MIKROSZKÓPIA "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)
Miért is használunk a gyakorlatban mikroszkópot? Leggyakoribb mikroszkópos vizsgálati minták:
- Sejtek - Szövetek
MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉL VILÁGBAN
MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉL VILÁGBAN
MIKROSZKÓPIA
1590
2009
A FÉNY
Fény: Az elektromágneses spektrum látható tartománya. Elemi részecskékb l (fotonokból) álló, rendezett, több síkban haladó térbeli hullám. Monokromatikus fény: olyan fény, amelyben csak egyetlen hullámhosszúságú sugarak vannak. Összetett fény: Több, különféle hullámhosszúságú fényhullám keveréke. A látható fény hullámhossztartománya nagyjából 400-750 nm.
A FÉNY
A fény hullámtani jellemz i: Hullámhossz, (λ): egy adott frekvenciájú hullám ismétlődő egységei (pl. csúcsok) közti távolság. Frekvencia: Az egy másodperc alatti rezgések száma. Amplitúdó: A rezgés hullámok csúcsa és közepe közti távolság, vagyis a hullámok kitérésének mértéke
A látható fény komponensei
A LÁTHATÓ FÉNY KOMPONENSEI
A MIKROSZKÓP FELÉPÍTÉSE okulár
objektív makrométer csavar mikrométer csavar
tárgyasztal kondenzor diafragma fényforrás
A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA
A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA A mikroszkóp nagyítása egyenl az objektív és okulár nagyításának szorzatával:
Okulár: ő-30 x nagyítás Objektív: Ő-100 x nagyítás a színkorrekció jelzése
Maximum nagyítás : 3000X
az immerzió jelzése
a numerikus apertúra értéke
az objektív nagyítása
javasolt fedőlemez vastagság
mechanikus tubushossz (mm)
a különleges rendeltetés jelzése immerziós jelzőcsík
az objektív frontlencséje
HASZNOSÍTHATÓ-E A MAXIMÁLIS NAGYÍTÁS?
Optikai lencsék leképzési hibái Szférikus aberráció Gömbi eltérés az optikai lencsék egyik tipikus leképezési hibája. Domború lencsék esetében azoknál a fénysugaraknál jelentkezik, amelyek a lencse optikai tengelyétől távolabb, a lencse szélén haladnak keresztül. Mivel ott más szögben törnek meg, mint a lencse közepe felé, ezért a különböző fénysugarak nem találkoznak egy pontban: pontszerű leképezés helyett szóródási kört hoznak létre.
Optikai lencsék leképzési hibái Kromatikus aberráció (Színhiba)
A lencsék különböző mértékben törik meg a fényt az egyes hullámhosszokon, ezért a fény sugarak másképp törnek meg, aszerint, hogy milyen a színük. A tárgyról kiinduló sugarak nem ugyanazon fókusz pontra érkeznek. (Színgyűrűk keletkeznek)
A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE FELBONTÓKÉPESSÉG (d) : ~0.25 mm a legkisebb távolság a minta két, még éppen megkülönböztethet pontja között.
A felbontóképesség annál jobb, minél közelebbi pontok különböztethet ek meg egymástól.
A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE A mikroszkóp felbontóképessége, (d) :
d=
fényhullámhossz 2 A numerikusappertura
objektív
tárgy
A = n·sinα n: a tárgyat takaró fedőlemez és a frontlencse közötti közeg törésmutatója. (n értéke levegőre n=1, desztillált vízre n=1,33, cédrusolajra n=1,51.) α: az optikai főtengely és a legszélső fénysugár által bezárt szög (az objektív nyílásszögének a fele)
FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHET SÉGEI
(i) A számlálóban szereplő érték csökkentése, vagyis rövidebb hullámhosszúságú fény alkalmazása. Ultraibolya fény alkalmazásával a felbontóképesség akár 0,1 μm-re csökkenthető, ám mivel költséges kvarc lencséket kell alkalmazni és olyan detektort, amely érzékeli az ultraibolya fényt, az ultraibolyafénymikroszkópot ritkán használják.
FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHET SÉGEI (ii) A nevező, vagyis a numerikus apertúra értékének növelése. n növelése: A fedőlemez és a frontlencse közé a levegőnél nagyobb törésmutatójú anyagot cseppentünk, és a frontlencsét a folyadékcseppbe merítjük. Ezeket a lencséket (leggyakrabban a 100-szoros nagyítású objektíveket), immerziós (bemerülő) objektíveknek nevezzük. Az immerziós folyadék leggyakrabban cédrusolaj. Az olajos objektívek az ún. olajimmerziós, vagy más néven homogén immerziós objektívek (jelük HI). Ha az objektíven a WI jel van, az objektív és a fedőlemez közé desztillált vizet kell csöppenteni. Cédrus olaj (n=1,51) használata esetén a numerikus apertúra értéke 1,43 (sin72°=0,95; 0,95x1,51= 1,43, vagyis ekkor a fénymikroszkóp felbontása 0,28 μm).
a növelése: A lencse fél nyílásszögét hozzávetőleg 72°-ig lehet fokozni, mert a nagyobb beesési szöggel érkező fénysugarak már teljes visszaverődést szenvednek. Minthogy a levegő törésmutatója 1, a legjobb felbontású száraz objektívek numerikus apertúrája 0,95.
MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS objektív mikrométer
okulár mikrométer
MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS
hajszál
objektív mikrométer skála
okulár mikrométer skála mikrométer
okulár mikrométer skála
Mikroszkópos sejtszámlálás A Bürker kamra
A fedőlemez és tárgylemez közötti távolság 0,1 mm
Speciális mikroszkópos vizsgálati módszerek 1. 2. 3. 4. 5.
Fáziskontraszt mikroszkópia Polarizációs mikroszkópia Fluoreszcens mikroszkópia Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia Elektron mikroszkópia
Vizsgált mikroszkópos minták Natív minták Festett minták
(előny, hátrány)
Fáziskontraszt mikroszkópia A biológiai minták jelentős része átlátszó, ha hagyományos fénymikroszkóppal vizsgáljuk. A fáziskontraszt mikroszkóp képes a kontraszt növelésére festetlen minták esetében, a felbontóképesség jelentős csökkentése nélkül. A fáziskontraszt mikroszkópot elsősorban élő, festetlen minták vizsgálatára használjuk. Fritz Zernike 1953-ban Nobel díjat kapott a fázis kontraszt mikroszkóp feltalálásáért. A minta optikailag sűrűbb részén áthaladó, fáziskésést szenvedett, elhajlott fénysugarak útja elválik a mintán elhajlás nélkül áthaladó fénysugarakétól, melyeket az objektív fázislemeze „késleltet” . A két fénysugárpopuláció interferenciája kontrasztos képet eredményez, ahol az optikailag sűrűbb részek sötétebbek.
Élő sejtek hagyományos fény (a) és fáziskontraszt mikroszkóppal (b) vizsgálva
Fáziskontraszt mikroszkópia
fázislemez
fázisgyűrű
Fáziskontraszt mikroszkópia
baktérium a minta által megtört fénysugarak 1/Ő fáziskésést szenvednek
a minta által megtört fénysugarak 1/2 fáziskésést szenvednek
kioltás
a nem érzékelhető fáziskülönbségek szemmel látható amplitúdó változássá alakulnak
Fáziskontraszt mikroszkópia A
B
Polarizációs mikroszkópia • A közönséges fény a tér minden síkjában rezgő (sok síkban poláros) fényhullámok keveréke. B
A
A
B
A polarizált fény alkalmas anizotróp, kettős fénytörő anyagok vizsgálatára.
Polarizációs mikroszkópia Poláros fény előállítására alkalmas pl. a mészpát kristály. Ha a kristályon természetes fényt bocsátunk át, a fény két sugárra bomlik: Egyikük, az ordinárius sugár, követi a Snellius-Descartes törvényt, és a beesési síkban halad. A másik, az extraordinárius sugár nem követi a Snellius-Descartes törvényt, és kilép a beesési síkból . Az ordinárius sugár rezgési síkja a kristály főmetszetével párhuzamos, az extraordináriusé merőleges a kristály főmetszetére. Polarizációs vizsgálatnál a két sugár zavarja egymást, az egyik sugarat el kell távolítani. Nicol angol fizikus egy olyan prizmát készített, melyben az ordinárius fénysugár teljes visszaverődést szenved, az extraordinárius fénysugár viszont áthalad a kristályon és mint poláros fény lép ki.
Polarizációs mikroszkópia Régebben Nicol prizmákat alkalmaztak a polarizációs mikroszkópokban, újabban úgynevezett polarizációs szűrőket építenek be. A polarizációs szűrő két üveglemez közé ragasztott nagyon vékony hártya, amelyben tű alakú párhuzamos főtengelyű kristályok helyezkednek el sűrűn egymás mellett. A polarizációs mikroszkópok speciális alkatrészei 1. Polarizátor, amellyel a polarizált fényt állítjuk elő 2. Analizátor, amellyel a poláros fényt vizsgáljuk 3. Kerek, fokbeosztással ellátott forgatható tárgyasztal
Polarizációs mikroszkópia
Polarizációs mikroszkópia Az anyagokat fénytörésük alapján két nagy csoportra lehet osztani: (1) Az ún. izotróp anyagok a fényt egyszeresen törik. Bennük a fény minden irányban egyforma sebességgel terjed és a közeg egyetlen törésmutatóval jellemezhető. Amorf, rendezetlen szerkezetűek. Izotróp a legtöbb gáz és folyadék, valamint számos szilárd, általában nem kristályos anyag (például az üveg). Kivétel: NaCl (kősó) (2) Az ún. anizotróp anyagok a fényt kettősen törik. Bennük a beeső fény két, egymásra merőlegesen polarizált fénysugárra bomlik, amelyek a polarizációs mikroszkópban vizsgálhatók. Az anizotróp anyagok jellegzetes képviselői a kőzetek, a növényi rostok, keményítő-szemcsék, valamint a rendezett struktúrát mutató biológiai rendszerek, mint pl. a lipoproteid membránok. Polarizációs optikával való vizsgálatra csak az anizotróp anyagok alkalmasak
Polarizációs mikroszkópiás vizsgálat eredménye
Burgonya keményitő (Cirkuláris dikroizmus)
Fluoreszcens mikroszkópia/ Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia
ultraibolya
Látható fény
Hullámhossz (nanométer)
infravörös infravörös
Mikroszkópia: múlt és jelen vékonybél keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés
vékonybél keresztmetszet, immunofluoreszcens festés
Mikroszkópia: múlt és jelen here keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés
here keresztmetszet, immunofluoreszcens festés
Fluoreszcencia
Fluoreszcencia -egy atom vagy molekula külső sugárzás hatására átmenetileg gerjesztett állapotba kerül, majd alacsonyabb energiájú (nagyobb hullámhosszú) fotont bocsájt ki (emittál). A fluoreszcens abszorpció és emisszió egy . nanoszekundumon belül játszódik le.
Fluoreszcens Mikroszkópia A fluoreszcens mikroszkópia napjaink leggyorsabban fejl d mikroszkópiás technikája, mind az orvostudomány, mind a biológiai kutatások nélkülözhetetlen eszköze. Legfontosabb alkalmazási területe a különböz makromolekulák térbeli és id beli elhelyezkedésének vizsgálata sejt/szövet szinten. Használják még többek között fehérje interakciók vizsgálatára is.
A fluoreszcens mikroszkóp felépítése
A fluoreszcens filter kocka felépítése
Gerjesztő szűrő (exciter filter): a higanygőz/xenon lámpa fényének csak meghatározott tartományát engedi a vizgálandó mintára. Határoló szűrő (barrier filter): csak a megfelelő hullámhosszú emittált fénysugarakat engedi át a detektor felé, a gerjesztő sugarakat kiszűri. Dikroikus tükör (dichroic mirror): visszaveri a gerjesztő, átengedi az emittált fénysugarakat.
Fluorokrómok Fluorokróm – Természetes vagy szintetikus, fluoreszcenciára képes molekula. A fluorokrómok delokalizált elektronrendszere felelős a specifikus abszorpcióért és emisszióért.
Fluorokrómok
Immunofluoreszcens Mikroszkópia
Immunofluoreszcens Mikroszkópia
Fluoreszcens fehérjék Green Fluorescent Protein (GFP) - Medúzából származó fluoreszcens fehérje. Használjuk fehérjék elhelyezkedésének, koncentrációjának , kölcsönhatásainak és dinamikájának meghatározására élő sejtekben/szövetekben. Gyakorlatilag bármely fehérjét nyomon tudunk követni ha hozzá GFP-t fuzionáltatunk. Genetikailag módosított GFP variánsok, mint YFP (sárga), cián (CFP) léteznek a megfelelő irányba eltolt emissziós spektrummal (lásd FRET). DsRed -Vörösben emittáló fluoreszcens fehérje
Fluoreszcens immunhisztokémia SLE anti-nukleáris autoantitestjeinek kimutatása (FITC)
Fluorescent Proteins
Tubulin-GFP
Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia A konfokális mikroszkóp segítségével a hagyományos fluoreszcens mikroszkópnál komplexebb módszert a sejtek/szövetek viszgálatára. A mintát lézer gerjeszti pontonkként, x-y irányban pásztázva. Az emittált fotonokat egy fotoelektron sokszorozó detektálja. A mintából vékony optikai metszetek sorozatát készítjük, ugyanis a detektor előtti csapnyílások kiszűrik a más fókuszsíkokból jövő zavaró fluoreszcenciát. Az optikai metszetekből a vizsgált minta háromdimenziós szerkezete számítógéppel meghatározható.
a konfokális mikroszkóp fényútja
lézer
fókuszban lev emittált sugár
fotoelektron fotoelektron sokszorozó sokszorozó detektor detektor detektor csapnyílás fókuszon kívüli emittált sugarak dikroikus tükör objektív
minta fókuszsíkok
gerjeszt sugár
Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp
Fényforrások fluoreszcens/konfokális mikroszkópiához
Fluoreszcens és konfokális képmin ség összehasonlítása
Béka asztrocita Mitotikus orsó
A hagyományos fluoreszcens mikroszkópos detektálás eredménye
Fluoreszcens immunhisztokémia - aktin mikrofilamentumok kimutatása
A konfokális mikroszkópos detektálás eredménye
Tüdő artéria endotél sejtjei
Z-szeletelés
3D Rekonstrukció
Z-szeletelés után a mikroszkóphoz kapcsolt számítógép segítségével a minta térbeli szerkezete modellezhet , a minta térbeli képét bármilyen irányb l vizsgálhatjuk.
3D Rekonstrukció
Drosophila Egg Chamber
3D modelling
ŐD képalkotás
A konfokális mikroszkópot be lehet programozni hogy tetsz leges id nként készítsen képeket az él mintáról. Az igy készült képekb l mozi fájlokat készítünk.
ŐD képalkotás
Tubulin-GFP
ELEKTRON MIKROSZKÓPIA ‘Elektron-sugár’ forrás (Elektron ágyú) Filament
Melegítés (500 C) -
-
Wehnelt sapka (negatív potenciál)
-
-
Töltés kollektor
e-
e-
-
e-
e-
+++++++++++
+++++++++++ Anód (positív potenciál)
Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM) Elektorn sugár
Kondenzátor lencsék
Kondenzátor apertura Minta OBJEKTÍV Objektív apertura
Közbeiktatott lencsék PROJEKTOR Detektor
Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM)
Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM) Elektorn sugár Első kondenzátor lencse Kondenzátor appertúra Második kondenzátor lencse Objectív apertúra Pásztázó teketrcs Erősítő/Detektor
OBJEKTÍV Visszavert elektronok MINTA
Másodlagos elektronok
Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM)
