MIKROSZKÓPIA "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)
MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉLŐVILÁGBAN
MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉLŐVILÁGBAN
MIKROSZKÓPIA
MIKROSZKÓPIA
1590
2009
A FÉNY
Fény: Az elektromágneses spektrum látható tartománya. Elemi részecskékből (fotonokból) álló, rendezett, több síkban haladó térbeli hullám. Monokromatikus fény: olyan fény, amelyben csak egyetlen hullámhosszúságú sugarak vannak. Összetett fény: Több, különféle hullámhosszúságú fényhullám keveréke. A látható fény hullámhossztartománya nagyjából 400-750 nm.
A FÉNY
A fény hullámtani jellemzői:
Hullámhossz, (λ): egy adott frekvenciájú hullám ismétlődő egységei (pl. csúcsok) közti távolság. Frekvencia: Az egy másodperc alatti rezgések száma. Amplitúdó: A rezgés hullámok csúcsa és közepe közti távolság, vagyis a hullámok kitérésének mértéke
A LÁTHATÓ FÉNY KOMPONENSEI
A MIKROSZKÓP FELÉPÍTÉSE okulár
objektív
makrométer csavar mikrométer csavar
tárgyasztal kondenzor diafragma fényforrás
A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA
A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA A mikroszkóp nagyítása egyenlő az objektív és okulár nagyításának szorzatával:
Okulár: 5-30 x nagyítás Objektív: 4-100 x nagyítás a színkorrekció jelzése
Maximum nagyítás : 3000X
az immerzió jelzése
a numerikus apertúra értéke
az objektív nagyítása
javasolt fedőlemez vastagság
mechanikus tubushossz (mm)
a különleges rendeltetés jelzése immerziós jelzőcsík
az objektív frontlencséje
HASZNOSÍTHATÓ-E A MAXIMÁLIS NAGYÍTÁS?
A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE FELBONTÓKÉPESSÉG,( ) : ~0.25 m a legkissebb távolság a minta két, még éppen megkülönböztethető pontja között. A felbontóképesség annál jobb, minél közelebbi pontok különböztethetőek meg egymástól.
A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE A mikroszkóp felbontóképessége, ( ) :
( )=
2A
fényhullámhossz numerikusappertura
objektív
tárgy
A = n·sinα n: a tárgyat takaró fedőlemez és a frontlencse közötti közeg törésmutatója. n értéke levegőre n=1, desztillált vízre n=1,33, cédrusolajra n=1,51. α: az optikai főtengely és a legszélső fénysugár által bezárt szög (az objektív nyílásszögének a fele)
FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHETŐSÉGEI
(i) A számlálóban szereplő érték csökkentése, vagyis rövidebb hullámhosszúságú fény alkalmazása. Ultraibolya fény alkalmazásával a felbontókpesség akár 0,1 μm-re
csökkenthető, ám mivel költséges kvarc lencséket kell alkalmazni és olyan detektort, amely érzékeli az ultraibolya fényt, az ultraibolyafénymikroszkópot ritkán használják.
FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHETŐSÉGEI (ii) A nevező, vagyis a numerikus apertúra értékének növelése. n növelése: A fedőlemez és a frontlencse közé a levegőnél nagyobb törésmutatójú anyagot cseppentünk, és a frontlencsét a folyadékcseppbe merítjük. Ezeket a lencséket (leggyakrabban a 100-szoros nagyítású objektíveket), immerziós (bemerülő) objektíveknek nevezzük. Az immerziós folyadék leggyakrabban cédrusolaj. Az olajos objektívek az ún. olajimmerziós, vagy más néven homogén immerziós objektívek (jelük HI). Ha az objektíven a WI jel van, az objektív és a fedőlemez közé desztillált vizet kell csöppenteni. Cédrus olaj (n=1,51) használata esetén a numerikus apertúra értéke 1,43 (sin72 =0,95; 0,95x1,51= 1,43, vagyis ekkor a fénymikroszkóp felbontása 0,28 μm).
növelése: A lencse fél nyílásszögét hozzávetőleg 72 -ig lehet fokozni, mert a nagyobb beesési szöggel érkező fénysugarak már teljes visszaverődést szenvednek. Minthogy a levegő törésmutatója 1, a legjobb felbontású száraz objektívek numerikus apertúrája 0,95.
MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS
objektív mikrométer
okulár mikrométer
MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS
hajszál
objektív mikrométer skála
okulár mikrométer skála mikrométer
okulár mikrométer skála
Speciális mikroszkópos vizsgálati módszerek
1. 2. 3. 4.
Fáziskontraszt mikroszkópia Fluoreszcens mikroszkópia Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia Elektron mikroszkópia
Fáziskontraszt mikroszkópia A biológiai minták jelentős része átlátszó, ha hagyományos fénymikroszkóppal vizsgáljuk. A fáziskontraszt mikroszkóp képes a kontraszt növelésére festetlen minták esetében, a felbontóképesség jelentős csökkentése nélkül. A fáziskontraszt mikroszkópot elsősorban élő, festetlen minták vizsgálatára használjuk. Fritz Zernike 1953-ban Nobel díjat kapott a fázis kontraszt mikroszkóp feltalálásáért. A minta optikailag sűrűbb részén áthaladó, fáziskésést szenvedett, elhajlott fénysugarak útja elválik a mintán elhajlás nélkül áthaladó fénysugarakétól, melyeket az objektív fázislemeze „felgyorsít” . A két fénysugárpopuláció interferenciája kontrasztos képet eredményez, ahol az optikailag sűrűbb részek sötétebbek.
Élő sejtek hagyományos fény (a) és fáziskontraszt mikroszkóppal (b) vizsgálva
Fázis kontraszt mikroszkópia
fázislemez
fázisgyűrű
Fázis kontraszt mikroszkópia
fázislemez
baktérium a minta által megtört fénysugarak 1/4 fáziskésést szenvednek
a minta által megtört fénysugarak 1/2 fáziskésést szenvednek
kioltás
a nem érzékelhető fáziskülönbségek szemmel látható amplitúdó változássá alakulnak
Fluoreszcens mikroszkópia/ Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia
ultraibolya
Látható fény
Hullámhossz (nanométer)
infravörös infravörös
Megtermékenyítés: spermium aszter, hím és női pronukleusz
Mikrotubulus DNS Centroszóma
Transzfektált sejtkultúra
DNS microtubulus aktin
Mikroszkópia: múlt és jelen vékonybél keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés
vékonybél keresztmetszet, immunofluoreszcens festés
Mikroszkópia: múlt és jelen here keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés
here keresztmetszet, immunofluoreszcens festés
Fluoreszcencia
Fluoreszcencia -egy atom vagy molekula külső sugárzás hatására átmenetileg gerjesztett állapotba kerül, majd alacsonyabb energiájú (nagyobb hullámhosszú) fotont bocsájt ki (emittál). A fluoreszcens abszorpció és emisszió egy . nanoszekundumon belül játszódik le.
Fluoreszcens Mikroszkópia
A fluoreszcens mikroszkópia napjaink leggyorsabban fejlődő mikroszkópiás technikája, mind az orvostudomány, mind a biológiai kutatások nélkülözhetetlen eszköze. Legfontosabb alkalmazási területe a különböző makromolekulák térbeli és időbeli elhelyezkedésének vizsgálata sejt/szövet szinten. Használják még többek között fehérje interakciók vizsgálatára, de a sejten belüli pH és ionkoncentrációk meghatározására is.
A fluoreszcens mikroszkóp felépítése
A fluoreszcens filter kocka felépítése
Gerjesztő szűrő (exciter filter): a higanygőz/xenon lámpa fényének csak meghatározott tartományát engedi a vizgálandó mintára. Határoló szűrő (barrier filter): csak a megfelelő hullámhosszú emittált fénysugarakat engedi át a detektor felé, a gerjesztő sugarakat kiszűri. Dikroikus tükör (dichroic mirror): visszaveri a gerjesztő, átengedi az emittált fénysugarakat.
Fluorokrómok
Fluorokróm – Természetes vagy szintetikus, fluoreszcenciára képes molekula. A fluorokrómok delokalizált elektronrendszere felelős a specifikus abszorbcióért és emisszióért.
Fluorokrómok
Fluorokrómok
Bovine pulmonary artery endothelial cells visualized using components of the SelectFX Nuclear Labeling Kit and Alexa Fluor phalloidin conjugates. Nuclei and F-actin were stained, respectively, with (top left) DAPI and Alexa Fluor 680 phalloidin, (top right) SYTOX Green dye and Alexa Fluor 568 phalloidin, (bottom left) 7-AAD and Alexa Fluor 488 phalloidin, and (bottom right) TO-PRO-3 dye and Alexa Fluor 350 phalloidin.
Sejtorganellum/DNS/Ca2+ próbák Sejtorganellum próbák:
Mitokondrium: MitoTracker and MitoFluor Lizoszóma: LysoTracker and LysoSensor Golgi apparátus: BODIPY
Endoplazmatikus retikulum: DiOC, Blue-White DPX
DNS: Acridine orange, Propidium iodide, DAPI, Hoechst
Ca2+: fura-2 and indo-1, fluo-3, fura red
endotél sejt. mitochondrium vörös, peroxiszóma zöld, sejtmag kék.
Immunofluoreszcens Mikroszkópia
Immunofluoreszcens Mikroszkópia
Immunofluoreszcens Mikroszkópia
MT DNS CS
Fluoreszcens fehérjék Green Fluorescent Protein (GFP) - Medúzából származó fluoreszcens fehérje. Használjuk fehérjék elhelyezkedésének, koncentrációjának , kölcsönhatásainak és dinamikájának meghatározására élő sejtekben/szövetekben. Gyakorlatilag bármely fehérjét nyomon tudunk követni ha hozzá GFP-t fuzionáltatunk. Genetikailag módosított GFP variánsok, mint YFP (sárga), cián (CFP) léteznek a megfelelő irányba eltolt emissziós spektrummal (lásd FRET). DsRed -Vörösben emittáló fluoreszcens fehérje
Fluorescent Proteins
Tubulin-GFP
vizsgálandó gén
GFP-FÚZIÓS FEHÉRJÉK plazmid GFP génnel
transzfekció
fúziós fehérje zöld fényt bocsájt ki kék gerjesztőfény hatására, a fehérjét nyomonkövethhe tjük élő sejtben
GFP
transzkripció, transzláció
Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia
A konfokális mikroszkóp segítségével a hagyományos fluoreszcens mikroszkópnál mélyebben lehet behatolni a sejtekbe/szövetekbe. A mintát lézer gerjeszti pontonkként, x-y irányban pásztázva. Az emittált fotonokat egy fotoelektron sokszorozó detektálja. A mintából vékony optikai metszetek sorozatát készítjük, ugyanis a detektor előtti csapnyílások kiszűrik a más fókuszsíkokból jövő zavaró fluoreszcenciát. Az optikai metszetekből a vizsgált minta háromdimenziós szerkezete számítógéppel meghatározható.
a konfokális mikroszkóp fényútja fókuszban levő emittált sugár lézer
fotoelektron fotoelektron sokszorozó sokszorozó detektor detektor detektor csapnyílás
fókuszon kívüli emittált sugarak dikroikus tükör
objektív minta fókuszsíkok
gerjesztő sugár
Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp
75 millió Ft
Fényforrások fluoreszcens/konfokális mikroszkópiához
Fluoreszcens és konfokális képminőség összehasonlítása
Z-szeletelés
Z-szeletelés
Drosophila Egg Chamber
Z-szeletelés
Drosophila Egg Chambers
3D Rekonstrukció
Z-szeletelés után a mikroszkóphoz kapcsolt számítógép segítségével a minta térbeli szerkezete modellezhető, a minta térbeli képét bármilyen irányből vizsgálhatjuk.
3D Rekonstrukció
Drosophila Egg Chambers
4D képalkotás
A konfokális mikroszkópot be lehet programozni hogy tetszőleges időnként készítsen képeket az élő mintáról. Az igy készült képekből mozi fájlokat készítünk.
4D képalkotás
Tubulin-GFP
4D képalkotás
Tubulin-GFP, Histon-RFP
Drosophila embryonic divisions
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Elsősorban fehérje-fehérje interakciók valós idejű megfigyelésére alkalmas módszer. Mindkét ”interakció
gyanús” fehérjéhez fluorokrómot kapcsolunk. Leggyakrabban CFP-t az egyikhez, YFP-t a másikhoz. Ha van interakció CFP-t gerjesztve a YFP emisszió mértéke nő
meg, ha nincs, a CFP emisszió nő. Lásd ábra.
FRET: fluorescence resonance energy transfer
CFP CFP YFP YFP
FISH Fluoreszcens in situ Hibridizáció fluoreszcensen jelölt DNS próbák hibridizálása genomiális DNS- hez, szekvenciák lokalizációjára, génátrendeződések vizsgálatára használjuk. Orvosi gyakorlatban a kromoszómaszám rendellenességek (és egyéb kromoszóma mutációk) praenatalis diagnózisa a legfontosabb felhasználási területe.
ELEKTRON MIKROSZKÓPIA ‘Elektron-sugár’ forrás (Elektron ágyú) Filament
Melegítés (500 C) -
-
Wehnelt sapka (negatív potenciál)
-
-
Töltés kollektor
e-
e-
-
ee-
+++++++++++
+++++++++++ Anód (positív potenciál)
Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM) Elektorn sugár
Kondenzátor lencsék Kondenzátor apertura
Minta OBJEKTÍV Objektív apertura
Közbeiktatott lencsék PROJEKTOR Detektor
Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM)
Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM) Elektorn sugár
Első kondenzátor lencse Kondenzátor appertúra Második kondenzátor lencse Objectív apertúra Pásztázó teketrcs Erősítő/Detektor OBJEKTÍV Visszavert elektronok MINTA
Másodlagos elektronok
Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM)
