Mikrobiologie plísňových sýrů Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Mikrobiologie plísňových sýrů Bakalářská práce

Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Vypracovala: Růžena Zatloukalová

Brno 2012

ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mikrobiologie plísňových sýrů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

V Brně dne ………………………………………. Podpis ……………….…..……………………….

PODĚKOVÁNÍ

Touto cestou bych ráda poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při tvorbě bakalářské práce i při mikrobiologických rozborech. Mé poděkování patří také celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin.

ABSTRAKT

Bakalářská práce pojednává o možné kontaminaci plísňových sýrů a jejímu vlivu na senzorické a chemické změny. Popisuje výrobu jednotlivých skupin plísňových sýrů a jejich zrání. Zabývá se jednotlivými mikroorganismy, zejména bakteriemi mléčného kvašení a kulturními druhy plísní. Charakterizuje nežádoucí mikroorganismy způsobující kontaminaci a uvádí možná opatření v boji proti nim. Vybrané skupiny mikroorganismů byly stanoveny kultivačními metodami ve vzorcích sýrů s plísní v těstě. Zjištěné hodnoty jsou shrnuty ve výsledcích a závěru.

Klíčová slova: mléko, sýr, mikroorganismy, bakterie, plísně, kvasinky, mykotoxiny

ABSTRACT The bachelor work deals with possible contamination of mould cheese and its influence on sensory and chemical changes. It describes the production of individual mould cheese groups and their ripening. It deals with various microorganisms, especially lactic acid bacteria and cultivated types of mould. It characterizes undesirable microorganisms causing contamination and identifies possible defense. Selected groups of microorganisms were identified by cultivation methods in samples of cheese with mould in the batter. The obtained values are summarized in the chapter called The Results and Conclusion.

Keywords: milk, cheese, microorganisms, bacteria, moulds, yeasts, mycotoxins

OBSAH 1 ÚVOD............................................................................................................................ 7 2 CÍL PRÁCE.................................................................................................................. 8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................ 9 3.1 PLÍSŇOVÉ SÝRY A JEJICH ROZDĚLENÍ ....................................................................... 9 3.2 VÝROBA SÝRŮ ....................................................................................................... 11 3.2.1 Sýry s plísní v těstě ........................................................................................ 11 3.2.2 Sýry s plísní na povrchu................................................................................. 16 3.2.3 Sýry s plísní v těstě i na povrchu ................................................................... 21 3.3 VÝZNAMNÉ MIKROORGANISMY ............................................................................. 22 3.3.1 Technologicky důležité mikroorganismy ...................................................... 22 3.3.2 Mikroorganismy způsobující kažení sýrů...................................................... 29 3.3.3 Vady plísňových sýrů způsobené mikroorganismy ....................................... 31 3.3.1 Mykotoxiny v plísňových sýrech................................................................... 33 3.4 PREVENCE .............................................................................................................. 35 3.4.1 Hygiena pracovníků v provozu...................................................................... 35 3.4.2 Vybavení a sanitace provozu ......................................................................... 35 3.4.3 Použití jakostních a zdravotně nezávadných surovin pro výrobu.................. 36 3.4.4 Dodržování technologických postupů ........................................................... 37 3.4.5 HACCP .......................................................................................................... 38 4 MATERIÁL A METODIKA.................................................................................... 39 4.1 CHARAKTERISTIKA MATERIÁLU ............................................................................. 39 4.2 PŘÍPRAVA LABORATORNÍCH POMŮCEK .................................................................. 40 4.3 ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ ............................................................................................ 40 4.4 ŘEDĚNÍ VZORKŮ .................................................................................................... 41 4.5 STANOVENÍ MIKROORGANISMŮ.............................................................................. 41 4.6 POSTUP PŘI VAŘENÍ AGAROVÝCH PŮD .................................................................... 43 5 VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................ 44 6 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 48 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ................................................................... 49 8 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK....................................................................... 52

1 ÚVOD Sýry patří k tradičním produktům, které člověk poznal již před několika tisíci lety. Představují velkou a poměrně různorodou skupinu mléčných výrobků konzumovanou po celém světě. Jedná se o čerstvé nebo prozrálé výrobky. Získávají se oddělením syrovátky po koagulaci mléka s různou tučností. V sýrech se koncentrují základní složky sušiny mléka, hlavně kasein a mléčný tuk. Podle vyhlášky č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje, ve znění pozdějších předpisů, je sýrem - mléčný výrobek vyrobený vysrážením mléčné bílkoviny z mléka působením syřidla nebo jiných vhodných koagulačních činidel, prokysáním a oddělením podílu syrovátky. Sýry se liší chutí, strukturou nebo technologickým postupem, proto je možno je rozdělit podle řady hledisek. Nejjednodušší dělení je podle typu mléka. Dále se dělí podle tvrdosti na čerstvé, měkké, polotvrdé a tvrdé sýry. Podle způsobu srážení mléka rozlišujeme kyselé a sladké sýry. Ke sladkým sýrům řadíme také skupinu sýrů, kdy se při srážení mléka uplatnila jak syřidla, tak i vytvořená kyselina mléčná. Podle zrání se klasifikují přírodní sýry na nezrající, zde patří čerstvé sýry a termizované. Pak sýry zrající a to na povrchu, s mazem na povrchu a v celé hmotě. Z toho sýry plísňové, které jsou zrající s tvorbou charakteristické plísně na povrchu, uvnitř hmoty či sýry dvouplísňové.

7

2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je zpracovat literární rešerši, ve které budou shrnuty informace o plísňových sýrech. Práce je z mikrobiologického hlediska zaměřena na

popis

technologicky

důležitých

i

kontaminujících

mikroorganismů.

Dále na charakterizování prevence v boji proti nežádoucím mikroorganismům způsobujícím kažení sýrů. Součástí práce je provedení experimentálního stanovení významných skupin mikroorganismů vyskytujících se ve 3 druzích sýrů s plísní uvnitř těsta.

8

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Plísňové sýry a jejich rozdělení V roce 2008 byla spotřeba sýrů v České republice 12,9 kg na osobu. Z toho plísňových sýrů 1,6 kg. V roce 2010 již celková spotřeba sýrů překročila 13 kg na osobu (www.czso.cz). Základní surovinou pro výrobu plísňových sýrů je kravské mléko, některé druhy sýrů se vyrábějí z mléka ovčího i kozího. Nejčastěji se používá šetrná pasterace, která zajišťuje nezávadnost sýrů. Standardizace mléka se provází proto, aby bylo dosaženo požadovaného obsahu tuku v sušině. Pro sýry s plísní v těstě je žádoucí lipolýza v průběhu zrání, proto se homogenizuje smetana pro standardizaci mléka. Nezbytným předpokladem pro výrobu sýrů je přídavek čistých kultur do mléka před sýřením (KADLEC a kol., 2009). Převážná část plísňových sýrů patří do skupiny sladkých zrajících sýrů, kde je sražení kaseinu způsobeno syřidly. Existují také plísňové sýry, k jejichž výrobě se používá srážení kyselé (CALLEC, 2003). Ze vzniklé sraženiny se uvolňuje syrovátka. Některé operace při zpracování sraženiny podporují její synerezi. Následuje její formování v tvořítkách, které je závislé na typu sýru. Solení plísňových sýrů v zrně je významné, protože má vliv nejen na výslednou chuť, ale ovlivňuje také aktivitu kultur a enzymů při zrání (HUTKINS, 2006). Proces zrání představuje komplexní souhrn změn způsobených syřidlovými enzymy, enzymovou činností kultur, případně činností nezákysových kultur, při kterých sýr získává typický vzhled, konzistenci, chuť, vůni a složení. Dochází k rozkladu bílkovin, změnám tuku a výrazně se mění konzistence sýrů. Důležité jsou podmínky zrání, které závisí na typu sýra. Určují rychlost zrání, ztráty hmotnosti, tvorbu kůry a další. Rozhodujícími parametry je teplota a doba zrání (KADLEC a kol., 2009).

9

Obr. 1 Schéma rozdělení plísňových sýrů (Zdroj: autor)

Plísňové sýry jsou rozděleny podle obrázku č. 1, a to na sýry s tvorbou charakteristické plísně na povrchu. Při jejich srážení se používá menší množství syřidla a sýřenina se krájí najemno (CALLEC, 2003). Mezi sýry s plísní na povrchu řadíme sýry typu Camembert, De Brie, Hermelín, Chaource, Coulomminers. Jedná se o měkké sýry vyrobené sražením pomocí syřidla bez dohřívání sýřeniny a lisování s povrchem pokrytým bílou ušlechtilou plísní Penicillium camemberti (VLKOVÁ, 2009). Další skupinou jsou sýry s tvorbou charakteristické plísně uvnitř hmoty. Po nasolení a odkapání se vytvářejí podlouhlé vpichy, které pomáhají růstu plísně. V těchto případech zrání probíhá od středu směrem ven (CALLEC, 2003). Mezi oblíbené sýry s plísní v těstě se řadí francouzský Roquefort, Bleu ďAuvergne, anglický

Stilton,

italská

Gorgonzola,

česká

Niva

a

další.

Měkké

až polotvrdé sýry jsou protkané zelenou nebo modrou plísní Penicillium roqueforti (KOPÁČEK, 2011). Existují také sýry dvouplísňové, kde dochází k růstu plísní jak na povrchu, tak i uvnitř těsta. Používá se tedy kombinace obou plísní. U nás se vyrábí sýr Vltavín. Známá je také německá Cambozola (CALLEC, 2003).

10

3.2 Výroba sýrů 3.2.1 Sýry s plísní v těstě Sýry s plísní v těstě se vyrábějí v současnosti z homogenizovaného mléka. Homogenizované tukové kuličky mají větší reakční povrch, a proto v nich rychleji probíhá lipolýza a ostatní reakce vyvolané enzymy plísně. Pro primární anaerobní zrání se plnotučné mléko zakysává mezofilní bakteriální kulturou obsahující Lactococcus lactis ssp. lactis a citran metabolizující L. lactis ssp. lactis biovar diacetylactis a Leuconostoc ssp. (GÖRNER, VALÍK, 2004). Do plnotučného sýrařského mléka se přidává pro aerobní zrání suspenze spor plísně P. roqueforti v množství 103 až 104 spór na 1 ml mléka. Někteří sýraři doporučují přidávat spory plísně do mléka, jiní až do sýrového zrna (KADLEC a kol., 2009). Koagulované mléko se krájí a drobí na zrno velikosti obyčejně jako vlašský ořech, ale i menší. Vzniklá sýřenina se zahřívá na 26 až 37 °C a udržuje se při této teplotě 30 minut. Za slabého pohybu sýřeniny se postupně odpouští syrovátka. Sýřenina se nejprve solí v zrně, potom se formuje a při teplotě 21 až 27 °C se ponechává několik dní odkapat, přičemž dochází k fermentaci laktosy v zrně. Sýřenina kysne a dosahuje hodnoty

pH

4,8

až

4,9.

V tomto

stavu

je

sýřenina

náchylná

na

růst

a rozmnožování nežádoucích kvasinek a bakterií (GÖRNER, VALÍK, 2004). Hutkins (2006) popisuje, že se sýrové bochníky nasolí ve vodné lázni, jakmile je ukončena fermentace. Sýry roquefortského typu se vyrábějí značně slané, na Slovensku s obsahem 4 % NaCl, ale v zahraničí až 8 % NaCl. Pro dosažení těchto koncentrací soli se mladé sýry musí solit v zrně a i na sucho po zformování (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.2.1.1 Zrání Modrá plíseň Penicillium roqueforti je schopna se vyrovnat s přebytkem CO2 a s nedostatkem O2, přesto je třeba sýr propichovat jehlami pro usnadnění růstu. Zabezpečí se tak výměna plynů (HUTKINS, 2006). Přemístí se do místnosti s teplotou 12-15 °C a relativní vlhkosti 90 až 95 % (GÖRNER, VALÍK, 2004). Podle Kadlece a kol., (2009) sýry zrají při teplotách 9-12 °C a vysoké relativní vlhkosti více jak 90 %. V počátku zrání může být teplota i vyšší a později se snižuje, nebo je také možné sýr nechat zrát i při nižší teplotě, a to 4-8 °C (HUTKINS, 2006).

11

Dochází k prorůstání plísní. Za 2 až 4 měsíce sýr správně proroste a získá požadované vlastnosti. Celková doba je závislá na velikosti sýra, a na podmínkách při kterých zraje (PAVELKA, 1996). V průběhu zrání je tuková globule vystavena enzymu lipáza (obr. 2), a dochází tím k rozrušení a uvolnění volných mastných kyselin (HUTKINS, 2006).

Obr. 2 Štěpení tuku (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004)

Volné mastné kyseliny se následnou oxidační dekarboxylací mění na metylketony. Ty mají významný vliv na aroma, chuť i vůni sýrů. Účinnými mají být 2-heptanon a 2-nonanon. K celkovému aroma sýrů s plísní v těstě přispívají ještě sekundární alkoholy, metyl- a etyl-estery mastných kyselin a produkty vzniklé proteolýzou mléčné bílkoviny (HUTKINS, 2006). Při zrání těchto sýrů vzniká na jejich povrchu maz jako u sýrů zrajících pod mazem. Tento maz má svými enzymy, které difundují do sýra, vliv na tvorbu typického aroma roquefortu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Vzniklý maz se z povrchu odstraňuje, protože ucpává ústí vpichů, kterými se do těsta dostává vzdušný kyslík. Sýr se balí do hliníkové fólie a skladuje se při nízkých teplotách (KADLEC a kol., 2009). Hlavní těžiště výroby sýrů s plísní v těstě je správný růst dobrého kmene Penicillium roqueforti. Ve zracích místnostech musí být zabezpečena správná teplota a relativní vlhkost a dostatečná výměna vzduchu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Je důležité poznamenat, že během zrání modrých sýrů roste pH a tím se mění chuť. Všechna laktosa byla zfermetována smetanovým zákysem a ušlechtilá plíseň použije vzniklou kyselinu mléčnou jako zdroj energie. Při fermentaci kyseliny mléčné dochází ke vzrůstu pH z 4,6 na 6,0. Na zvýšení pH mají vliv enzymy a produkty jejich metabolitu jako například amoniak a aminové sloučeniny. Nicméně vzrůst 12

pH k neutrálnímu může také mít vliv na bezpečnost a trvanlivost sýru (HUTKINS, 2006).

Roquefort Nejvýznamnější francouzský sýr (obr. 3), který znali již staří Římané. Je prvním francouzským sýrem, který získal přívlastek AOC. Bylo to již v roce 1925. Na jeho výrobu se používá výhradně ovčí mléko, které se nepasteruje. Výroba začíná mícháním ranního mléka s mlékem z předchozího dne (RIDGWAYOVÁ, 2004). Přidání plísní Penicillium roqueforti se provádí buď současně s přidáváním syřidla, nebo při tvarování bochníků (IBURG, 2004). Vzniklé mladé sýry se musí pětkrát denně obracet, aby se odstranila přebytečná syrovátka (CALLEC, 2003). Zrání probíhá v jeskyních hory Mont Combalou nejméně tři měsíce. Dochází zde k přirozené cirkulaci vzduchu, která udržuje konstantní teplotu 9 °C a 95 % vlhkost. Po propíchání jehlami se dovnitř sýrů dostává jeskynní vzduch obsahující plísňové spory (IBURG, 2004). Laktace ovcí trvá od prosince do července a každá vyprodukuje asi 2-3 litry mléka. Pro výrobu 3 kg sýru je zapotřebí mléka od 6-8 ovcí (HARBUTT, 2009).

Obr. 3 Roquefort (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998)

Gorgonzola Italský sýr (obr. 4) z oblasti Lombardie se vyrábí výhradně z kravského mléka. Srážení probíhá syřidly z telecích žaludků při teplotě 28-32 °C. Poté se očkuje sporami modré plísně Penicillium roqueforti. Následně se několik dní prosoluje za sucha při teplotě 18-20 °C. Zrání trvá 2-3 měsíce a to při teplotě 5-8 °C (IBURG, 2004). Callec (2003) uvádí, že gorgonzola zraje při relativně vyšší teplotě, a to 20-22 °C. Sýr se několikrát propichuje, aby se tak podpořil růst plísně, která přechází na charakteristické zelené žilkování (IBURG, 2004). Podle Foxe (2004) se gorgonzola vyrábí z kravského mléka, které je pasterováno při 73 °C po dobu 40 sekund. Následně se přidá startovací kultura v množství 106 KTJ/ml mléka a spory Penicillium roqueforti. Použije se syřidlo z telecích žaludků. 13

Koagulace probíhá při 30-40 °C. Následně se sraženina krájí na 2-2,5 cm části a plní do forem. Syrovátka se nechá uvolňovat 10 hodin při 18°C. Po tuto dobu se zformovaný sýr 4krát otočí. Solení trvá 40 hodin při 22 °C. Sýry zrají při 4-6 °C po dobu 83 dnů a při 85 až 90% relativní vlhkosti. K propíchnutí dochází po 12 a 20 dnech. Gorgonzola obsahuje nejméně 48 % tuku v sušině. Obsah soli se pohybuje mezi 2-3 %. Existuje celá řada variant toho sýru. Příčinou jsou různé podmínky výroby a zrání. (TEUBNER a kol., 1998). Původně se vyráběla přidáním syřidla do večerního mléka, vzniklá sýřenina se pověsila do druhého dne. Tím do ní vnikly spory plísně nacházející se ve vzduchu. Poté se přemístila do formy a překryla se sýřeninou z ranního mléka. Takto připravená gorgonzola zrála déle než rok (CALLEC, 2003). Průmyslově vyráběná gorgonzola je známá jako „una pasta“, což je směs dvou druhů pasterovaného mléka v jedné vrstvě sýřeniny. Doba zrání je poloviční oproti tradiční výrobě (RIDGWAYOVÁ, 2004). Obr. 4 Gorgonzola (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998)

Niva Tento sýr vyrábí v České republice Mlékárna Otinoves již od roku 1963; a mlékárna MADETA a.s. v sýrárně v Českém Krumlově. Výroba sýru byla také zavedena již v roce 1948 v sýrárně Dolní Přím, kterou dnes vlastní Niva s.r.o. (www.syr-niva.cz, LIKLER, 2008). Základní surovinou pro výrobu Nivy v mlékárně Otinoves je pasterované plnotučné mléko. Toto mléko pochází z chráněných oblastí Drahanské vrchoviny Moravského krasu. Používá se ušlechtilá píseň Penicillium roqueforti, syřidlo, smetanová kultura a sůl. Kravské mléko se zpracovává ve speciálních výrobnících. Vytvarované bochníky se nasolují v solné lázni. Následně se propichují, aby se vytvořily průduchy. Dříve zrála Niva v jeskyni Michalka. V současnosti zrání probíhá 3-4 týdny v prostorách s přesně stanovenými klimatickými parametry. Hmotnost takto vyrobeného bochníku je 2 kg, obsah tuku v sušině 50 % (www.mot.cz).

14

Technologií výroby sýru Niva se zabýval Kněz (1960) ve své knize Výroba sýrů, kde popisuje, že se plnotučné kravské mléko se pasteruje při teplotě 72-75 °C. Po zchlazení na 29-31 °C se zakysá přidáním smetanového zákysu. Plísňová kultura se v optimální dávce přidává buď přímo do mléka, nebo do zrna po odpuštění části syrovátky. Dále Kněz uvádí, že se do mléka přidává mléčnan vápenatý nebo nasycený roztok chloridu vápenatého. Doporučuje se však používat pro tento sýr zásadně mléčnan. Upravuje se také tučnost mléka v závislosti na roční době a obsahu bílkovin od 3,5 do 3,8 %. Následuje sýření při teplotě 29-31 °C. Volí se taková dávka syřidla, aby došlo ke sražení mléka během 60 minut. Sýřenina se krájí nožovou harfou na hranolky, přetahuje se upraveným plechem, a opět krájí. Část syrovátky se poté odpustí. Do vany se sýrovým zrnem se přidá sůl a spory plísní. Pro dosažení dobrého prosolení sýrového zrna se používají formovací vozíky. Poté se formuje do tvořítek. Sýry se ihned obracejí a odnáší do místnosti, v níž při teplotě 18-22 °C odkapávají. Prokysané, odkapané sýry se solí ručně na sucho při teplotě 14-16 °C. Zrání probíhá ve zracím sklepě, kde jsou sýry uloženy do stojanů. Nejprve se však omyjí ve slané vodě, aby se odstranily zbytky nečistot soli. Nechají se oschnout, zváží se a jehlami se propíchají. Teplota ve sklepě se pohybuje mezi 12-14 °C a relativní vlhkost je 95 %. Sýry se otáčejí v průběhu zrání a kontroluje se povrch. Přemístí se do sklepa, kde je teplota 6-8 °C a relativní vlhkost 95-98 %. Důležitá je důkladná výměna vzduchu. Při zrání se tvoří na povrchu maz. Způsobuje ucpávání vpichů a musí se odstraňovat. Ve třetím měsíci sýry dozrávají při teplotě 3-5 °C. V tomto období dochází ke stabilizaci jakosti a Niva je dokonale prozrálá. Existuje také možnost vyrábět sýr Niva z odstředěného mléka za přídavku homogenizované smetany.

Modřenín Firma Povltavské mlékárny a.s. zařadila do svého sortimentu také sýr s plísní v těstě. Vyrábějí sýr, který však nenese název Niva, ale Modřenín (obr 5). Sušina tvoří 53 %, tuk je 30 % (www.sedlcansky.cz).

Obr. 5 Modřenín (Zdroj: www.sedlcansky.cz, 2012) 15

3.2.2 Sýry s plísní na povrchu Primární, neboli anaerobní zrání, tj. zkysnutého mléka a zkysnuté sýřeniny při výrobě probíhá za pomocí mezofilního zákysu obsahujícího kulturní bakterie Lactococcus lactis ssp. lactis a L. lactis ssp. cremoris. Mikroorganismy tohoto zákysu působí až do ukončení odkapávání formované sýřeniny. Aby bylo kysání sýřeniny zaručené, přidává se zákys do mléka zahřátého na 30 °C v množství 0,5 až 1,0 %. Při této teplotě mléko kysá asi jednu hodinu. Potom bílkovina mléka koaguluje přídavkem takového množství syřidla, aby vznikla sýřenina správné konzistence za asi 2 hodiny (GÖRNER, VALÍK, 2004). Pokrájená sýřenina na sýrové zrno se zamíchá a nedohřívá. Raději se téměř okamžitě naplní do forem. Tímto se zabrání synerezi a výsledkem je sýr s vysokým obsahem vlhkosti. Bochníky sýra jsou několikrát otočeny během 18 hodin. Během této doby dochází k dofermentování laktosy a tím poklesne pH na 4,7. Solí se ve vodné lázni. Následně se na povrch aplikují plísně, pokud se nepřidaly již do mléka (HUTKINS, 2006). Podle Vlkové (2009) se krájená sýřenina nebo i bez krájení přeloží do připravených tvořítek a formuje se do požadovaného tvaru. Syrovátka se nechá odkapat do druhého dne, za přiměřeného obrácení sýrů. Po tuto dobu stále probíhá primární anaerobní zrání sýrů. Teplota při formování nemá klesnout pod 25 až 20 °C. Odkapaná sýřenina má mít hodnotu pH 4,8 až 4,6 (kyselost 80 až 90 SH). Zkysnutí sýřeniny na toto maximum je pro výrobu velmi důležité. Je umožněn růstu kvasinek a bakteriální mikroflóry, která se uplatňuje v počátečných stádiích zrání sýrů s plísní na povrchu. Po formování, kysání se sýry solí buď ručně, na sucho nebo v solné koupeli natolik, aby hotové obsahovali asi 3,5 % NaCl (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.2.2.1 Zrání Sýry po solení a očkování kulturní plísní začnou zrát. Dochází k tomu ve zrací místnosti při teplotě 10 °C a vysoké relativní vlhkosti. Musí se na podložkách obracet, aby byl zajištěn kontakt se vzduchem ze všech stran. Rozvíjí se porost plísně, která na sýry intenzivně působí 12 až 14 dní (HUTKINS, 2006). Především na začátku zrání se rozvíjí na povrchu sýrů již zmíněné kvasinky. Rostou v počátečním stádiu i na sýrech zrajících pod mazem. Při nadměrném nárůstu mohou zpomalit, až znemožnit rozvoj 16

kulturní plísně. Jejich růst a uskutečněná hydrolýza bílkovin na povrchu sýrů způsobuje změny v kyselosti povrchu a vnitřku sýrů. Jejich hodnota pH nejdříve klesá, to znamená, že sýr ještě kysá asi do poloviny zrání. Poté hodnota pH opět stoupá, což znamená, že začala druhá aerobní fáze zrání (GÖRNER, VALÍK, 2004). Hutkins (2006) uvádí, že vnější vrstvy sýrů se významně mění a jejich kasein koagulovaný syřidlem, který byl na začátku tuhý a křehký, se stává měkčím. Je to způsobeno rozkladem kyseliny mléčné plísní za současného uvolňování amoniaku, který vzniká deaminací aminokyselin. Tyto změny jsou na řezu pozorovatelné i vizuálně. Na rozkladu kaseinu (obr.6) se podílejí jak mikrobiální proteolytické enzymy bakteriálních kultur, plísní, kvasinek, tak i další enzymy pocházející z použitého syřidla. V případě zrání těchto sýrů se proteolýza uplatňuje až po glykolýze. Oproti tvrdým sýrům se zde uplatňuje hlubší rozsah zrání, to znamená, že dochází k významnějším strukturním změnám kaseinu. Je rozložen až na aminokyseliny a amoniak (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Obr. 6 Jednoduchý přehled rozkladu kaseinu (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004)

Na odkyseleném povrchu sýrů porostlém kulturní plísní Penicillium camemberti, kde odkyselování pokračuje z obou stran, se tvoří tzv. kamembertská červeň. Jedná se o nárůst mikroorganismu Brevibacterium lines, který se obvykle objeví asi za 14 dní od začátku výroby. Hodnota pH na těchto místech bývá v neutrální nebo slabě alkalické oblasti, což tomuto mikroorganismu vyhovuje (GÖRNER, VALÍK, 2004).

17

Jeho vliv na zrání sýrů s plísní na povrchu je sporný. Někteří autoři se přiklánějí k názoru, že Brevibacterium lines přispívá k zrání, jiní jej považují za nežádoucí kontaminaci (VLKOVÁ, 2009). Po třech týdnech hlavního zrání se sýry balí a uchovávají při nízké teplotě asi při 5 °C nebo mírně vyšší, aby mohlo probíhat další pomalé zrání. Toto dozrávání se uskutečňovalo v časech malovýroby, kdy výrobci dodávali sýry specializovaným obchodníkům po ukončení hlavního zrání a obchodní jejich jemné dozrávání reguloval podle přání stálých zákazníků. Přitom sýry nabývaly plné a jemné aroma a tzv. typickou žampiónovou chuť (GÖRNER, VALÍK, 2004). Plíseň Penicillium camemberti produkuje proteinázu a peptidázu. Tyto enzymy způsobují štěpení bílkovin a rozklad aminokyselin za vzniku amoniaku a methanthiolu, které jsou typické pro tyto sýry. Lipolýzou tuku se uvolňují mastné kyseliny. Ty podléhají následně oxidační dekarboxylaci. Důležitými produkty jsou metylketony (HUTKINS, 2006). Významný vliv na aroma kamembertských sýrů mají 1-oktan-3-ol, 1,5-oktadien-3-ol a 2-metylizoborneol. Jiní autoři tvrdí, že při zrání těchto sýrů vznikají i sirné sloučeniny: dimetyl bisulfid, dimetyl trisulfid a metional. Odlišné lokální aroma camembertských sýrů mohou vznikat i působením jiných nekulturních, ale ne škodlivých bakterií a kvasinek (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Byla provedena studie na vliv vysokotlakého ošetření mléka před výrobou na zrání sýra camembert. Na výrobu sýrů se použilo syrové kravské mléko a kravské mléko ošetřené při 500 MPa po dobu 10 minut. Zjistilo se, že se zvýšila vlhkost sýrů a naopak obsah bílkovin a aktivita plasminů poklesla právě v důsledku tohoto ošetření. Po 15 dnech zrání bylo více kaseinu rozloženo v sýrech z ošetřeného mléka. Při senzorickém hodnocení nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi sýrem ze syrového mléka a ošetřeného vysokým tlakem. Celkově provedená studie ukázala, že vysokotlaké ošetření mléka před výrobou vedlo k pozměnění složení a zrání sýrů oproti vzorovému sýru, avšak s přijatelnou senzorickou kvalitou (VOIGT, et al. 2011).

18

Camembert de Normandie Francouzský sýr, který získal pečeť AOC ještě před rokem 1983. Je nejčastěji napodobovaným sýrem na světě (IBURG, 2004). Vyrábí se ze syrového kravského mléka s přidáním mezofilní kultury. Při sýření je pH přibližně 6,4 a doba sražení je 30-45 min. Sýřenina se překládá do typických forem pomocí naběraček, a to buď ručně, nebo pomocí automatizovaného systému. Odpouštění syrovátky probíhá spontánně přes perforované stěny forem prvních hodin při teplotě 26-28 °C, pak se postupně teplot snižuje až na 20 °C. Získá se tvaroh s nízkým obsahem minerálních látek a s pH mezi 4,6-4,7 (FOX, 2004). Po odtečení zbývající syrovátky se sýrové těsto solí. V prostorech se speciální vlhkostí vzduchu a teplotou dochází k sušení. Sýr dozrává ve sklepních prostorách, kde se každých 48 hodin obrací (IBURG, 2004). Po tvarování se sýry se pokropí roztokem se sporami tří druhů plísně Penicillium candidum. Po 5 dnech se provede solení na sucho velmi jemnou solí. Zrání probíhá ve sklepech při relativní vlhkosti 85 % a teplotě 14 °C (MASUI, JAMADA, 2007). Fox (2004) uvádí, že sýr zraje ve sklepích po dobu nejméně 21 dnů při teplotě 11-13°C a při 90% relativní vlhkosti. Görner, Valík (2004) uvádějí, že Camembert je měkký sýr vyrobený sladkým srážením mléka (pomocí syřidla) bez dohřívání sýřeniny, bez lisování, slabě solený (3,5 % NaCl) s vnějším porostem kulturní plísně Penicillium camemberti. Je kulatého tvaru s průměrem 9 cm a výškou 3,5 cm, hmotností 0,12 kg a obsahem tuku v sušině 45 %.

De Brie Je to poměrně rozsáhlá skupina francouzských sýrům, z nichž dva nesou pečeť AOC. Jedná se o Brie de Meaux a Brie de Melun (obr. 7.) (IBURG, 2004). Přízvisko Meaux, Melun, Coulommiers a další, udává místo původu Brie. Dle zákona je tento sýr definován jako měkký sýr s povrchovou plísní s nejméně 40 % tuku v sušině a 44 % sušiny (TEUBNER a kol., 1998). Tradiční sýr Brie je možné vyrábět z nepasterovaného mléka i z mléka pasterovaného. Sýřenina se nekrájí a ani nelisuje. K odkapávání dochází samovolně při rovnoměrném vytváření sýrových prstenců ze sýřeniny. Sýry se ukládají na slaměné rohože. Musí se pravidelně obracet a poté je na povrch aplikována plíseň Penicillium

19

camemberti. (RIDGWAYOVÁ, 2004). Sýry zrají nejméně 4 týdny při 10 °C, případně i déle než 2 měsíce (TEUBNER a kol., 1998). Sýr de Brie má se sýrem camembertským podobné až shodné vlastnosti. Na vzhledu se vyznačuje dortovou

formou

a

mývá

průměrně

25 cm

a hmotnost 1,2 až 1,5 kg. Pro možnost prozrávání od povrchu do vnitřku nebývá významně hrubší jako camembertský sýr (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Obr. 7 Brie de Melun (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998)

Hermelín Zrající sýr s ušlechtilou plísní na povrchu. Jedná se o českou napodobeninu původního francouzského sýru Camembert, jehož název je patentově chráněn. Proto se u nás od roku 1946 používá název Hermelín. Firma Pribina vyrábí sýr camembertského typu pod označením Král sýrů (obr.8). Sedlčanský Hermelín (obr. 9) vyrábí Povltavské mlékárny a.s. Sušina tohoto sýru je 46 % a tuk 23 %. Výroba začíná příjmem mléka, pak následuje jeho tepelné ošetření pasterací při teplotě 75 °C. Přidají se užitečné mezofilní bakterie a kulturní plísně Penicillium candidum. Proběhne sýření a vzniklá sýřenina se krájí harfou. Mícháním se docílí dokonalého uvolnění syrovátka. Sýrové zrno se plní do forem. Další významnou fází výroby je aplikace NaCl. Provádí se v solné lázni. Poté jsou zformované a nasolené sýry transportovány do zracích sklepů. Parametry zrání jsou obdobné jako u výroby sýrů camembertského typu (www.sedlcansky.cz, www.laktoscollection.cz).

Obr. 9 Hermelín (www.sedlcansky.cz, 2012)

Obr. 8 Hermelíny (Zdroj: www.files.nakladany-hermelin.cz, 2012) 20

3.2.3 Sýry s plísní v těstě i na povrchu Z technologického hlediska došlo ke kombinaci výroby obou předchozích skupin sýrů. Výroba je pracnější. Důležité je vytvoření podmínek pro růst obou plísní jak Penicillium roqueforti, tak i Penicillium camemberti. Jelikož u tohoto sýru nedochází k propíchání těsta jehlami, tak porost plísně uvnitř těsta bývá slabší. Obsah tuku v sušině je výrazně vyšší než u jiných plísňových sýrů, většinou jsou také měkké a s menší velikostí (PAVELKA, 1996).

Vltavín Český zástupce sýrů s kombinovanou plísní (obr.10). Sušina tvoří 53 % a tuk je 30%. Do svého sortimentu ho zařadila firma Povltavské mlékárny a.s. (www.sedlcansky.cz).

Obr.10 Vltavín (Zdroj: www.sedlcansky.cz, 2012)

Cambozola Německý smetanový sýr s bílou plísní na povrchu a modrou v těstě (obr.11) (CALLEC, 2003). Obsahuje až 70 % tuku v sušině. Chuť je lehce pikantní. Za otce se považuje francouzský Camembert a za matku italská Gorgonzola (HARBUTT, 2009).

Obr. 11 Cambozola (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998)

21

3.3 Významné mikroorganismy 3.3.1 Technologicky důležité mikroorganismy 3.3.1.1 Bakterie Bakterie jsou organismy, které nemají diferenciované jádro, proto se řadí mezi prokaryota. Tvoří po fyziologické stránce velmi rozmanitou skupinu mikroorganismů. Zahrnuje zástupce, kteří se liší vztahem ke kyslíku, k různým zdrojům energie i tím jakou vyžadují výživu pro svůj růst (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Základním tvarem jsou koky a tyčinky. Množí se dělením (VLKOVÁ, 2009).

Bakterie mléčného kysaní Přídavek čistých kultur do mléka před sýřením je nezbytným předpokladem výroby tvarohů a sýrů. Základní kulturou pro většinu sýrů je mezofilní kultura, která se nazývá také jako primární. Obsahuje bakterie mléčného kysání a používá se především pro produkci kyseliny mléčné z laktosy v počáteční fázi výroby sýrů. Sníží se tak pH mléka na požadovanou hodnotu, kdy mohou enzymy syřidla působit a vysrážet tak dokonale kasein. Uplatňují se bakterie rodu Lactococcus a Leuconostoc. Optimální teplota růstu je mezi 20 až 30 °C (KADLEC a kol., 2009). Jsou aerotolerantní či fakultativně anaerobní (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Rod Lactococcus Patří do čeledi Streptococcaceae. Jsou to grampozitivní koky, fakultativně anaerobní. Nacházejí se všude, kde probíhá spontánní kvašení biologického materiálu (VLKOVÁ, 2009). Některé kmeny mají schopnost fermentovat citran na acetoin a diacetyl, který dává charakteristické aroma mléčným výrobkům. Tato vlastnost však není stálá (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Lactococcus lactis ssp. lactis Grampozitivní ovoidní buňky s průměrem 0,5 až 1,0 µm. Většinou se nacházejí v párech a tvoří kratší nebo delší řetízky. V mlékařství rostou při 10 °C, avšak optimální teplota je 30 °C. Nerostou při 45 °C. Jsou to bakterie, které homofermentativně přeměňují laktosu, glukosu a maltosu na kyselinu mléčnou. Sacharosu nefermentuje vůbec, případně jen v nepatrném množství (GÖRNER, VALÍK, 2004). Některé kmeny

22

se vyznačují tvorbou antibiotika nisinu. Jeho schopnost inhibovat rozvoj některých grampozitivních bakterií se využívá při konzervaci potravin (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

Lactococcus lactis ssp.lactis biovar diacetylactis Některé kmeny mají schopnost fermentovat citran na acetoin a diacetyl, oxidu uhličitého, kyseliny octové, kyseliny mléčné. Diacetyl dává charakteristické aroma mléčným výrobkům. Tato vlastnost však není stálá. Tvorba těchto látek je regulována plazmidem (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Lactococcus lactis ssp. cremoris Tvoří nesporulující a nepohyblivé koky, oválné buňky. Je fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní (CHUMCHALOVÁ, 2012). Doprovází často Lactococcus lactis ssp. lactis s nímž má podobné vlastnosti. Liší se však tím, že tvoří větší buňky a delší řetízky v mléku. Roste při 10 °C, i při nižších teplotách, neroste při 40 °C. Tato bakterie také fermentuje glukosu a laktosu na kyselinu mléčnou. Tvoří měřitelné množství CO2 (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Rod Leuconostoc Patří do čeledi Streptococcaceae. Zahrnuje grampozitivní koky tvořící páry a řetízky. Jedná se o bakterie, které heterofermentativně přeměňují glukosu na kyselinu mléčnou, oxid uhličitý a kyselinu octovou případně etanol. Většina koků je schopna fermentovat citran za přítomnosti laktosy na acetoin, diacetyl a 2,3-butylenglykol (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tyto bakterie vyžadují pro svůj růst řadu látek, zejména aminokyseliny a vitamíny (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum Tvoří dextran ze sacharosy. Je méně aktivní a méně náročný na živiny a růstové faktory (GÖRNER, VALÍK, 2004). Využívá se při průmyslové výrobě dextranů, jako náhražka krevní plazmy v lékařství (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Netvoří ze sacharosy dextranový sliz. Vyznačuje se také přeměnou citranu na acetoin a diacetyl. Vyhovující teplota se pohybuje mezi 18 až 25 °C. Patří mezi 23

leukonostoky jež jsou nejméně náročné na přítomnost růstových faktorů, vitamínů skupiny B a aminokyselin (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Rod Brevibacterium Brevibacterium linens Patří do čeledi Brevibacteriaceae. Grampozitivní nesporulující bakterie, které tvoří nepravidelné tyčinky. Jsou striktně aerobní. Optimálně rostou při 20-25 °C. Uplatňuje se především při výrobě sýrů zrajících pod mazem, protože tvoří typické aroma a zbarvení (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.3.1.2 Plísně Plísně jsou vícebuněčné eukaryontní organismy s pravým jádrem, které je obaleno jaderným obalem, a tak odděleno od cytoplazmy. Vyznačují se chemoheterotrofním metabolismem. Energii a převážnou část stavebního materiálu získávají z organických látek. Produkují sekundární toxické metabolity, označované jako mykotoxiny. Většina plísní je striktně aerobní tzn., že roste pouze v aerobním prostředí. Avšak část z nich může být fakultativně anaerobní (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003). Tvoří rychle rostoucí mycelia, která se skládají z větvených vláken neboli hyf. Rozlišujeme mycelia substrátová a vzdušná (VLKOVÁ, 2009). Označují se také jako mikroskopické vláknité mikromycety a řadí se mezi houby. Dělí se podle přítomnosti a typu rozmnožování do těchto taxonomických jednotek:


do třídy Zygomycetes – jednobuněčné a pohlavní rozmnožování s tvorbou

zygospor, nepohlavní rozmnožování endosporami


do podkmenu Ascomycotina – pohlavní rozmnožování, kdy se tvoří askospory,

nepohlavní rozmnožování prostřednictvím exospor


do podkmenu Deuteromycotina – rozmnožování je nepohlavní pomocí exospor

(ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

Technologicky významné kulturní plísně: Plísně patří do sekundární mikroflóry, která je velmi variabilní a tvoří ji dále například bakterie mléčného kysání nezákysového původu, propionové bakterie, stafylokoky, kvasinky. Jsou důležité při zrání sýrů (KADLEC a kol., 2009). Aplikují se cíleně při výrobě sýrů, protože se využívá jejich proteolytické a lipolytické aktivity. 24

Zajišťují tak správný průběh zrání a vznik žádoucích chuťových a aromatických látek (KOPÁČEK 2011). Plísňové kultury jsou obvykle pěstovány na povrchu polotuhých a tuhých substrátů a dodávají se do mlékáren v komerční formě suspenzí nebo lyofilizovaných prášků obsahujících konidie. Výrobci mazových a plísňových kultur pro zrání sýrů obvykle poskytují nejen údaje o vhodném dávkování kultur, ale i informace o barvě mycelia, růstové rychlosti, citlivosti k teplotě a NaCl, deacidifikační, proteolytické a lipolytické aktivitě. Kultury Penicillium camemberti jsou očkovány do mléka pro výrobu sýrů, anebo jsou rozstřikovány na sýry, obvykle po solení. Kultury Penicillium roqueforti jsou většinou inokulovány přímo do mléka pro výrobu sýrů (KADLEC a kol., 2009). Plísně používané při zrání sýrů mají dlouho historii bezpečného užívání. Již od dob říše římské se vyrábějí sýry roquefortského typu. V případě sýrů camembertského typu se plísně používají od konce 18. století. Tyto potraviny jsou konzumovány, aniž by se negativně projevovaly na lidském zdraví. Přesto existuje možné nebezpečí konzumace plísňových sýrů, které vyplývá z tvorby mykotoxinů a jiných biologicky účinných látek a možného narušení složení přirozené mikroflóry ve střevech. Ostrý (2011) pro představu uvádí, že při konzumaci 1 g Nivy se do organismu dostane 1.106 KTJ/g. V současnosti není stále dostatečně objasněno, co se s životaschopnými sporami a úlomky mycelia děje při průchodu trávicím traktem člověka

Rod Penicillium Český název štětičkovec, získal podle tvaru rozmnožovací nepohlavní struktury. Rod Penicillium do roku 2001 obsahoval více než 225 druhů (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003). Jeho druhy tvoří kolonie s velkým množstvím žlutozelených až modrozelených konidií, ty jsou na různých potravinách patrné jako zelené, sametové až moučné povlaky. Zbarvení okraje kolonií je bílé, jelikož na nich nejsou spory (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Z plísní je nejrozsáhlejší a nejrozšířenější. Vyskytují se v teplém a mírném klimatu. Jejich spory se prakticky vyskytují všude, a proto jsou velmi častými kontaminanty. Způsobují například kažení ovoce a zeleniny, pečiva, koření a dalších potravin (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003). Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti se řadí do skupiny Asymmetrica, protože

se

vyznačují

nesymetrickým

uspořádáním

(ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 25

štětičkovitých

konidioforů

Penicillium camemberti Někteří autoři uvádějí jiný název, a to Penicillium candidum. V dalších literaturách je Penicillium candidum označováno jako hybrid Penicillium camemberti. Metabolismus Penicillium camemberti (obr. 12) způsobuje štěpení bílkoviny a hydrolýzu tuku, čili lipolýzu. Vzniknuté volné mastné kyseliny následně podléhají oxidační dekarboxylaci za vzniku metylketonů. Plíseň je charakteristická svou vysokou náročností na přístup kyslíku, proto roste pouze na povrchu. Zrání způsobují enzymy, které produkuje a ty difundují do sýru z povrchu. Tvrdá a křehká konzistence sýřeniny se postupně mění na měkkou a roztíratelnou. Společně s kvasinkami metabolizuje také laktózu za CO2 a H2O. Dále způsobují odkyselování povrchu a následně i celé hmoty. Děje se to prostřednictvím amoniaku vzniklého deaminací aminokyselin (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Obr. 12 Penicillium camemberti (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004)

Penicillium caseicolum Kulturní plíseň, která se používá společně s Penicillium camemberti jako kamembertská kultura. Pokud sýr zraje vzájemným působením těchto plísní, tak chuť a vůně je jemnější v porovnání se sýry, u kterých byla použita pouze jedna z nich (GÖRNER, VALÍK, 2004).

26

Penicillium roqueforti Jedná se o plíseň (obr. 13) vyskytující se ve více varietách, která dobře prorůstá těstem, protože je málo náročná na vzdušný kyslík a odolná k vyšším koncentracím soli. Přístup kyslíku nesmí klesnout pod 5 %. Mezi hlavní vlastnosti patří proteolytické a lipolytické štěpení (GÖRNER, VALÍK, 2004). Aby mohlo docházet k unikání CO2 vznikajícího při fermentaci laktosy a přístupu dostatečného množství kyslíku pro rozvoj plísní, musí mít tyto sýry značně otevřenou strukturu. Z těchto důvodu je těsto propichováno jehlami, a vzniklé vpichové dráhy dál zlepšují výměnu plynů. Je-li struktura málo pórovitá, tak plíseň roste v sýrech jen podél dráhy vpichu (VLKOVÁ, 2009). Penicillium roqueforti může produkovat několik mykotoxinů. Mezi ně patří především slabě toxická mykofenolová kyselina, PR-toxin, roquefortin (JIČÍNSKÁ, 1995).

Obr. 13 Penicillium roqueforti (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004) Geotrichum candidum Rod Geotrichum, čeleď Endomycetaceae. Patří do asporogenních kvasinek (Cryptococcacales, Fungi imperfecti) Jedná se o vláknitou houbu, která se rozmnožuje rozpadem hyf na oidie. Je enzymově velmi aktivní a dokáže rozkládat bílkoviny, tuky i sacharidy. Dobře roste na půdách do pH 7. Vyskytuje se na starším tvarohu, bílém jogurtu a zkyslém mléku, kde tvoří povlak. Protože je málo náročná na kyslík, může růst i uvnitř másla. V potravinářském průmyslu může dojít ke kontaminaci při styku suroviny s povrchem nedostatečně očištěných strojů (GÖRNER, VALÍK, 2004).

27

Fox (2004) uvádí že, při výrobě sýrů s plísní na povrchu se Geotrichum candidum objeví ve stejnou dobu jako kvasinky. Je velmi citlivé na sůl, a proto je jeho růst omezen solením. V minulosti Geotrichum candidum způsobovalo obavy technologů, protože jeho proteolytická aktivita se negativně projevovala na povrchu sýru. Ale jeho enzymatické vlastnosti hrají významnou roli při formování chuti a vůně. V současnosti se provádí výběr kmenů, které nezpůsobí vadu sýru a zároveň lepší kontrolou nad jejich použitím se docílilo širokého použití tohoto druhu. Vybrané kmeny jsou přidávány do pasterovaného mléka za účelem zlepšení chuťových vlastností Camembertu. U sýrů s plísní v těstě vykazuje G. candidum růstový potenciál, podobně jako P. roqueforti v nepřítomnosti solí, což naznačuje možné překrývání dvou druhů v těstě sýra během počáteční fáze zrání. Kontaminace G. candidum může způsobit inhibici růstu a sporulace P. roqueforti. To zdůrazňuje význam správné výrobní praxe, aby se zabránilo kontaminaci. (FOX, 2004) 3.3.1.3 Kvasinky Jsou to heterotrofní eukaryotní mikroorganismy. Řadí se mezi mikroskopické houby. Rostou převážně v koloniích. Množí se vegetativně pučením nebo dělením a sexuálně tvořením askospór (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Mléčné kvasinky fermentují laktózu. Jsou nepostradatelnou součástí mazové kultury požívané při výrobě sýrů zrajících pod mazem. Pro výrobu sýrů roqouefortského typu se využívají Kluyveromyces lactis, patřící do čeledi Saccharomycetaceae, Torulopsis candida a Debaryomyces hansenii. Mají vliv na tvorbu aromatických 5 až 9 uhlíkatých metylketonů. Mírně produkují etanol, který s volnými mastnými kyselinami tvoří aromatické estery. Asimilací laktosy, tvorbou alkalických produktů, které odkyselují povrch sýry, tvorbou růstovým látek podporuje rozmnožování plísní. Pokud se kvasinky rozvíjejí víc než je žádoucí, způsobují mikrobiální kažení sýrů. V tomto případě se považují za kontaminanty (GÖRNER, VALÍK, 2004). Debaryomyces hansenii a Kluyveromyces lactis se obvykle přidávají proto, že jejich způsob spotřeby substrátu je zcela odlišný. Kluyveromyces spotřebovává prvně laktosu a až pak teprve laktát, naopak D. hansenii je schopna přeměňovat laktosu i laktát ve stejnou dobu (FOX, 2004). 28

Debaryomyces hansenii Rod Debaryomyces, čeleď Saccharomycetaceae. Kvasinka má buňky kulaté až krátce oválné. Tato kvasinka je součástí mazových kultur, které rostou na povrchu sýru. Může na tekutých produktech tvořit bílý povlak. Vyskytuje se v mléčných produktech, na mase, na pokožce lidí. Mám schopnost štěpit tuk, snižovat redoxní potenciál. Bývá součástí kultur tepelně neošetřených masných výrobků (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.3.2 Mikroorganismy způsobující kažení sýrů 3.3.2.1 Patogenní bakterie Listeria monocytogenes Je zástupcem rodu Listeria patřící do čeledi Listeriaceae. Grampozitivní nesporulující tyčinka 0,4-0,5 µm x 0,5-2,0 µm velká. Je fakultativně anaerobní až aerobní. Optimální teplota růstu je 30-37 °C. Roste při pH 5,0 až 9,0. Je osmotolerantní, tzn. že rostě při vodní aktivitě 0,90-0,92 a dokáže se rozmnožovat v závislosti na optimální teplotě růstu v prostředí s 10% koncentrací NaCl. Fermentuje laktosu na kyselinu mléčnou (JIČÍNSKÁ, 1995). Vyskytuje se v přírodě v půdě, ve vodě, v potravinách které byly fekálně znečištěny. Je nebezpečná u slabých jedinců, jako jsou děti a těhotné ženy, starší lidé. Je původcem onemocnění listerióza (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

Staphylococcus aureus Rod Staphylococcus, čeleď Staphylococcaceae. Grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní koky v průměru 0,5-1,0 µm, tvoří shluky. Roste v rozmezí 10 až 45 °C. Při těchto teplotách tvoří stabilní enterotoxin (JIČÍNSKÁ, 1995). Způsobuje angínu, hnisavé onemocnění kůže, ran. V nosohltanu se nachází. Do potravin se dostává z hnisavých ložisek osob, které připravovali příslušné potraviny. Mezi ně například patří uzeniny, cukrářské výrobky. Onemocnění toxinem se nazývá stafylokoková enterotoxikóza a projevuje se žaludeční nevolností, horečkou, zvracením, křečemi (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

29

Escherichia coli Rod Escherichia, čeleď Enterobacteriaceae. Gramnegativní nesporolující bakterie tvořící tyčinky o rozměrech 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm. Roste v rozsahu 10-45 °C, avšak optimální teplota růstu je 30-37 °C. Je součástí přirozené mikroflóry ve střevech lidí a zvířat. Považuje se za indikátor fekálního znečištění vyplívající ze špatné úrovně hygieny a sanitačního režimu (JIČÍNSKÁ, 1995). Zkvašuje cukry (glukosu, laktosu, atd.) za tvorby kyseliny mléčné, pyrohroznové, octové, mravenčí a plynu. Je fakultativně anaerobní. Vyvolává gastrointestinální onemocnění projevující se průjmy i krvavými, nevolností, křečemi, horečkami (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Vyskytuje

se

v syrovém

mléce,

v kontaminovaných

mléčných

výrobcích.

Nejvhodnější podmínky poskytují sýry, především měkké a povrchově zrající. Na pomnožení a přežití má vliv typ sýra, konečné pH, typ a aktivita zákysové kultury, teplota a trvání skladování atd (JIČÍNSKÁ, 1995).

3.3.2.2 Kontaminující plísně Penicillium commune Je to plíseň, která tvoří několik mykotoxinů. Mezi nejznámější patří cyklopiazonová kyselina, cyklopaidová kyselina, palitantin, rugulovasiny. Vyskytuje se hlavně v mouce, arašídech, jablkách, kukuřici, sójových bobech (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003).

Mucor Rod Mucor, čeleď Mucoraceae Tvoří vatovité vzdušné mycelium. V počátku je bílé, ale postupně tmavne a rychle se rozrůstá. Hyfy jsou málo větvené, neseptované. Sporangiofory jsou větvené a silně vzpřímené. Na svých koncích nesou sporangia, která jsou nejdříve světlá, pak tmavě hnědá až zčernají. Uzrálé sporangium puká, část jeho stěny zůstává na nosiči (GÖRNER, VALÍK, 2004). Některé druhy produkují proteolytické enzymy, proto se rozvíjí na mase a mléčných výrobcích (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

Rhizopus Některé druhy mohou tvořit mykotoxiny, jiné jsou patogenní. Je poměrně podobný Mucoru, avšak liší se tvorbou stolonů a rhizoidů. Působí převážně kažení ovoce, ale i dalších potravin (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 30

3.3.3 Vady plísňových sýrů způsobené mikroorganismy Mezi příčiny vad sýrů je možné zařadit: -

mléko s nevhodnou nebo méně vhodnou jakostí určené k sýření

-

nedodržování postupů, případně nesprávné technologické postupy

-

nesprávně zajištěná teplota a vlhkost při zrání sýrů

-

rozvoj nežádoucích mikroorganismů

-

jiné příčiny

Rozdělení vad sýrů 1. Vady vnějšího vzhledu – poškození povrchu sýra, rozvoj nežádoucí povrchové mikroflóry 2. Vady vnitřního vzhledu – různé praskliny a trhání těsta, nesprávná tvorba ok v sýru, časné a pozdní duření, změny v barvě těsta, neodpovídající změny v konzistenci 3. Vady chuti a vůně – patří mezi nejvýznamnější vady, chuť je nevýrazná, necharakteristická, projevuje se cizí pachuť, pálivost, zatuchlost, hořkost 4. Vady ve složení – v případě, že nejsou dodrženy garantované složky, tedy sušina, tuk, sůl (KOPÁČEK, 2011).

3.3.3.1 Mikrobiální kontaminaty sýrů s plísní v těstě V sýrech může docházet k rozvoji některých kvasinek mazové kultury, které jsou přirozenou součástí výroby těchto sýrů, avšak jejich přílišný růst je nežádoucí. Zejména se jedná o Debaryomyces hansenii, Candida sp. a Kluyveromyces lactis. Kvasinky mají lipolytickou aktivitu, proto způsobují i žluklou chuť, volné mastné kyseliny mohou esterifikovat s alkoholy a vytvářejí tak ovocnou chuť a vůni. Výskyt kvasinek se může na povrchu sýrů projevit osliznutím. Častým zdrojem kontaminace bývají například solné lázně, po kterých je nutné sýry dostatečně osušit, protože kvasinky se množí především na povrchu sýru s nepřiměřeně vysokou vlhkostí. Při zrání sýrů se jejich hodnota pH zvyšuje, což spolu se značným vysokým obsahem solí může vést k nežádoucímu rozvoji patogenních bakterií Listeria monocytogenes a Staphylococcus aureus (VLKOVÁ, 2009). Na rozvoj Listeria monocytogenes v sýrech má vliv jejich schopnost růstu při nízké vodní aktivitě v potravině a psychrotrofní vlastnosti. Mohou přežívat po celou dobu záruky a během

31

skladování. Pomnožení mikroorganismu je závislé na kmenu, na technologickém postupu, teplotě zrání a skladování a další (JIČÍNSKÁ, 1995). Nadouvání (duření) sýrů může být způsobeno fermentací zbytkové laktózy v sýru plynotvornými koliformními bakteriemi. Tuto chybu podporuje i nedostatečné solení. Nečistá zatuchlá chuť bývá způsobena cizími kontaminujícími plísněmi, případně nevhodným kmenem. Tzv. romadurové zrání může být způsobeno nedostatečným prosolením sýřeniny a jejím formováním při vyšší teplotě. Červené skvrny na povrchu sýrů mohou vznikat růstem cizí barevné plísně. Bílý až šedý maz na povrchu může vznikat následkem růstu mazovitých bakterií při příliš nízké teplotě nebo v případě přesolení sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Neuspokojivý vývoj prorůstání plísně těstem je způsobeno většinou nedostatkem kyslíku. Přísun kyslíku se zajišťuje propícháváním těsta. Vliv může mít také použití nevhodného kmene plísně. Jako vadu označuje ale i přílišný rozvoj plísně způsobující obvykle nečistou chuť sýru. Příčinou jsou nevhodné podmínky pro růst plísně (KOPÁČEK, 2011).

3.3.3.2 Mikrobiální kontaminanty sýrů s plísní na povrchu Při nedostatečné hygieně může při výrobě sýrů s plísní na povrchu docházet k rozvoji nežádoucích i patogenních mikroorganismů. Jedná se o plíseň Geotrichum candidum, stafylokoky, E. coli a Listeria monocytogenes (VLKOVÁ, 2009). Sýry překysané nebo přesolené mohou být tvrdé, křídovité s bělošedým mazem na jejich povrchu. Maz brání normálnímu růstu kulturní plísně. Je možné i nadouvání sýrů v důsledku rozmnožení plynotvorných koliformních bakterií např. z rodu Escherichia (GÖRNER, VALÍK, 2004). Napadení sýrů nekulturními druhy plísní Mucor a Rhizopus může způsobit černání povrchu. Není to časté. Pokud se však vyskytne, tak je to způsobeno sekundární kontaminací nežádoucími mikroorganismy ze vzduchu ve zracích prostorech. Roztékání těsta nastává u nedostatečné odkapaných sýrů. Často tuto vadu doprovází příliš rychle a nepravidelně přezrávaní. K roztékání také může dojít po kontaminaci peptonizujícími druhy bakterií. Ty jsou pro zrání nežádoucí (KOPÁČEK, 2011). Penicillium commune je nejrozšířenější plísní kontaminující sýry a produkující celou řadu mykotoxinů. Pouze kyselinu cyklopiazonovou produkuje in vitro Penicillium camemberti (LAW, 1999). 32

3.3.1 Mykotoxiny v plísňových sýrech Mykotoxiny – Jsou to sekundární toxické metabolity vláknitých mikromycetů. Patří mezi významné toxiny přírodního původu. Název mykotoxiny byl poprvé použit v roce 1955. Jedná se o strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti. Nejsou tvořeny bílkovinami (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003). Mykotoxiny jsou občas detekovány v sýrech. S ohledem na velmi nízkou hladinu a relativně nízkou toxicitu nepředstavuje konzumace riziko pro lidské zdraví. Je však důležité znát důkladnou klasifikaci plísňových izolátů používaných při výrobě potravin. Provádět

hlavně

morfologickou

analýzu

společně

s molekulárními

metodami

k potvrzení identity izolátů a mikotoxinů, jež produkují (LAW, 1999). Jičínská (1995) uvádí, že se pro výrobu sýrů musí vybírat pouze kmeny, které mykotoxiny neprodukují.

Kyselina cyklopiazonová (obr.14) Byla nalezena a izolována v roce 1968. O deset let později byla její produkce stanovena u Penicillium camemberti. Kyselina je tvořena idolovou tetramickou sloučeninou a je středně toxická. Toxické účinky CPK se projevují hepatotoxicitou, nefrotoxicitou u potkanů. Dále bývá označovat za gastroenterotoxin (u kuřat a prasat). Způsobuje degenerativní změny myokardu a kosterního svalu. Je potenciálním inhibitorem syntézy bílkovin. Přítomnost tohoto mykotoxinu byl zaznamenán v kukuřici, sýrech camembertského typu, měkkých plísňových sýrech typu Roquefort, rýži, v drůbežím mase, atd. (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003).

Obr. 14. Kyselina cyklopiazonová (Zdroj: www.med.muni.cz, 2003)

33

PR-toxin (Penicillium roqueforti-toxin) Sesquiterpen PR-toxin je nejtoxičtější ze sekundárních metabolitů. Brání syntézy nukleové kyseliny a bílkoviny. Je cytotoxická v lidských buňkách, u prasat v játrech potkanů, kromě toho je ještě mutagenní. Mnoho kmenů P. roqueforti používaných v obchodě jako startovací kultury nebo izolovaných z modrých sýrů mají schopnost produkovat PR-toxin v umělých médiích. PR-toxin je však nestabilní v sýru a je převeden na méně toxický PR-imin a PR-amid, který je nestabilní v přítomnosti základní a neutrální aminokyseliny (FOX, 2004).

Roquefortin C, isofumigaclavin A a jeho stereoisomer fumigaclavin A Jsou typickým metabolitem P. roqueforti, nachází se právě velmi často v sýrech s plísní uvnitř těsta. Údaje o biologické aktivity těchto alkaloidů jsou vzácné, jediné zaznamenané hodnoty toxicity LD-50, jsou hodnoty 169-189 mg roquefortinu A/kg tělesné

hmotnosti

a

340 mg

isofumigaclavinu

A/kg

tělesné

hmotnosti

po intraperitoneální aplikaci na myších (FOX, 2004).

Finoli et.al. (2001) prováděl se výzkum, jehož cílem bylo stanovit Roquefortin C a PR-toxin v domácích a dovážených sýrech s modrou plísní v těsta, identifikovat používané kmeny Penicillium a analyzovat jejích kapacity pro výrobu toxinů v kultivačních půdách. Roquefortin C byl detekován vždy v sýrech v rozmezích od 0,05 do 1,47mg/kg, zatímco PR-toxin nebyl nikdy nalezen. K identifikovaným kmenům patřil Penicillium glarum, cyclopium, crustosum. Kmeny izolované ze zahraničních sýrů patřily Penicillium roqueforti. Všechny tyto kmeny byly schopny produkovat Roquefortin C v kultivačním médiu. PR-toxin byl však vyroben pouze z jednoho kmene (FINOLI a kol., 2001).

Mykofenolová kyselina Kyselina mykofenolová není vždy produkována kmeny P. roqueforti. Hodnota LD-50 stanovená pro mykofenolovou kyseliny je vysoká, 2500 a 700 mg/kg pro myši a potkany. Avšak subakutní toxické účinky byly pozorovány u opic a potkanů (FOX, 2004).

34

3.4 Prevence Pro dodržení mikrobiologické kvality sýrů je nutné přijmout opatření pro omezení jejich

rozvoje.

Preventivní

opatření,

která

jsou

významná

v boji

proti

mikroorganismům, zahrnují hygienické zásady při získávání mléka, osobní hygienu pracovníků, dodržování správných technologických postupů atd (VLKOVÁ, 2009).

3.4.1 Hygiena pracovníků v provozu Pracovníci musí dodržovat osobní hygienu. V provozu nesmí dojít k rekontaminaci pasterovaného mléka. Je nutné dbát na čistotu rukou a oděvu, proto jsou vhodně umístěna umývadla s teplou vodou, desinfekčním mýdlem a osušovačem rukou případně s často vyměňovanými ručníky. V provozu jsou zřízeny oddělené prostory, kde se vyměňuje oděv a obuv. Pokrývky hlavy zabraňují padání vlasů (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

3.4.2 Vybavení a sanitace provozu Řešením prostorů, jejich vybavením a dalším důležitými body pro mlékárenskou výrobu se zabývá nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 852/2004 ze dne 29. dubna 2004 o hygieně potravin. Příloha II – Obecné požadavky na potravinářské prostory (mimo pojízdných prodejen a přechodných prostor) obsahuje kapitoly, ve kterých jsou jednotlivě popsány jak obecné tak i zvláštní požadavky, které musí provoz splňovat. Příklad některých požadavků: -

Místnosti musí být udržovány v čistotě a v dobrém stavu.

-

Podlahy opatřené kvalitní dlažbou.

-

Stěny obložené kvalitními obklady do požadované výšky, dobře omyvatelné, desinfikovatelné.

-

Povrchy včetně povrchů zařízení musí být zhotoveny z materiálů, které jsou dobře čistitelné a desinfikovatelné, neovlivňují negativně kvalitu výrobků.

Dalším významným nařízením je nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ze dne 29. dubna 2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu.

35

Pro odstranění zvířeného prachu a také páry, se používá ventilace. Vhodnějším způsobem je klimatizace. Kdy se řízeným procesem přivádí do provozu zfiltrovaný mikrobiologicky čistý vzduch. Je upraven na požadovanou teplotu a vlhkost, což je významné například pro prostory, ve kterých zrají sýry. Zároveň je odsáván znečištěný vzduch. Celý prostor musí být řešen a vybaven tak, aby se zabránilo vnikání hlodavců, ptactva, hmyzu (PAVELKA, 1996). Odstraňují se nečistoty, prach a zbytky ze strojů, stěn a podlah provozoven. Důležité je důkladné odstranění nečistot z méně přístupných míst, jako jsou například ohyby potrubí. Právě v těchto místech se mohou tvořit ložiska vhodná pro rozmnožování mikroorganismů.

K odstranění se používá kombinace mechanických i chemických

prostředků (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Mezi nejrozšířenější čistící a desinfekční prostředky patří fosfáty, různé povrchově aktivní látky, komplexotvorné přísady, chlor, chlornan sodný a další silná činidla. Je důležité, aby tyto prostředky splňovali stanovené požadavky (GAJDŮŠEK, 2000). Peroxid vodíku se používá v sýrařství v 5 až 10 % koncentraci jako desinfekční prostředek, protože je účinný proti klostridiím. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002)

3.4.3 Použití jakostních a zdravotně nezávadných surovin pro výrobu Základní surovinou je pasterované kravské mléko, případně kozí a ovčí. Jen v některých případech je povoleno používat mléko syrové, pak je důsledně veterinárně kontrolováno (KADLEC a kol., 2009). Mléko musí splňovat mnoho jakostních požadavků. Jedná se především o chemické složení, kdy významným parametrem je obsah kaseinu, poměr tuku a kaseinu. Přítomnost vápenatých iontů je důležitá pro sýřitelnost mléka. V případě pasterovaného mléka se dodává CaCl2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Kadlec a kol. (2009) uvádí, že je třeba dodržovat přísné hygienické zásady při získávání mléka od dojnic. Následuje úprava mléka v mlékárně. Filtrací nebo centrifugací dochází k odstranění mechanických nečistot. Baktofugace slouží k redukci spor Clostridium tyrobutyricum. Pokud se použije tento způsob, dochází tím ke snížení dávky NaNO3 nebo KNO3 přidávaného do mléka právě pro odstranění těchto bakteriálních spor (KOPÁČEK, 2011). Aby bylo mléko zdravotně nezávadné pro výrobu, je nutné zabezpečit účinnou pasteraci, která je určená pro výrobu sýrů a zároveň zabránit rekontaminaci paterovaného mléka (VLKOVÁ, 2009). 36

Mléko určené pro výrobu sýrů se ošetřuje pasteraci. Je to záhřev na teploty pod 100 °C. Dochází k usmrcení vegetativních forem mikroorganismů a k minimálním změnám v chemickém složení mléka. Používá se šetrná pasterace při 72-74 °C po dobu 15 až 20 sekund. Je vhodná, protože při vyšších pasteračních záhřevech se zhoršuje sýřitelnost mléka a oddělování syrovátky (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.4.4 Dodržování technologických postupů Pro zajištění mikrobiologické kvality a požadované jakosti plísňových sýrů je třeba důsledně dodržovat technologické postupy. Porušení některého z kroků výroby může mít vliv na neodpovídající konzistenci sýru, rozvoji nežádoucích mikroorganismů a dalších vad (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Vlková (2006) uvádí, že při výrobě sýrů je potřeba zabezpečit podmínky zaručující optimální

množení

požadovaných

kultur

a

bránící

rozmnožení

nežádoucích

mikroorganismů. Mezi tyto důležité podmínky je možné zařadit dodržování teploty při sýření, správné dávkování syřidla. Používat vždy nekontaminované kultury pro primární i sekundární zrání. Velmi obezřetně manipulovat se sýry při jejich solení. Dodržovat teploty vodní lázně a doby, po kterou bude solení probíhat. Neboť právě této krok může mít vliv na rozvoj mazových kultur. Ve zracích prostorech zabezpečit správnou teplotu, relativní vlhkost a v neposlední řadě i výměnu vzduchu. Zbránit výskytu nežádoucích mikroorganismů v těchto prostorech, tak aby nedošlo ke kontaminaci (GÖRNER, VALÍK, 2004).

37

3.4.5 HACCP Zkratka HACCP znamená - Hazard Analysis and Critical Control Points

Účel HACCP Identifikace potencionálních problémů s patogeny, které se mohou během výroby vyskytovat. Zajištění opatření sloužících k zabránění jejich výskytu, a nebo jejich pravděpodobnost minimalizovat.

Systém HACCP tvoří: 1. Identifikace rizik Za riziko se považuje nepřípustná kontaminace, růst nebo přežití mikroorganismů, které mohou způsobit znehodnocení, případně zdravotní závadnost potraviny. Může se jednat i o nepřípustnou tvorku a přetrvávání jejich toxických metabolických produktu v potravině. 2. Určení kritických bodů kontroly Kritické kontrolní body (CCP) jsou místo, výrobní postupy případně technologický proces. Může být ovlivněn takovým způsobem, aby se vyloučil, a nebo alespoň minimalizoval výskyt rizik. 3. Metody monitorování 4. Zavedení způsobu ověřování účinnosti systému HACCP, které zahrnuje také směrnice korigujících akcí v případě, že se některá operace CCP vymkla kontrole.

Pro každou výrobu a jednotlivý provoz je třeba sestavit plán HAACP. Významná je také aplikace systému HACCP. V mlékárenském průmyslu se úspěšně vyzkoušel systém založený na HACCP při monitorování zdrojů kontaminace E. coli a koliformních bakterií ve výrobě sýrů. Za kritické kontrolní body se v plánu vybraly technologické operace a zařízení, která vytvářejí

zvýšené riziko listeriové a salmonelové kontaminace nebo zaplísnění

(ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Systém HACCP je uveden v Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 852/2004 ze dne 29. dubna 2004 o hygieně potravin. Obsahuje návody pro pracovníky potravinářských provozu jak zavádět tento systém.

38

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Charakteristika materiálu Vzorek č. 1 - Jihočeská Niva, 50% tuk v sušině, 52% sušina Složení: mléko, jedlá sůl (max 5,5%), mlékárenské kultury, ušlechtilá plíseň Penicillium roqueforti. Balení: 110g. Datum minimální trvanlivosti: 14. 04.2012 Na obalu je uvedeno Chráněné zeměpisné označení.

Průměrné nutriční hodnoty na 100g výrobku: Energie:

1410 kJ/337 kcal

Bílkovin:

19,5 g

Sacharidy:

1,2 g

Tuk: 28,8 g Výrobce: Madeta a.s. České Budějovice Země původu: Česká republika

Obr. 15 Jihočeská Niva (Zdroj: www.madeta.cz, 2012) Vzorek č. 2 – Niva, 50% tuk v sušině, 53% sušina Složení: mléko, jedlá sůl (nejvíce 6%), mléčná kultura, ušlechtilá plíseň Penicillium roqueforti. Balení: 100g. Datum minimální trvanlivosti: 05. 04. 2012. Výrobek nese označení Klasa a získal ocenění v soutěži Regionální potravina Olomouckého kraje 2010.

Průměrné nutriční hodnoty ve 100g výrobku: Energie

1460 kJ

Bílkoviny

20,9 g

Sacharidy

2,0 g

Tuky

29,0 g 39

Výrobce: Mlékárna Otinoves s.r.o. Země původu: Česká republika

Obr. 16 Niva (Zdroj: www.files.fantasyfood.cz, 2012) Vzorek č. 3 – Niva, 50% tuk v sušině, 52% sušina Složení: mléko, jedlá sůl (nejvýše do 5%), mléčná kultura, plísňová kultura Balení: Válec 2,344 kg. Datum minimální trvanlivosti: 27. 03. 2012 Výrobce: Niva s.r.o. Dolní Přím Země původu: Česká republika

Obr. 17 Niva (Zdroj: www.shoppardubice.jipnapoje.cz, 2012)

4.2 Příprava laboratorních pomůcek Před provedením rozboru se laboratorní sklo sterilizovalo v horkovzdušném sterilizátoru při 165 °C po dobu 60 minut. Zkumavky s destilovanou vodou a Erlenmayerovy baňky s živnými půdami se sterilizovaly v parním sterilizátoru při 121 °C 20 minut.

4.3 Zpracování vzorků U všech tří vzorků Nivy o hmotnosti 10 g, které se sterilně odebraly, se provedlo desetinné ředění. Inokulum (1 ml) se očkovalo do sterilních a označených Petriho misek. Poté se zalilo živnou půdou zchlazenou přibližně na 45 °C. Inokulum se s půdou 40

pečlivě promíchalo a vzniklá směs se nechala na vodorovné ploše zatuhnout. Po úplném zatuhnutí se nechaly Petriho misky inkubovat v termostatech při odpovídajícím čase a teplotě pro určitou skupinu mikroorganismů. Při odběru stěrů z povrchu sýrů se použila vysterilizovaná vatová tyčinka. Zpracování vzorků stěrů proběhlo stejně.

4.4 Ředění vzorků Tab. 1 Desetinné ředění vzorků

Celkový počet mikroorganismů

Bakterie mléčného kysání

Plísně

Kvasinky

Koliformní bakterie

Těsto

10-6, 10-7

10-4, 10-5

10-4, 10-5

10-3, 10-4

10-1, 10-2

Stěr

10-5, 10-6

10-3, 10-4

10-3, 10-4

10-3, 10-4

10-1, 10-2

Těsto

10-6, 10-7

10-4, 10-5

10-4, 10-5

10-4, 10-5

10-1, 10-2

Stěr

10-5, 10-6

10-3, 10-4

10-3, 10-4

10-3, 10-4

10-1, 10-2

Těsto

10-6, 10-7

10-4, 10-5

10-4, 10-5

10-4, 10-5

10-1, 10-2

Stěr

10-5, 10-6

10-3, 10-4

*10-4, 10-5

*10-4, 10-5

10-1, 10-2

Vzorek

1

2

3

*Pozn. Jiné ředění Vzorek 1 – Jihočeská Niva, vzorek 2 – Niva z mlékárny Otinoves, vzorek 3 – Niva Dolní Přím

4.5 Stanovení mikroorganismů Provádělo se stanovení těchto skupin mikroorganismů:

1) Celkový počet mikroorganismů (CPM) na živné půdě Plate count agar (PCA) Složení živné půdy dle ČSN EN ISO 4833 Trypton

5,0 g

Kvasničný extrakt

2,5 g

Glukóza

1,0 g

Agar

12,0 g

41

Navážka 20,5 g půdy se rozpustí v 1 000 ml destilované vody. Následně se upraví se pH 7 ±0,2 při 25 °C. Živná půda se musí sterilovat v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut. Kultivace živné půdy probíhá v termostatu při 30 °C 72 hodin. Výrobce: Biokar Diagnostics, France

2) Plísně a kvasinky na živné půdě s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem Složení živné půdy dle ČSN ISO 21527-1 a ČSN ISO 21527-2 Kvasniční extrakt 5,0 g Glukóza

20,0 g

Chloramfenikol

0,1 g

Agar

15,0 g

Navážka 40,1 g půdy se rozpustí v 1 000 ml destilované vody. Upraví se pH 6,6 ± 0,2 při 25 °C. Půda se sterilizuje v autoklávu při 121 °C 15 minut. Kultivace živné půdy probíhá při 25 °C po dobu 120 hodin. Výrobce: Biokar Diagnostics, France

3) Koliformní bakterie na agaru s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučí a glukózou (VRBL) Složení živné půdy: Pepton

7,0 g

Kvasničný extrakt

3,0 g

Laktóza

10,0 g

Chlorid sodný

5,0 g

Žlučové soli

1,5 g

Neutrální červeň

0,03 g

Krystalická violeť

0,002 g

Agar

12,0 g

Voda

1000 ml

Navážka půdy se rozpustí v 1 000 ml destilované vody. Provede se úprava pH 7,4 ± 0,2 agaru při 25 °C. Tato půda se nesterilizuje v autoklávu. Pouze se 2 minuty

42

povaří. Kultivace živné půdy probíhá při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Výrobce: Biokar Diagnostics, France

4) Bakterie mléčného kvašení na živné půdě MRS Složení živné půdy: Pepton

10,0 g

Masový extrakt

10,0 g

Kvasničný extrakt

5,0 g

Glukóza

20,0 g

Tween 80

1,0 g

Hydrogenfosforečnan draselný

2,0 g

Octan sodný

5,0 g

Citran amonný

2,0 g

Síran hořečnatý

0,2 g

Síran manganatý

0,05 g

Agar

15,0 g

Navážka 70,3 g půdy se rozpustí v 1 000 ml destilované vody. Upraví se pH 5,7 ±0,1 při 25 °C. Provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut. Kultivace živné půdy probíhá při 37°C po dobu 72 hodin. Výrobce: Biokar Diagnostics, France

4.6 Postup při vaření agarových půd Agar v připravených živných půdách se musí nechat při běžné laboratorní teplotě nabobtnat. Poté jsou živné půdy při teplotě 100 °C rozvařeny ve vodní lázni. Tekutá půda se rozlije do Erlenmayerových baněk o objemu 400 ml. Následně se sterilizují baňky v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 až 20 minut. Ztuhlé živné půdy se uchovávají v lednici pro další použití. Pro mikrobiologickou analýzu je třeba baňky rozvařit 5 minut v autoklávu a ochladit na teplotu 35 až 40 °C.

43

5 VÝSLEDKY A DISKUZE Vyhodnocení výsledků proběhlo po ukončení příslušné kultivace pro danou skupinu mikroorganismů. Na jednotlivých Petriho miskách se spočítaly kolonie a zjištěné hodnoty se vyjádřily jako aritmetický průměr. U všech odebraných vzorků a příslušného ředění byly prováděny dvě opakování. Konečný výsledek počtu mikroorganismů v sýrech s plísní v těstě je vyjádřen v KTJ v 1 g materiálu. Výsledky vyhodnocení všech vzorků jsou uvedeny v tabulce 2.

Tab. 2 Vyhodnocení výsledků odebraných vzorků z těst a stěrů z povrchu sýrů

Celkový počet mikroorganismů

Bakterie mléčného kysání

Plísně

Kvasinky

Koliformní bakterie

Těsto

29 · 107

22 · 106

40 · 105

10 · 104

ND

Stěr

31 · 104

ND

45 · 101

45 · 102

ND

Těsto

33 · 107

12 · 106

42 · 105

45 · 102

ND

Stěr

37 · 105

21 · 104

13 · 104

22 · 104

ND

Těsto

54 · 105

16 · 105

43 · 105

45 · 103

ND

Stěr

68 · 104

45 · 101

*14 · 104

*69 · 104

ND

Vzorek

1

2

3

*Pozn.: U těchto vzorků se použilo odlišné ředění. ND – není detekováno Vzorek 1 – Jihočeská Niva, vzorek 2 – Niva z mlékárny Otinoves, vzorek 3 – Niva Dolní Přím V tabulce jsou uvedeny průměrné výsledky mikrobiologického rozboru jednotlivých skupin mikroorganismů. Vyjádření stanovených výsledků se provedlo pomocí aritmetického průměru ze dvou ploten od každého vzorku.

Stanovení hodnot celkového počtu mikroorganismů v plísňových sýrech nám sloužilo jako orientační zjištění a mělo ukázat stupeň mikrobiálního osídlení jednotlivých vzorků. Podle zjištění vzorek č. 3 odebraný z těsta obsahoval 54 · 105 KTJ/g mikroorganismů. Jedná se o nejnižší hodnotu oproti ostatním vzorkům. Nejvíce mikroorganismů ze stěru bylo detekováno u vzorku č. 2. 44

Koliformní bakterie nebyly detekovány v žádném vzorku sýrů, jak v těstě tak i na povrchu sýrů. Dle Nařízení Komise č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny nesmí Escherichia coli u sýrů z tepelně ošetřeného mléka nebo tepelně ošetřené syrovátky překročit hodnotu 1000 KTJ/g. Koliformní bakterie mají v potravinářské mikrobiologii význam jako indikátorové mikroorganismy. Představují indikátory sekundární kontaminace potravin, indikátory správné sanitace technologického zařízení a nářadí (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007).

25000000

20000000

15000000 KTJ/g

Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 10000000

5000000

0 1

Obr. 18 Bakterie mléčného kysání – těsto sýrů

Hodnoty zjištěných baktérií mléčného kysání (obr. 18) u vzorků z těsta se pohybují od 16 · 105 KTJ/g do 22 · 106 KTJ/g. Přítomnost těchto mikroorganismů jsme nedetekovali pouze u stěru ze vzorku č 1. V další dvou stěrech se hodnoty pohybovaly od 45 · 101 do 21 · 104 KTJ/g. Bakterie mléčného kysání se přidávají jako primární mezofilní kultura do mléka. Představují je především bakterie rodu Lactococcus a Leuconostoc.

Jejich počty v sýrech nejsou legislativně stanoveny. (GÖRNER,

VALÍK, 2004).

45

4350000 4300000 4250000 4200000

KTJ/g

4150000 Vzorek 1 4100000

Vzorek 2 Vzorek 3

4050000 4000000 3950000 3900000 3850000 1

Obr. 19 Plísně – těsto sýrů

Nejvyšších

hodnot

u

stanovení

plísní

(obr.

19)

dosáhl

vzorek

č. 3, a to 43 · 105 KTJ/g. Také se zjistila přítomnost plísní na povrchu sýrů. Ze stěrů jich bylo nejvíce detekováno ve vzorku č. 1. Pro výrobu plísňových sýrů se používají kulturní druhy plísní Penicillium roqueforti, camemberti a další. Jejich množství není v Nařízení Komise č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny kontrolováno.

46

800000

700000 600000

KTJ/g

500000 Vzorek 1 400000

Vzorek 2 Vzorek 3

300000 200000

100000 0 1

Obr. 20 Kvasinky – stěr z povrchu Pozn. Vzorek 3 – Bylo použito odlišné ředění - 10-4.

Kvasinky (obr. 20) jsou součástí mazové kultur, a i když během výroby se odstraňují z povrchu těsta, tak jsou pro sýry důležité díky svým enzymům. Jejich přítomnost byla detekována, jak na povrchu sýrů, tak i v těstě. Také kvasinky nejsou v Nařízení Komise č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny kontrolovány.

47

6 ZÁVĚR Plísňové sýry jsou pro svou charakteristickou chuť, vůni, aroma a vzhled velmi vyhledávanou skupinou mléčných výrobků. V České republice má výroba některých druhů sýrů s plísní na povrchu, v těstě a kombinované s oběma plísněmi dlouholetou tradici. V současné době existuje na našem území několik mlékáren a malých výroben, které svými prostory, vybavením, technologií, použitím kvalitních surovin, splňují požadavky nařízení EU a naší legislativy na výrobu těchto sýrů. Jelikož je výroba sýrů velmi složitý proces, nelze zcela zabránit jejich případné kontaminaci. Avšak cílem je například prostřednictvím zaváděného HACCP kontrolovat místa a operace, při níž by k případné kontaminaci mohlo dojít, a zároveň možná nebezpečí eliminovat na minimum.

Byly analyzovány 3 vzorky sýrů s plísní uvnitř těsta s názvem Niva od různých mlékáren. Experimentálně se stanovoval:


celkový počet mikroorganismů,




počet koliformních bakterií,




plísní,




kvasinek,




bakterií mléčného kvašení.

Při experimentálním stanovení vybraných skupin mikroorganismů u vzorků sýrů Niva bylo zjištěno, že vyhovují mikrobiálním požadavkům, stanoveným Nařízení EP a Rady (ES) 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Dle tohoto nařízení nesmí E. coli u sýrů z tepelně ošetřeného mléka či tepelně ošetřené syrovátky překročit hodnotu 1000 KTJ/g. Přítomnost koliformních bakterií nebyla detekována v žádném vzorku sýrů, jak v těstě, tak i na povrchu.

48

7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY BURDYCHOVÁ R., SLÁDKOVÁ P., 2007: Mikrobiologická analýza potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 208 s.

CALLEC Ch., 2002: Encyklopedie sýrů. Rebo Productions, Česlice, 256 s.

FINOLI C., VECCHIO A., GALLI A., DRAGONI I., 2001: Roquefortine C occurrence in blue cheese, Journal of Food Protection, 64: 246-251.

FOX P. F., 2004: Cheese: chemistry, physics, and mikrobiology. Elsevier, Amsterdam, 617 s.

GAJDŮŠEK S., 1998: Mlékařství. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 135 s.

GÖRNER F., VALÍK L., 2004: Aplikovaná mikrobiologia požívatín. Malé Centrum, Bratislava, 528 s.

HARBUTT J., 2009: World cheese book. DK Publishing, New York, 352 s.

HUTKINS R. W., 2006: Microbiology and technology of fermented foods. Blackwell, Oxford, 473 s.

CHUMCHALOVÁ J., 2012: Miniatlas mikroorganismů. Databáze online [cit. 2012-0215]. Dostupné na: http://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/lac-2.htm

IBURG A., 2004: Lexikon sýrů. Rebo Productions, Čestlice, 301 s.

JIČÍNSKÁ E., HAVLOVÁ J., 1995: Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských výrobcích. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 106 s.

49

KADLEC P., MELZOCH K., VOLDŘICH M., 2009: Co byste měli vědět o výrobě potravin?: technologie potravin. Key Publishing, Ostrava, 536 s.

KOPÁČEK 2011: Vady sýrů a faktory, které je ovlivňují, Potravinářská revue, 3/2011, 100 s

LAW B. A., 1999: Technology of cheesemaking. Sheffield Academic Press, Sheffield, 322 s.

LIKLER L., 2008: Výroba sýrů s vnitřní plísní na území České republiky. Databáze online [cit. 2012-02-15]. Dostupné na: http://laktoscollection.cz/view.php?nazev=vyroba-syru-s-vnitrni-plisni-na-uzemi-ceskerepubliky&cisloclanku=2008060001

MASUI K., YAMADA T., 2007: Francouzské sýry. Slovart, Praha, 288 s.

MALÍŘ F., OSTRÝ V. a kol., 2003: Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů, Brno, 394 s.

OSTRÝ 2011: Identifikace nebezpečí plísní v potravinách, Výživa a potraviny, 5/2011, 56 s

PAVELKA A., 1996: Mléčné výrobky pro vaše zdraví. Litera, Brno, 105 s.

RIDGWAYOVÁ J., 2004: Průvodce světem sýrů. Fortuna Print, Praha, 224 s.

ŠILHÁNKOVÁ L., 2002 Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha, 363 s.

TEUBNER Ch., MAIR-WALDBURG H., EHLERT F., 1998: Sýry - velká encyklopedie. Perfekt, Bratislava, 255 s.

50

VLKOVÁ E., RADA V., KILLER J., 2009: Potravinářská mikrobiologie. Česká zemědělská univerzita, Praha, 168 s.

VOIGT D. D., PATTERSON M. F., LINTON M. et al., 2011: Effect of high-pressure treatment of milk prior to manufacture on ripening of Camembert cheese. Innovative food science & emerging technologies, 12: 1-5.

http://www.mot.cz/niva.htm [cit. 2012-02-15]

http://www.syr-niva.cz/niva [cit. 2012-02-15]

http://www.sedlcansky.cz/kolik-pepu-znas/deli-sekce/#syr-2 [cit. 2012-02-15]

http://www.czso.cz/csu/2011edicniplan.nsf/tab/53004FB2E5 [cit. 2012-02-15]

Nařízení evropského parlamentu a Rady (ES) č. 852/2004 ze dne 29. dubna 2004 o hygieně potravin

Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ze dne 29. dubna 2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu

ČSN ISO 4833 Všeobecné pokyny pro stanovení celkového počtu mikroorganismů

ČSN ISO 21527-1, ČSN ISO 21527-2 Všeobecné pokyny pro stanovení počtu kvasinek a plísní

Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje

51

8 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK OBRÁZKY: Obr. 1 Schéma rozdělení plísňových sýrů (Zdroj: autor) Obr. 2 Štěpení tuku (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004) Obr. 3 Roquefort (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998) Obr. 4 Gorgonzola (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998) Obr. 5 Modřenín – (Zdroj: www.sedlcansky.cz, 2012) Obr. 6 Jednoduchý přehled rozkladu kaseinu (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004) Obr. 7 Brie de Melun (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998) Obr. 8 Hermelín (Zdroj: www.files.nakladany-hermelin.cz, 2012) Obr. 9 Hermelín (Zdroj: www.sedlcansky.cz, 2012) Obr. 10 Vltavín (Zdroj: www.sedlcansky.cz, 2012) Obr. 11 Cambozola (Zdroj: TEUBNER a kol., 1998) Obr. 12 Penicillium camemberti (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004) Obr. 13 Penicillium roqueforti (Zdroj: GÖRNER, VALÍK, 2004) Obr. 14 Kyselina cyklopiazonová (Zdroj: www.med.muni.cz, 2003) Obr. 15 Jihočeská Niva (Zdroj: www.madeta.cz, 2012) Obr. 16 Niva (Zdroj: www.files.fantasyfood.cz, 2012) Obr. 17 Niva (Zdroj: www.shoppardubice.jipnapoje.cz, 2012) Obr. 18 Bakterie mléčného kysání – těsto sýrů Obr. 19 Plísně – těsto sýrů Obr. 20 Kvasinky – stěr z povrchu

TABULKY: Tab. 1 Desetinné ředění vzorků Tab. 2 Vyhodnocení výsledků odebraných vzorků z těst a stěrů z povrchu sýrů

52