plaatsvinden in dierlijke cellen. Effecten op microbiële populaties in het milieu kunnen daarmee worden uitgesloten.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Het in deze studie te gebruiken vector zal, zoals kenmerkend is voor virussen, buiten een dierlijke gastheer geen activiteit vertonen.

I. Mogelijke gevolgen: Er zijn geen gevolgen te verwachten.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Er zijn geen potentiële effecten geïdentificeerd. De vraag naar de waarschijnlijkheid is daarom niet relevant.

III. Het risico: Het risico is verwaarloosbaar klein.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Het vaccinia virus is in eerste instantie gebruikt voor pokkenvaccinatie. Infectie met het vaccinia virus worden meestal goed verdragen, hoewel in sommige gevallen ernstige bijwerkingen kunnen optreden. MVA is wereldwijd toegediend aan meer dan 120.000 personen voor pokkenvaccinatie zonder dat daarbij melding is gemaakt van ernstige complicaties. Aangezien de vector verminderd virulent is ten opzichte van wildtype vaccinia virus, zullen er geen gevolgen zijn voor de behandelmethoden die beschikbaar zijn in de huidige medische of veterinaire praktijk.

I. Mogelijke gevolgen: Er zijn geen gevolgen te verwachten.

II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid is verwaarloosbaar klein.

H. Veranderingen in de medische of veterinaire praktijk Mogelijke onmiddellijke en/of vertraagde, directe en indirecte milieueffecten van de veranderde medische en veterinaire praktijk ten gevolge van de toepassing van de GGO’s. Hieronder wordt verstaan dat de toepassing van het GGO kan leiden tot een verminderd effect en afgenomen toepasbaarheid van geneesmiddelen. De vraag is of de zes deleties in het genoom van MVA zullen leiden tot veranderingen in de medische praktijk.

II. De waarschijnlijkheid: De vraag naar waarschijnlijkheid is daarom niet relevant. III. Het risico: Het risico is verwaarloosbaar klein.



Pagina 24 / 32

Tabel 2.3 milieurisicoanalyse van de HA sequentie (één van de genen HA1 t/m HA16 van influenza A) Bepaling van eigenschappen die schadelijke effecten kunnen hebben (Identificatie en toelichting “oorzaak-gevolg” relaties)



(rekening houdend met de wijze van introductie en het introductie milieu) A. Persistentie en invasiviteit Bij de bepaling van het milieurisico van veranderde persistentie en invasiviteit van een GGO toegepast in medisch en veterinair onderzoek gaat het om de bepaling van mogelijke effecten van de genetische modificatie op het gastheerbereik, de infectiviteit, en de pathogeniteit en virulentie voor potentiële gastheren (mensen en dieren) in het milieu. Van een hogere persistentie en invasiviteit van een virale vector (i.e. het GGO) ten opzichte van het natuurlijk voorkomende wildtype virus waarvan het is afgeleid, kan sprake zijn indien het GGO na toediening aan een proefpersoon of proefdier, langer dan het wildtype virus in een actieve vorm aanwezig kan blijven, en er vervolgens shedding kan plaatsvinden van infectieuze deeltjes van het GGO in, en deze shedding leidt tot infectie van andere organismen. Daarbij moet in beschouwing genomen worden dat het GGO door de genetische modificatie veranderd kan zijn in zijn weefseltropisme, gastheerbereik, en in de mate van infectiviteit en virulentie. Hierbij spelen onder andere de mogelijkheden voor replicatie en transmissie een rol. Deze veranderingen kunnen leiden tot een gewijzigd ziektebeeld in gastheren die vatbaar zijn voor infectie door het wildtype virus, of tot uitbreiding van de ziekte naar nieuwe gastheren. De gekloneerde HA sequentie is één van de genen HA1 t/m HA16 afkomstig van influenza A. De verschillende HA varianten hebben in de natuurlijke context een volkomen identieke functie, namelijk binding van het virus-partikel aan de gastheercel en membraan fusie van de virus membraan en de endosomale membraan. De vraag is of expressie van het HA gen leidt tot een verandering in weefseltropisme, gastheerbereik en in de mate van infectiviteit en virulentie van de virale vector in vergelijking Ministerie van IenM IM 12-001/00

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Het vaccinia virus kan repliceren in runderen en mens. Infectie met het vaccinia virus wordt meestal goed verdragen. Zoals beschreven in tabel 2.2 kunnen in uitzonderlijke gevallen ernstige en soms levensbedreigende complicaties optreden. De MVA vector is ten opzichte van het vaccinia virus sterk geattenueerd en heeft zes grote deleties in het genoom. Hierdoor is het gastheerbereik van MVA sterk verminderd en kan de MVA alleen repliceren in baby hamster kidney cellen (BHK-21) en in CEF cellen. In humane cellen is MVA replicatiedeficiënt. In omstandigheden dat er nieuwe virusdeeltjes gevormd worden (in geval van complementatie met wildtype vaccinia virus zoals beschreven in tabel 2.2) of in dieren waarin het virus kan repliceren (kippen), is het de vraag of de geproduceerde HA eiwitten onderdeel gaan uitmaken van de envelop van de deeltjes, of op een andere manier invloed kunnen hebben op de virusbiologie van de vector. Indien verhoogde persistentie of invasiviteit, of een uitbreiding van het gastheerbereik van de vector aanleiding zou geven tot ziektebeelden dan zouden de gevolgen groot kunnen zijn, maar alleen indien het ziektebeeld gepaard gaat met significante hinder of klachten. De mogelijke schadelijke effecten van HA worden onder onderdeel D van deze tabel besproken.

I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van een eventueel veranderde persistentie of invasiviteit van de vector kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat de insertie van de HA sequentie leidt tot wijzigingen in persistentie of invasiviteit is verwaarloosbaar klein. III. Het risico: Het risico van verhoging van de persistentie of de invasiviteit bij toepassing van GGO als virale vector voor de expressie van de HA sequentie, is verwaarloosbaar klein.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Er is geen reden is om te veronderstellen dat het HA genproduct een interactie heeft met de MVA virusbiologie. De vorming van de envelop van influenzavirussen en pokkenvirussen zoals MVA verloopt op zeer verschillende wijze. Pagina 25 / 32

met wildtype vaccinia virus. Hierbij moet in beschouwing genomen worden dat de MVA vector een zestal genen ter grootte van totaal 31 kilobasen mist ten gevolge van veelvuldige passages in CEF cellen. Om een rol te kunnen spelen in de virusbiologie van de vector zou het genproduct van het HA gen op een of andere manier een activiteit moeten hebben die de afwezige genen in MVA zou kunnen complementeren.

In influenza virus partikels is de virale envelop afkomstig van het cellulaire membraan van de gastheercel waarin de oppervlakte eiwitten HA en NA zijn geïncorporeerd. De functie van het HA eiwit is dan ook toegespitst op de incorporatie in de plasmamembraan. Bij pokkenvirussen inclusief MVA verkrijgen zogenaamde “primaire intracellulaire virions” met één lipide membraan twee additionele lipide membranen in het transGolgi netwerk en het endosoom van de cel. De aldus gevormde “intracellulaire enveloped virions” worden naar de periferie van de cel getransporteerd en fuseren met de celmembraan waarbij de buitenste membraan van het partikel wordt verloren en de uiteindelijke extracellulaire enveloped partikels met een dubbele membraan vrijkomen. De vorming van met HA gepseudotypeerd MVA virus is niet mogelijk aangezien eiwitten die zijn geïntegreerd in het plasmamembraan zoals het HA eiwit niet specifiek zullen worden getarget of geïncorporeerd in de MVA partikels. Daarbij komt dat de viruspreparaten met name naakte virions bevatten. De fragiele buitenste membranen van de extracellular enveloped virions worden tijdens de opzuivering van het vaccin verloren. In het uiterst onwaarschijnlijke geval dat het HA eiwit zou worden ingebouwd in het membraan van het MVA virus partikel zal geen effect op het tropisme worden waargenomen aangezien het tropisme van MVA al zeer breed is. Selectie van de verschillende HA subtypes is niet van invloed op de risicobeoordeling van de recombinante HA virus. De verschillende HA varianten hebben in de natuurlijke context een volkomen identieke functie, namelijk binding van het viruspartikel aan de gastheercel en membraan fusie van de virus membraan en de endosomale membraan. Aangezien het HA eiwit niet zal worden geïncorporeerd in de MVA virale envelop en het gezien de normale functie van het structurele HA eiwit zeer onwaarschijnlijk dat de additie van dit eiwit invloed zal hebben op de blokkade van morfogenese van MVA in zoogdiercellen is het gastheerbereik van het GGO ongewijzigd ten opzichte van het gastheerbereik van de uitgangsvector. Op basis van deze gegevens kan worden uitgesloten dat de virale eigenschappen van de vector veranderd zullen worden door expressie van de HA sequentie. De kans dat expressie van de HA sequentie enig effect heeft op het gastheerbereik, de infectiviteit of de pathogeniteit, of de virulentie voor potentiële gastheren van de vector (mensen en dieren) in het milieu, is daarom verwaarloosbaar klein.


Pagina 26 / 32

B. Selectieve voordelen Voor de milieurisicoanalyse van een GGO toegepast in medisch of veterinair onderzoek zijn die selectieve voordelen relevant die leiden tot verhoogde persistentie en invasiviteit. De oorzaak-gevolg relaties die hierbij een rol spelen zijn behandeld onder A. Het is onder dit onderdeel de vraag of expressie van de HA sequentie leidt tot selectieve voordelen die een verandering in weefseltropisme, gastheerbereik en in de mate van infectiviteit en virulentie van de virale vector in vergelijking met wildtype vaccinia virus. Hierbij moet in beschouwing genomen worden dat de MVA vector een zestal genen ter grootte van totaal 31 kilobasen mist ten gevolge van veelvuldige passages in CEF cellen. Om een rol te kunnen spelen in de virusbiologie van de vector zou het genproduct van de geïnserteerde HA sequentie op een of andere manier een activiteit moeten hebben die de afwezige genen in MVA zou kunnen complementeren.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Evenals onder A geldt dat indien verhoogde persistentie of invasiviteit, of een uitbreiding van het gastheerbereik van de vector aanleiding zou geven tot ziektebeelden dan zouden de gevolgen groot kunnen zijn, maar alleen indien het ziektebeeld gepaard gaat met significante hinder of klachten. Het is uiterst onwaarschijnlijk dat expressie van HA een effect zal hebben op de virusbiologie van de vector. Een toegenomen virulentie is dan ook zeer onwaarschijnlijk. De mogelijke schadelijke effecten van HA worden onder onderdeel D van deze tabel besproken. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect De waarschijnlijkheid dat er als gevolg van selectieve voordelen een verhoogde kans op het optreden van en mogelijk schadelijk effect ontstaat, is verwaarloosbaar klein.

I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van selectieve voordelen kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat de genetische modificatie leidt tot selectieve voordelen is te verwaarlozen. III. Het risico: Het risico van selectieve voordelen bij toepassing van het GGO als virale vector voor de expressie van de HA sequentie is verwaarloosbaar klein.

C. Kans op genoverdracht op andere soorten en de kans dat hierdoor selectieve voor of nadelen op deze soorten worden overgedragen Genoverdracht op andere soorten kan plaatsvinden door (homologe) recombinatie. Op de eerste plaats wordt in beschouwing genomen of er overdracht van genetisch materiaal plaats kan vinden van het GGO naar andere virussen. Die kans is op de eerste plaats afhankelijk van de aanwezigheid van een verwant virus binnen het zelfde celcompartiment waarin het GGO zich bevindt. Vervolgens zijn de kans op recombinatie en de eigenschappen van het gevormde product afhankelijk van de genetische opbouw van het GGO. Van een mogelijk gevormde recombinant moet vervolgens worden nagegaan in hoeverre hieruit selectieve voor- of nadelen voortvloeien. Onder dit onderdeel wordt de vraag gesteld of de HA sequentie kan worden overgedragen van de MVA vaccinvector naar andere virussen en of dit vervolgens voor deze virussen kan leiden tot een selectief voor- of nadeel. Selectieve voor- of nadelen kunnen alleen optreden als de expressie van de HA sequentie vervolgens een interactie hebben met de virale levenscyclus.


I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Er dient te worden nagegaan of er een mogelijkheid bestaat tot recombinatie tussen de HA sequenties uit de MVA vaccinvector en in de proefpersonen of in derden aanwezige influenzavirussen. Aan een dergelijke uitwisseling zijn mogelijk schadelijke gevolgen verbonden, omdat de ontstane virussen in sequentie verschillen met de uitgangsvirussen (influenza). II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect De waarschijnlijkheid van het optreden van incorporatie van het influenza gen in wildtype influenza virussen door recombinatie of reassortment in de proefpersonen, derden of niet-doelwit organismen is verwaarloosbaar klein. Reassortment kan worden uitgesloten vanwege het feit dat uitsluitend de coderende regio van het HA gen in de MVA vector is geïncorporeerd. De niet-coderende regio’s van HA zijn noodzakelijk voor het inpakken van het gen in een influenza partikel. Er zijn bovendien meerdere fysieke obstakels voor recombinatie en/of reassortment, aangezien injectie van MVA-HA in de bovenarm plaatsvindt en influenzavirussen zich in de luchtwegen bevinden en de RNAs van de MVA en influenza virussen zich respectievelijk in het cytoplasma en de kern van de cel zullen bevinden.

I. Mogelijke gevolgen: De gevolgen van genoverdracht kunnen groot zijn, afhankelijk van de ernst van het ziektebeeld dat erdoor wordt veroorzaakt, in de normale gastheer, of, als er sprake is van een uitbreiding van het gastheer bereik, in een nieuwe gastheer. II. De waarschijnlijkheid: De HA sequentie kan niet naar andere soorten worden overgedragen. III. Het risico: Het risico van genoverdracht op andere soorten is verwaarloosbaar klein.

Pagina 27 / 32

Zoals in tabel 2.2 geconcludeerd is, is zowel het risico van coinfectie en dat hierdoor recombinatie van MVA met wildtype vaccinia virussen optreedt als het optreden van kiembaanoverdracht (verticale transmissie) verwaarloosbaar klein. De aanwezigheid van de HA sequentie heeft hier geen invloed op.


Pagina 28 / 32

D. Effecten op doel en niet doel populaties Effecten op de proefpersonen die aan de studie deelnemen (doelpopulatie) vallen niet onder het toetsingskader van de milieuregelgeving en worden om die reden hier niet direct in beschouwing genomen. De effecten op de proefpersoon vallen onder de medische verantwoordelijkheid van de behandelend arts. Effecten op niet doelpopulaties zullen alleen op kunnen treden indien er sprake is van verspreiding van het GGO in de omgeving van de proefpersoon. Een aantal aspecten betreffende pathogene effecten is al in beschouwing genomen onder A. In dit onderdeel worden de eventuele effecten van het GGO beoordeeld op doel en niet-doel populaties in de omgeving van de proefpersoon. Bij de beoordeling moet rekening worden gehouden met de te verwachten blootstellingsweg en mate van blootstelling. De vraag is welke effecten de HA sequentie kan hebben in doel en niet-doelpopulaties. Met effecten worden schadelijke en niet-schadelijke, zoals onder andere toxische en allergene, effecten bedoeld met uitzondering van gezondheidseffecten. Specifieke gezondheidseffecten voor de mens worden onder onderdeel E besproken. Hiervoor moet worden nagegaan wat er bekend is over de effecten die het HA gen kan hebben op de mens.


I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Afhankelijk van de mate en wijze van blootstelling kunnen er bij een mens en dieren in de omgeving van de proefpersoon effecten optreden. Het gekloneerde HA gen in het GGO speelt een rol bij de virusbiologie van het influenza virus. De verschillende HA varianten hebben in de natuurlijke context een volkomen identieke functie, namelijk binding van het virus-partikel aan de gastheercel en membraan fusie van de virus membraan en de endosomale membraan. De HA genen en de daardoor gecodeerde HA eiwitten zijn buiten de context van een influenza virus onschadelijk. Expressie van een enkel individueel influenza gen kan geen ziekte veroorzaken die vergelijkbaar is met door influenza veroorzaakte ziekten. Expressie van de HA sequentie zal kunnen leiden tot een immuunrespons tegen het specifieke HA eiwit.

I. Mogelijke gevolgen: Expressie van de HA1-16 kunnen geen ziekte veroorzaken, maar zal hooguit leiden tot het optreden van een immuunrespons II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat expressie van de HA1-16 genen leidt tot het optreden van (schadelijke) effecten op doel en niet doel populaties is verwaarloosbaar klein. III. Het risico: Het risico van effecten op doel en niet doel populaties is verwaarloosbaar klein.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Het vaccin wordt intramusculair toegediend in de bovenarm. De proefpersonen zullen een, twee of drie injecties ontvangen (met tussenpozen va 3-4 weken) met een standaard dosis van 108 p.f.u, of een 10 of 100 maal lagere dosis (107 of 106 pfu). De kans op verspreiding van de MVA vaccinvector is het grootst als kort na de vaccinatie, het vaccin zou kunnen lekker uit de injectieplaats. Infectie van derden kan vervolgens uitsluitend optreden via wondjes in de huid. De vector is in staat andere cellen te infecteren, dit effect is echter uitdovend aangezien de vector zich in humane cellen niet kan vermenigvuldigen. De dosis waaraan een derde wordt blootgesteld is in vergelijking met de dosis die aan de proefpersoon toegediend wordt laag als gevolg van het replicatiedeficiënte karakter van de vector. Expressie van de HA sequentie zal kunnen leiden tot een immuunrespons tegen het specifieke HA eiwit. In eerdere klinische studies met DNA coderend voor HA van verschillende subtypes (H3, H5) als vaccin is aangetoond dat zowel DNA-H3 en DNA-H5 veilig, goed te verdragen en immunogeen zijn en niet leiden tot een schadelijk of ziekteverwekkend effect. De kans dat blootstelling van derden zal optreden en dat dit zal leiden tot een schadelijk of ziekteverwekkend effect is derhalve verwaarloosbaar klein. Blootstelling van dieren door infectie via kleine wondjes in de huid zou kunnen resulteren in soortgelijke locale reacties zoals beschreven voor de mens. Verspreiding van MVA-HA virus van een gevaccineerde naar zoogdieren of vogels is echter Pagina 29 / 32

onwaarschijnlijk aangezien het virus ook dieren uitsluitend via wondjes van de huid kan infecteren. Als het virus met de intacte huid in contact komt kan geen infectie optreden. In het onwaarschijnlijke geval dat een dier toch geïnfecteerd wordt zal expressie van de HA kunnen leiden tot een immuunrespons. In preklinische studies in muizen en makaken is vaccinatie van MVA met een HA insertie van influenza A veilig bevonden. Ook in kippen, waarin MVA mogelijk kan repliceren werd een relatief hoge dosis van een MVA vaccin met H5 insertie goed verdragen. De kans dat blootstelling van dieren zal optreden en dat dit zal leiden tot een schadelijk of ziekteverwekkend effect is derhalve verwaarloosbaar klein.

E. Mogelijke effecten op menselijke gezondheid Aspecten gerelateerd aan de pathogeniteit van het GGO zijn reeds aan de orde geweest in onderdeel A. Daar werd de vraag gesteld of expressie van de gekloneerde HIV genen door het GGO leidt tot verandering in weefseltropisme, gastheerbereik, en in de mate van infectiviteit en virulentie van de virale vector in vergelijking met wildtype adenovirus Aspecten gerelateerd aan toxiciteit of allergeniteit en andere gezondheidsgerelateerde effecten op doel en niet-doel organismen zijn onder D behandeld. In dit onderdeel worden de eventuele effecten van het GGO beoordeeld op de menselijke gezondheid in de omgeving van de proefpersoon. Elementen die daarbij in beschouwing genomen moeten worden zijn toxiciteit of andere schadelijke effecten zoals een effect van het GGO op het immuunsysteem, en allergeniteit van het genproduct. Bij de beoordeling moet rekening worden gehouden met de te verwachten blootstellingsweg en mate van blootstelling. De vraag is welke effecten de HA sequentie kan hebben op de gezondheid van de mens. Hiervoor moet worden nagegaan wat er bekend is over de effecten die het HA gen kan hebben op de mens.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt In onderdeel A is beschreven dat de kans dat expressie van het HA gen enig effect heeft op het gastheerbereik, de infectiviteit of de pathogeniteit, of de virulentie voor potentiële gastheren van de vector (mensen en dieren) in het milieu verwaarloosbaar klein is. In onderdeel D is geconcludeerd dat expressie van de gekloneerde HA genen geen ziekte kunnen veroorzaken die vergelijkbaar is met door influenza veroorzaakte ziekten. Expressie van de HA sequenties zal enkel kunnen leiden tot een immuunrespons tegen dit specifieke HA eiwit. In preklinische studies met MVA-HA vaccins zijn geen ziekteverwekkende effecten beschreven.

I. Mogelijke gevolgen: Expressie van de HA sequenties kan geen ziekte veroorzaken, maar zal hooguit leiden tot het optreden van een immuunrespons in mensen. II. De waarschijnlijkheid: De waarschijnlijkheid dat expressie van de HA sequentie zal leiden tot het optreden van (schadelijke) effecten op menselijke gezondheid is verwaarloosbaar klein. III. Het risico: Het risico van effecten op menselijke gezondheid is verwaarloosbaar klein.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect In onderdeel A is geconcludeerd dat de kans dat expressie van de HA sequenties geen effect heeft op het gastheerbereik, de infectiviteit of de pathogeniteit, of de virulentie voor potentiële gastheren van het GGO (mensen en dieren) in het milieu. In onderdeel D is geconcludeerd dat de hoeveelheid deeltjes waarmee derden via een mogelijke secundaire infectie mee in aanraking komen laag is en er sprake is van een uitdovend effect.

F. Mogelijke effecten op menselijke en diergezondheid ten gevolge van consumptie Er zal uitsluitend sprake van consumptie zijn indien het een toepassing op dieren betreft, en de proefdieren na afloop van het experiment voor menselijke consumptie of als diervoeder worden aangeboden. Alleen in dat geval wordt dat aspect in beschouwing genomen. Daarbij moet worden nagegaan in Ministerie van IenM IM 12-001/00

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Er is geen sprake van consumptie, gevolgen ten gevolge van consumptie worden daarom buiten beschouwing gelaten.

I. Mogelijke gevolgen: Niet van toepassing.

II. De waarschijnlijkheid: Niet van toepassing. Pagina 30 / 32

hoeverre consumptie van de tot expressie gebrachte genen kunnen leiden tot gezondheidsschade voor mens of dier.

II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Niet van toepassing.

III. Het risico: Niet van toepassing.

In onderhavige aanvraag is geen sprake van consumptie.

G. Effecten op microbiële populaties in mens, dier of milieu In het algemeen wordt hieronder verstaan de negatieve effecten die GGO’s kunnen hebben op (micro-) organismen die voorkomen als commensalen, of die verantwoordelijk zijn voor kringlopen van nutriënten of afbraak van organisch materiaal.

I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt Het in deze studie te gebruiken vector zal, zoals kenmerkend is voor virussen, buiten een gastheer geen activiteit vertonen.

De vraag is of het expressie van de HA sequentie een effect hebben op andere microbiële populaties in mens, dier of het milieu. Expressie van de genen kan alleen plaatsvinden in dierlijke cellen. Effecten op microbiële populaties in het milieu kunnen daarmee worden uitgesloten.


I. Mogelijke gevolgen: Er worden geen gevolgen verwacht. II. De waarschijnlijkheid: Er zijn geen potentiële effecten geïdentificeerd. De vraag naar de waarschijnlijkheid is daarom niet relevant. III. Het risico: Er bestaat geen risico dat expressie van de HA sequentie leidt tot nadelige effecten op microbiële populaties in mens dier of milieu.

H. Veranderingen in de medische of veterinaire praktijk Mogelijke onmiddellijke en/of vertraagde, directe en indirecte milieueffecten van de veranderde medische en veterinaire praktijk ten gevolge van de toepassing van de GGO’s. Hieronder wordt verstaan dat de toepassing van het GGO kan leiden tot een verminderd effect en afgenomen toepasbaarheid van geneesmiddelen. De vraag is of de expressie van de HA sequentie zal leiden tot veranderingen in de medische praktijk.


I. Evaluatie van mogelijke gevolgen van het schadelijke effect, indien het optreedt In onderdeel E is geconcludeerd dat er geen ziekteverwekkende effecten bekend zijn uit resultaten van klinische studies met op MVA gebaseerde vaccins en met HADNA vaccins. De HA sequentie zal geen gevolgen hebben voor de behandelmethoden die beschikbaar zijn in de huidige medische of veterinaire praktijk. II. Waarschijnlijkheid van het optreden van het schadelijke effect Er zijn geen potentiële (schadelijke) effecten geïdentificeerd op de medische of veterinaire praktijk. De vraag naar de waarschijnlijkheid is daarom niet relevant.

I. Mogelijke gevolgen: Er zijn geen (schadelijke) gevolgen te verwachten voor de medische of veterinaire praktijk. II. De waarschijnlijkheid: Er zijn geen potentiële effecten geïdentificeerd. De vraag naar de waarschijnlijkheid is daarom niet relevant. III. Het risico: Er bestaat geen risico dat expressie van de HA sequentie leidt tot nadelige effecten op de medische of veterinaire praktijk.

Pagina 31 / 32

DEEL 3. BEPALING VAN HET ALGEHELE RISICO VAN HET GGO Hieronder wordt de milieurisicoanalyse van de voorgestelde introductie van MVA met HA gensegment van influenza A uitgevoerd. Potentieel significante risico’s zijn die risico’s waarvan niet is vastgesteld dat deze risico’s geen significante effecten hebben.

Schatting van het risico dat aan de toepassing van alle ingebrachte sequenties is verbonden Zowel voor de gebruikte vector (MVA) als voor het hierin gekloneerde HA gensegment (één van de genen HA1-HA16 van influenza A) is geconcludeerd dat er geen sprake is van een risico voor mens en milieu. De kans op verspreiding van het GGO in het milieu is het grootst bij lekkage van het GGO uit de injectieplaats kort na de toediening aan de proefpersoon. Ten gevolge hiervan kunnen derden mogelijk aan het GGO worden blootgesteld en kan zelfs infectie van derden niet op voorhand worden uitgesloten. De schadelijke effecten die dien ten gevolge kunnen optreden zullen echter ook dan verwaarloosbaar klein zijn.


Strategieën voor risicobeheer bij de doelbewuste introductie van de GGO’s.

Bepaling van het algehele risico van het GGO

(Eventuele aanvulling op strategieën die reeds zijn opgenomen in de aanvraag) Aangezien er geen risico’s zijn geconstateerd die groter worden geschat dan verwaarloosbaar klein, is risicomanagement uit oogpunt van milieuveiligheid niet noodzakelijk.

Pagina 32 / 32

Verwaarloosbaar klein

Milieurisicoanalyse bij de aanvraag IM Datum: 12 oktober 2012

Recommend Documents