Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve výrobním prostředí

Hygiena potravin

Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve výrobním prostředí J. BRYCHTA,T. BRYCHTA, H. BULAWOVÁ, E. KLÍMOVÁ MVDr. Josef Brychte, Ph.D., vedoucí oddělení hygieny potravin, SVÚ Jihlava

Státní veterinární ústav Jihlava

SOUHRN Brychta J., Brychta T., Bulawová H., Klímová E. Mikrobiální kontaminace JUT a pohyb bakterií ve výrobním prostředí. Veterinářství 2014;64:875-883. Změny senzorických vlastností masa a jeho kažení mají přímou souvislost s kvalitou jatečného opracování, ale především s  povrchovou kontaminací jatečně upraveného těla (JUT) na jatkách. Rychlost projevu změn závisí, kromě podmínek skladování a manipulace s masem, také na spektru bakterií, které se na kontaminaci JUT podílejí, a na jejich aktivitě. V rámci úřední kontroly kontaminace JUT bylo na SVÚ Jihlava vyšetřeno 263 destruktivních stěrů z prasat. Při hodnocení CPM byly tři vzorky bez mikrobiologického nálezu (1,3 %); 63 vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (26,7 %); 72 vzorků bylo hodnoceno jako přijatelné (30,5 %) a 98 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (41,5 %). Při hodnocení zjištěného počtu Enterobacteriaceae bylo 96 vzorků bez mikrobiologického nálezu (40,7 %); 18 vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (7,6 %); 47 vzorků bylo hodnoceno jako přijatelné (19,9 %) a 75 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (31,8 %). Dále bylo vyšetřeno 155 destruktivních stěrů z JUT skotu. Při hodnocení CPM bylo osm vzorků bez mikrobiologického nálezu (5,2 %); 39 vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (25,2 %); 34 vzorků bylo hodnoceno jako přijatelné (21,9 %) a 74 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (47,8 %). Při hodnocení zjištěného počtu Enterobacteriaceae bylo 59 vzorků bez mikrobiologického nálezu (38,1 %); pět vzorků bylo hodnoceno jako vyhovující (3,2 %); 24 vzorků bylo hodnoceno jako přijatelné (15,5 %) a 67 vzorků bylo hodnoceno jako nevyhovující (43,2 %).

SUMMARY Brychta J., Brychta T., Bulawová H., Klímová E. Microbial contamination of carcass and movement of bacteria in a production environment. Veterinářství 2014;64:875-883. Changes of sensory properties of meat and its possible spoilage have direct connection with surface contamination of carcases with bacteria at slaughterhouses. Speed of these changes is linked to the way the meat is treated, storage conditions, and contaminating bacteria species – especially their activity. 263 destructive samples of swine carcasses were tested at SVI Jihlava during state control of surface contamination. Considering aerobic colony counts 3 samples contained no bacteria (1.3 %), 63 samples (26.7 %) were satisfactory, 72 samples (30.5 %) were acceptable and 96 samples (41.5 %) were unsatisfactory. In case of Enterobacteriaceae 96 samples (40.7 %) contained no bacteria, 18 samples (7.6 %) were satisfactory, 47 samples (19.9 %) were acceptable and 75 samples (31.8 %) were unsatisfactory. 155 destructive samples from cattle carcasses were tested at SVI Jihlava during state control. Considering aerobic colony counts 8 samples (5.2 %) contained no bacteria, 39 samples (25.2 %) were satisfactory, 34 samples (21.9 %) were acceptable, and 74 samples (47.8 %) were unsatisfactory. In case of Enterobacteriaceae 59 samples (38.1 %) contained no bacteria, 5 samples (3.2 %) were satisfactory, 24 samples (15.5 %) were acceptable, and 67 samples (43.2 %) were unsatisfactory.

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

875

Hygiena potravin

Úvod Ztráty potravin v průběhu jejich produkce (od vidlí po vidličku) až do okamžiku jejich konzumace jsou celosvětově velmi vysoké. Odhaduje se, že asi 1,3 miliardy tun celosvětově vyrobených potravin podléhá každoročně zkáze. V Evropě se odhaduje množství zkažených potravin na 90 milionů tun za rok. Tato čísla je potřeba brát jako orientační, protože ve zprávě je odhad zkažených potravin mezi 50–20 % z  celkového množství v  Evropě vyrobených potravin (ANON 16). Co se masa týká – v  Evropě se odhad ztrát z  celkové produkce masa pohybuje do 25 %. Není zcela jasné, kolik procent z  celkového množství ztrát je přičítáno následkům bakteriálního kažení. Je však nad míru jasné, že to bude většina z  konzumace vyřazených surovin a  potravin (ANON 18). O  bakteriích se většinou ví pouze to, že jsou původci různých onemocnění, že kazí potraviny apod. Málo se však ví například o  tom, jak probíhá jejich šíření ve výrobním prostředí, v surovině či potravině.

Současný stav Provozovatelům potravinářských podniků (PPP) a  jejich zaměstnancům se většinou dostanou do rukou pouze údaje o posouzení výsledků laboratorních vyšetření. Z protokolu vyplývá, že v jejich výrobku byly nebo nebyly prokázány patogenní bakterie, nebo že výskyt kontrolovaných bakterií vyhovuje/nevyhovuje stanoveným limitům platné legislativy. V  tomto případě se poskytuje údaj o  množství kolonii tvořících jednotek/ /KTJ/CFU apod. Tento údaj však v žádném případě není roven počtu jednotlivých bakterií, které se nacházejí v jedné kolonii. Jak vypadá jedna KTJ, například L. monocytogenes na Petriho misce, je vidět na  obrázku 1. Jak vysoký počet bakterií se nachází v jedné kolonii, je patrné na roztěru z jedné KTJ pod mikroskopem (obr. 2). Jak z obrázků vyplývá, jedna KTJ je složená z milionů až miliard jednotlivých bakterií. Navíc bakteriální kolonie není žádné náhodné seskupení bakterií, ale dobře organizované společenstvo, které si musí zajistit dobré zásobování živinami a  odvádění produktů bakteriálního metabolismu. Kolonie je protkána „tunely“, které jsou naplněny vodným roztokem s  živinami či odpadními látkami bakteriálního metabolismu, případně látkami enzymatických aktivit, jako jsou enzymy, metabolity, toxiny a jiné látky (obr. 3). Jednotlivé kolonie bakterií vidíme především na živných médiích, která se v laboratořích používají k izolaci a  diagnostice jednotlivých rodů a  druhů bakterií. Ve skutečnosti se na potravinách vyskytují spíše v  jiné formě. V koloniích je vidíme například na povrchu výrobků, kdy jsou původcem především barevných senzorických změn. Podobně je tomu i  u kolonií plísní. To ale neplatí pro plísňové sýry, jako je Niva apod., kde naopak jejich přítomnost, viditelnost vyžadujeme. Ve výrobním prostředí nejsou bakterie pouze ve statické formě, jak by

876

Obr. 1– Rostoucí kolonie Listeria monocytogenes na Petriho misce, ALOA agar (Foto. SVÚ Jihlava) se dalo předpokládat, ale jsou v pohybu (pasivní/aktivní) nebo tvoří biofilmy. Svalovina, získaná ze zdravého zvířete, které je poraženo předepsaným způsobem, by neměla obsahovat žádné bakterie ani plísně. Jakmile jsou zvířata poražena a pokračuje jatečné opracování, je maso vystaveno možné kontaminaci. Pro dobrou údržnost a kvalitu masa je bezpodmínečně nutné udržet v provozu co nejvyšší úroveň hygieny a sanitace. Proto celkový počet bakterií, které mohou kontaminovat maso ve výrobním prostředí, musí být co možná nejnižší. Je to klíčový faktor pro stanovení doby spotřeby, potažmo pro údržnost masa ve vysoké kvalitě. Na povrchu jatečně upraveného těla (JUT), krátce po vykolení, můžeme zjistit různou úroveň kontaminace. Ta se může pohybovat v širokém rozmezí, a to od desítek KTJ na 1 cm2 až po hodnoty 107 KTJ/cm2, výjimečně i  vyšší. Většina těchto bakterií patří do skupiny psychrotrofních, která může mít podíl 35–93 % z celkové kontaminace JUT.15 Zastoupení jednotlivých bakteriálních rodů se kvalitativně mění od počáteční kontaminace až do nástupu kažení. Mezi dominující bakterie, které se uplatňují v  procesu kažení, patří například Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, Serratia spp., Enterobacter spp., Hafnia spp., Clostridium spp., Bacillus spp., Photobacterium phosphoreum, bakterie mléčného kvašení, kvasinky, plísně (ANON 19).

Tab. 1 – Stimuly a následné reakce bakterií Stimul

reakce na stimul

Chemický

Chemotaxis

Elektrický

Galvanotaxis

Gravitace

Geotaxis nebo gravitaxis

Světlo Magnetické pole

Fototaxis Magnetotaxis

Směr proudu tekutiny

Rheotaxis

Osmotický tlak

Osmotaxis

Teplota

Termotaxis

Dotyk

Thigmotaxis

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

Hygiena potravin

je v přepočtu 14násobek buněčné délky/s. Listeria monocytogenes je poněkud pomalejší, dosahuje rychlosti asi 6 μm/min, což je v  přepočtu trojnásobek buněčné délky/min.2 Veškerý pohyb bakterií je však závislý především na teplotě okolí, koncentraci bakterií, dostupné atmosféře, výživě, pH prostředí apod. Teplota, stejně jako jiné inhibující faktory, je u  většiny pohyblivých bakterií limitujícím faktorem jejich šíření v prostředí.

Obr. 2 – Roztěr L. monocytogenes pod mikroskopem, barvení podle Grama29

Bakteriální pohyb Sledování pohybu bakterií je umožněno díky elektronové mikroskopii a rozvoji různých skenovacích metod. Probíhá především v  laboratořích, kde se  dají dobře modelovat a důsledně sledovat vlivy různých prostředí a stresů na chování bakterií, včetně zmíněného pohybu.

Ovlivnění pH: má zásadní vliv na pohyb bakterií po povrchu agaru. Bylo prokázáno, že bakteriální expanze do okolí se výrazně snižuje při pH 3–4. Pro pohyb bakterií bylo zjištěno jako nejvhodnější pH 5–9. Hodnota pH nad 9 pohyb opět výrazně zpomaluje.1

Teplota Při teplotě <28 °C expandují kolonie pomalu, stejně jako při teplotě >37 °C. To však neplatí všeobecně, například u Campylobacter jejuni byla zjištěna vyšší pohybová aktivita při 42 °C než při 37 °C.1,4

Vlhkost Obr. 3 – Vnitřní struktura bakteriální kolonie Psychrotrofní bakterie mají oproti mezofilním kratší lag fázi, což znamená, že se rychleji přizpůsobují okolnímu prostředí. Většina bakterií, které způsobují kažení masa a masných výrobků, je schopna přímo tvořit nebo se podílet na tvorbě biofilmů ve výrobním prostředí. Je známo, že biofilmy jsou také významným zdrojem infekcí. V USA bylo prokázáno, že asi 80 % perzistentních infekcí člověka má přímou souvislost s bakteriálním biofilmem.12 Při tvorbě biofilmu se významně uplatňuje schopnost bakterií vykonávat aktivní pohyb. Bylo zjištěno, že například bakterie E. coli se pohybují rychlostí asi 30 μm/s při aktivním plavání (swiming motility) a 2–10 μm/s při plazivém pohybu (swarming motility). V  přepočtu to znamená, že bakterie E. coli překoná během sekundy vzdálenost, která se rovná až 15 násobku délky vlastní buňky. Podobnou rychlostí se může pohybovat také S. typhimurium, která je schopna vyvinout rychlost až 28 μm/s, což

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

Při zjišťování vlivu relativní vlhkosti (RV) prostředí na expanzi bakteriálních kolonií bylo zjištěno, že hodnota <35 % RV zpomaluje pohyb až dvacetkrát oproti 90 % RV. 1 V  tabulce 1 uvádíme základní druhy bakteriálních pohybů a jejich aktivátorů (ANON 22). Všechny uvedené pohyby jsou aktivovány jedním nebo více stimuly.

Aktivní pohyb bakterií umožňují především jejich povrchové organely A. Bičíky Jedná se o  tzv. motor bakterií/nanomotor. U  většiny bakterií se tvoří dva různé druhy bičíků, a to polární bičíky umožňující (swimming motility) plavání v  tekutém prostředí a laterální bičíky pro (swarming motility) plazivý pohyb na povrchu potraviny, zařízení nebo tkáně, kde se bakterie nacházejí. Geny pro tvorbu laterálních bičíků se vyskytují přibližně u  60 % izolovaných bakte-

877

Hygiena potravin

Obr. 4 – Bakteriální bičíky a pili/fimbrie 28 Zdroj: https://www.google.cz/search?sourceid=navclient&hl=cs&ie =UTF-8&rlz=1T4LENP_csCZ539CZ539&q=flagella+pili+picture riálních kmenů a k jejich expresi dochází při růstu bakterií na pevném povrchu.

B. Fimbrie (pili) obr. 4 Jsou vláknité struktury na povrchu bakteriální buňky. Skládají se z molekul bílkoviny zvané pilin, které jsou uspořádány do tvaru spirály. Rozlišují se dva základní morfologické typy. Krátké, tzv. rigidní pili a delší vlnité, tzv. flexibilní pili. Krátká rigidní vlákna jsou hlavním typem fimbrií, jež se vyskytují asi u 95 % bakteriálních kmenů. Tato rigidní vlákna umožňují adhezi (přilnutí/přilepení) buňky k  různým povrchům, ale tvoří se i  při různých růstových podmínkách okolního prostředí. Naproti tomu exprese flexibilních pili je ovlivňována především fyzikálními a chemickými podmínkami prostředí, kde se bakterie nacházejí.10 U  pohyblivých bakterií můžeme pozorovat několik druhů pohybů, které souvisejí s podněty z okolního prostředí. Bakterie tyto podněty vyhodnocují jako vhodné či nebezpečné pro jejich další životaschopnost a  poté následuje (kromě jiného) pohyb bakterií do vhodného prostředí.

Jedná se například o: 1) Swimming – plovoucí pohyb způsobený pohyby bičíků především v tekutinách. Buňky se pohybují individuálně a  náhodně. Nejčastějším způsobem pohybu je pohyb pomocí rotace bičíku. Rotace bičíku, vnější organely, která slouží jako lodní šroub, poskytuje sílu pro relativně rychlý pohyb bakterie – až 30 buněčných délek za sekundu (20–60 μm/s). Jsou popsány různé typy pohybů pomocí bičíku závislé jednak na počtu bičíků a dále jejich umístění na povrchu buňky. Některé druhy bakterií (Pseudomonas, Spirillum, Chromatium, Halobacteria) jsou schopny pouze pohybu vpřed a vzad. Změna směru je pasivní, je závislá na tzv. Brownově pohybu. Naopak jiné druhy (Escherichia, Salmonella, Sinorhizobium, Rhodobacter, Agrobacterium) se pohybují v přímé linii, s občasnou aktivní změnou směru. 2) Swarming – bakterie vykonávají plazivý pohyb po povrchu prostředí, na kterém se nacházejí. „Swarming“ by však neměl být chápán jako úzký termín používaný k  popisu pohybu bakterií. Spíše než o  pouhý pohyb se totiž jedná o širší způsob organizace bakteriálního společenství, jehož součástí je i společný pohyb. 2,11

878

Při pozorování mikrostruktury jsou bakterie při tomto druhu pohybu vysoce organizované ve formacích, které vypadají jako víry nebo pruhy. Pohyb je plynulý a výhradně podél dlouhé osy buněk, které jsou během pohybu spojené ve svazcích (obr. 5, 6). Během plazivého pohybu vznikají dlouhé, mnohojaderné a  vysoce pohyblivé buňky se zvýšeným množstvím bičíků, které rychle a koordinovaně (jako populace) migrují. Pohyb bakterií po povrchu může pomoci patogenním druhům v  migraci, adhezi a  rozšiřování se z místa infekce. Swarming může chránit patogeny například před makrofágy, a to tak, že zvyšuje odolnost bakterií proti jejich pohlcení makrofágem. Také sekrece bakteriálních toxinů je většinou spojena se souběžným  řízením pohybu.7 Bylo prokázáno, že tato organizace bakterií (resp. diferenciace buněk v  rámci tohoto společenstva, např. u  Salmonella enterica sérovar Typhimurium) vykazuje zvýšenou rezistenci na různá antibiotika. Swarming je značně závislý na hustotě bakteriálních buněk, dostupnosti živin a vlhkosti povrchu. Mezi nejrychlejší bakterie patří například Proteus mirabilis, B. megaterium, Clostridium bifermentans, Bacillus alvei, B. cereus.8 Některé bakterie produkují ve vysokém množství povrchové surfaktanty (povrchově aktivní látky – sliz/hlen), které redukují tenzi mezi povrchem a bakteriemi pro umožnění klouzavého pohybu. Tento jev je běžný například u některých kmenů E. coli a salmonel, ne však u všech izolátů. Předpokládá se, že surfaktanty produkující kmen absorbují vodu a potřebné látky z  povrchu (například masa) pod bakteriální vrstvou, a  tak umožňují vznik fluidní podvrstvy umožňující zrychlení pohybu.2,7 Buňky s  plazivým pohybem mají vyšší šanci vyvolat u hostitele onemocnění (viz obr. 7). Např. Proteus mirabilis může migrovat močovým traktem a způsobit infekci ledvin. Studie „swarm motility“ různých bakterií jsou orientovány především do zdravotnictví, kde tento jev představuje vysoké riziko pro rozvoj onemocnění i  při léčbě pacienta, a  může se výrazně uplatnit i  při sekundární kontaminaci nástrojů a  zařízení. Sledováním stejného problému ve výrobě potravin se zabývá velmi málo studií. 2,11 Každý bakteriální rod má určité specifické projevy pohybu. Například důležitým aspektem při růstu a šíření kolonií rodu Proteus je cykličnost. Každý cyklus může být rozložen na čtyři části: 1) diferenciace buněk do formy

Obr. 5 – Bakteriální „Swarm“ forma – nadměrná flagelace celého povrchu buňky.30 Typický zástupce může být: E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Proteus mirabilis

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

Hygiena potravin

Obr. 6 – Kolektivní plazivý pohyb bakterií (S. marcescens) na povrchu Virgin agaru9 Vysvětlivky: Front of surfactant layer – čelo mukózní (slizovité) vrstvy Surfactant layer – mukózní (slizovitá) vrstva Front of swarming bacteria – čelo plazivě se pohybujících bakterií Zdroj: Avraham Be’er and Rasika M. Harshey. 2011 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21889437 plazivé; 2) lag fáze buněk, která předchází aktivnímu pohybu; 3) migrace buněk; 4) slučování (buňky se přestávají pohybovat a  rediferencují, což se projeví ve změně jejich morfologie zpět na plovoucí formu). Během fáze migrace se plně diferencované buňky naráz pohybují do všech směrů od původního místa po dobu několika hodin. Cyklus plazivého pohybu a slučování je několikrát opakován, až nakonec na agarové půdě vznikají typické koncentrické prstence a  linie, tvořené ve fázi slučování, které prstence ohraničují.7 (obr. 3). Jak již bylo řečeno, bičíky nejsou využívány pouze pro swimming, ale uplatňují se i  při swarmingu, který je závislý na velkém počtu bičíků a mezibuněčné komuni-

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

kaci. Tento druh organizovaného pohybu byl prokázán jak u gramnegativních, tak i grampozitivních bakterií. Například bakterie, jako jsou E. coli nebo S. typhimurium – tedy s  velmi dobrým plavacím (swiming) typem pohybu, pokud jsou na tvrdém povrchu, jsou schopny diferenciace na vláknité (až 50 μm dlouhé) mnohojaderné buňky se zvýšeným počtem bičíků, které se po povrchu přemisťují spolu jako celá kolonie. Často je tento pohyb přirovnáván k pohybu včelího roje, hejna ptáků či ryb. Bakterie jsou organizované tak, že se vnější část kolonie pohybuje jako vír směrem ven (od středu) a uvolněné místo ve středu je pak zaplňováno nově narostlými bakteriemi. Výsledkem je rychlá expanze kolonií – až do 3 μm/s  nebo 1 cm/h. Je vhodné připomenout, že při tomto přesunu bakterií musí docházet k intenzivní mezibakteriální komunikaci (Quorum sensing), která je pro swarming i jiné druhy pohybu nezbytná..8 3) Gliding – jedná se o klouzavý pohyb po povrchu, vyskytující se pouze u  nebičíkatých bakterií. V  mnoha směrech je shodný s plazivým pohybem. Podle rychlosti pohybu se dají bakterie rozdělit na pomalé a rychlé (slow a fast gliders). Pomalé (slow gliders) – nejvíce studovanou skupinou jsou myxobakterie, gramnegativní půdní bakterie. Klouzavý pohyb (gliding) je u  nich velmi pomalý (1–20 μm/min). Rychlost je závislá na vzdálenosti mezi jednotlivými buňkami – čím větší vzdálenost, tím menší rychlost pohybu. Například u bakterií Myxococcus xanthus se rozlišuje klouzání sociální a klouzání samostatné. Při samostatném pohybu/klouzání jsou bakterie schopny pohybovat se jednotlivě. Zdrojem tohoto pohybu je tvorba a mohutné vypuzování slizu. Při sociálním (společném) pohybu/klouzání spolu více bakterií vytvoří jakéhosi „slimáka“ a pohybují se spolu pomocí pilí typu IV. Rychlé (fast gliders) – jedná se například o cyanobakterie. Tyto bakterie se pohybují rychlostí asi 1–10 μm/s. 4) Twitching – je to trhavý druh pohybu, který lze pozorovat jak u nebičíkatých, tak bičíkatých bakterií, ale nesouvisí s pohyby bičíku. Buňky se pohybují převážně jednotlivě, shluky bakterií nejsou vyloučeny. Pohyb se jeví jako nesouvislý a trhavý, nesleduje dlouhou osu buňky. 5) Swirling – vířivý pohyb. Charakteristické je kroužení, točení, víření bakterií. 6) Flocking – je koordinovaný pohyb milionů až miliard buněk v prostředí, podobný vodní vlně, nebo hejnu ptáků, rybímu hejnu apod. 7) Tumbling – kotoulový pohyb. Lze ho charakterizovat jako chaotické otáčení, tápání (buňky vyhledávají/ /detekují lepší životní podmínky). 8) Sliding – klouzavý pohyb je druh pohybu, způsobený expanzivními silami v rostoucí kultuře v kombinaci se speciálními povrchovými vlastnostmi buněk, plynoucích z redukce tření mezi buňkou a substrátem. Při pozorovaní mikrostruktury jsou bakterie při tomto druhu pohybu slité v  uniformní povlak úzce svázaných buněk v  jedné vrstvě. Vrstva se pohybuje pomalu a jednotně. 9) Darting – míhavý pohyb je druh pohybu, způsobený expanzivními silami vyvinutými v  agregátu buněk potažených povlakem a  plynoucí z  „vystřelení“ buněk

879

Hygiena potravin

Tab. 2 – Destruktivní a nedestruktivní stěry z JUT – rok 2013 – nákup služeb (SVÚ Jihlava) Počet kolonií aerobních mikroorganismů JUT

Hodnota Vyhovující

Metoda odběru:

0

Summ.

Prasata

destruktivní

Prasata

236

Enterobacteriaceae

Přijatelné

Nevyhovující

hodnoty

hodnoty

hodnoty

n

%

n

%

n

%

n

%

3

1,3

63

26,7

72

30,5

98

41,5

Hodnota Vyhovující 0

Summ. n

%

Nevyhovující

hodnoty

n

%

n

%

n

%

7,6

47

19,9

75

31,8

236

96 40,7

18

75

Přijatelné

hodnoty

hodnoty

nedestruktivní

24

1

4,2

15

62,5

4

16,7

4

16,7

24

18

0

0

3

12,5

3

12,5

Skot

destruktivní

155

8

5,2

39

25,2

34

21,9

74

47,8

155

59 38,1

5

3,2

24

15,5

67

43,2

Skot

nedestruktivní

17

5,9

5,9

8

47

4

23,5

4

23,5

17

16 94,1

0

0

1

5,9

0

0

Vysvětlivky: nákup služeb = státní kontrola

z  tohoto agregátu. Při pozorování mikrostruktury jsou bakterie při tomto druhu pohybu náhodně rozložené do agregátů s volnými územími agaru. Ani buňky, ani agregáty se nehýbou, s  výjimkou vystřelení, které je pod mikroskopem pozorováno jako záblesk (ANON 22, 23).

Tvorba biofilmu Pohyb bakterií má přímou souvislost nejen s  šířením bakterií v prostředí, ale také s tvorbou biofilmu. Například bakterie P. aeruginosa vykazují tři typy pohybu – swarming, twitching a  sliding, přičemž bylo prokázáno, že twitching a  swarming jsou přímo spojeny s  tvorbou biofilmu a patogenezí.5 Odhaduje se, že až 99 % všech mikroorganismů na Zemi existuje ve formě biofilmu. Bakteriální biofilm může být vytvářen v prostředí nemocnic, potravinářské výroby, na potravinách, na zubech apod. Obsahuje bakterie, které jsou až tisíckrát odolnější k antimikrobiálním látkám či jiným nepříznivým faktorům (výživa, vlhkost, nedostatek kyslíku, pH, salinita apod.) než volné bakterie. Byla prokázána i zvýšená bakteriální rezistence proti hostitelskému imunitnímu systému (ANON 25). Tvorba biofilmu je běžná také u psychrotrofních bakterií, které jsou spojovány s kažením masa. Nejčastěji jsou zmiňovány bakterie rodu Pseudomonas, které se běžně podílejí na kažení masa a jsou často dominantní kontaminující (psychrofilní/psychrotrofní) mikroflórou na mase, které je uchováváno v teplotách 2–8 °C .16 Tyto bakterie jsou schopny přežívat i při nízkých hladinách O2 (0–5 %) a jsou zjišťovány i u vakuově baleného masa.13,15 Výsledkem masivní kontaminace masa i  výrobního prostředí nemůže být nic jiného než rychlé kažení například výsekového masa a  také masných výrobků, které jsou z  vysoce kontaminovaného masa vyrobeny. Specifické problémy se objevují při výrobě fermentovaných trvanlivých masných výrobků, jejichž výsledná kvalita je přímo závislá na mikrobiologické čistotě masa.

Vliv mikrobiologické kontaminace na kažení masa Jak již bylo zmíněno výše, u chlazeného masa se výrazně prosazují psychrofilní bakterie, které při vyšší povrcho-

880

vé kontaminaci na cm2 začnou působit organoleptické změny včetně osliznutí, změny barvy a  vůně. Zpočátku bývají dominantní bakterie rodu Pseudomonas a mikrokoky. Během skladování a rozvíjejícího se kažení se začínají prosazovat jiné bakteriální rody. Je to výsledek konkurenčního boje mezi bakteriemi o  ovládnutí prostředí. Kromě vlastních bakteriálních produktů, jako jsou například bakteriociny, závisí konkurenční výsledek i na dostupnosti kyslíku, pH, vlhkosti, teplotě apod. Dále je to i otázka složení masa (libové x tučné, hovězí x vepřové atd). Vysoká úroveň povrchové mikrobiální kontaminace představuje mimořádnou zátěž nejen pro maso, ale i pro technologické zařízení a  výrobní prostředí. Manipulací s  vysoce kontaminovaným masem vzniká přenesení bakterií (otisk) na kontaktní i nekontaktní plochy a tato kontaminovaná místa se poté stávají zdrojem sekundární kontaminace „čistého“ masa, kterému se tak výrazně snižuje možnost udržet si kvalitu až do konce data spotřeby. Je prokázáno, že počáteční kontaminace na úrovni 1.105/cm2 a skladování při 5 °C způsobuje osliznutí masa již po šesti dnech. Na druhé straně při kontaminaci masa na úrovni 102/cm2 a shodné teplotě skladování, se osliznutí projeví až po 12 dnech (ANON 26). Existuje celá řada studií, které se zabývají problematikou kolonizace masa bakteriemi. Byla objasněna biokinetika, chemické a  fyzikální podmínky při probíhající kontaminaci masa (pozitivní chemotaxe), stejně jako připravenost a vybavenost bakterií k adherenci na biotické či abiotické povrchy. Byla prokázána skutečnost, že G- bakterie (E. coli, Pseudomonas spp. apod.) vykazují rychlejší adherenci k povrchům než G+ (laktobacily, stafylokoky apod.). Jak již bylo zmíněno výše, maso získané ze zdravých zvířat je mikrobiologicky čisté. Toto “tvrzení“ je vyvozováno ze zkušeností dlouhodobě prováděné veterinární prohlídky a laboratorního ověřování kontaminace masa zdravých zvířat v  rámci „sebekontroly“ provozovatele. Avšak podmínky pro možnou prvotní kontaminaci masa se někdy splňují již během vyskladňování „potravních zvířat“ ze stájí, jejich transportu, ustájení před porážkou apod. Stres u těchto zvířat může způsobovat vyšší vylučování střevních bakterií (včetně patogenních) do vnějšího prostředí..3 Samozřejmě, že nejvyšší riziko kontaminace vyplývá ze špatně provedené porážky, nedbalém stažení kůže a  prodlevě či nedokonale provedeném vykolení. Stejně

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

Hygiena potravin

Tab. 3 – Logaritmické hodnoty pro vyhodnocení vyšetření na celkový počet aerobních mikroorganismů a Enterobacteriaceae (Metodický návod SVS ČR 2004/29/HYGI ze dne 2. 1. 2005 – v platném znění, stanovující pravidla pro pravidelné kontroly všeobecné hygieny, prováděné provozovateli v podnicích) Denní průměr logaritmických hodnot vyhovující hodnoty ≤m

přijatelné hodnoty >m ale ≤M

nevyhovující hodnoty >M

Skot/ ovce/ kozy/ koně

Prasata

Skot/ovce/ kozy/ koně

Prasata

Skot/ovce/ kozy/ koně

Prasata

Počet kolonií aerobních mikroorganismů (log)

<3,5 <3 160 CPM

<4,0 <10 000 CPM

3,5 až 5,0 3 160–100 000 CPM

4,0 až 5,0 10 000–100 000 CPM

>5,0 >100 000 CPM

>5,0 >100 000 CPM

Enterobacteriaceae Celkový počet

<1,5 <30

<2,0 <100

1,5 až 2,5 31–320

2,0 až 3,0 100–1 000

>2,5 >320

>3,0 >1 000

jak se na pokračující kontaminaci masa může podílet zastaralá technologie, tak se negativně projeví i  špatné pracovní a hygienické návyky zaměstnanců, včetně znečištěného výrobního prostředí. Masivní kontaminace masa je ireverzibilní (nevratná), lze ji pouze částečně napravit za použití dalších technologických postupů, které znamenají vícenáklady, a  při silné kontaminaci masa je výsledek velice nejasný. Nelze opomenout ani legislativu, která povoluje, respektive zakazuje některé způsoby ošetření JUT (především chemickými látkami) či vybouraného masa.

Metodika odběru vzorků JUT prasat a skotu V laboratořích SVÚ Jihlava se běžně vyšetřují destruktivní i  nedestruktivní stěry jatečně upravených těl (JUT) prasat a skotu. Vyšetření se provádí podle platné legislativy – nařízení Komise (ES) 2073/2005 a metodického návodu SVS ČR č. 3/2011 (v aktuálním znění). Provozovatel potravinářského podniku musí podle nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 provádět mikrobiologickou kontrolu JUT, masných polotovarů, zejména mletého a strojně odděleného masa a čerstvého drůbežího masa, a to nejméně jednou týdně. Stěry z  JUT jsou odebírány buď PPP, nebo inspektory státního veterinárního dozoru (státní objednávka/zakázka).

1) Destruktivní metoda Pro stanovení počtu KTJ čeledi Enterobacteriaceae a počtu kolonií aerobních mikroorganismů se z jatečně opracovaného těla skotu, prasat, ovcí, koz a  koní po konečné úpravě před začátkem chlazení odebírají čtyři vzorky tkáně o  celkové ploše 20 cm2 (vzorek à 5 cm2). Kousky tkáně se z  jatečně opracovaného těla získávají buď pomocí sterilního korkovrtu (průměr 2,5 cm) nebo odříznutím plátku o velikosti 5 cm2 a tloušťce max. 5 mm s  použitím sterilního nástroje. Vzorky z  jednoho kusu jatečně opracovaného těla musejí být na jatkách asepticky vloženy do vzorkovnice nebo plastového ředicího sáčku a přepraveny k dalšímu zpracování do laboratoře. Vzorky se uchovávají při teplotě 2–4 °C.

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

2) Nedestruktivní metoda Vyšetření na počet kolonií aerobních mikroorganismů a Enterobacteriaceae – stěrová metoda. Plocha stěru by měla mít velikost nejméně 100 cm2 (50 cm2 u jatečně upravených těl drobných přežvýkavců) na jedno vzorkované místo. K  vlastnímu odběru se použije celkem osm tampónů (čtyři navlhčené a  čtyři suché). Každé odběrové místo je nejdříve setřeno navlhčeným tampónem a poté suchým. Každý suchý a navlhčený tampon z  jednoho místa stěru se označí místem odběru. Všechny popsané stěry (osm kusů) se vloží do jednoho sterilního obalu a tím tvoří soubor stěrů z jednoho vzorkovaného jatečného kusu.

Výsledky vyšetření JUT prasat a skotu Výsledky (SVÚ Jihlava) vyšetření dodaných vzorků z JUT prasat a skotu (ze státní zakázky) a jejich hodnocení jsou shrnuty v tab. 2 a 3. Z  tabulky vyplývá, že úroveň kontaminace JUT není nijak uspokojivá a my bychom rádi upozornili na několik aspektů. 1) Je zde patrný výrazný rozdíl výtěžnosti bakterií při použití destruktivní a nedestruktivní stěrové metody. 2) Je poněkud překvapivé, že jsme „schopni vyrobit“ JUT s  nulovou mikrobiologickou kontaminací. Počet stěrů bez nálezu (nulová hodnota) CPM u  prasat byl 1,3 % u destruktivních stěrů, u nedestruktivních stěrů to bylo 4,2 %. Při hodnocení CPM ze stěrů z JUT skotu je situace obdobná, i když procenta „čistých stěrů“ jsou 5,2 pro destruktivní a 5,9 % pro nedestruktivní stěry. Při hodnocení celkových počtů Enterobacteriaceae u  JUT prasat jsou hodnoty výrazně odlišné. U  40,7 % destruktivních stěrů z  JUT prasat nebyly tyto bakterie prokázány vůbec, u nedestruktivních stěrů to bylo dokonce 75 % „čistých“ stěrů. Při hodnocení bakterií čeledi Enterobacteriaceae u destruktivních stěrů ze skotu jsou hodnoty negativních výsledků na úrovni 38,1 % a u nedestruktivních je to až 94,1 %. 3) Spíše než nulové hodnoty jsou alarmující výsledky u  nevyhovujících hodnot CPM. Příliš vysoké hodnoty

881

Hygiena potravin

kontaminace JUT prasat pro CPM byly na úrovni 41,5 % pro destruktivní a 16,7 % pro nedestruktivní stěry. U JUT skotu byly nevyhovující hodnoty pro CPM zjištěny na úrovni 47,8 % pro destruktivní stěry a 23,5 % pro nedestruktivní. Pro Enterobacteriaceae u prasat byly nevyhovující hodnoty na úrovni 31,8 % pro destruktivní stěry a 12,5 % pro stěry nedestruktivní. U skotu byly nevyhovující hodnoty Enterobacteriaceae zjištěny u 43,2 % destruktivních stěrů, u  nedestruktivních stěrů nebyly žádné nevyhovující hodnoty prokázány. Pouze 5,9 % stěrů bylo hodnoceno jako přijatelné hodnoty. 4) Úroveň bakteriální kontaminace JUT jak prasat, tak i  skotu, je příliš vysoká na to, aby bylo možné garantovat dobrou kvalitu výsekového masa či jiných výrobků po delší dobu. Takto vysoce kontaminované maso bude určitě zdrojem kontaminace technologie při bourání masa a získané výsekové maso se může začít velmi rychle kazit. Je nutné si uvědomit, že každá manipulace se syrovým masem během zpracování, transportu na místo prodeje, při skladování v  obchodě a  vlastním prodeji, včetně transportu do domácnosti, napomáhá penetraci bakterií do hlubších vrstev masa.

Diskuse Celkový počet mikroorganismů Celkový počet mikroorganismů (mezofilních) je na jedné straně velmi významný a výhodný ukazatel (indikátorový ukazatel) pro odhad kvality a  údržnosti masa. Mohl by být do jisté míry ukazatelem pro odhad kvality sanitace a  hygienických návyků personálu. Na druhé straně ho nelze využít jako indikátorový ukazatel pro přítomnost či nepřítomnost patogenních bakterií. Bohužel v průběhu několika let se význam tohoto limitního ukazatele bezpečnosti pro maso a masné výrobky ve vyhláškách zeslaboval, až z  naší (po vzoru evropské platné legislativy) vymizel úplně. Bakteriální kolonizace povrchu masa probíhá stejně jako osídlování povrchu jakéhokoli výrobního zařízení. Množství vznikajících mikrokolonií je závislé na síle kontaminace. Mikrokolonie se rozrůstají, během několika hodin expandují do okolí, až se následně spojí do kontinuální bakteriální (biofilmové) vrstvy, která se projeví osliznutím povrchu masa a dalšími senzorickými změnami. Jakmile se vytvoří spojení mezi bakteriemi a povrchovou vrstvou masa, jedná se již o nevratnou/ireverzibilní vazbu, která se nedá odstranit. Tato vazba je tvořena bakteriálními extracelulárními polysacharidy, nazývá se glycocalyx a  je základní stavební deskou pro vznik biofilmu. Na osliznutí masa se nejčastěji podílejí rody Pseudomonas, Lactobacillus, Enterococcus, Weissella, Brochothrix (Narendran, 2003).

Enterobacteriaceae Bakterie čeledi Enterobacteriaceae jsou běžné kontaminanty masa a  masných výrobků a podílí se významnou měrou na jejich kažení. Kromě toho čeleď Enterobacteriaceae zahrnuje jak řadu obligátně patogen-

882

Obr. 7 – Proteus spp. Inkubace: 30 °C, 2 dny, 1% glukózový agar (Foto: SVÚ Jihlava, Brychta, T.) ních rodů – Salmonella (břišní tyfus, paratyfus a salmonelózy), Shigella (bacilární úplavice) a Yersinia (mor, střevní infekce), tak i  řadu potenciálně patogenních rodů – Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Citrobacter a další. Růst a s ním spojená metabolická aktivita těchto mikroorganismů způsobuje enzymatický rozklad bílkovin. S  tím souvisí výrazné negativní změny vůně, barvy a  další výrazné senzorické defekty. U balených výrobků se projeví i tvorba plynu, který může až výrazně páchnout po H2S, NH3 a indolu (ANON 27). Do této čeledi je zahrnut také významný indikátorový ukazatel, na který by se nemělo zapomínat. Jsou to koliformní bakterie. Dříve se více prosazoval názor, že ukazatel koliformní bakterie je indikátorem fekálního znečištění. I tento koncept je často napadán například proto, že ne všechny prokázané koliformní bakterie jsou fekálního původu. Za typické zástupce koliformních a  zejména fekálních koliformních bakterií byly považovány příslušníci rodů Citrobacter, Enterobacter, Escherichia a Klebsiella. Dnes se název a hodnocení této skupiny bakterií mění na „fekální (nebo přesněji termotolerantní) koliformní bakterie“. Jsou to koliformní bakterie, které si ponechaly svoje růstové a fermentační vlastnosti i ve 44 °C. Některé bakterie z  této čeledi jsou, kromě jiného, významnými producenty biogenních aminů. Biogenní aminy jsou, jednoduše řečeno, produkty jejich metabolické enzymatické činnosti, které se podílejí na rozpadu bílkovin a  aminokyselin masa. Některé z  aminů mohou být nebezpečné především pro alergiky. Kromě toho mohou biogenní aminy způsobovat migrény, bolesti hlavy, žaludeční a střevní potíže, včetně dalších pseudoalergických reakcí. Proto je potřebné na ně pohlížet jako na látky nebezpečné pro zdraví konzumenta a také je možné tyto metabolity posuzovat jako indikátory nízké kvality syrového masa. Mezi významné producenty například histaminu patří E. coli, Morganella morgani, Proteus mirabilis. Vysoká produkce putrescinu byla zjištěna u  bakterií Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia grimessii, Proteus spp.

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

Hygiena potravin

apod. Bylo opakovaně prokázáno, že E. coli, častý kontaminant masa a  masných výrobků, silně produkuje i  jiné aminy, jako jsou cadaverin, putrescin, tyramin apod.9

9. 10. 11.

Závěr

12. 13.

• Bakterie jsou schopny šířit se po mase, potravinách a výrobních zařízeních vlastní aktivitou. • Bakterie jsou schopny vytvářet biofilmy v  jakémkoli prostředí a mohou být výrazným zdrojem sekundární kontaminace jak výrobního zařízení, tak vyráběných potravin. • Je prokázán výrazný rozdíl ve výtěžnosti bakterií z  destruktivních a  nedestruktivních stěrů z  JUT skotu a prasat. • U JUT prasat jsme zjistili, že asi 39 % JUT vykázalo nevyhovující hodnoty pro CPM (destruktivní + nedestruktivní stěry). Pro parametr Enterobacteriaceae to bylo 30 %. • U JUT skotu jsme zjistili, že asi 45 % JUT vykázalo nevyhovující hodnoty pro CPM (destruktivní + nedestruktivní stěry). Pro parametr Enterobacteriaceae to bylo 43 %. • Silně bakteriálně kontaminované maso vykazuje známky kažení již po několika dnech. Počínající senzorické změny masa jsou spojovány až s hraniční mikrobiologickou kontaminací na úrovni 107/cm2.

14.

15. 16.

17.

18. 19. 20. 21.

22. 23. 24. 25.

Literatura: 1. Be'er, A. – Strain, S. K. – Hernández, R. A. – Ben-Jacob, E. – Florin, E. L. Periodic reversals in Paenibacillus dendritiformis swarming. J Bacteriol 2013;195 (12) :2709-17. 2. Darnton, N. C. - Turner, L. - Rojevsky, S. - Berg, H. C. Dynamics of bacterial swarming. Biophysical Journal 2010;(98)10:2082-2090. 3. Fenlon, D. R., Wilson, J., Donachie, W. The incidence and level of Listeria monocytogenes contamination of food sources at primary production and initial processing. Journal of Applied Bacteriology 1996;81: 641-650. 4. Hazeleger, W. C. - Wouters, J. A. - Rombouts, F. M. – Abee, T. Physiological Activity of Campylobacter jejuni Far below the Minimal Growth Temperature. Applied and Environmental Microbiology. 1998;( 64)10: 3917-3922. 5. Hewitt, J. L. A  comparative Study of Pseudomonas aeruginosa Strains. A Thesis for the Degree of Master of Science in Bioengineering. University of Notre Dame. Indiana. 2010: 1-59. 6. Huijing Du, H. - Xu, Z. - Anyan, M. - Kim, O. - Leevy, W. M. – Shrout, J. D. – Alber, M. High Density Waves of the Bacterium Pseudomonas aeruginosa in Propagating Swarms Result in Efficient Colonization of Surfaces. Biophysical Journal 2012;103:601-609. 7. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Mikrobiology 2010;8:634-644. 8. Overhage, J. – Bains, M. – Brazas, M.D. – Hancock, R.E.W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa Is a  Complex Adaptation Leading to Increased Production of Virulence Factors and Antibiotic Resistance. Journal of Bacteriology. 2008;(8)190:2671-2679.

VETERINÁŘSTVÍ 11/2014

26. 27. 28. 29. 30. 31.

Özkaya, F. D. – Ayhan, K. – Vural, N. Biogenic amines produced by Enterobacteriaceae isolated from meat products. Meat Science 2001;58:163 – 166. Pospěchová, P. Klinický význam rodu Aeromonas. Bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita v Brně 2009: 1-55. Sharma, M. – Anand, S. K. Swarming: A  coordinated bacterial aktivity. CURRENT SCIENCE, 2002;Vol. 83, No. 6, p. 707-715. Srey, S. - Jahid, I. K. - Sang-Do Ha. Biofilm formation in food industries: A food safety concern. Food Control 2013;31: 572-585. Robertson, M. - Hapca, S. M. – Moshynets, O. – Spiers, A. J. Air–liquid interface biofilm formation by psychrotrophic pseudomonads recovered from spoilt meat. Antonie van Leeuwenhoek 2013;103:251-259. Roy, S. – Babic, I. – Watada, A. E. – Wergin, W. P. Unique advanteges of using low temperature scanning electron microscopy to observe bacteria. Protoplasma 1966;195: 133 – 143. Stokes, J. L. – Redmond, M. L. Quantitative Ecology of Psychrophilic Microorganisms. Applied Microbiology 1966;(14) 1:74-78. Narendran, V. Bacterial Attachment to Meat Surfaces. A  thesis for the degree of Doctor of Philosophy in Food Technology at Massey University, Palmerston North, New Zealand 2003:1-280. ANON. http://www.futuredirections.org.au/publications/food-and-water-crises/315-on-overview-of-global-food-losses-and-waste. html ANON. http://www.crosswordnexus.com/word/SWARMINGMOTILITY ANON. http://www.fao.org/docrep/014/mb060e/mb060e00.htm ANON. http://fri.wisc.edu/docs/pdf/FRI_Brief_Microbial_Food_ Spoilage_7_07.pdf ANON. https://www.google.cz/search?sourceid=navclient&hl=cs&ie=UTF-8&rlz=1T4LENP_csCZ539CZ539&q=l.monocytogenes+picture ANON. http://www.weizmann.ac.il/plants/Milo/images/cell%20 motility%20speed121208Clean(1).pdf ANON. http://web.natur.cuni.cz/filosof/images/stories/knihovna/ morfogeneze_bakterialnich_kolonii.pdf ANON. http://www.microbiologytext.com/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=65 ANON. https://www.amherst.edu/users/D/ndarnton/research/swimming ANON. http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/ id/26447 ANON. http://epubs.surrey.ac.uk/2212/1/233122.pdf M http://www.ilsi.org/Europe/Documents/EP%20Enterobacteriaceae. pdf ANON. http://cronodon.com/BioTech/Bacteria_pili.html ANON. Obr. č. 2. http://textbookofbacteriology.net/Listeria.html ANON. Obr. č. 5. https://www.google.cz/search?q=bacterial+flagella+fimbriae+photo+picture+ gallery&hl=cs&rlz=1T4LENP_csCZ539C Z539&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ei= nQc0U6W1KMLoswab94HIBg&ved=0CGkQ7Ak&biw=1322&bih=657

Adresa autora: MVDr. Josef Brychta, Ph.D. NRL pro maso a masné výrobky, Státní veterinární ústav Jihlava, Rantířovská 93, Jihlava 586 05 E-mail: [email protected]

883