Mikrobiális aktivitás mérése talajban CO2-termelés alapján Laborgyakorlat Összeállította: Gruiz Katalin, Molnár Mónika, Klebercz Orsolya, 2010.
A mérés célja Laborkísérletekre van szükség annak megállapítására, hogy a talajban lévő mikroflóra működőképes és aktiválható-e, és ha igen, milyen módon (levegőztetés, olajbontó baktériumok talajhoz keverése, tápanyagkiegészítés stb.) A laborgyakorlat során két, ennek az igénynek a kielégítésére szolgáló mini-reaktoros gyorstesztelő módszert ismerünk meg. Mindkét, viszonylag egyszerű talajlégzésmérőrendszer alkalmas mind a talajok állapotának, mind a talajszennyező szénhidrogének bonthatóságának megítélésére, mind pedig a remediációhoz használható technológia vizsgálatára. A talaj állapota, aktivitása úgy jellemezhető talajlégzési teszttel a legegyszerűbben, hogy a megfelelően előkészített és levegőztetett talaj széndioxid termelését folyamatosan mérjük. A termelt széndioxid abszolút mennyisége is alkalmas durva jellemzésre, de a folyamat dinamikáját jobban jellemzi az a módszer, amit Torstensson (1994) javasol. A talajlégzés folyamatos mérése közben bontható szubsztrátot adagolunk a rendszerhez. A pillanatszerű beadagolás hatására bekövetkező légzésintenzitás növekedést a széndioxid termelés időgörbéjének meredekségével lehet jellemezni. A széndioxid termelés alapján mért talajlégzés mind tiszta, mind szennyezett talajok esetében jellemzi a talaj állapotát. A dinamikus vizsgálat szintén alkalmas mind tiszta, mind szennyezett talajok jellemzésére, várható viselkedésük vizsgálatára. A légzést mérő tesztrendszer segítségével az alkalmazástól függően választ kaphatunk a következőkre: •
szennyezett-e a talaj,
•
toxikusan hat-e a szennyezőanyag, vagyis gátolt-e a mikróbák működése vagy sem,
•
adaptálódott-e a mikroflóra és aktívan működik-e,
•
aktiválható-e a mikroflóra,
•
ha aktiválható a mikroflóra, milyen technológiai paraméterekre van szükség az optimális működéshez.
A termelődött CO2 mennyisége arányos az elbontott szénhidrogén mennyiségével, a biológiai oxidáció mértékével, tehát a rendszer alkalmas, mind a talaj biológiai állapotának felmérésére, mind a biodegradáció folyamatának jellemzésére és követésére. A szénhidrogén vagy más szerves szennyezőanyag típusából, a talaj fajtájából, a szennyezőanyag korából és koncentrációjából adódó különbségek kimérésére is alkalmazható a mérőrendszer.
A technológiát tekintve válasz kapható például arra (levegőztetett rendszer esetében) hogy milyen mértékű levegőztetésre van szükség a mikroflóra aktiválásához. Szükség van-e tápanyag adagolásra (N-, P-forrás), szükségesek-e adalékanyagok (pl. hozzáférhetőséget javító anyagok). Karbonátos talajok esetén a felszabaduló CO2 zavarhatja a mérést. A gyakorlat során kis térfogatú reaktorokban vizsgáljuk a szennyezetlen és szénhidrogénekkel szennyezett talajok biológiai állapotát, valamint a levegőztetés hatását szennyezett talajokra CO2 termelés alapján. A két vizsgált mérőrendszer közti legfontosabb különbség, hogy az első módszer zárt közegben, míg a második átlevegőztetett rendszerben vizsgálja a talaj aktivitását.
1. Talajlégzés mérése zárt palackban - Az OxiTop légzésmérő rendszer 1.1.
A mérés elve
A teszt a manometrikus oxigén-meghatározás elvén alapul, melynek lényege, hogy az élő szervezetek az O2 elfogyasztása mellett, széndioxidot állítanak elő. Az utóbbi gázt megköti egy abszorpciós szer, és ennek eredményeként nem szabad gázként jelenik meg, amiből következően a nyomás megváltozása kizárólag az oxigénfogyasztásra vezethető vissza, amit manometrikusan mérünk. Az oxigénfogyasztás manometrikus méréséhez a következő feltételeknek kell teljesülnie: •
A (biológiailag aktív) mintának gázt át nem eresztő edénybe zárva kell lennie.
•
A minta fölött levegővel töltött, megfelelően méretezett gáztérnek kell rendelkezésre állnia, amely korlátozás nélkül biztosítja a biológiai lebontáshoz szükséges oxigént.
•
A mérőedényben a széndioxid megkötésére szolgáló abszorpciós szert kell elhelyezni olyan módon, hogy az ne kerülhessen érintkezésbe a mintával.
•
A reakciós edényen megfelelő nyomásmérő berendezést kell elhelyezni.
•
A reakciós edényt a mérés közben állandó hőmérsékletű helyen kell tartani.
1.2. Az OxiTop Control zárt palackos légzésmérő rendszer jellemzése Az alkalmazott OxiTop Control készülék légzésintenzitás változások mérésére alkalmazható. A rendszer a mintában lévő élő mikroorganizmusok aerob légzése során felhasznált oxigén fogyását, és az ezzel arányosan növekvő, kilélegzett szén-dioxid mennyiségét követi nyomon. A szén-dioxid a talajminta fölötti légtérbe kerül, ahol egy NaOH-ot tartalmazó edény található, a keletkező szén-dioxid megkötésére. Mivel az oxigén fogy, és a keletkező széndioxidot pedig elnyelődik, ezért az edény légterében a légzés hatására nyomáscsökkenés figyelhető meg, amit a mérőfejben elhelyezett nyomásmérő mér. A készülék vezérlése és az információk lekérdezése a Control Panel-lel történik. A Control Panel infravörös jelekkel képes kapcsolatot teremteni a mérőfejekkel.
1.3. Szükséges eszközök, anyagok 1. OxiTop-C mérőfejek 2. OxiTop OC110 Controller 3. ACHAT OC PC kommunikációs szoftver 4. AK 540/B típusú adatátviteli vezeték RS 232 porthoz 5. Mérőedények 6. Nátriumhidroxid 7. Környezeti minta (pl.talaj) Egy összeállított rendszer felépítését mutatja az 1. ábra.
1. ábra. A zárt palackos OxiTop Control talajlégzésmérő rendszer
1.4. A mérés kivitelezése A mintatartó edényekben (500 ml) elhelyezzük a talajmintákat (100 g), majd hozzáadjuk a szükséges adalékanyagokat. Ezután az edényben elhelyezett anyagokat homogenizáljuk, majd csatlakoztatjuk a NaOH tartó edényt. Ebbe az edénybe ~ 1 g szilárd NaOH-ot mérünk be. A NaOH tartó csavarosan illeszkedik a fedélhez. A NaOH-os edények csatlakoztatása után rögzítjük a tömítéseket csavaros technikával. A Control Panelen már ezt megelőzőleg be kell állítani a mérési módot, időt és a méréshatárt. A megfelelő beállítások ellenőrzése után elindíthatjuk a mérést, mégpedig úgy, hogy a Control Panel-t megfelelően közel (kb. 40 cm távolságba) helyezzük a mintatartó edényhez, hogy az infravörös kapcsolat létrejöjjön. A kapcsolat tényleges létrejöttét a mérőfejen piros fény felvillanása jelzi. A mérés ideje alatt állandó hőmérsékletet, és napsugárzástól mentes környezetet kell biztosítani, mert ezek mind hatással vannak a mért nyomásértékekre. A változásokat az idő függvényében rögzíti a készülék, az időadatokat percekben jeleníti meg. A mért adatokat az adatátviteli vezeték segítségével továbbíthatjuk a számítógépre egy a készülékhez tartozó számítógépes szoftver segítségével, majd Excel táblában elvégezhetjük a kiértékelést.
A talaj-mikrokozmosz kísérleteink során nyomásváltozást mértünk, mely a talaj mikroflóra aerob légzése során felhasznált oxigénfogyásból adódik. A zárt palack tesztet alkalmazó talajlégzés mérés főbb paraméterei Mérőedény (reaktor) térfogata:
500 ml
Talajmennyiség a reaktorban:
100 g
Talajminták nedvességtartalma:
15–18 %
Hőmérséklet:
25 oC
Mérési mód:
nyomásváltozás Δp [hPa]
Méréshatár:
300 hPa
Mérési idő:
5 nap
NaOH mennyiség:
1,5 g
1.5. Az eredmények értékelése Az OxiTop mérőfej öt napon keresztül, öt percenként rögzíti a palackban uralkodó nyomás értékét. Mivel a tesztedényt állandó hőmérsékleten tartjuk, ezért a nyomásváltozás elvileg kizárólag a talaj légzése során termelődött, és a NaOH által elnyelt szén-dioxid mennyiségével arányos. A kiértékelés szemléltetésére egy, különböző szerves szennyezőkkel kezelt kísérlet talajainak teszteredményeit közöljük. kontroll pakura friss
50
dízel friss pakura régi
dízel régi
p [hPa] 0 0
2000
4000
6000
8000
-50 -100 -150 -200 -250
idő [min] 2. ábra. Nyomáscsökkenés az 5 napos zárt palack teszt során
Az eredményekből a következő következtetések vonhatók le: 1.
A mindegyik görbén megjelenő nyomáscsökkenés szennyezőanyagok gyors biodegradációja elkezdődött.
azt
mutatja,
hogy
a
2.
A meredeken induló görbék azt mutatják, hogy a dízelolaj sokkal gyorsabban és könnyebben bontható a mikróbák számára, mint a nagy mólsúlyú pakurakomponensek.
3.
A frissen szennyezett talajban gyorsabban bontják a szennyezőanyagot a mikrobák, mint a régebben szennyezett talajban. Gyorsabban aktiválódnak a szénhidrogénbontó mikroorganizmusok a friss szennyeződések esetében, hiszen nagyobb a hozzáférhető frakció, míg a régi szennyeződés esetén feldúsultak a nehezebben bontható, kevésbé hozzáférhető komponensek.
4.
Ugyanakkor a nagymértékű a nyomáscsökkenés a dízelolajjal régóta szennyezett talajban is, ami az adaptálódott mikroflóra jelenlétét és aktivitását mutatja.
5.
A szennyezett területről származó, régi, koros szennyeződést tartalmazó pakurával szennyezett talajnak még a kontroll talajénál is kisebb az aktivitása, ami arra utal, hogy szénhidrogének már biológiailag nem vagy nehezen hozzáférhetőek, a mikroflóra aktivitásának növelésére van szükség.
A nyomásértékek jól szemléltetik a talajokban zajló különböző folyamatok eredményét, a mikroflóra adaptációs képességét. A könnyebben bontható dízelolajhoz gyorsabban adaptálódtak a mikroorganizmusok; nagyobb a mikrobiális aktivitás, (nagyobb az oxigénigény és ezzel együtt a nyomáscsökkenés) ezekben a talajokban. (A dízeolajjal szennyezett mintáknál megfigyelhető hogy a mérőedénybe helyezett NaOH kimerülése miatt nem nyelődött el a CO2, ezért nem tudott tovább csökkenni a nyomás. Ilyen nagy légzésintenzitásnál több NaOH-ra van szükség.)
2. Talajlégzés mérése átlevegőztetett rendszerben 2.1.A mérés elve A bemutatott mérési eljárás azon alapul, hogy a vizsgálni kívánt talajrészletet CO2-mentesített levegővel levegőztetjük át. Így a reaktorból távozó levegő széndioxid-tartalma teljes mértékben a talajmikroflóra tevékenységéből származik. A keletkezett szén-dioxidot elnyeletjük, mennyiségét titrimetriásan határozzuk meg. 2.2.A mérőrendszer összeállítása A mérőrendszer szénhidrogénekkel szennyezett talajok mikrobiológiai állapotára ad felvilágosítást. Segítségével megállapítható, hogy van-e a talajban működőképes mikroflóra, a mikroflóra aktiválható-e a technológiai paraméterek megváltoztatásával (pl. levegőztetéssel, hozzáférhetőséget fokozó adalékanyagok adagolásával). A talaj származhat szennyezett területről, de vizsgálhatunk mesterséges szennyezett talajokat is.
1. ábra: A mérőrendszer összeállításának elve és gyakorlati megvalósítása
5
1
6 3 4 10
A talajlégzést vizsgáló tesztrendszerben központi szerepe van egy folyamatosan levegőztethető 1100 cm3 hasznos térfogatú üvegreaktornak. Az üvegreaktor aljára kavicsréteget, erre pedig vászonlapot teszünk a levegőztető eldugulásának elkerülésére. A reaktor tetejéhez gumidugó, üvegcső és gumicső segítségével csatlakozik a vízsugárszivattyú, melynek segítségével levegőt áramoltatunk át a rendszeren. A talajjal töltött reaktoron való áthaladás előtt kétszeres, lúgban történő elnyeletéssel, eltávolítható a levegő CO2 tartalma.
Így titrálás során már csak azt a CO2 -t mérjük, amely a mikroorganizmusok életműködéséből származik, tehát az olajbontást jellemzi. 2.3. A mérés kivitelezése A mérés során általában szennyezett talajokat vizsgálunk. Az oszlopreaktorba töltött vizsgálandó talajjal elindítjuk a levegőztetést. A CO2 termelődés felfutását és állandósult állapotát mérhetjük megfelelő gyakorisággal végzett CO2 meghatározással. Feldatok: 1. A szennyezett talaj levegőztetése 2. A termelt CO2 mennyiségének meghatározása CO2 mennyiségi meghatározása A meghatározás gázanalitikai módszerrel, sav-bázis titrálással történik. A CO2 elnyeletését 150 cm3-es gázmosópalackban, 100 cm3 1 mólos NaOH oldatban végezzük. Az elnyeletés után a lúgoldatból 10 cm3 térfogatú mintákat titrálunk. 3 párhuzamos mérést végzünk. A titrálás menete: A mintát 3 csepp fenolftalein indikátor halványrózsaszínig titráljuk. A reakciók:
jelenlétében
0,1
mólos
HCl
oldattal
NaOH + HCl = NaCl + H2O Na2CO3 + HCl = NaCl + NaHCO3 Majd 3 csepp metilvörös indikátor jelenlétében hagymaszínig titráljuk a bürettában levő 0,1 mólos faktorozott HCl-val. A végpont előtt az oldatot kiforraljuk, majd hűtés után tovább titráljuk hagymaszínig. NaHCO3 + HCl = NaCl + H2O +CO2 Megjegyzés: Fontos, hogy a titrálást viszonylag alacsony hőmérsékleten (15 oC körül), az erős rázogatást kerülve végezzük. 3.4. Az eredmények értékelése A vizsgált talajok biológiai állapotát jellemezzük és összehasonlítjuk széndioxid termelésük alapján. A Jegyzőkönyvvel szemben támasztott követelmények A jegyzőkönyvnek mindkét mérés esetében tartalmaznia kell az alábbiakat: • A vizsgálat célja, alkalmazhatósága • A mérés menete, készülékrajz • A vizsgálat során kapott és számított adatok alapján a szennyezett talajok értékelése és jellemzése
