Mikrob Penghasil Nukleotida Æ Digunakan luas sbg Penyedap rasa -purin ribonukleosida-5’-monofosfat: Æ 5’-GMP (as. Guanilat) Æ 5’-IMP (as. Inosinat) Æ 5’- XMP (as. Xanthilat)
-5’-AMP & isomer 2’ , 3’ -5’-deaoksiribonukleitida -Nukleotida pirimidin
Tidak ada efek
Æ Produksi 5’-IMP & 5’-GMP -Enzimatik : hidrolisis RNA khamir -dikembangkan di jepang th 1959 - dikemersialisasi th 1961 ÆNa2-IMP ÆNa2-GMP
Digunakan sbg food additives Kombinasi dg Na-glutamat
-Sup -Sauces
Cukup 0.005- 0.01 %
-jumlah zat penyedap rasa yg dikonsumsi setiap makan; Æ 0.1 – 0.2 g terdiri dari: - 5’- IMP = 8 – 12 % - 5’ – GMP = 1.5 – 2.0 % Kombinasi dg glutamat Produksi : - enzimatik Æ hdrolisis - Fermentasi Di Jepang : 3000 ton/tahun ÎDipelajari untuk tujuan kemoterapi : antibiotik & sitostatik Æ analog purin : - 8-Azaguanin Terapi kanker - 6-Merkaptopurin Æβ-D-arabifuranosiladenin Æ efektif utk Herpes
Struktur:
Biosintesis: -dimulai dr PRPP (dibentuk dr ribosa 5-fosfat & ATP) -turunan purin komplit I: Æ as. Inosinat (5’-IMP) Prekusor 5’-AMP, 5’-XMP, 5’-GMP
Regulasi: -overproduksi nukleotida purin dicegah oleh regulasi feedback. Æproduksi komersial, dieliminasi scr parsial mutan auxotrofik or mutan resisten thd nalog purin
Metode Produksi: 1. Enzimatik or pemecahan scr Kimiawi a. hidrolisis enzimatik dr RNA khamir b. pemecahan RNA dg enzim endogenousÆ ekskresi c. hidrolisis kimiawi dr RNA khamir dg fosforilasi 2. Fermentasi: pakai mutan Æ block biosintesis nukleotida Æ tidak ada regulasi endproduct a. Fermentasi & fosforilasi kimiawi b. Konversi nukleosida jadi 5’-nukleotida
1a, 1c, 2a, 2b Æ digunakan utk produksi 5’- IMP & 5’- GMP
*Produksi 5’-IMP & 5’-GMP dg Hidrolisis RNA scr Enzimatik -metode I produksi nukleaotida scr komersial -50 % produk 5’-nukleotida di Jepang Tahapan proses: 1. Kultur sel khamir Æ RNA tinggi 2. Ekstraksi RNA 3. Produksi enzim penghidrolisis 4. Hidrolisis RNA 5. Isolasi dan purifikasi 5’-IMP & 5’-GMP RNA sel : - 5 % mRNA - 10 – 15 % tRNA - 75 – 80 % rRNA
- Khamir Æ kandungan DNA rendah Sumber RNA terbaik Candida utilis Saccharomyces cerevisiae -kandungan RNA tgt kondisi kultur: Æ awal fase Log : RNA tinggi Æ C/N ratio rendah : RNA tinggi Æ + ion Zn 0.25 ppm & 0.15 % fosfat (molase or glukosa)
ÆSel khamir dipisahkan & dikeringkan ÆRNA diekstrasi dg larutan garam alkalin panas (8-20 % NaCl; 8 jam; 100oC) ÆRNA diendapkan dg HCl or etanol ÆDikeringkan ( kandungan RNA 70 – 90 %; BM:10000-150000) Hidrolisis enzimatik Sumber enzim : - Penicillium citrinum - Streptomyces aureus
*Produksi 5’-IMP & 5’-GMP dg Hidrolisis RNA scr kimiawi -hidrolisis pd kondisi alkalin -Campuran 2’- & 3’- nukleotidaÆ bukan 5’-nukleotida -Pemanasan 130oC selama 3-4 jam dalam Ca(OH)2 Æ prod nukleoside -Fosforilasi Æ produksi 5’-IMP dan 5’- GMP *Produksi 5’-IMP dg Fermentasi Metode: 1. Produksi inosin Æ fosforilasi kimia Æ 5’-IMP 2. Fermentasi langsung jadi 5’-IMP 3. Produksi adenosin or 5’-AMP Æ konversi enzimatik Æ 5’-IMP 4. Konversi hipoxanthin (prod. Kimiawi) Æ 5’-IMP *Alasan ekonomis: no 1 & 2 digunakan scr komersil
Fermentasi produksi inosin: -sel tidak permeabel thd nukleotida -Permeabel thd nukleosida 5’-IMP (tidak dikeluarkan dr dalam sel) defosforilasi Inosin (dikelurkan dr dalam sel) -pertama ditemukan pd mutan auxotrof adenin (ade-) - Bacillus - Brevibacterium - Corinebacterium - Streptomyces - Saccharomyces *fosforilasi scr kimia dg triakilfosfat dg PCl3
Fermentasi inosin Brevibacterium ammoniagenes KY 13761
Fermentasi langsung 5’-IMP: ÆMutan harus: - tidak punya SAMP sintetase Æ hilangkan regulasi AMP pd level PRPP amidotransferase - aktivitas enzim pendegradasi 5’-IMP rendah - membran permeabel untuk ekskresi 5’-IMP
*Produksi 5’-GMP dg Fermentasi ÆEkskresi 5’-GMP pada galur liar sangat jarang Æ efek regulasi pd PRPP amidotransferase, IMP dehidrogenase, dan GMP sintetase Metode: 1. Fermentasi dr AICARÆ konversi kimiawi jadi 5’-GMP 2. Produksi guanosin Æ fosforilasi kimia Æ 5’-GMP 3. Produksi xanthin or 5’-XMP Æ konversi enzimatik Æ 5’-GMP 4. Fermentasi langsung jadi 5’-GMP
*no 1 & 2 digunakan scr komersil
Fermentasi dr AICAR: Mikrob produksi AICAR (5-amino-4-imidazole karboksamida ribosida)
E. coli B. subtilis B. megaterium Brevibacterium flavum -galur auxotrof purin Æblock reaksi AICARP formiltransferase (AICARP Æ FAICARP) -tidak ada aktivitas enzim yg menghidrolisis Karakter: AICA-ribosida -enzim yg menkatalisis biosintesis AICAR tidak sensitif thd regulasi nukleotida purin intraselular
-Produksi dipengaruhi sporulasi - sporulasi Æ kurangi produksi AICAR Ditekan : - inhibitor (as. Butirat) - kurangi supply O2 -AICARP yang terbentuk diekskresikan dalam bentuk terdefosforilasi (AICAR) - AICAR Æ konversi ke guanosin Æ fosforilasi jadi 5’-GMP
Fermentasi Guanosin: -Galur yg ekskresi guanosin harus: Æ tidak ada SAMP sintetase Æ tidak ada GMP reduktase Æ aktivitas nukleosidase tereduksi Æ enzim biosintesis GMP tidak teregulasi -Bacillus subtilis -Bacillus pumilus -Bacillus licheniformis -Corynebacterium petrophilum -Corinebacterium guanofaciens -Streptomyces griseus
