Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Mikrogyöngy alapú multiplex immunoassay rendszer fejlesztése multi-mikotoxin vizsgálatra: Túl a XX. századi alkalmazásokon
Czéh Árpád Soft Flow Hungary Kft. K+F Laboratórium
Témavezető:
Dr. Lustyik György
Doktori Iskola: Doktori Iskola vezetője: Program: Programvezető:
Interdiszciplináris Orvostudományok Doktori Iskola D93 Prof. Dr. Sümegi Balázs B-130; Funkcionális fehérje dinamika vizsgálata biofizikai módszerekkel Prof. Dr. Nyitrai Miklós Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biofizikai Intézet
Soft Flow Hungary Kutató Fejlesztő Kft. Pécs, 2014
TARTALOMJEGYZÉK 1.
BEVEZETÉS................................................................................................................................... 1
2.
FŐBB CÉLKITŰZÉSEK – PROBLÉMA HIPOTÉZIS ALAPÚ MEGKÖZELÍTÉSE ................. 4
3.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...................................................................................................... 7
4.
EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................ 8
5.
ÚJ EREDMÉNYEK ...................................................................................................................... 16
6.
EREDMÉNYEK ALKALMAZÁSA ............................................................................................ 18
7.
REFERENCIÁK ........................................................................................................................... 19
8.
KÖZLEMÉNYEK ......................................................................................................................... 21
1.
BEVEZETÉS
A mikotoxinokat termelő penészgombák, a mezőgazdasági termények széles skáláját fertőzhetik meg a betakarítás előtti és utáni időszakban. 1960 fontos dátum a mikotoxikológiában; ekkor érkezett ugyanis az Egyesült Királyságba egy szállítmány földimogyoró, mely a szállítás során gombás fertőzést szenvedett. Ez a földimogyoró végül állati takarmányként került felhasználásra, később ugyanez a földimogyoró okozta 100.000 pulyka pusztulását. A mintában egy, gombák által termelt toxikus anyagot, az aflatoxint sikerült kimutatni. Az aflatoxinok felfedezésével kezdetét vette a mikotoxinok körültekintő, alapos és szervezett kutatása. Ennek köszönhetően mostanra több mint 300 eltérő szerkezetű mikotoxint azonosítottak, melyek a világ minden táján kiemelt figyelmet kapnak, mint az emberi és állati egészségre veszélyt jelentő ágensek. A legkülönbözőbb penészgombafajok által megfertőzött gabonák gyakran jelentős mennyiségű mikotoxint tartalmaznak. A mikotoxinok
különböző
mikroszkópikus
gombák
alacsony-móltömegű,
másodlagos
anyagcseretermékei, melyek az egyszerű terményekből kiindulva a táplálékláncon keresztüljutva jelentős veszélyt jelenthetnek az álatokra, és az emberre is, hiszen bizonyítottan számos súlyos akut, valamint krónikus megbetegedés kialakulásához vezethetnek. A Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), felmérése szerint a világ élelmiszertermelésének 2050-ig meg kell kétszereződnie. Az élelmiszer-termelés, ilyen drámai növekedéséhez a következő 35 évében innovatív megoldásokra lesz szükség, melyek segítségével elérhetjük, illetve megőrizhetjük az állati és/vagy emberi fogyasztásra kerülő gabonák toxinmentességét világszerte. A legfontosabb világszerte előforduló mikotoxinok: aflatoxinok, ochratoxin A, fumonizinek, deoxinivalenol, zearalenon, és a T-2. Mikotoxinok széleskörű megjelenésével, elterjedésével a
1
számukra optimális pára- és a hőmérsékletviszonyok mellett kell számolni (Rahmani et al., 2009). A mikotoxinok okozta kóros elváltozások az azonnali emésztési problémáktól, az endokrin
rendellenességeken
és
a
csökkent
immunitáson
keresztül,
egészen
a
karcinogén/teratogén hatásokig terjedhetnek (Liu és a Wu, 2010; Reddy and Bhoola, 2010). A bizonyítottan mikotoxinok okozta egészségügyi problémák, kockázatok és a társadalmigazdasági jellegű tényezők indokolták a szabályozások és a mikotoxinokra vonatkozó határértékek megalkotását, és bevezetését. Időközben az Európai Közösség és a Food and Drug Administration (FDA, USA) meghatározta a mikotoxinok megengedhető maximális szintjét a hat, legfontosabb mikotoxinra élelmiszer és takarmányminták esetén. Határértékkel szabályozott mikotoxinok köre időről időre bővül. 2003 végére mintegy 100 országban került kialakításra monitoring rendszer, az élelmiszerekben és takarmányokban fellelhető; határértéket meghaladó mennyiségű mikotoxinok kimutatására (FAO, 2004). A takarmányok és az élelmiszerek mikotoxin tartalmának meghatározáshoz, valamint a kapcsolódó kockázatértékeléshez alkalmas analitikai módszerekre van szükség. Az immunoassay technológia az 1950-es évek közepén született, és már az 1980-as évekre széles körben alkalmazott módszerré vált. Az ELISA módszer a mikotoxin vizsgálatok terén is gyorsan közkedveltté vált, ennek köszönhetően már az 1990-es évek közepe óta a legtöbb fejlett országban alkalmaznak - erre akkreditált analitikai laboratóriumokban - kompetitív ELISA módszert a mikotoxinok kimutatására (Barna-Vetro et al., 1994). Az Analitikai Vegyészek Szövetsége (Association of Official Analytical Chemists (AOAC)) és az Európai Szabványügyi szabványosított
Bizottság mikotoxin
(European analitikai
Standardization módszert
tett
Committee
(CEN))
közzé. Módszereiket
számos laborközi
összehasonlító vizsgálatok keretében validálták. A módszerek elfogadottsága, így az összehasonlító vizsgálatokban résztvevő laborok száma évről évre egyre nő. Az AOAC által elismert, hivatalos módszereket leíró tanulmányának (Horwitz, 2000) legújabb kiadása körülbelül 40 validált mikotoxin analtikai módszert tartalmaz. A felhasználók a módszerek részleteiről, előnyeiről és alkalmazásáról a megjelent; összefoglaló tanulmányokból is tájékozódhatnak (FAO, 2004; Gilbert and Anklam, 2002). A hat legfontosabb mikotoxinra kellően pontos és érzékeny; kromatográfiás, vagy immunkémiai technikákon alapuló analitikai módszerek állnak rendelkezésre. Ezen túlmenően, azonban a közelmúltban számos új analitikai módszer is megjelent: fluoreszcencia-polarizációs próba, MIP (molecular imprinted polymers) használata, infravörös spektroszkópia, kapilláris elektroforézis, felszíni plazmon-rezonancia
bioszenzorok,
vékonyréteg-kromatográfia
gázkromatográfia (GC). 2
(TLC),
HPLC,
és
A mikotoxin analitika területén jelenleg elérhető ELISA kitek mindegyike egy időben csupán egyetlen mikotoxint képes kimutatni (Magan and Olsen, 2004). Ugyanakkor a legutóbbi öt évben a mikotoxin co-infekciókat leíró publikációk tanúsága alapján, a multiplex vizsgálatok iránti igény nyilvánvalóan növekszik (Sulyok et al., 2007). A multi-mikotoxinos (több mikotoxin egyidejű megjelenése) környezet súlyosabb és komplexebb egészségügyi kockázatot és kihívást jelent, ezért a multi-mikotoxin szennyezések szélesebb körű és alaposabb megfigyelése vált szükségessé. Az elmúlt évtizedben LC-MS/MS technológia gyors fejlődésének köszönhetően a több mikotoxin egyidejű azonosítása felgyorsult. A műszeres háttér fejlődése természetesen magával vonta a mintaelőkészítés javulását, egyszerűsödését is (Berthiller et al., 2014). Született egy rövidítés a; QuEChERS; amely a LC-MS/MS-hez kapcsolódó; gyors, egyszerű, olcsó, hatékony, robusztus és biztonságos minta előkészítés rövidítése (Berthiller et al., 2014). Jelenleg a multi-mikotoxin analízisre alkalmas tesztek leginkább a növényi termékekre koncentrálnak. A vizsgálatok elvégzésére a jövőben az egyik legmegfelelőbb módszer a több mikotoxin egyidejű analízisére alkalmas, kompetitív multiplex mikrogyöngy rendszer lehet. Az első, öt mikotoxin szimultán analízisére képes áramlási citometriás mikotoxin esszé 2008-ban a Budapesten rendezett sejtanalitikai világkongresszuson (ISAC; Czeh et al.; 2008) került bemutatásra. Hasonló, kompetitív mikrogyöngy esszét, közölt Anderson 2010-ben, amely két mikotoxin párhuzamos vizsgálatát tette lehetővé (Anderson et al., 2010). Ezek után 2011-ben Peters és kollégái is bemutatták az általuk kidolgozott közvetett gátláson alapuló, hat mikotoxint vizsgáló rendszert, amely a Luminex (Austin, TX, USA) áramlási citométerére lett kidolgozva (Peters et al., 2011). Peters rendszerében karboxil funkciós csoporttal rendelkező mágneses mikrogyöngyöket alkalmaz (x-MAP MultiAnalyte platform), ezzel könnyítve meg a mosási lépések elvégzését. Az igazi válasz a világméretű multi-mikotoxin kihívásra 2011ben érkezett meg; amikor az előzetesen már publikációkban ismertetett, hat mikotoxin szimultán analízisére
alkalmas mikrogyöngy alapú multiplex
esszé, kereskedelmi
forgalomban elérhetővé vált (Czeh et al., 2012). A mikotoxikológia eltökélten küzd azért, hogy „kiszorítsa” az emberi egészségre veszélyt jelentő mikotoxinokat az élelmiszer-lánc egészéből, hiszen a széles körben elterjedt szántóföldi hatást gyakran követi a mikotoxinok táplálékláncban történő megjelenése (biotranszfer), eljutva egészen az emberig (Fink-Gremmels, 1999; Peraica et al., 1999; Plestina et al., 1990; Wild and Gong, 2010). A mikotoxinok eljuthatnak (bio-transzfer) az emberhez közvetlenül, szennyezett gabona termékek fogyasztásával, vagy közvetett módon, olyan állati eredetű élelmiszer fogyasztásával, melyekben előzetesen mikotoxin halmozódott fel. Az 3
emlős, és emberi minták vizsgálatára jelenleg rendelkezésre álló ELISA módszer - a gabonavizsgálatokban alkalmazott kitekhez hasonlóan - egyidejűleg egyetlen mikotoxin kimutatására alkalmas (Magan and Olsen, 2004). A mikotoxinok mennyiségének csökkentésére jelenleg az alábbi négy módszer mutatja a legbiztatóbb eredményeket: (1) a mikotoxinok bontására környezetbarát enzimekkel (2) a mikotoxinokat irreverzibilisen kötő ágensek kifejlesztése, melyek a maszkolt mikotoxinok keletkezését segítik elő, vagy blokkolják a toxinok felszívódását, (3) mikotoxin rezisztens vetőmagok nemesítése (4) a betakarítás/szállítási/tárolás technológiájának fejlesztése annak érdekében, hogy megakadályozzuk a gombák elszaporodását a terményekben. A kompetitív fluoreszcens immunoassay (CFIA) multiplex rendszer kiválóan alkalmas a mikotoxikológiában legutóbb felmerült két kihívás megválaszolásában; az egy azonos gomba által termelt (1) több különféle mikotoxin gyakori együttes detektálásában és a (2) nagyszámú maszkolt mikotoxin változat elkülönítésében. A végső cél, a MycoEpi elnevezésű; megelőző stratégián alapuló, mikotoxin-orientált epidemiológiai megközelítés bevezetése. A MycoEpi a jövőben alkalmas lehet a globális kockázati zónák előrejelzésére, a mikotoxinnal szennyezett gabonák kiszűrésére és megsemmisítésre, még azok élelmiszerláncba történő bekerülése előtt, illetve a bio-transzfer folyamatok detektálására.
2.
FŐBB CÉLKITŰZÉSEK – PROBLÉMA HIPOTÉZIS ALAPÚ MEGKÖZELÍTÉSE
2012-ben, a világ népessége több mint 7 milliárd fő volt (Worldometers, 2012). Ugyanakkor a FAO 2009-es jelentése szerint, a népesség 2050-re, elérheti a 9,3 milliárd főt. Ezért az emberiségnek az elkövetkező 35 évben 70 %-kal több élelmiszert kell előállítani ahhoz, hogy élelmezni tudja a föld lakosságát (FAO - Economic and Social Development Department., 2008). Ezen tény a mennyiségi növekedés mellett ráirányítja a figyelmet a mikotoxinmentes élelmiszerek előállítására. Problémát jelent továbbá, hogy jelenleg a világ gabonatermesztése erősen központosított, kevesebb, mint 10 régió rendelkezik jelentős nemzetközi szállítási és kereskedelmi kapacitásokkal. A dolgozat egyik célja a több mikotoxin egyidejű vizsgálatra alkalmas módszer kidolgozásával hozzájárulni ahhoz, hogy a szennyezett élelmiszerek miatt, kialakuló potenciális katasztrófák elkerülhetőek legyenek. Ennek egyik lehetséges útja a minták szűrése, a szennyezett tételek megsemmisítése; elkerülve ezzel a szennyezett élelmiszer fogyasztásából adódó toxikózist. A szállítási problémák tovább súlyosbíthatják a fennálló problémát, hiszen a szállítás során újabb mikotoxinok jelenhetnek meg, multi-mikotoxin 4
szennyezést idézve elő a szállított gabonákon, vagy egyéb terményeken. A CFIA multiplex rendszer lehetővé teszi az egészségügyi kockázatok beazonosítását, és segít megakadályozni a fertőzött gabonák bejutását a globális élelmiszerláncba. A tervezett módszer alkalmas a szennyezett tételek kiszűrésére keletkezzen a toxikózis akár a szántóföldön, akár a szállítás/raktározás során. Jelen tézis kettő fontosabb hipotézis alapú megközelítés köré szerveződött. Az alább ismertetett elemek mögött álló egyszerű megoldások célja, együtt erősíteni a mikotoxin monitoring rendszert. A tervezés és a tesztelés során arra összpontosítottunk, hogy a XXI. század elvárásainak megfelelő, kellően robosztus rendszert dolgozzunk ki multi-mikotoxinos minták analízisére. 2.1. A probléma hipotézis alapú megközelítése (a) A mikrogyöngy esszé kiváló kötési kinetikai adottságainak kiaknázása egy gyors és költséghatékony multiplex mikrogyöngy rendszer fejlesztésére; a CFIA illesztése az analitkai rendszerbe. (b) Műszer-független kersztkalibrációs eljárás (IICC) fejlesztése az esszé rendszer, különböző áramlási citométereken történő teljes kompatibilitásának biztosítására. A jövőben a két fent említett elem összekapcsolása révén egy komplex mikotoxin monitoring rendszert, a myco-epidemiológia (MycoEpi) válik elérhetővé. A MycoEpi egy integrált, átfogó kockázatkezelési megközelítés a globális élelmiszer-lánc védelmére, mely a hagyományos empirikus epidemiológia alapelvein nyugszik, ugyanakkor integrálja XXI. századi biotechnológiát és telemetriát. Jelen megközelítés a kockázatértékelés támogatásán keresztül jelentősen növelheti a kapcsolódó egészségpolitikai döntések hatékonyságát. Hiszen a javasolt rendszer komplex élelmiszer biztonsági kockázatelemzést kínál; számszerűsíthető kockázatot jósolt, amely nagy jelentőséggel bír az egyének vagy a társadalom szintjén is; mindenütt ahol megjelennek multimikotoxin szennyezések (European Commission, 2002; Merrill, 1997). Elsőszámú cél, egy robosztus analitikai módszer kifejlesztése és globális hozzáférés biztosítása a több toxinnal szennyezett minták méréséhez megfizethető áron. A második célkitűzés, jól alkalmazható, egységes protokoll kidolgozása a különböző áramlási citométerek fluoreszcens kalibrálására, amely lehetővé teszi, hogy a mérések során kapott eredmények összevethetőek legyenek.
5
Az "egy penész – egy mikotoxin" hipotézis megdöntése jelentős hatással volt az addig széles körben elismert, egyetlen mikotoxin egyidejű mérésére alkalmas ELISA módszer megítélésére. Ugyanis a több mikotoxinnal szennyezet, vagy maszkolt mikotoxin tartalmú minták ELISA-val történő vizsgálatánál előfordulhatnak hamis, vagy nem megfelelő eredmények. 2012 óta több olyan eredményt leíró publikáció jelent meg, melyben a kötött mikotoxinok mellett másodlagos metabolitok is megtalálhatóak (Streit et al., 2013). Sajnos több jelenlegi ELISA kit ilyen körülmények között az összes mikotoxin koncentrációt “alulméri”, hiszen nem képes detektálni a mintában lévő maszkolt toxin mennyiségét. Új vizsgálati
módszerekre
van
szükség,
mely
képes
a
gabonák
multi-mikotoxin
szennyeződésének azonosítására. Az általunk tervezett CFIA multi-mikotoxin esszé lehetőséget teremt arra, hogy a maszkolt toxinok ellen kifejlesztett antitestek segítségével kibővítsük a rendszert a maszkolt mikotoxinok mérésével. A terveink között szerepel egy integrált kockázatértékelő stratégia kidolgozása (IRAS), ami magába foglalja az első két célkitűzés eredményeit. 2.2. Alkalmazott stratégiák A felmerült tudományos probléma megoldása, az alábbi ötlépéses stratégiával történt: 1.
Mikrogyöngy alapú kompetitív fluoreszcens immunoassay fejlesztése nagy affinitású monoklonális antitestek alkalmazásával. A mikrogyöngyök kínálta speciális kötési kinetika kihasználása az ELISA analitikai paraméterit meghaladó immunoasssay fejlesztésében.
2. A CFIA rendszerhez illeszkedő, egységes egy lépéses extrakciós eljárás kidolgozása, amely lehetővé teszi a kiválasztott hat mikotoxin együttes kezelését/analízisét. 3.
Spike-olt minták alkalmazásával (mivel nem létezik mind a hat vizsgálandó mikotoxint egyidejűleg tartalmazó referencia minta) kidolgozni az esszé minősítéséhez szükséges validációs protokollt, amivel bizonyítani lehet a párhuzamos minták statisztikai azonosságát/megfelelőségét. Az alacsony méréstartományban szükséges érzékenység biztosítása érdekében alapvető fontosságú a keresztreakciókból és a minta extrahálásából adódó mátrixhatások csökkentése.
4.
Kidolgozni a műszer-független keresztkalibrálási (IICC) protokollt, ami a CFIA rendszer kompatibilitását hivatott biztosítani, a különböző áramlási citométereken. A műszer-független minőségellenőrzés az analízis szoftver integráns részévé tehető.
6
5.
Az FCAP Array szoftver hozzáigazítása a CFIA
analitikai eljáráshoz. A
továbbfejlesztett szoftver kritikus elem, amely támogatja az analitikai platform adatkezelését a MycoEpi és a bio-átviteli vizsgálatok egésze során.
3.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
A fejlesztése során felhasznált anyagok és módszerek mindegyike azt a célt szolgálta, hogy több mikotoxin egyidejű mérésére tervezett CFIA eljárás, a legkülönbözőbb mintaféleségek (mátrixok) mikotoxin tartamának meghatározására alkalmas lehessen. A vizsgálati rendszer végül az alábbi – egy, vagy több mikotoxint tartalmazó - mikotoxinforrásokra került kidolgozásra: (1) a gabona, (2) az elsődleges biológiai testfolyadékok, mint a vér, vizelet és nyál, (3) a testnedvek, szövetek és szervek; elsődleges vagy másodlagos bio-transzfer források. Multi-mikotoxin szennyezések detektálása CFIA módszerrel Mivel a munka középpontjában módszerfejlesztés állt; a méréseket a kidolgozott reagensekkel és protokollok alkalmazásával folytattuk el. Az összehasonlító vizsgálatokat különböző gyártóktól származó, hét eltérő készüléken végeztük. Az adatgyűjtés minden esetben az áramlási citométerek saját szoftverével történt. Az alkalmazott multiplex CFIA protokoll részletei előzetesen publikálásra kerültek (Czeh et al., 2012). Az analízis szoftver módosításra került oly módon, hogy a felhasználó az eredményeket egyszerű és átlátható módon tudja értékelni. Az alkalmazott áramlási citométerek különbözőségei ellenére, az eredmények egységes formátumban jönnek létre (Czeh et al., 2013). Extrakciós protokoll növényi és állati mintákhoz Egy kellően hatékony, robosztus, egylépéses extrakciós eljárás elengedhetetlen a sikeres multi-mikotoxin rendszer kidolgozásában. A gabonára vonatkozó minta előkészítési protokoll részletei korábban közlésre kerültek (Czeh et al., 2012). Az egységes extrakciós eljárásnak kellően hatékonynak kell lennie ahhoz, hogy a mikrogyöngy rendszer a hat mikotoxin mindegyéket megfelelő pontossággal, reprodukálható módón tudja meghatározni a határértéket jelentő koncentrációnál. A táplálékláncba került mikotoxin minden esetben a biotranszfer folyamatok keretében haladnak a növényektől az állatok felé. Minden a dolgozatban leírt állatkísérletnél, figyelembe vettük az Európai Bizottság ajánlásait (86/609 EEC) (European Commission, 1986), ugyanakkor valamennyi kísérletet jóváhagyta a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet állatjóléti bizottsága.
7
A kifejlesztett módszerek ellenőrzése, validálási módszer kidolgozása, validálás A CFIA mikotoxin vizsgálati módszer validálása során minden eljárást különböző koncentrációtartományokban végrehajtottuk, a mintákat hat párhuzamosban vizsgáltuk, három független ismétlésben. A vizsgálatok során alkalmazott minták toxinmentes extraktumok spike-olásával készültek, így különbség tehető a kinyerési hatékonyság és a mátrix okozta jelerősítés, jelcsökkentés között. A vizsgálatok során többek között az ISO standard 5725‐ 5:1998 irányelv ajánlásai kerültek alkalmazásra (Gilbert és Anklam, 2002; Sulyok et al., 2007; ISO, 1998) Flow citometriás kereszt-kalibrálási protokoll kidolgozása A hét áramlási citométer által képviselt funkcionális sokszínűség kezelésére egy átfogó és univerzális multiplex platform protokollra volt szükség. Cél volt bebizonyítani; hogy nincsen jelentős eltérés a vizsgálatba bevont készülékek között; nincsen akadálya a multi-mikotoxin eredmények összehasonlításának (Czeh et al., 2013). Analízis szoftver Az analízis szoftver lehetővé teszi a különböző áramlási citométeren elvégzett mikotoxin mérések kiértékelését. A szoftver módosítások célja az volt, hogy váljon a hat toxin mindegyike egy időben mérhetővé/kezelhetővé. A CFIA analízishez szükséges valamennyi algoritmus beépítésre került (ezek közül néhány az eredmények szakaszban részletezésre kerül).
4.
EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
CFIA felfogható az ELISA rendszereket leváltó multiplex mikrogyöngy rendszerként. Szisztematikus fejlesztőmunka eredménye ez az analitikai rendszer, amely alkalmazza a XXI. századi biotechnológia vívmányait a mikotoxinok vizsgálatára. 4.1. Továbbfejlesztett multiplex immunoassay A 2000-es évek elején, az elérhető mikotoxin ellenes monoklonális antitestek megfelelőek voltak ugyan az ELISA módszerekben történő alkalmazáshoz; azonban a multiplex esszé elvárásainak nem feleltek meg.
8
1. ábra: A T-2 toxin kalibrációs görbéje a kompetitív rendszerekre jellemző, szigmoid görbe.
A kompetitív immunoassay-re jellemző kalibrációs görbe alakja szigmoid (lásd. 6. ábra). A nagyobb affinitású reagensek alkalmazásával lehetőség nyílt a kalibrációs görbe lineáris szakaszának kiszélesítésére (Barna-Vetro et al., 1994). A továbbfejlesztett multiplex immunoassay több előnyös tulajdonsággal rendelkezik: (1) a multiplex rendszerekre jellemző, aspecifikus kötődésből adódó mátrixhatás lecsökkenthető (lásd. 2. ábra), és (2) elérhető, hogy a hat mikotoxinra az EU által előírt határértékek a kalibrációs görbe középső, lineáris szakaszára essenek (lásd. 2. ábra)
9
2. ábra: A nagy affinitású monoklonális antitestek alkalmazásával kidolgozott multiplex mikrogyöngy rendszer hét standardpont alapján felvett kalibrációs görbéi Az EU által előírt határérték minden esetben a görbe középső szakaszára esik
4.2. Egylépéses extrakciós eljárás Az egylépéses extrakciós eljárás kidolgozásában jelentős know-how tapasztalat áll rendelkezésre, amely elősegítette a cél elérését, hogy a kifejlesztett extrakciós eljárás váljék kompatibilissá a multiplex esszé platformmal. Alapvető elvárás, az extrakciós eljárással szemben, hogy legyen reprodukálható, függetlenül attól, hogy egyetlen, vagy akár hat mikotoxin egyidejű kinyerése a cél. 10
3. ábra: Alflatoxin B1-től mentes termények jellemző fluoreszcens intenzitása. 1 = búza; 2 = kukorica; 3 = mungó bab; 4 = fehér csillagfürt; 5 = tavaszi árpa; 6 = csicseriborsó; 7 = kevert takarmány. Az első oszlop (0g/ml) mutatja a toxinmentes, míg az utolsó (2g/kg) az élelmiszer alapanyagokra vonatkozó EU határértéket. Valamennyi termény jellemző MFI értéke a határértéket jelentő “B” színt felett van.
Hét különböző, akkreditált laboratóriumban, referencia módszerrel előzetesen bevizsgált, toxinmentes gabonamátrix került előkészítésre, és extrahálásra. Valamennyi mintát a hat mikotoxin együttes vizsgálatára alkalmas CFIA rendszerrel vizsgáltuk (lásd, 3. ábra). Figyelembe véve az EU által meghatározott határértékeket; a mintákkal párhuzamosan egy toxinmentes és egy (élelmiszer alapanyagokra vonatkozó) határértéknek megfelelő aflatoxin B1-et tartalmazó standard is mérésre került. A két standard mérésével kapott MFI értékeket szaggatott vonal jelöli (A és B) a 3. ábrán. Az A és B vonal által határolt rész adja meg a toxinmentes mintákra jellemző MFI tartományt. Analitikai szempontból a 6 vizsgált toxin közül az aflatoxin B1 tekinthető a legproblematikusabbnak, ezért az erre vonatkozó eredmények kerülnek itt bemutatásra. Az aflatoxin B1 határértéke a legalacsonyabb a vizsgált mikotoxinok közül, így itt szükséges a legnagyobb érzékenység, itt lehet kritikus a minta mátrixhatása is. A 4. ábra tanúsága szerint a kidolgozott egylépéses eljárás a hét vizsgált növényi minta egyikében sem szabadít fel olyan anyagokat a mátrixból, amelyek a mérés során fals pozitív eredményeket okoznának a negatív mintákban. Hiszen mind a hét gabona esetében a kapott MFI érték a toxinmentes és a határértéknek megfelelő standard MFI értéke között helyezkedik el. A kidolgozott CFIA rendszerbe tartozó egyéb mikotoxinokra vonatkozó, hasonló vizsgálatokat eredményei itt nem kerülnek közlésre.
11
4.3. Validációs eljárások spike-olt mintákkal; a módszer minősítése és statisztikai értékelésére A vizsgálandó hat mikotoxint egyidejűleg tartalmazó, minősített referencia anyag (CRM) nem kapható, ezért a módszer érzékenységének bizonyítására más módszerre van szükség. Cél volt demonstrálni, hogy a CFIA rendszer érzékenysége, valamennyi toxin esetében meghaladja a hasonló ELISA-k érzékenységét. Szisztematikus munkával sikerült megszüntetni a multiplex immunoassay-re jellemző, aspecifikus kötődésből adódó mátrixhatást. A CFIA és az ELISA rendszerek összehasonlításának eredményeit az 1. táblázat tartalmazza. LOD (µg/kg)
∆ (x)
Határérték (µg/kg)
1.00
8.3
2
1.63
5.00
3.1
5
2.0
45.85
222.00
4.8
2000
4511
2.4
32.50
35.00
1.1
300
Zearalenone
5113
2.3
1.89
10.00
5.3
100
DON
4598
2.2
87.80
200.00
2.3
1750
Mycotoxin
MFI
CV %
CFIA
ELISA
Aflatoxin B1
4177
1.7
0.12
Ochratoxin A
3866
1.6
Fumonisin B1
2278
T-2 toxin
1. táblázat: A CFIA és ELISA rendszerek detektációs limit (LOD) értékeinek összehasonlítása.
Összehasonlítva CFIA teszt detektációs értékeit, az eredmények azt mutatják, hogy azok 1.18.3-szor alacsonyabbak, mint a megfelelő ELISA rendszer jellemző értékei (1. táblázat). A kidolgozott CFIA rendszer, összehasonlítva az ELISA módszerrel, két fontos előnnyel bír; az egyik előny a lehetőség a hat mikotoxin párhuzamos mérésére; a másik a megnövekedett érzékenység. 4.4. Műszer-független keresztkalibrálás - a CFIA platform alkalmazása különböző áramlási citométereken A
műszer-független
keresztkalibráláshoz
(IICC)
QuantiBRITE
kalibrációs
mikrogyöngyrendszer került alkalmazásra, mellyel a vizsgált hét áramlási citométer mérési paraméterei egymáshoz igazíthatóak. A hipotézis alapján a keresztkalibrálást követően egy áramlási citométerektől független analízis szoftver alkalmas lehet a minőségbiztosítási feladatok ellátására és a mérések kvantitatív értékelésre. A keresztkalibrálás eredményeit az 4. ábra illusztrálja. A QuantiBRITE mikrogyöngyök segítségével elvégzett műszer-független keresztkalibrálással két készülék szinkronizálása nem sikerült; az Accuri és a Luminex melynek oka, hogy ezen két készüléknél nincsen lehetőség a PE jelerősítés módosítására.
12
Továbbá az Accuri felbontása 7 dekád, szemben a többi készülék jellemzően, 3-4 dekádos felbontásával.
Csatornaszám (PE csatornában)
250
Calibur
200
Array Partec
150
Accuri Guava
100
FC500 Luminex 50 2,5
3
3,5
4
4,5
5
A mikrogyöngyök felületén lévő átlagos PE molekulaszám (LOG)
4 ábra: A QuantiBRITE mikrogyönggyel elvégzett műszer-független keresztkalibrálás eredményei.
4.5. A mikrogyöngy alapú rendszer dinamikájának jellemzése Az itt bemutatott eredmények a CFIA rendszer előnyösebb kötési kinetikai tulajdonságaival magyarázhatóak, ezért fontos az ELISA és CFIA módszerek kötési kinetikájának összehasonlítása. Cél volt, mérni és összehasonlítani az antigén-PE konjugátum kötési kinetikáját a mikrogyöngyök felületén található antitesttel, illetve az antitestek és az antigénenzim konjugátum jellemző kötési kinetikáját ELISA rendszerben. A vizsgálat során időről időre megmértük a fehérje kötődéséből adódó átlagos fluoreszcencia-intenzitást (MFI)/optikai denzitást (OD), ebből következtettünk a reakciókinetikára. A két rendszerben mérhető jelek (OD az ELISA és MFI a CFIA esetén) összehasonlításához egységes optikai skála kialakítása vált szükségessé, lásd 5. ábra. Az 5. ábra y-tengelyén ez az egységesített optikai skála (EORU; equivalent optical reading units) került ábrázolásra. Az EORU skálán a 60 percnél mérhető maximális jelintenzitás értékét tekintjük 1 egységnek. Az 5. ábrán látható két görbe illusztrálja a különbséget a kompetitív immuntesztek kötési kinetikái között. Jól látható, hogy a 45 percnél rövidebb inkubáció esetén jelentős különbségeket mértünk. Tisztán látszik az is, hogy a CFIA rendszer esetében rövidebb inkubációs idő alkalmazásával is értékelhető jelet kapunk. Feltételezésünk szerint, a gyorsabb reakció egyik lehetséges oka hogy a CFIA estén az antitest/antigén kötések kialakulása 13
gyorsabb, hiszen míg az ELISA esetében a reakció csupán a mikrotiter plate falára korlátozódik, addig a CFIA esetében (a folyadékfázisban) ilyen jellegű gátlás nincsen. Az ELISA és CFIA rendszerek kötési kinetikáját az alábbi egyenletek írják le: CFIA estén y = 0.1887ln(x) + 0.2367, R2=0.998 és ELISA estén y = 0.2677ln(x) - 0.1518, R2=0.954. Az egyenletek három független mérés eredményei alapján kerültek megállapításra. Minden időpontnál ábrázoltuk a jellemző szórásértékeket is, melyekről megállapítható, hogy jelentős eltéréseket nem tapasztaltunk; lásd 5. ábra.
CFIA és ELISA rendszerek kötési kinetikájának összehasonlítása 1,20 y = 0.1887ln(x) + 0.2367 R² = 0.9979
1,00
EORU
0,80 y = 0.2677ln(x) - 0.1518 R² = 0.954
0,60 0,40 0,20
ELISA
CFIA
0,00
0
10
20
30
40
50
60
Inkubációs idő (perc) 5. ábra: A CFIA és ELISA rendszerek kötési kinetikájának összehasonlítása. Az y-tengelyen az EORU (egységesített optikai skála) került ábrázolásra. Az EORU skálán a 60 percnél mérhető maximális jelintenzitást értékét tekintjük 1 egységnek.
14
CFIA rendszer kötési kinetikája 5800 5300 4800
MFI
4300 3800 3300
4 időpont
2800
5 időpont
2300
Mért érték
1800 0
10
20
30
40
50
60
Inkubációs idő (perc) 6. ábra: A CFIA jellemző kötési kinetikája 15, 20 és 60 perces inkubáció után. Kör szimbólum jelöli a tényleges, 12 időpont alapján kapott görbét. A négyzet és háromszög szimbólummal jelzett görbe a 4 és 5 pont alapján 45 percre jósolt MFI értékeket mutatja.
A hat lehetséges mikotoxin közül a DON kerül itt bemutatásra (lásd. 6. ábra). Az utolsó fázisban a kiválasztott toxint inkubálva az MFI értékek kerültek rögzítésre 2, 5, 10 és 15 percnél. Ezt követően a kapott MFI értékekre a korábban számított egyenlet segítségével görbét illesztettünk. A fenti protokollt kiegészítésre került a 20 percnél mért MFI-t is rögzítésével. Ez estben a görbeillesztés 5 időpont alapján történt meg. Összevetve a teljes mérési sorral, jól látszik, hogy mind a 4, mind az 5 pont alapján jósolt görbe jól közelít a tényleges görbéhez. 4.6. A CFIA analitikai rendszer alkalmazása emlős minták vizsgálatára A CFIA rendszer adaptálása állati minták multi-mikotoxin tartalmának meghatározásához folyamatban van. Laboratóriumi modellállaton (patkány) elvégzett zearalenon (ZEA) etetési kísérletek után a begyűjtött vérplazma mikotoxin tartalmát vizsgáltuk (lásd 7. ábra).
15
7. ábra: Vérplazma ZEA koncentrációk. A mikotoxin koncentrációt 3 napos ZEA etetési kísérletben kezelt, ivarérés előtti nőstény patkányok vérplazmájában mértük CFIA rendszerrel. A vérben a mért ZEA koncentráció dózisfüggő növekedést mutatott, követve az orálisan bevitt mennyiségeket.
Az eredmények arra utalnak, hogy a kidolgozott vizsgálati eljárás alkalmas lehet az állati minták mikotoxin tartalmának meghatározására. A testreszabott FCAP Array analízis szoftver rendelkezik azokkal az algoritmusokkal, amelyek alkalmassá teszik mind a növényi és állati eredetű minták multiplex méréseinek kezelésére (lásd 2. táblázat). Szoftver jellemzők
1
EU határértékek (g/kg)
2
Nemzeti, vagy regionális határok kiválasztása
3
Gyermek/felnőtt/állati felhasználás
4
Görbe standardjainak száma
5 6
Vizsgált mikotoxinok AB1
OTA
FB1
T-2
ZEA
DON
2
5
1400
300
100
1250
megvalósítható
6
6
6
6
6
6
Mikotoxinok számának korlátozása
nem
nem
nem
nem
nem
nem
Logaritmikus skála alkalmazása
igen
igen
igen
igen
igen
igen
Table 2: Speciális analízis szoftver multi-mikotoxinos minták CFIA vizsgálatára
5.
ÚJ EREDMÉNYEK
A kutatás célja több mikotoxin egyidejű analízisére alkalmas analitikai módszer fejlesztése volt, mellyel a szennyezett gabonák kiszűrhetőek az élelmiszerláncból továbbá az élelmiszer és/vagy takarmányminták mikotoxin vizsgálatának költsége csökkenthető. Munkánk során 16
igyekeztünk ötvözni a múlt innovatív megoldásait és a XXI. század biotechnológiájának forradalmi újdonságait. (1)
Elsőként fejlesztettünk ki és publikáltunk a mikotoxinok mérésére szolgáló, mikrogyöngy alapú multiplex mikroanalitikai eljárást. Kompetitív fluoreszcens mikrogyöngy (CFIA) alapú áramlás citometriás analitikai módszert fejlesztettünk ki hat mikotoxin gabonamintákból történő egyidejű kvantitatív analízisére. A kidolgozott rendszert kereskedelmi forgalomba hozható termékké fejlesztettük. A korábban publikált eljárások módosításával kidolgoztuk a CFIA módszerhez szükséges fluoreszcens (PE) konjugátumok, és antitesttel jelölt mikrogyöngyök előállítását. Optimalizáltuk a kifejlesztett rendszert, bizonyítottuk, hogy a kidolgozott PE/antitest kötési módszer nem befolyásolja az antitestek antigén felismerő/kötő képességét. Igazoltuk hipotézisünket, miszerint a CFIA és ELISA rendszerek elérő kötési
kinetikával
rendelkeznek,
melynek
eredményét
reakciósebességben
és
érzékenységben láthatjuk. Bizonyítottuk, hogy a kifejlesztett mikrogyöngy alapú CFIA érzékenysége, jelentősen meghaladja a mikotoxikológiában eddig alkalmazott ELISA módszerek jellemző adatait. Igazoltuk, hogy a kidolgozott CFIA rendszer minden alkotórésze több hónapon keresztül megőrzi minőségét. (2)
Műszer-független kereszt-kalibrálási (IICC) eljárás került kidolgozásra hét különböző áramlási citométerre; a kifejlesztett fluoreszcencia alapú CFIA mennyiségi analízis segítésére. Bizonyítottuk, hogy az új IICC eljárás alkalmazásával a különböző készülékeken végzett multi-mikotoxin mérések eredményei megegyeznek.
(3)
Kidolgoztunk egy egységes egylépéses extrakciós eljárást, mellyel a hat mikotoxin együttes extrakciója elvégezhető. Az új extrakciós eljárás kombinálva az IICC eljárással; lehetőséget teremtett az új analitikai vizsgálati platform kidolgozására.
(4)
A már létező analitikai szoftvert speciális funkciókkal egészítettük ki, ami kompenzálja a különböző készülékek közötti eltéréseket; mintakezelést, lézereket. Az új szoftver megkönnyíti a multi-mikotoxin mérések elvégzését, kiértékelését azzal, hogy tartalmazza az alkalmazandó vizsgálati protokoll részleteit, a standard pontok koncentrációját és a különböző régiókra vonatkozó határértékeket.
(5)
CFIA rendszer alkalmassá tettük állati minták mikotoxin tartalmának analízisére, és ezzel együtt a bio-transzfer nyomon követésére is a teljes élelmiszerláncban. A zearalenon mikotoxin állati mintákból történő mennyiségi méréséhez az irodalomban elsőként alakítottunk ki mérési protokollt
17
(6)
A kidolgozott, klinikai potenciállal is rendelkező analitikai rendszer (MycoEpi) jövőbeli bevezetését javasoljuk. MycoEpi stratégia alkalmas lehet az átfogó egészségügyi kockázatbecslésre, kezelésre. Segítségével a mikotoxin szennyezések nyomon követhetőek a szántóföldtől, a mikotoxin élelmiszerláncon keresztüli mozgásán át, egészen ez emberig.
6.
EREDMÉNYEK ALKALMAZÁSA
Napjainkban a fejlett országok élelmiszer kínálata mikotoxikológiai szempontból sokkal biztonságosabbnak tekinthető, mint amilyen a XX. század végén volt. Azonban továbbra is jelentős kihívások és teendők várnak ránk az élelmiszerlánc egészét illetően. Mostanra bebizonyosodott, hogy a jövőben csak a multidiszciplináris megközelítés szavatolhatja a globális élelmiszer-ellátás biztonságát. MycoEpi segítségével nagy lépést tehetünk a globális mikotoxin toxikózisok kialakulása ellen. A multi-mikotoxin szennyezések nyomon követésére, vizsgálatára az egyik legalkalmasabb módszer lehet az általunk kidolgozott CFIA rendszer. Amely ugyanakkor – a MycoEpi-vel kombinálva - alkalmas a növénytermesztési technikák, a mikotoxin kötési és bontási módszerek hatékonyságának nyomon követésére is.
18
7.
REFERENCIÁK
1. Anderson,G.P., Kowtha,V.A. and Taitt,C.R., 2010. Detection of fumonisin b1 and ochratoxin a in grain products using microsphere-based fluid array immunoassays. Toxins. (Basel) 2, 297. 2. Barna-Vetro,I., Gyongyosi,A. and Solti,L., 1994. Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay of Fusarium T-2 and zearalenone toxins in cereals. Appl. Environ. Microbiol. 60, 729. 3. Berthiller,F., Burdaspal,P.A., Crews,C., Iha,M.H., Krska,R., Lattanzio,V.M.T., MacDonald,S., Malone,R.J., Maragos,C.M., Solfrizzo,M., Stroka,J. and Whitaker,T.B., 2014. Developments in mycotoxin analysis: An update for 2012-2013. World Mycotoxin Journal 7, 3. 4. Czeh,A., Torok,L., Torok,T., Siklodi,B., Lustyik,G. Development of competitive multiplexed microbead array technology for simultaneous detection of mycotoxins in food and feed products. ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, 2008. - Oral Presentation 5. Czeh,A., Mandy,F., Feher-Toth,S., Torok,L., Mike,Z., Koszegi,B. and Lustyik,G., 2012. A flow cytometry based competitive fluorescent microsphere immunoassay (CFIA) system for detecting up to six mycotoxins. J. Immunol. Methods 384, 71. 6. Czeh,A., Schwartz,A., Mandy,F., Szoke,Z., Koszegi,B., Feher-Toth,S., Nagyeri,G., Jakso,P., Katona,R.L., Kemeny,A., Woth,G. and Lustyik,G., 2013. Comparison and evaluation of seven different bench-top flow cytometers with a modified six-plexed mycotoxin kit. Cytometry A 83, 1073. 7. European Commission. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes . L 358, 0001-0028. 12-18-1986. Official Journal . Ref Type: Report 8. European Commission. Regulation (EC) No 178/2002 of the European Parliament and of the Council of 28 January2002 laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food SafetyAuthorityand laying down procedures in matters of food safety. L31. 2-1-2002. Official Journal of the European Communities. Ref Type: Report 9. FAO, 2004. Worldwide regulations for mycotoxins in food and feed in 2003. FAO, Food and Nutrition Paper No. 81. 10. FAO - Economic and Social Development Department., 2008. The State of Food Insecurity in the World, 2008: High food prices and food security - threats and opportunities". Food and Agriculture Organization of the United Nations. 11. Fink-Gremmels,J., 1999. Mycotoxins: their implications for human and animal health. Vet. Q. 21, 115. 12. Gilbert,J. and Anklam,E., 2002. Validation of analytical methods for determining mycotoxins in foodstuffs. Trends Anal. Chem. 21. 19
13. Horwitz,W., 2000. Natural Toxins. In: Official Methods of Analysis of AOAC International. [AOAC International., Gaithersburg, USA]. 14. ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Alternative methods for the determination of the precision of a standard measurement method. 1998. Ref Type: Report 15. Liu,Y. and Wu,F., 2010. Global burden of aflatoxin-induced hepatocellular carcinoma: a risk assessment. Environ. Health Perspect. 118, 818. 16. Magan,N. and Olsen,M., 2004. Mycotoxins in Food: Detection and Control. Woodhead Pub.. 17. Merrill,R.A., 1997. Food safety regulation: reforming the Delaney Clause. Annu. Rev. Public Health 18, 313. 18. Peraica,M., Radic,B., Lucic,A. and Pavlovic,M., 1999. Toxic effects of mycotoxins in humans. Bull. World Health Organ 77, 754. 19. Peters,J., Bienenmann-Ploum,M., de,R.T. and Haasnoot,W., 2011. Development of a multiplex flow cytometric microsphere immunoassay for mycotoxins and evaluation of its application in feed. Mycotoxin. Res 27, 63. 20. Plestina,R., Ceovic,S., Gatenbeck,S., Habazin-Novak,V., Hult,K., Hokby,E., Krogh,P. and Radic,B., 1990. Human exposure to ochratoxin A in areas of Yugoslavia with endemic nephropathy. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 10, 145. 21. Rahmani,A., Jinap,S. and Soleimany,F., 2009. Qualitative and Quantitative Analysis of Mycotoxins. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 8, 202. 22. Reddy,L. and Bhoola,K., 2010. Ochratoxins-food contaminants: impact on human health. Toxins. (Basel) 2, 771. 23. Streit,E., Schwab,C., Sulyok,M., Naehrer,K., Krska,R. and Schatzmayr,G., 2013. Multimycotoxin screening reveals the occurrence of 139 different secondary metabolites in feed and feed ingredients. Toxins. (Basel) 5, 504. 24. Sulyok,M., Berthiller,F., Krska,R. and Schuhmacher,R., 2006. Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2649. 25. Sulyok,M., Krska,R. and Schuhmacher,R., 2007. Application of a liquid chromatographytandem mass spectrometric method to multi-mycotoxin determination in raw cereals and evaluation of matrix effects. Food Addit. Contam 24, 1184. 26. Wild,C.P. and Gong,Y.Y., 2010. Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue. Carcinogenesis 31, 71. 27. Worldometers. Worldometers.info. Retrieved . 4-12-2012. Ref Type: Electronic Citation
20
8.
KÖZLEMÉNYEK
Értekezés alapjául szolgáló közlemények 1. Czeh A, Schwartz A, Mandy F, Szoke Zs, Koszegi B, Feher-Toth S, Nagyeri Gy, Jakso P, Katona LR, Kemeny A, et al. Comparison and Evaluation of Seven Different Bench-Top Flow Cytometers With a Modified Six-Plexed Mycotoxin Kit. Cytometry: Part A 2013. IF: 3.711; Citations: 0 2. Czeh A, Mandy F, Feher-Toth S, Torok L, Mike Z, Koszegi B, Lustyik G. A Flow Cytometry Based Competitive Fluorescent Microsphere Immunoassay (CFIA) System for Detecting Up to Six Mycotoxins. J Immunol Methods 2012;384:71-80. IF: 2.203; Citations: 9 3. Kriszt R, Krifaton C, Szoboszlay S, Cserhati M, Kriszt B, Kukolya J, Czeh A, Feher-Toth S, Torok L, Szoke Z, et al. A New Zearalenone Biodegradation Strategy Using Non Pathogenic Rhodococcus Pyridinivorans K408 Strain. PLoS One 2012;7:e43608. IF: 4.092; Citations: 7 Értekezés témájában megtartott előadások 1. Czeh A, Torok L, Torok T, Siklodi B, Lustyik Gy.
Development of competitive
multiplexed microbead array technology for simultaneous detection of mycotoxins in food and feed products. ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, 2008. Értekezés témájában bemutatott poszterek 1. Czeh A, Torok L, Gorombey P, Torok T, LantosE, Lustyik Gy. Development of Flow Cytometric Multiplexed Microbead Assay for Detection of Mycotoxin Contamination. Regional Biophysics Conference, Balatonfüred, Hungary, 2007.
2. Czeh A, Toth Sz, Torok L, Torok T, Lustyik Gy.
Development and validation of
Multiplexed Microbead Assay for Detection of six different Mycotoxins in feed. CYTO Congress, Seattle, Washington, USA, 2010.
3. Czeh A, Toth Sz, Torok L, Torok T, Lustyik Gy. Side by side Comparison Between the Traditional ELISA and the New Fungi-Plex6 Microbead Assay (MA) for Detection of six Mycotoxins. World Mycotoxin Forum, Amsterdam, Holland, 2010.
21
4. Czeh A, Toth Sz, Mike Z, Koszegi B, Mandy F, Lustyik Gy. Flow Cytometry is Reaching New Horizons In Disease Prevention: An Illustration How A Multiplexed Mycotoxin Kit Performs Using Several Types of Instrument with Either Analog or Digital Signal Processing. CYTO Congress, Baltimore, Maryland, USA, 2011.
5. Czeh A, Mandy F, Lustyik Gy. Flow Cytometry Based Myco-Epidemiology has Potential Impact on Mycotoxin outbreaks and Health: A Largely Ignored Global Concern A Harmonized Approach to Preventive Medicine. ESCCA Congress, Dublin, Ireland, 2011. 6. Székács A, Bánáti H, Czéh Á, Tóth Sz, Juracsek J, Darvas B, Székács I, Lustyik Gy. Detection of environmental and food contaminant mycotoxins with polymeric bead-based immune-detection
in
a
multiplexed
flow
cytometry
assay
format.
The
4th
Annual NanoScience Technology Symposium, Miami, Florida, USA, 2011.
7. Czeh A, Feher-Toth Sz, Szoke Zs, Ferenczi Sz, Kriszt, R, Nagyeri Gy, Mandy F, Kovacs KJ, Lustyik Gy, A Microbead Assay Platform for the Detection of Zearalenone from rat blood and brain tissue. CYTO Congress, Leipzig, Germany, 2012. 8. Fehér-Tóth Sz, Kukolya J, Czéh Á, Török L, Lustyik Gy. A new fluorescent microsphere based assay for studying Aflatoxin B1 biodegradation by flow cytometry CYTO Congress, Leipzig, Germany, 2012. Egyéb közlemények 1. Beres A, Lelovics Z, Antal P, Hajós G, Gézsi A, Czeh A, Lantos E, Major T. "Does
happiness help healing?" Immune response of hospitalized children may change during visits of the Smiling Hospital Foundation's Artists. Orv Hetil. Oct 23; 152(43):173944.2011. Összesített impakt faktor: 9,7
Független hivatkozások száma: 13
22
