Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Mikrosatelity a jejich využití v genetických analýzách Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracoval:
prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.
Jan Wijacki
Brno 2014
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: Mikrosatelity a jejich využití v genetických analýzách vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb. o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací.
Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č.121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona.
Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.
V Brně dne ....................................................... Podpis studenta ................................................
Chtěl bych poděkovat panu prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D za odborné vedení mé bakalářské práce, za to, že mi věnoval svůj čas a umožnil mi konzultace v případě problémů a také poskytl část odborné literatury.
ABSTRAKT Mikrosatelity jsou krátké repetitivní sekvence DNA vyskytující se jak v prokaryotickém tak eukaryotickém genomu. Patří do tzv. satelitní DNA a nachází se v kódujících i nekódujících oblastech genetické informace. Jsou tvořeny 1-6 páry bází a počet repetic jednotlivých motivů se může pohybovat až ve stovkách. Testují se pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) nebo pomocí kapilární elektroforézy a fragmentační analýzy. V současné době jsou hojně využívány jako molekulární genetické markery a používají se například pro analýzu paternity, genetické mapování nebo studium genetické diverzity populací.
Klíčová slova: mikrosatelity, PCR, PAGE, analýza paternity, genetické mapování, diverzita populací
ABSTRACT Microsatellites are short repetitive DNA sequences localized in both procaryotic and eucaryotic genome. It belongs to the satellite DNA located in the coding and noncoding regions of genetic information. They consist of 1-6 base pairs and the number of repetitions of individual motifs can move up in the hundreds. Microsatellites are tested using the polymerase chain reaction (PCR) and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) or by capillary electrophoresis and fragment analysis. They are currently widely used as molecular genetic markers used, e.g. for paternity analysis, genetic mapping studies and genetic population and diversity studies.
Key words:
microsatellites, PCR, PAGE, paternity analysis, genetic mapping, population diversity
OBSAH 1
Úvod.......................................................................................................................... 7
2
Cíl práce .................................................................................................................... 8
3
Literární přehled ....................................................................................................... 9
4
3.1
Genetická informace a její struktura .................................................................. 9
3.2
Co jsou minisatelity? ........................................................................................ 10
3.3
Co jsou mikrosatelity?...................................................................................... 11
Postavení mikrosatelitů v genomech ...................................................................... 11 4.1
Struktura mikrosatelitů ..................................................................................... 11
4.1.1
4.1.1.1
Mononukleotidové ............................................................................. 11
4.1.1.2
Dinukleotidové .................................................................................. 11
4.1.1.3
Trinukleotidové ................................................................................. 12
4.1.1.4
Tetranukleotidové .............................................................................. 12
4.1.1.5
Pentanukleotidové ............................................................................. 12
4.1.1.6
Hexanukleotidové .............................................................................. 12
4.1.2
4.2 5
6
Rozdělení dle délky repetice ..................................................................... 11
Rozdělení dle struktury sekvence ............................................................. 12
4.1.2.1
Dokonalé (Perfect)............................................................................. 12
4.1.2.2
Nedokonalé (Imperfect)..................................................................... 13
4.1.2.3
Přerušené (Interrupted) ...................................................................... 13
4.1.2.4
Složené (Compound) ......................................................................... 13
Výskyt mikrosatelitů v genomu ....................................................................... 14
Pravděpodobné mechanismy vzniku mikrosatelitů z hlediska evoluce .................. 16 5.1
SMM (stepwise mutation model) ..................................................................... 16
5.2
DNA slippage ................................................................................................... 16
Příklad laboratorních metod používaných pro testování mirkosatelitů .................. 17 6.1
PCR .................................................................................................................. 17
7
6.2
PAGE ............................................................................................................... 20
6.3
Kapilární elektroforéza vyhodnocená pomocí fragmentační analýzy .............. 22
Oblasti využití testování mikrosatelitů ................................................................... 23 7.1
Analýza paternity a individuální identifikace .................................................. 23
7.2
Genetické mapování ......................................................................................... 25
7.3
Studium asociací s příčinnými geny a segregace alel ...................................... 27
7.4
Studium genetické diverzity populací .............................................................. 27
8
Závěr ....................................................................................................................... 30
9
Použitá literatura ..................................................................................................... 31
1 ÚVOD Díky značnému rozvoji lidského vědění a znalostí, se člověk v posledních desítkách let snažil o rozluštění genomu. Genomem se rozumí soubor veškeré genetické informace v daném organismu. Nejednalo se však pouze o genom lidský, ale například také o genom myší, prasečí nebo genomy různých rostlin. Díky různým projektům a nákladným výzkumům na sekvenaci, nejen lidského genomu, bylo této problematice mnohem lépe porozuměno. S těmito znalostmi v kombinací se znalostmi moderní laboratorní techniky a analýzy se také podařilo zjistit mnoho faktů o mikrosatelitech. Mikrosatelity jsou součástí genetické informace, kterou představuje deoxyribonukleová kyselina (DNA). Tato DNA je tvořena dvěma řetězci, z nichž každý se skládá z jednotek zvaných nukleotidy. Mikrosatelity jsou specifické sekvence těchto nukleotidů, které se systematicky opakují v daných motivech. U každého organismu můžeme najít různé počty takovýchto mikrosatelitů a také se můžou skládat z různých motivů a počtů opakování. Cílem mnoha výzkumů bylo zjistit, k čemu tyto mikrosatelity slouží a co všechno se pomocí nich můžeme o jednotlivých organismech dozvědět.
7
2 CÍL PRÁCE Cílem této práce je, pomocí zpracování dostupné literatury, stručně přiblížit problematiku mikrosatelitů, jakožto krátkých tandemových repetic DNA, a jejich využití v genetických analýzách a výzkumech. Několik kapitol je také věnováno stručnému zasvěcení do definice genetické informace a její struktury. Dále jsou zmíněny druhy mikrosatelitů rozdělených do několika skupin jak podle délky repetice, tak i podle struktury sekvence. V další části jsou stručně popsány pravděpodobné mechanismy
vzniku
mikrosatelitů
z hlediska
evoluce
a
příklady
vybraných
laboratorních metod používaných pro testování mikrosatelitů. Závěrečná kapitola je věnovaná několika příkladům využití mikrosatelitů v praxi.
8
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Genetická informace a její struktura Ve druhé polovině 19. století byly moravským mnichem Johanem Gregorem Mendlem publikovány základní poznatky o dědičnosti určitých znaků, které vyvodil ze svých pozorování na základě pokusů s rostlinami hrachu setého. Tyto informace však ve vědeckých kruzích nebyly brány zcela vážně, a proto se o nich moc nemluvilo. Zlom nastal až v roce 1900, tedy šestnáct let po smrti Johana Mendla, kdy byly jeho principy znovuobjeveny a potvrzeny a daly tak vznik vědnímu oboru, který dnes nazýváme genetika. Znovuobjevením Mendlových poznatků se vědci začali více zabývat otázkami jako: „Co je to gen?“. Tuto otázku se podařilo zodpovědět v polovině 20. století, kdy bylo prokázáno, že geny se skládají z komplexních molekul zvané nukleové kyseliny. V zásadě existují dva typy nukleových kyselin, a sice ribonukleová kyselina (RNA) jejíž základní složkou je ribóza a deoxyribonukleová kyselina (DNA), kde základní cukernou složku tvoří deoxyribóza. Tyto nukleové kyseliny jsou tvořeny ze základních stavebních částí zvaných nukleotidy. Nukleotid se vždy skládá ze tří složek: 1) molekula cukru 2) slabě kyselá molekula fosfátu 3) slabě bazická dusíkatá molekula
Obr. 1 Schéma stavby nukleotidu
9
Dusíkaté báze v molekulách DNA a RNA se mírně liší. V DNA jsou báze zastoupeny adeninem (A), cytosinem (C), guaninem (G) a thyminem (T). Molekula RNA se liší v přítomnosti uracilu (U) místo thyminu. Škála možných dusíkatých bází v RNA je tedy A, C, G, U. V roce 1953 byl učiněn velký objev ve studiu nukleových kyselin, kdy James Watson a Francis Crick odvodili, jak jsou nukleotidy poskládány uvnitř DNA. Věděli, že jsou nukleotidy spojené mezi sebou v řetězci, a že tato spojení jsou tvořená chemickými interakcemi mezi fosfátem jednoho a cukrem dalšího nukleotidu. Tato spojení tak tvoří tzv. cukr-fosfátovou páteř řetězce. Dusíkaté báze jsou připojeny k cukrům v páteři, vždy jedna báze k jednomu cukru. Báze takto poskládané tvoří jakousi posloupnost (sekvenci), která je charakteristická pro každý řetězec a právě tato sekvence od sebe odlišuje jednotlivé geny. Watson a Crick přišli na to, že molekula DNA je tvořena dvěma řetězci nukleotidů, které jsou vzájemně spojeny pomocí vodíkových můstků mezi protějšími bázemi. Přišli také na to, že ne každá báze je komplementární s jakoukoli bází, ale že se párují podle schématu: A-T, C-G v DNA a A-U, C-G v RNA. Tento princip párování bází nám mimo jiné slouží k předpovídání sekvencí druhého řetězce, pokud známe pouze jeden z nich. Takto spojené řetězce jsou zformovány do spirálovité struktury, kterou nazýváme duplex, neboli dvojitá šroubovice (dvoušroubovice). Molekuly DNA se skládají ze dvou řetězců nukleotidů, na rozdíl od molekul RNA, které jsou tvořeny pouze jedním řetězcem. (Snustad & Simmons, 2009)
3.2 Co jsou minisatelity? Minisatelity jsou tandemově se opakující elementy, se skupinami tandemových repetic rozprostřenými napříč genomem. Společně s mikrosatelity popírají umělé rozdělení repetic do dvou skupin na tandemové a rozptýlené. Minisatelity se skládají z repetitivních jednotek, které obsahují 9-64 nebo ještě více nukleotidů a byly poprvé popsány na člověku, ale následně byly objeveny také u mnoha jiných druhů. Počet základních opakujících se jednotek se výrazně liší v jednotlivých místech genomu a poskytují tak užitečný zdroj genetických markerů. Díky této nadměrné variabilitě v počtu tandemových kopií jsou minisatelity také nazývány VNTRs (variable number tandem repeats). (Rotschild & Ruvinsky, 2011)
10
3.3 Co jsou mikrosatelity? Mikrosatelity, také nazývány jako jednoduché opakující se sekvence (SSR - simple sequence repeats), krátké tandemové repetice (STR - short tandem repeats) nebo tandemové repetice o variabilním počtu (VNTR - variable number tandem repeats) jsou všudypřítomnou skupinou jednoduchých opakujících se sekvencí DNA, které jsou zastoupeny jak v eukaryotickém, tak v prokaryotickém genomu a dokazují vysoký stupeň polymorfismu alel. Jsou to tandemové repetice sekvencí DNA obsahující několik párů bází (1-6). Někteří vědci jsou však toho názoru, že tandemové řady obsahující 7-9 párů bází (bp - base pairs) by také měly být klasifikovány jako mikrosatelity a odlišit je tak od minisatelitů, které obsahují 10-100 bp. (Bhargava & Fuentes, 2010) Výhodou mikrosatelitů také je, že se v genomu vyskytují častěji než minisatelity.
4 POSTAVENÍ MIKROSATELITŮ V GENOMECH 4.1 Struktura mikrosatelitů Mikrosatelitů existuje v různých genomech celá řada. Nejzákladnější rozdělení je do několika skupin podle dvou základních kritérií, kterými jsou: 1) délka repetice 2) struktura sekvence
4.1.1
4.1.1.1
Rozdělení dle délky repetice
Mononukleotidové
Jedná se o takové mikrosatelity, které jsou tvořeny pouze jednou, stále se opakující, bází. Obecný vzorec takovéto repetice lze například zapsat jako: (A)n, nebo (T)n atd. Písmeno v závorce označuje, z jaké báze se repetice skládá a index „n“ vyjadřuje počet opakování dané báze v mikrosatelitu. (Tóth, Gáspári, & Jurka, 2000)
4.1.1.2
Dinukleotidové
Dinukleotidové mikrosatelity jsou takové, jejichž repetitivní sekvence je složena z motivu tvořeného dvěma různými nukleotidy. Jedním z nejběžněji zastoupených dinukleotidových mikrosatelitů je například motiv (CA)n. Jedná se tedy o
11
motiv složený z bází cytosinu a adeninu v počtu „n“ opakování za sebou. (Tóth, Gáspári, & Jurka, 2000)
4.1.1.3
Trinukleotidové
Tři nukleotidové báze tvoří základ repetitivní sekvence trinukleotidových mikrosatelitů. Obecný vzorec takového mikrosatelitu pak můžeme zapsat například jako (ATG)n. Nemusí se vždy nutně jednat o tři různé báze, jako například v motivu (CAC)n. (Tóth, Gáspári, & Jurka, 2000)
4.1.1.4
Tetranukleotidové
Skupina tetranukleotidových mikrosatelitů se vyznačuje svou repetitivní sekvencí, která je složená ze čtyř nukleotidových bází. Obecný vzorec takovýchto mikrosatelitů pak můžeme zapsat jako (GATA)n, (GACA)n atd. (Tóth, Gáspári, & Jurka, 2000)
4.1.1.5
Pentanukleotidové
U této skupiny je základní motiv repetitivní sekvence tvořen pěti bázemi. Obecný zápis takového mikrosatelitu pak může mít podobu (GATAC)n. (Tóth, Gáspári, & Jurka, 2000)
4.1.1.6
Hexanukleotidové
Hexanukleotidové mikrosatelity jsou tvořeny základním motivem, který obsahuje šest bází a obecně je můžeme zapsat například (GACGTA)n. (Tóth, Gáspári, & Jurka, 2000)
4.1.2
4.1.2.1
Rozdělení dle struktury sekvence
Dokonalé (Perfect)
Dokonalé mikrosatelity jsou takové, jejichž sekvence nejsou přerušeny žádnou bází nepatřící do opakujícího se motivu. (Bhargava & Fuentes, 2010)
např.: CTGT AAAAAAAAAA GT
12
4.1.2.2
Nedokonalé (Imperfect)
Nedokonalé mikrosatelity obsahují v opakujícím se motivu bázi, která do motivu nepatří. (Bhargava & Fuentes, 2010)
např.: CTGT AAAATAAAAAA GT
4.1.2.3
Přerušené (Interrupted)
Mikrosatelity, které ve svém opakujícím se motivu obsahují krátkou sekvenci, která do motivu nepatří. Na rozdíl od nedokonalých je u přerušených mikrosatelitů sekvence přerušena cizí sekvencí složenou z několika bází. (Bhargava & Fuentes, 2010)
např.: CTGT AAAATCGAAAAAA GT
4.1.2.4
Složené (Compound)
Složené mikrosatelity obsahují zpravidla dvě charakteristicky se opakující sekvence. (Bhargava & Fuentes, 2010)
např.: CTGT AAAGGGAAAGGGAAAGGGAAA GT
13
4.2 Výskyt mikrosatelitů v genomu Velikost genomu je individuální v závislosti na druhu organismu. Mikrosatelity se vyskytují napříč celým genomem. Tab. 1 Porovnání velikostí jednotlivých genomů (Brdička, 2001) Organismus
Český název
Počet nukleotidů
HIV typ 1 Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Gallus gallus Sus scrofa Homo sapiens Equus caballus Bufo bufo Allium cepa Pinus resinosa Amoeba proteus
Virus HIV typ 1 Bakterie E. coli Pekařská kvasinka Huseníček rolní Octomilka obecná Kur bankivský Prase divoké Člověk Kůň Ropucha obecná Cibule kuchyňská Borovice Měňavka velká
9 750 4 639 221 12 067 280 100 000 000 180 000 000 1 200 000 000 3 108 700 000 3 300 000 000 3 311 000 000 6 900 000 000 18 000 000 000 68 000 000 000 290 000 000 000
Z hlediska
výskytu
mikrosatelitních
sekvencí
je
pravděpodobně
nejlépe
prostudovaný lidský a myší genom. Mikrosatelity představují jednu z nejdynamičtějších složek genomu a tvoří často jeho významnou část. V genomech se nacházejí mnohdy dlouhé mikrosatelitové úseky, které vznikají expanzí kratších úseků. (Šteflová et al., 2011) Mikrosatelitové sekvence se vyskytují jen zřídka v oblastech kódující DNA. Udává se, že se jedná asi pouze o 9 až 15% mikrosatelitů a tuto skupinu tvoří převážně trinukleotidové a hexanukleotidové repetice, které neporušují čtecí rámec. (Hancock, 1995) Moran (1993) prováděl výzkum výskytu všech možných tříd mikrosatelitů v prasečím genomu. Systematicky vyhledával opakující se motivy složené z více než dvaceti nukleotidů, od mononukleotidových až po tetranukleotidové repetice, pro všechny prasečí sekvence zaznamenané v databázi Genbank. Interpretaci jeho výsledků komplikuje skutečnost, že mikrosatelity byly zjištěny jak v cDNA (komplementární DNA), tak v genomické DNA přibližně 181 jaderných genů známých v té době. Nicméně byl získán alespoň přibližný obraz toho, jaký je výskyt jednotlivých druhů repetic. Mononukleotidových repetic bylo objeveno celkem 9, z toho 8 bylo tvořeno 14
bázemi (A)n nebo (T)n a 1 bázemi (C)n nebo (G)n. Dinukleotidových repetic bylo zjištěno celkem 10, z toho 7 jich tvořil motiv (CA)n nebo (GT)n a 3 motivy (GA)n nebo (CT)n. Trinukleotidových repetic bylo zjištěno 5, což představovalo pouze 4 z 20 možných motivů a tetranukleotidových bylo zjištěno 9. V těchto devíti repeticích bylo zahrnuto pouze 6 z 60 možných motivů. Procentuální zastoupení jednotlivých kategorií tedy bylo: mononukleotidové 27,3%, dinukleotidové 30,3%, trinukleotidové 15,1% a tetranukleotidové 27,3%. Mezi jednotlivými motivy byl nejčastěji zastoupen mononukleotidový motiv (A)n.(T)n (24%) a dinukleotidový (CA)n.(GT)n (21%). (Rotschild & Ruvinsky, 2011) Ellegren (1993) také prováděl výzkum databází sekvencí DNA, ale pouze pro mono-
a
dinukleotidové
sekvence.
Ze
zjištěných
hodnot
odhadoval,
že
mononukleotidové repetice s motivem (A)n.(T)n se vyskytují s četností 1:7000 bází a repetice s motivem (CA)n.(GT)n dokonce s četností 1:30000 bází. Z těchto měření zjistil, že prasečí genom obsahuje 400000 kopií mononukleotidových repetic s motivem (A)n.(T)n a zhruba 100000 dinukleotidových repetic s motivem (CA)n.(GT)n. (Rotschild & Ruvinsky, 2011) Tato čísla ovšem platí pro prasečí genom, který je tvořen přibližně 3,1 miliardami bází (Tab.1). Proto je jasné, že se u jiných organismů můžeme setkat s jinými hodnotami. Udává se, že lidský genom je složen asi ze 3% z mikrosatelitů, což při velikosti genomu (Tab.1) odpovídá přibližně 1 milionu bází. Obecně platí, že mikrosatelity mají tendenci být v pozitivní korelaci s velikostí genomu. To znamená, čím větší genom, tím více mikrosatelitů. Při porovnání celých sekvenovaných genomů se ukázalo, že nejvíce mikrosatelitů obsahují genomy savců. Naopak u rostlin je frekvence mikrosatelitů v negativní korelaci s velikostí genomu, tedy čím větší je genom, tím méně obsahuje mikrosatelitů. (Ellegren, 2004)
15
5 PRAVDĚPODOBNÉ
MECHANISMY
VZNIKU
MIKROSATELITŮ Z HLEDISKA EVOLUCE 5.1 SMM (stepwise mutation model) Tento model mutační evoluce mikrosatelitů se používá při zkoumání dvou různých skupin (například populací nebo živočišných nebo rostlinných druhů) pro odhad genetické vzdálenosti mezi nimi. Byla prezentována široká škála modelů evoluční dynamiky mikrosatelitů, avšak většina z nich je odvozena právě z modelu SMM. V případě mikrosatelitů se v původním SMM předpokládalo, že mutace upravují délku repetiční řady pomocí přidání nebo odebrání repetiční jednotky s danou četností, nezávisle na délce repetice. (Ellegren, 2004)
Převzato z: http://nitro.biosci.arizona.edu/ftdna/models.html#Step Obr. 2 Schéma SMM
5.2 DNA slippage Dalším možným mechanismem v evoluci mikrosatelitů je tzv. DNA slippage. V genomech se nacházejí mnohdy dlouhé mikrosatelitové úseky, které vznikají expanzí kratších úseků. Mechanizmus této expanze není zcela objasněn, i když se předpokládá, že významnou roli hraje „prokluzování“ DNA polymerázy při replikaci (DNA slippage). (Šteflová et al., 2011) 16
Princip spočívá v tom, že pokud dojde při replikaci k prokluzu DNA polymerázy po vlákně, vlákno DNA může vytvořit smyčku, což má za následek přidání nebo vymazání nukleotidu na nově syntetizovaném vlákně. (Pray, 2008)
Převzato z: http://www.nature.com/scitable/resource?action=showFullImageForTopic&imgSrc=/scitable/content/ne0 000/ne0000/ne0000/ne0000/116896155/6460_82.jpg Obr. 3 Schéma slippage
6 PŘÍKLAD LABORATORNÍCH METOD POUŽÍVANÝCH PRO TESTOVÁNÍ MIRKOSATELITŮ 6.1 PCR Tato metoda byla objevena v roce 1983 americkým biochemikem Kary Mullisem. Teoreticky byla sice popsána již v roce 1971, ale Kary Mullis byl prvním člověkem, který tuto metodu dokázal realizovat v praxi. O deset let později, tedy v roce 1993, byl za tento objev oceněn Nobelovou cenou v oboru chemie. (Clark, 2005) PCR neboli polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction), je biotechnologická metoda založená na množení (amplifikaci) požadovaného úseku DNA in vitro. K amplifikaci se používá speciální DNA-polymeráza.
Odtud tedy název
polymerázová řetězová reakce. Řetězová se nazývá proto, že amplifikované jednotky vznikají řetězovou reakcí a jejich počet roste exponenciální řadou: 2, 4, 8, 16, 32, 64, ... 17
atd. Z jednoho úseku DNA, který amplifikujeme tak může vzniknout při 35 cyklech až 235 kopií. Původně se používala pro PCR analýzu polymeráza získaná z bakterie Escherichia coli. Tato polymeráza však byla teplotně nestabilní a docházelo k její inaktivaci, proto musela být pravidelně dodávána při každém amplifikačním cyklu. Dnes se již používá Taq-polymeráza, která je získávána z termofilních bakterií Thermus aquaticus, a během teplotně denaturačního kroku zůstává aktivní. Nesporná výhoda Taq-polymerázy spočívá v tom, že se jí může dodat nadbytek již při přípravě směsi pro PCR a nemusí tak být doplňována po každém cyklu. PCR je dále řízena pouze postupným střídáním teploty. Zařízení pro PCR, tzv. termální cyklery automaticky mění teplotu a mohou pojmout velké množství vzorků, což dělá amplifikaci specifických sekvencí DNA relativně jednoduchou. (Snustad & Simmons, 2009) Na druhou stranu má Taq-polymeráza také jisté nevýhody. Zřejmě největší nevýhodou je to, že není schopna tzv. 3‘ 5‘ korekční aktivity. To znamená, že pokud dojde při replikaci ve směru 3‘ 5‘ k chybě, tento enzym není schopen tuto chybu opravit a ta je dále replikována jako jakýkoliv jiný nukleotid dané sekvence DNA. Pokud je kladen důraz na vysokou přesnost, provádí se PCR s využitím jiných teplotně stabilních polymeráz. Mezi takové patří například Pfu-polymeráza (získána z bakterie Pyrococcus furiosus), nebo Tli-polymeráza (z bakterie Thermococcus litoralis). Tyto polymerázy vykazují 3‘ 5‘ korekční aktivitu. Další nevýhodou Taq-polymerázy může být skutečnost, že dokáže amplifikovat pouze úseky DNA o maximální délce 10 000 bází (10 kb). Pro amplifikaci delších fragmentů bychom mohli použít například Tflpolymerázu (z Thermus flavus), která je schopna amplifikovat fragmenty až okolo délky 35 kb. Při amplifikaci fragmentů nad 35 kb je metoda PCR neúčinná. (Snustad & Simmons, 2009) Obecně PCR analýza probíhá ve třech základních krocích:
1) Denaturace - jedná se o rozrušení struktury dsDNA (double strand DNA dvouvláknová DNA) na dvě jednotlivá vlákna. Tento děj se odehrává za teploty 92-95ᵒC. Je nutné, aby došlo k úplné denaturaci a k rozestoupení jednotlivých řetězců, protože kdyby tomu tak nebylo, mohlo by dojít k renaturaci a následnému nesprávnému nasednutí primerů na řetězec. 18
2) Annealing -
tento krok by se dal označit, jako nasedání primerů na jedno vlákno DNA. Jako primery se používají krátké úseky DNA o délce přibližně 18-26 bp, které se dále dělí na přímé a zpětné. Při tomto kroku se využívá komplementarity bází, což zajišťuje přesné umístnění primeru. V této fázi je v termocykleru teplota 50-60ᵒC.
3) Elongace -
neboli
také
extension
nebo
prodlužování.
Jedná
se
o
enzymatickou reakci, která je katalyzována enzymem Taqpolymerázou. Tato reakce probíhá při teplotě 72ᵒC a její princip spočívá v „nasednutí“ DNA polymerázy na primery a připojování volných dusíkatých bází k vláknu DNA. I v tomto případě je využíván princip komplementarity bází. Na závěr probíhá tzv. závěrečná polymerační reakce, při které dochází k dokončení syntézy jednotlivých řetězců při teplotě 72ᵒC. (Brown, 2007)
Upraveno podle: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html Obr. 4 Schéma průběhu PCR analýzy
Vyhodnocení amplifikovaných fragmentů DNA se provádí nejčastěji metodou elektroforézy v 3% agarosovém gelu. Fragmenty jsou obarveny pomocí molekul 19
ethidiumbromidu (EtBr), který se váže mezi jednotlivé báze DNA. Gel je následně prosvícen UV světlem a tím je DNA zviditelněná. Podle vzdálenosti proužků od nanesení se určuje délka jednotlivých fragmentů. V tomto případě platí, že čím je fragment kratší, tím rychleji prostupuje gelem. (Maniatis, Fritsch, & Sambrook, 1982) V případě mikrosatelitů je však tato metoda velmi nepřesná, protože pomocí ní nemůžeme určit přesné délky repetic a případné rozdíly mezi nimi.
Obr. 5 Schéma vyhodnocení gelové elektroforézy
6.2 PAGE Obecně patří elektroforéza mezi elektromigrační separační metody, jejichž principem
je
využití
rozdílné
pohyblivosti
nabitých
částic
ve
stejnosměrném elektrickém poli. (http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/cze/CZE.pdf)
Metoda PAGE (Polyakrylamidová gelová elektroforéza - polyacrylamide gel electrophoresis) nejčastěji používá polyakrylamidové gely, které se vyznačují vynikající homogenitou a rozlišovací schopností. Tyto gely tvoří inertní molekulární síť, která zpomaluje prostup proteinů a před použitím se připravují polymerizací akrylamidového monomeru. (Maniatis, Fritsch, & Sambrook, 1982) Koncentrace polyakrylamidu nám, podobně jako u agarózového gelu, určuje velikost pórů a tím také hustotu sítě. V porovnání s agarózou má polyakrylamid tři velké výhody: a) Mají tak velkou dělící schopnost, že mohou separovat molekuly DNA, které se svou velikostí liší až 500 krát (tj. od 1 bp do 500 bp). 20
b) Dokážou pojmout mnohem více DNA než agaróza (až 10µg DNA). c) DNA, která je získaná z polyakrylamidového gelu je velmi čistá. Metodu PAGE lze také, mimo jiné, rozdělit do dvou základních skupin: 1) Denaturační PAGE - v tomto případě se na gel nanáší teplotně denaturovaná DNA (tedy jednořetězcová). Aby mohlo dojít k dělení, je potřebná přítomnost denaturantu v gelu. Tento postup zajistí, že molekuly budou separovány pouze na základě své velikosti, a zároveň se vyloučí vliv prostorové struktury a složení bází. Tato metoda se využívá primárně pro určení velikosti fragmentů DNA, pro testování mikrosatlitů a sekvencování. Většinou se provádí vertikálně.
2) Nedenaturační PAGE (nativní) - v případě této metody se vzorek separuje nedenaturovaný. Výhodou také je, že výsledek je možné barvit ethidiumbromidem. Tuto metodu však nelze použít pro přesné stanovení velikosti molekul, protože mobilita DNA je ovlivněna prostorovou strukturou DNA.
Metoda PAGE je pro analýzu mikrosatelitů téměř ideální, protože na rozdíl od klasické elektroforézy na agarózovém gelu, při které můžeme spolehlivě separovat fragmenty od 50 bp až do 500 000 bp (v závislosti na koncentraci gelu), na polyakrylamidovém gelu můžeme odlišit fragmenty o délce 100 až 1000 bp dsDNA (při koncentraci 3,5%) nebo dokonce 5 až 100 bp (při koncentraci 20%). V optimálních podmínkách můžeme docílit rozlišení mezi fragmenty s rozdílem pouhého jednoho páru nukleotidů. Tato přesnost se využívá právě u mikrosatelitní DNA. (Hruban, 1999) Podobně jako u vyhodnocování PCR pomocí klasické gelové elektroforézy za použití agarózového gelu, tak i v případě PAGE lze použít přímé barvení pro zviditelnění nukleové kyseliny v gelu. Nejrychlejší a nejjednodušší je metoda barvení ethidiumbromidem, který se vmezeřuje do dvoušroubovice DNA a dále je prosvěcován 21
ultrafialovým světlem. Toto barvení se však používá především na agarózovém gelu, protože je možné zviditelnit pouze fragmenty o délce 0,05-60 kbp. Tento způsob barvení je dostatečný pro orientační stanovení. V případě použití polyakrylamidového gelu lze také použít ethidiumbromid, ale pouze pokud se DNA fragmenty podstatně liší svou délkou (tj. počtem nejméně několika desítek nukleotidů). Pro citlivější zviditelnění menších rozdílů v délkách fragmentů se používá k barvení stříbro. Zdrojem stříbra zpravidla bývá dusičnan stříbrný (AgNO3). Tento způsob může být prováděn dvěma metodami. První metoda se skládá z přípravy roztoku amoniakálního stříbra jeho redukcí z dusičnanu pomocí hydroxidu amonného (NH4OH) a hydroxidu draselného (KOH) a tím se impregnuje vzorek (gel). Zviditelnění vazby stříbra dosáhneme kyselým roztokem formaldehydu. Druhá metoda je založena na přímé impregnaci gelu roztokem dusičnanu a následnou redukcí stříbra pomocí alkalického roztoku formaldehydu. (Hruban, 1999)
6.3 Kapilární elektroforéza vyhodnocená pomocí fragmentační analýzy Stejně jako dvě předchozí metody, i tato používá k separaci fragmentů o různé velikosti stejnosměrný elektrický proud. Rozdíl spočívá v tom, že předchozí metody jsou horizontální, zatímco kapilární elektroforéza probíhá vertikálně. Tato metoda je také mnohem přesnější, protože dokáže rozeznat fragmenty lišící se délkou pouhých několika bází. Proto má tato metoda při studiu mikrosatelitů velké uplatnění a je hojně používaná. Kapilární elektroforéza má rozsáhlé možnosti využití, které zasahují také do analytických úkolů, které byly dříve řešeny vysoce účinnou kapalinovou chromatografií nebo iontovou chromatografií. (Gaš, 2001) Vyhodnocení pomocí fragmentační analýzy spočívá v tom, že během PCR jsou fragmenty DNA označeny pomocí specifického primeru obarveného fluorescenčním barvivem. Dále je kapilára příčně osvětlena laserovým svazkem a světlo emitované barvivem při průchodu fragmenty je snímáno pomocí detektoru s příslušným optickým filtrem. Signál je zpracován pomocí počítačového programu. (Gaš, 2001) Fragmenty DNA jsou reprezentovány jednotlivými píky (z angl. „peak“ - vrchol) v elektroforetogramu. Délka těchto fragmentů je porovnávána s vnitřním standardem (Internal Size Standard), což je soubor fragmentů známé délky značený odlišnou 22
fluorescenční barvou, který se analyzuje spolu se vzorkem testované DNA. Intenzita signálu (fluorescence) je znázorněna výškou jednotlivých píků. (Butler, 2005)
Obr. 6 Schéma vyhodnocení fragmentační analýzy
7 OBLASTI VYUŽITÍ TESTOVÁNÍ MIKROSATELITŮ V dnešní době jsou mikrosatelity hojně používány v genetických analýzách při různých výzkumech. V mnoha případech plní funkci molekulárních genetických markerů.
7.1 Analýza paternity a individuální identifikace Mikrosatelity se využívají pro analýzu paternity (otcovství, rodičovství) a individuální identifikaci jedince v mnoha odvětvích. Vysoce ceněny jsou především pro svou vysokou variabilitu v počtu repetic mezi jedinci. Toho se využívá v genetice, medicíně, ale také v zemědělství a v neposlední řadě také ve forenzních vědách, kdy je tato metoda používána v souvislosti s identifikací osob ve spojitostech se spácháním trestného činu, nebo při identifikaci osob v případě hromadného neštěstí (zemětřesení, pád letadla, atd.). V případě trestných činů analýza DNA poskytuje spolehlivé důkazy jak pro usvědčení pachatele, tak i pro očištění nevinných podezřelých. (El-Alfy & ElHafez, 2012)
23
Princip metody spočívá v odebrání vzorku DNA. Pokud jde o analýzu paternity, obvykle se jedná o vzorek slin nebo vlasů, v případě trestných činů jsou to důkazy nalezené na místě činu obsahující DNA (krev, tkáně, vlasy, atd.). Ze vzorku se následně extrahuje DNA. Dnes již existují různé sady (kity) pro extrakci DNA, které usnadňují a urychlují práci jak lékařům, tak vyšetřovatelům. Extrahovaná DNA se následně amplifikuje pomocí PCR. Pro amplifikaci dnes již také existují různé sady (amplification kit), které obsahují různé primery a mikrosatelitní lokusy (až 15 a více lokusů). Pro každý lokus je použit jeden pár fluorescenčně značených primerů. Sady také mohou obsahovat markery pro identifikaci pohlaví. Tyto markery amplifikují specifické produkty na X nebo Y chromozomu o délce 107 nebo 113 bp. Po provedení PCR je dále amplifikovaná reakční směs podrobena kapilární elektroforéze a vyhodnocena pomocí analyzátoru. (El-Alfy & El-Hafez, 2012) Testování paternity je založeno na shodě alel v mikrosatelitních lokusech mezi dítětem, matkou a údajným otcem. Pokud matka není přítomna, jsou sledovány shody pouze mezi alelami dítěte a údajného otce. Pokud se DNA profily dítěte a údajného otce shodují, test je vyhodnocen jako případ „nevyloučeného“ otcovství. Pokud se DNA profily neshodují, pak se jedná o případ „vyloučeného“ otcovství. V případě testů paternity se také stanovuje „index otcovství“ (paternity index) a „pravděpodobnost otcovství“ (probability of paternity). (El-Alfy & El-Hafez, 2012)
Index otcovství - udává poměr pravděpodobností, že testovaný muž je otcem dítěte oproti předpokladu, že testovaný muž a dítě nejsou biologicky příbuzní. (Vzor výsledků testu DNA, Index paternity, Pravděpodobnost otcovství, 2011-2014)
Pravděpodobnost otcovství - představuje procento průkaznosti tvrzení, že testovaný muž je na základě genetického testu biologickým otcem dítěte za předpokladu, že před testem byla pravděpodobnost 50%. (Vzor výsledků testu DNA, Index paternity, Pravděpodobnost otcovství, 2011-2014)
V případě vyšetřování trestných činů by se analyzované vzorky měly kompletně shodovat pro všechny mirkosatelitní markery. Pouze v takovém případě by měl být podezřelý shledán vinným. (El-Alfy & El-Hafez, 2012)
24
Testy paternity se také používají v chovu psů a jiných domácích zvířat, kdy se pomocí těchto testů ověřuje původ zvířete nebo příbuznost alespoň s jedním z rodičů. U některých druhů plemenných hospodářských zvířat (např. dojná plemena skotu, masná plemena skotu, dojené ovce, dojené kozy, buvoli, atd.) jsou vyžadovány testy původu, které tvoří základ celého systému kontroly užitkovosti a odhadu plemenných hodnot. U prasat se používají testy parentity pro identifikaci kanců ve šlechtitelských chovech. Testy původu a individuální identifikace se také používají při obchodování s exotickými zvířaty a ptactvem, nebo chráněnými živočichy patřící do CITES (úmluva o mezinárodním obchodu s ohroženými druhy volně žijících živočichů a planě rostoucích rostlin). Své uplatnění má tato metoda také při identifikaci odcizených zvířat.
7.2 Genetické mapování Cílem mapování genomu a tvorby genomových a genetických map je rozluštění posloupnosti genů na řetězci DNA, lokalizace jejich umístění na jednotlivých chromozomech a případně dekódování úplné nukleotidové sekvence DNA jak v jednotlivých segmentech chromozomů, tak i v celém genomu. Genetické mapy můžeme rozdělit na tři základní typy:
1) Genetické -
jsou sestavovány s využitím molekulárních markerů (RFLPpolymorfismus délky restrikčních fragmentů, mikrosatelitů a dalších) a vyznačují se vysokou hustotou (malými vzdálenostmi mezi markery). Jednotkou vzdálenosti je 1 cM (centimorgan), který je roven vzdálenosti odpovídající 1% rekombinace (během 100 meióz dojde k 1 rekombinaci). (Snustad & Simmons, 2009)
2) Cytologické - jsou založeny na rozdílném pruhování jednotlivých chromozomů pozorovatelném pod mikroskopem po obarvení různými barvivy. (Snustad & Simmons, 2009)
3) Fyzické -
jsou založeny na molekulových vzdálenostech - bp, kilobáze (kb), megabáze (Mb) - oddělujících různé oblasti obřích molekul DNA přítomných na chromozomech. (Snustad & Simmons, 2009) 25
Upraveno podle: http://www.genome.gov/dmd/img.cfm?node=Photos/Graphics&id=85174 Obr. 7 Rozdíly mezi genetickou, cytologickou a fyzikální mapou
Mikrosatelity se ukázaly jako velmi užitečné při tvorbě map eukaryotických chromozomů o vysoké hustotě. V lidském genomu jsou zvláště užitečné mikrosatelity složené s polymorfních tandemových repetic, které jsou tvořeny dinukleotidovými sekvencemi AC/TG (AC v jednom řetězci, TG v komplementárním). V roce 1996 byla publikována souhrnná mapa mikrosatelitů v lidském genomu, která obsahovala 5264 mikrosatelitů AC/TG. Tímto bylo definováno 2335 oblastí na chromozomech o průměrné vzdálenosti 1,6 cM mezi jednotlivými sousedícími markery. Do roku 1997 bylo využito RFLP ke zmapování více než 16000 lidských genů. Tyto geny byly propojeny s fyzickou mapou lidského genomu a díky tomu bylo zmapováno více než 20000 STS (sequence-tagged sites - „místa se sekvenční adresou“) do 16354 různých lokusů. Tyto mapy následně umožnily identifikaci a popis genů a jejich mutací, které jsou zodpovědné za řadu lidských nemocí jako je například Huntingtonova choroba, nebo cystická fibróza. (Snustad & Simmons, 2009) Pomocí mikrosatelitů byly také sestaveny mapy lokusů pro kvantitativní znaky (QTL - quantitative trait locus). Moderní techniky umožnily vyhledávání lokusů kvantitativních znaků (QTL) v genomech různých druhů živočichů a rostlin. U laboratorních organismů (Drosophila melanogaster, myš), zemědělsky významných rostlin (rýže, kukuřice) a hospodářských zvířat (prasata, skot) byly takové lokusy 26
identifikovány a lokalizovány na konkrétních chromozomech. Mezi takto zkoumané znaky patří například počty chloupků u octomilky, obezita u myší, výnosy rýže, kukuřice a dalších plodin, mléčná užitkovost u skotu, růst a podíl tuku u prasat. Toto mapování bylo prováděno také u člověka, kde se zjišťovaly QTL pro znaky jako je vnímavost k nemocem jako diabetes, nádorová a kardiovaskulární onemocnění nebo schizofrenie. (Snustad & Simmons, 2009)
7.3 Studium asociací s příčinnými geny a segregace alel Mikrosatelity se používají jako nepřímé markery pro studium tehdy, pokud příslušný mikrosatelit leží v blízkosti příčinného genu, jehož alelické varianty nejsou známy, nebo je nejsme schopni detekovat (efekt genové vazby). Mikrosatelity pak mohou sloužit jako nepřímé markery pro určitý znak. Tohoto přístupu se využívá i např. v nepřímé diagnostice genetických chorob. Pomocí alel mikrosatelitů můžeme sledovat segregaci postižené alely u potomků, podmínkou je tedy znalost vazbové nerovnováhy v konkrétní rodině. Této vazby mikrosatelitu na určitý znak se využívá například při analýze bezrohosti u skotu. Jelikož příčinný gen bezrohosti v současné době zatím není znám, používají se právě nepřímé testy založené na DNA markerech, které jsou s tímto znakem v asociaci. Pomocí takovýchto molekulárně-genetických testů můžeme odlišit homozygotní a heterozygotní genotyp zvířat, ale pouze s určitou pravděpodobností. Jelikož je bezrohost dominantním znakem, je možné selektovat zvířata pouze na základě fenotypu, ale určování fenotypu může být ovlivněno výskytem volných rohů.
7.4 Studium genetické diverzity populací Mikrosatelity jsou nejpoužívanější markery pro studium genetické diverzity. Jsou používány pro fylogenetické analýzy, rostlinné a živočišné šlechtitelské programy, sestavování vazbových map, mapování ekonomicky významných kvantitativních znaků a identifikaci genů zodpovědných za požadované vlastnosti. Mikrosatelity byly původně navrženy pro výzkum degenerativních a neurologických chorob u člověka, ale ukázalo se, že jsou aplikovatelné i na mnoho jiných druhů. Navíc díky jejich vlastnosti kodominance umožňují identifikaci všech alel daného lokusu. Znalost kompletní sekvence genomu mnoha druhů a její veřejná dostupnost nyní
27
umožňuje stanovení frekvencí mikrosatelitů na úrovni celého genomu, snižuje ekonomické náklady a urychluje proces analýzy. Mikrosatelitní markery mohou být použity k určování struktury obyvatel mezi populacemi a v nich. Hodnocení rozdílnosti obyvatel nám pomáhá odhadnout míru migrace mezi populacemi za předpokladu, že tyto populace jsou v rovnováze (např. neprobíhá v nich selekce, mají stejnou míru mutací a generační čas). U rostlin míra mutace souvisí s šířením genů pomocí semen a pylu. Mikrosatelitní markery jsou výkonným
nástrojem
pro
odhalování
mimodruhových
nebo
vnitrodruhových
fylogenetických vztahů a to i u blízce příbuzných druhů. Fylogenetické vztahy odrážejí příbuznosti skupiny druhů na základě vypočtené genetické vzdálenosti v jejich evoluční historii. Míkrosatelity jsou tou nejlepší volbou pro studium mezidruhové příbuznosti. V analýzách fylogenetických vztahů mezi druhy a rodinami jsou také používány oblasti obklopující mikrosatelity (flanking regions), protože se vyvíjí pomaleji než repetiční sekvence. (Akemi, 2012) Rout et al. (2008) hodnotil fylogenetické vztahy indických koz pomocí 17 mikrosatelitních markerů. Vzorky byly odebrány z chovů na jejich přirozených stanovištích, které pokrývají různé agroklimatické zóny. Studie ukázaly, že výsledky analýzy mikrosatelitů byly v souladu s údaji mitochondriální DNA, které klasifikují indické populace koz do odlišných genetických skupin a plemen. Fylogenetická analýza a analýza hlavních komponent prokázala rozdělení koz podle jejich zeměpisného původu. Autoři dospěli k závěru, že i když se chovné plochy koz překrývají a jsou rozšířené po celé zemi, stále si zachovávají genetické rozdíly, když se nachází ve svých přirozených stanovištích. V rámci zachování biodiverzity a evoluční genetiky jsou mikrosatelity používány k získávání přesných informací v oblasti populační dynamiky, demografie a ekologickobiologických faktorů přirozených pro druhy a populace. Jako příklad takového přístupu můžeme uvést práci Becqueta et al. (2007). Becquet použil 310 mikrosatelitních markerů genotypovaných u 78 běžných šimpanzů a 6 bonobů, umožňujících přesnou genetickou analýzu struktury populace šimpanzů. Tito šimpanzi byli tradičně rozděleni do tří populací: západní, střední a východní. I když jsou morfologické a behaviorální rozdíly malé, genetické studie mitochondriální DNA a pohlavního chromozomu Y podporují geograficky založené označení. Výsledky ukázaly, že populace se zdají být nesouvislé a poskytly slabý důkaz 28
sklonů k variabilitě odrážející hybridizaci mezi šimpanzími populacemi. Kromě toho výsledky prokázaly, že populace středních a východních šimpanzů jsou si navzájem více příbuzné, než populace západních šimpanzů.
29
8 ZÁVĚR Tato práce shrnuje základní důležité vlastnosti mikrosatelitů. Nejčastěji se v eukaryotickém genomu vyskytují di-, tri- a tetranukleotidové mikrosatelitové sekvence, které jsou rozprostřeny napříč celým genomem, jak v kódujících tak v nekódujících oblastech. To je pravděpodobně také jeden z důvodů proč jsou dnes mikrosatelity jedny z nejvíce využívaných molekulárních markerů v genetických výzkumech a analýzách. Dalším důvodem pro jejich hojné využívání je také bezesporu relativně snadná manipulace s nimi. Pokud potřebujeme detekovat mikrosatelity ve vzorku DNA můžeme k tomu použít například polymerázovou řetězovou reakci (PCR) s následným vyhodnocením pomocí agarózové elektroforézy. Tato metoda je sice poměrně jednoduchá a rychlá, ale vzhledem k malé velikosti mirkosatelitů značně nepřesná, a proto se nepoužívá. Přesnější je metoda polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) s následným barvením vzniklých fragmentů pomocí AgNO3. Nejpřesnější, ale také nejdražší a nejnáročnější metoda detekce a určování velikostí mikrosatelitů
je
kapilární
elektroforéza
s následnou
fragmentační
analýzou
fluorescenčně barvených fragmentů za pomocí genetického analyzátoru. V praxi mají mikrosatelity široké využití. Nejen v oblasti vědy a výzkumu, jako je studium diverzity populací a genetického mapování, ale také v oblasti každodenního života. Zejména nacházejí své uplatnění při určování paternity (nejenom v humánní sféře), nebo při osobní identifikaci osob, ať už se jedná o osoby podezřelé ze spáchání trestného činu, nebo identifikaci obětí hromadných neštěstí. U zvířat slouží především k ověření rodičovství (parentity) a tím odhalení potenciálního zdroje chyb v datech pro výpočet odhadu plemenných hodnot nebo ověření rodičů u prodávaných zájmových zvířat. Neméně důležité uplatnění najdou také v medicínské oblasti a dalších.
30
9 POUŽITÁ LITERATURA AKEMI, Andrea, Juliana PEREIRA, Paula MACEDO a Karina ALESSANDRA. Microsatellites as Tools for Genetic Diversity Analysis. Genetic Diversity in Microorganisms.
InTech,
2012-02-24.
DOI:
10.5772/35363.
Dostupné
z: http://www.intechopen.com/books/genetic-diversity-inmicroorganisms/microsatellites-as-tools-for-genetic-diversity-analysis
BECQUET, Celine, Nick PATTERSON, Anne C. STONE, Molly PRZEWORSKI, David REICH a Kumarasamy THANGARAJ. Genetic Structure of Chimpanzee Populations. PLoS
Genetics.
2007,
vol.
3,
issue
4,
10.1371/journal.pgen.0030066.
e66-.
DOI:
Dostupné
z:http://dx.plos.org/10.1371/journal.pgen.0030066
BHARGAVA,
Atul
a
F.
F.
FUENTES.
Mutational
Dynamics
of
Microsatellites. Molecular Biotechnology. 2010, vol. 44, issue 3, s. 250-266. DOI: 10.1007/s12033-009-9230-4. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s12033-0099230-4
BISHOP, M.D., G.A. HAWKINS a C.L. KEEFER. Use of DNA markers in animal selection.
Theriogenology.
1995,
č.
43,
s.
61-70.
Dostupné
z:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0093691X9400018P
BRDIČKA, Radim. Lidský genom na rozhraní tisíciletí. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2001, 249 s. ISBN 80-247-0118-9.
BROWN, T. Klonování genů a analýza DNA: úvod. 1. české vyd. Překlad Martin Fellner. V Olomouci: Univerzita Palackého, 2007, xviii, 389 s. ISBN 978-802-4417196.
31
BUTLER, John M. Forensic DNA typing: biology, technology, and genetics of STR markers. 2nd ed. Boston: Elsevier Academic Press, c2005, xvii, 660 p. ISBN 01-2147952-8. CLARK, David P. Molecular biology. Boston: Elsevier Academic Press, c2005, p. ISBN 01-217-5551-7.
EL-ALFY, Sherif H. a Ahmed F. ABD EL-HAFEZ. Paternity testing and forensic DNA typing by multiplex STR analysis using ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2012, vol. 10, issue 1, s. 101-112. DOI: 10.1016/j.jgeb.2012.05.001.
Dostupné
z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1687157X12000194
ELLEGREN, Hans. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics. 2004, vol. 5, issue 6, s. 435-445. DOI: 10.1038/nrg1348. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nrg1348
GAŠ, B. (2001). Kapilární elektroforéza - Separační analytická metoda pro věk mikročipů. Vesmír 80, červenec , stránky 370-371.
HANCOCK, J. The contribution of slippage-like processes to genome evolution. Journal of molecular evolution. New York: Springer, 1995, roč. 24, č. 288, s. 1038-47. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8587102
HRUBAN, Vojtěch. Principy a aplikace molekulární genetiky ve šlechtění. Vyd. 1. Praha: Česká zemědělská univerzita, 1999, 242 s. ISBN 80-213-0519-3.
MANIATIS, Tom, E FRITSCH a Joseph SAMBROOK. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, x, 545 p. ISBN 08-796-9136-0.
PRAY, L. A. (2008). DNA replication and causes of mutation. Získáno 13.. duben 2014, z Nature Education: http://www.nature.com/scitable/topicpage/dna-replicationand-causes-of-mutation-409# 32
ROTHSCHILD, Max Frederick a Anatoly RUVINSKY. The genetics of the pig. 2nd ed. Wallingford, Oxfordshire, UK: CABI, 2011, x, 507 p. ISBN 978-184-5937-560.
ROUT, Pramod K, Manjunath B JOSHI, Ajoy MANDAL, D LALOE, Lalji SINGH a Kumarasamy THANGARAJ. Microsatellite-based phylogeny of Indian domestic goats. BMC Genetics. 2008, vol. 9, issue 1, s. 11-. DOI: 10.1186/1471-2156-9-11. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/1471-2156/9/11
SNUSTAD, D a Michael J SIMMONS. Genetika. Vyd. 1. Překlad Jiřina Relichová. Brno: Masarykova univerzita, 2009, xxi, 871 s. ISBN 978-802-1048-522.
ŠTEFLOVÁ, P., MICHALOVOVÁ, M., HOBZA, R., KUBÁT, Z., VYSKOT, B., & KEJNOVSKÝ, E. (2011). Expanze mikrosatelitů při PCR s mikrosatelitovými primery bez templátové DNA: Implikace pro obecný mechanizmus expanze mikrosatelitů v genomech. Genetická konference GSGM 2011: 14.-16.9.2011, Lednice : konferenční sborník. 1. vyd. Editor Jiří Doškař. Brno: Masarykova univerzita, 2011, 104 s. ISBN 978-80-210-5569-8.
TOTH, G. Microsatellites in Different Eukaryotic Genomes: Survey and Analysis. Genome Research. 2000, vol. 10, issue 7, s. 967-981. DOI: 10.1101/gr.10.7.967. Dostupné z: http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.10.7.967
ZHANG, W. a C. SMITH. Simulation of marker-assisted selection utilizing linkage disequilibrium: the effects of several additional factors. Theoretical and Applied Genetics. 1993, vol. 86, issue 4, s. 492-496. DOI: 10.1007/BF00838565. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF00838565
Vzor výsledků testu DNA, Index paternity, Pravděpodobnost otcovství. (2011-2014). Získáno
14.
duben
2014,
z
Bioquest
http://www.dnatestotcovstvi.com/hlavn%C3%AD-strana/vzorv%C3%BDsledk%C5%AF-testu-dna/
33
Diagnostics:
SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK Obr. 1 Schéma stavby nukleotidu ..................................................................................... 9 Obr. 2 Schéma SMM ...................................................................................................... 16 Obr. 3 Schéma slippage .................................................................................................. 17 Obr. 4 Schéma průběhu PCR analýzy ............................................................................ 19 Obr. 5 Schéma vyhodnocení gelové elektroforézy ......................................................... 20 Obr. 6 Schéma vyhodnocení fragmentační analýzy ....................................................... 23 Obr. 7 Rozdíly mezi genetickou, cytologickou a fyzikální mapou ................................ 26
Tab. 1 Porovnání velikostí jednotlivých genomů (Brdička, 2001) ................................. 14
34
SEZNAM ZKRATEK
DNA
-
deoxyribonukleová kyselina
cDNA -
komplementární DNA
dsDNA -
dvouvláknová DNA (double strand DNA)
RNA
-
ribonukleová kyselina
PCR
-
polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
PAGE -
polyakrylamidová gelová elektroforéza (polyacrylamide gel electrophoresis)
A,C,T,G,U - dusíkaté báze: Adenin, Cytosin, Thymin, Guanin, Uracil VNTR -
tandemové repetice s variabilním počtem opakování (variable number tandem repeats)
SSR
-
repetice jednoduchých sekvencí (simple sequence repeats)
STR
-
krátké tandemové repetice (short tandem repeats)
bp
-
pár bazí (base pair)
SMM -
stepwise mutation model
EtBr
ethidiumbromid
-
AgNO3 -
dusičnan stříbrný
NH4OH
- hydroxid amonný
KOH -
hydroxid draselný
RFLP -
polymorfismus délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism)
cM
-
centimorgan
STS
-
místa se sekvenační adresou (sequence-tagged sites)
QTL
-
lokusy kvantitativních znaků (quantitative trait locus)
35
