MIKOTOXINOK BIOMONITORING ÉS BIODETOXIFIKÁCIÓ Dr Kriszt Balázs tanszékvezető, egyetemi docens Szent István Egyetem Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar Környezetvédelmi és Környezetbiztonsági Tanszék 2012.11.28
A legjelentősebb mikotoxinok és az azokat termelő gombák Mikotoxin termelő gombák Aspergillus
Fusarium
Penicillium
Gomba fajok
Mikotoxinok
A. flavus A. parasiticus A. nomius A. pseudotamarii A. ochraceus
Aflatoxin (B1, B2, G1, G2)
F. verticillioides (syn. F. moniliforme) F. proliferatum F. graminearum F. avenaceum F. culmorum F. poae F. acuminatum F. sambucinum F. sporotrichioides F. graminearum F. culmorum F. sporotrichioides P. verrucosum P. viridicatum
Fumonisin (B1, B2, B3)
Ochratoxin (Ochratoxin A)
A tip usúTrichothecenes T-2 toxin, HT-2 toxin, diacetoxyscirpenol B tipusú Trichothecenes Nivalenol, Deoxynivalenol, fusarenonX Zearalenone
Ochratoxin (Ochratoxin A)
A mikotoxinok káros hatásai Mikotoxin Aflatoxin
Ochratoxin
Fumonisin Trichothecének
Zearalenon
Egészségügyi hatás Májbetegségek (hepatotoxikus, hepatokarcinogén hatás); karcinogén és teratogén hatások; bevérzések (bélcsatorna, vese); csökkent növekedési erély; immunszupresszió Vese toxikus; karcinogén; enyhe májkárosodás; enteritisz; teratogén hatás; rossz táplálékhasznosítás; csökkent növekedési erély; immunszupresszió Tüdő ödéma; lovaknál leukoencephalomalacia; ideg- és májtoxicitás; immunszupresszió Emésztési rendellenességek, csökkent súlygyarapodás; vérzések; ödéma; bőrkiütések; vérképzési zavarok; meddőség; lassú növekedés; immunszupresszió Ösztrogén hatás; vulva ödéma ;méh nagyobbodás; petefészek atrófia; emlőmirigyek nagyobbodása; meddőség; abortusz
A háziállatok eltérő érzékenységet mutatnak a különböző mikotoxinokra: Aflatoxin - pulyka, DON, Zealarenon - sertés, juh, Fumonizin - ló
Mikotoxinok biotranszformációjára alkalmas mikroorganizmusok Mikroorganizmus Flavobacterium aurantiacum Aspergillus flavus Rhodococcus erythropolis Rhodococcus pyridinivorans Trichosporon mycotoxinivorans Pseudomonas putida ZEA-1 Rhodococcus erythropolis Norcardia globulera Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger Acinetobacter calcoaceticus Trichosporon mycotoxinivorans Exophiala pinifera Rhinocladiella atrovirens Bacterium sp.ATCC 55552 Comamonas sp. NCB 1492 Agrobacterium sp. Eubacterium sp. BBSH797 Butyrvibrio fibrisolvens Selenomonas ruminantium Anaerovibrio lipolytica Curtobacterium sp.
Vizsgált mikotoxin Aflatoxin
Zearalenon
Ochtratoxin A
Fumonizin
Deoxynivalenol T-2 toxin
Referencia Ciegler et al., 1966 Hamid and Smith, 1987 Alberts et al. 2006 Cserháti et al. 2008 Schatzmayr et al., 2006 Altahi and El-Deeb, 2009 Rood and Duvick, 1998 Vágvölgyi et al., 2005 Hwang and Draughon, 1994 Schatzmayr et al., 2006 Duvick et al., 1998
Benedetti et al. 2006 Shima et al., 1997 Binder et al., 1998 Westlake et al., 1987 Westlake et al., 1987 Ueno et al., 1983
Aratás utáni mikotoxin szint csökkentési lehetőségek (takarmányadalékok) Toxin
adszorpció: Lactobacillus-ok alkalmazása sejtfelszínen történő megkötésre Élesztőből preparált mannooligoszacharidok alkalmazása toxin megkötésre Toxinbontó mikrobák direkt alkalmazása: takarmányadalékkénti alkalmazás Nocardia corynebacteroides aflatoxinos csirketáp mentesítésre (Tejada-Castaneda et al. 2008) Nem specifikus enzimek : peroxidáz enzimek alkalmazása (nem specifikus enzim, 30-40%-os aflatoxin konverzió, igen nagy enzim igény - Das et al. 2000) A toxinbontás/inaktiválás kulcsenzimeinek izolálása és alkalmazása: Biomin Mycofix Plus Iránymutató a mikotoxin mentesítési eljárásokhoz (Jemme 1989) „a inaktiválja, elbontsa, eltávolítsa a toxint takarmányok mikotoxin-szennyezettségének irányuló eljárások során nemcsak csökkentésére ne maradjon toxikus bomlástermék a mikotoxinok, hanem az eljárás során tápanyagtartalom ne változzon esetlegesen keletkező metabolitok, bomlási termékek termék technológiai biológiai jellemzői hatását isne változzanak vizsgálni kell” (EFSA, kerüljön2010) többe mint a dekontaminálandó anyag
A MYCOSTOP projekt (NKTH, 2009.01.01-2011.09.30) biodegradációs-biomonitoring ágának célkitűzései
1. fázis: Immunokémiai, analitikai és biomonitoring módszerek adaptálása mikotoxinok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára, biológiai hatásuk elemzésére 2.fázis: mikotoxinok degradációjára alkalmas mikrobák keresése, molekuláris taxonómiai azonosítása (rhodococcus törzsek bioremediációs gyűjteményekből +referencia törzsek, minél szélesebb törzsgarnitúra ~215 törzs!) a toxindegradáció követése analitikai és ELISA rendszerekkel 3. fázis: biztonságos törzsek kiválasztása: olyan mikrobák szelekciója, melyek a bontás során nem termelnek citotoxikus, genotoxikus, EDC-hatású metabolitokat 4. fázis: mikotoxinbontó mikrobák alkalmazása hal, madár és emlős etetési tesztekben
1. fázis: Immunokémiai, analitikai módszerek adaptálása mikotoxinok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára Monitoring módszerek gabonák mikotoxinok szennyezettségének vizsgálatára direkt ELISA (Toxi Watch-kit, SofFlow Ltd.) Flow citometria (Fungiplex-kit: Multiplex mikrogyöngy alapú flow citometriai analitikai kit a mikotoxin szennyezettség szimultán detektálására (Aflatoxin-B1, Zearalenon, T-2 toxin, Ochratoxin-A, Fumonisin-B1) HPLC-FLD (Wessling Hungary Kft.) MS/MS (Szegedi Gabonakutató, Aflatoxin) indirekt Mikotoxinogén Aspergillus and Fusarium törzsek izolálása, tenyésztése és taxonómiai jellemzése A toxinogén törzsek real time PCR alapú meghatározása (DON, Tri13-gene)
Hazai gabonaminták mikotoxin szennyezettsége Mikotoxin szennyezettség µg/kg Minta
Időpont
kukorica 10.01.20
Hely Pomáz
AB1 OTA FB1
90
140
1,5
42
116
10.01.20
búza
10.08.25 Csongrád <0,1 <0,2
kukorica 10.03.25 Sárbogárd 89,2 Rétság
ZEA DON
12,4 <0,2 1020 <100
árpa
kukorica 10.07.06
T2
3,4
310 <100
<50 <100 3420 <100
106 6440 <100 1404
<0,1 <0,2
487
<50 <100 <10 <100
A gabonaminták 5%-a, ELISA tesztekkel vizsgálva, legalább egy mikotoxin esetén elérte a határértéket. Ezen minták 17%-a több mint két toxint tartalmazott a határérték felett. (2010)
Magyarországon izolált, aflatoxin B1 termelő Aspergillus flavus törzsek
1. fázis: Biomonitoring módszerek adaptálása mikotoxinok kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára A mikotoxinok biológiai hatásán alapuló monitoring rendszerek Citotoxicitás: Aliivibrio fischeri toxikológiai-teszt (AflatoxinB1, Zearalenon) Saccharomyces cerevisiae- biolumineszcencia alapú citotoxicitás teszt (BLYR) Genotoxicitás Escherichia coli SOS-Chromotest (AFB1) Hormonhatás Saccharomyces cerevisiae – biolumineszcens alapú riporter rendszer (Zearalenon) Zebra dánió vitellogenin - ELISA és vitellogenin realtime-PCR rendszer
Miért az aflatoxin volt az első leírt mikotoxin és mi közük van ehhez a pulykáknak? 1. Aflatoxin inaktiválása átlagosan szenzitív háziállatokban: AFB1
cytochromes P450 (CYP)
AFB1-8,9-epoxid
Glutation transzferáz
AFB1GSH
2. Aflatoxin inaktiválása pulykákban:
AFB1-8,9-epoxid
AFB1
AFB1GSH GST
CYP 1A
DNS-kötés, mutáció, toxicitás
1960 pulyka X-kór: az aflatoxin felfedezése
1. fázis: SOS-Chromo genotoxicitás teszt
Tesztszervezet: E.coli PQ37 A teszt elve: Genotoxinok beindítják az SOS-repair rendszert (sfiA) A tesztszervezet mutációs tulajdonsága: β-galaktozidáz strukrúrgénje (lacZ) az sfiA gén kontrollja alatt sfiA indukció mértékével arányosan történik a lacZ gén átírása Kolorimetriás mérés: A termelődő enzim megfelelő szubsztrát jelenlétében mérhető Metabolikus aktiválás → indirekt hatás Eredmények kifejezése: Indukciós faktor: Genotoxikus aktivitás az egyes koncentrációszinteken IF >1,5 genotoxikus
Határérték felett képes az AFB1 detektálására (5 ppb ↔ 78 ppb) Biodegradációs kísérletekben screening módszerként való alkalmazás
BLYES/BLYR hormonhatás elemzés Eukarióta tesztrendszert: Saccharomyces cerevisiae BLYES Ösztrogén hatás emelkedett biolumineszcenciát eredményez
LOEC**=0,031 EC50*=0,99
BLYR* Citotoxikus hatás csökkent biolumineszcenciát eredményez (*Tennessee University által fejlesztett)
Határértéknek megfelelően képes a ZEA kimutatására: 0,1–3 ppm ↔ 0,031 ppm Direkt élelmiszer és takarmány vizsgálat Biodegradációs kísérletekben screening módszerként való alkalmazás
1. fázis: Real Time PCR rendszer fejlesztése zearalenon hatásáára hím zebradánióban termelődő vitellogenin kimutatására Kezelés: 21 napos inkubálás akváriumban
relatív vitellogenin szint
100 ng/l 17β-estradiol (pozitív kontroll)
5,9 ng/ml
1 mg/l Zearalenon
321844 ng/ml
10 µg/l Zearalenon
1127 ng/ml
0,1 µg/l Zearalenon
1 ng/ml
A Real Time PCR-el kapott eredmények jól korrelálnak a korábbi ELISA módszerrel végzett mérések eredményeivel.
Ezzel az ELISA teszten alapuló kimutatásnál egy jóval olcsóbb rendszert hoztunk létre, amelyben a relatív expresszió szintje jobban tükrözi a kezelésben szereplő ösztrogén hatású anyag koncentrációját A vitellogenin (kék)/ β-aktin (piros) duplex RealTime PCR reakciók eredménye (VIC és TAMRA Taqman próbák)
2. fázis.: Mikotoxin-bontó mikrobák keresése
Vizsgált toxinok: Aflatoxin-B1 , Zearalenon, T-2 toxin, Ochratoxin, Fumonisin Bontási kísérlet 215 tesztelt mikroba törzs 2-4 ppm toxin, 3 napos inkubáció, folyékony tápoldat Toxin monitoring 24 órás mintavétel Bontási rendszerek értékelése: ELISA (SoftFlow) és HPLC (Wessling)
2. fázis: Rhodococcus törzsek mikotoxin-bontó képességének vizsgálata Zearalenon
Ochratoxin
T2-toxin
Aflatoxin B1
Soft Flow
Wessling
Soft Flow
Wessling
Soft Flow
Wessling
Soft Flow
Wessling
%
%
%
%
Faj
strain
%
%
%
%
R. erythropolis
Ak-35
0
3
0
-
89
99
100
R. globerulus
AK-36
0
1
0
-
90
99
100
R. pyridinivorans
AK-37
61
67
22
-
0
98
99
R. pyridinivorans
K408
87
98
42
-
99
99
R. aetherivorans
AK 44
55
39
29
-
69
94
94
R. rhodochrous
ATTC 12
26
0
-
95
96
99
R. erythropolis
DSM 4306
17
2
-
95
95
100
R. erythropolis
DSM 743
11
0
-
96
70
70
R. coprophilus
N774
38
0
-
95
55
57
R. ruber
N361
58
R. gluberulus
N58
56
R. erythropolis
NI1
60
2
69
34
-
4
-
1
-
62
88
45
AflatoxinB1
OchratoxinA
Zealarenon H
CH3
45
95
45
45
95
99
99
O
CH3
H
O O
H3C
Nyolc fajba tartozó, 32 rhodococcus törzset vizsgáltunk A R. erythropolis NI1 törzs egyszerre három különböző mikotoxin bontására is képes: Zearalenon, T-2 és Aflatoxin-B1
O
O
O CH3
H3C
O H
O
T-2 toxin
O
CH3
2. fázis: Nem Rhodococcus törzsek mikotoxin-degradációs képessége (28 törzs) nemzetség
fajok
Zea
Ochra
T2
AFB1
Pseudomonas
6
1
0
0
6
Streptomyces
5
1
0
3
4
Chryseobacterium
3
0
0
0
3
Cupriavidus
2
0
2
1
2
Pseudoxanthomonas
2
2
0
1
2
Paracoccus
2
0
0
0
2
Microbacterium
2
0
0
2
2
Raoultella
1
0
0
0
0
Serratia
1
0
0
0
1
Sphingopyxis
1
0
1
0
1
Ochrobactrum
1
0
0
0
1
Gordonia
1
0
0
0
1
Arthrobacter
1
0
0
0
1
piros: >95% degradáció (Cupriavidus basiliensis Őr16: 99%!) sárga: >66% degradációáció
3. fázis :Aflatoxin-B1 degradációra képes mikrobák szelekciója kombinált toxikológiai profil alapján <50% bontás 50-90% bontás >90% bontás További biodetoxifikációs eljárásokhoz leginkább alkalmas: Genotoxicitás Genotoxicitás IF>1,5 Genotoxicitás megszűnt • Rhodococcus sp.Citotoxicitás NI2 IF>3 nem (NI2, K403C, DN1) • Pseudomonas sp.tapasztaltunk DN1 Citotoxicitás: Citotoxicitás nem tapasztaltunk (K14, UA58, ZV6, TN5) Gátlás >50% (NI2, K402, ZS1, FEH28, DN1, KÖ5) 4,5 3,5 100 2,5 50
1,5 0,5
0 -0,5 -50
-1,5
-2,5
Indukciós Faktor IF > 1,5 genotoxikus
-100 -3,5
Az AFB1 degradációs kísérletbe vont mikroszervezetek toxinbontásából származó minták
DN1 NI2
K403C
K405
K402
K406
K408
AK35
BRB1AB
GD2B
FEH28
EL1
ATTC 12674
K404
ZS1
KÖ5
AK36
H4
J4
NZS6
N11
GD2A
TN4
NZS9
TN5
ZV6
UA58
K2
K14
AK 42
AK 37
N58
-4,5 N361
-150
Kontroll
Biolumineszcencia gátlás (%)
Krifaton et al (2012): Analysis of aflatoxin-B1-degrading microbes by use of a combined toxicityDegradációs potenciál profiling method. Mutation >90% 50-90 %research 2011;726(1):1-7. <20% 150
A. fischeri teszt (10 h) A. fischeri teszt (15 h) SOS-Chromo teszt
ELISA teszt keresztreakciók (Soft Flow) zearalanonEDC (138 %) 3. fázis: Zealarenon degradációra képes, minimális maradék α-zearalenol (91%) hatást mutató mikrobák szelekciója BLYES-teszttel β-zearalenol (21%) HPLC
26,24
27,12
54,70
61,14
75,95
86,96
87,85
90,93
93,63
ELISA
19,92
30,64
54,60
63,02
70,93
82,69
85,39
93,00
93,02
α-zearalanol 98,20 98,20 (69%) 98,53 β-zearalanol (6%) 78,89
97,70
92,99
További 0,88 biodetoxifikációs eljárásokhoz leginkább alkalmas: HPLC-ELISA: • Rhodococcus sp. K402, K404 Jó (50-90) • Streptomyces sp. K14
Krifaton et al (2012): Application of a yeast estrogen reporter system for screening zearalenone degrading microbe, J. Haz.Mat (subm)
3. Fázis: Rhodococcus pyridinivorans zearalenon-bontó képességének vizsgálata patkányon, uterotropikus bioassay módszerrel ■ ■
■
OECD Guideline 440 (Uterotrophic Bioassay in Rodents) 18 napos (választás előtti) nőstény Wistar patkányok (MTA-KOKI Orvosi Géntech. Részleg) Marker: uterus tömege
I. ZEARALENON DÓZIS-HATÁS VIZSGÁLAT kontroll: tiszta olivaolaj
E2: 17-ösztradiol (pozitív kontroll) 0,04 mg/kg bw
Zearalenon több dózisban 0,1 ; 1 ; 5 ; 10 mg/kg bw
Eredmények: Szignifikáns hatás uterus tömegére: -E2 -Zearalenon 5 mg/kg ; 10 mg/kg *A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással.
4
***
***
3,5 Uterus tomeg/testtomeg
Normált uterus tömeg
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
CON
***
ZON 0,1 mg/kg ZON 1 mg/kg ZON 5 mg/kg ZON 10 mg/kg E2
3. Fázis: Rhodococcus pyridinivorans zearalenon-bontó képességének vizsgálata patkányon, uterotropikus bioassay módszerrel II. BIODEGRADÁCIÓ-VIZSGÁLAT:
■ ■
kontroll: LB tápoldat LB tápoldat + 5 ppm zearalenon Biodegradáció: R. pyridinivorans K408 (5 nap inkubáció, 28 ◦C-on, 180 rpm aeráció)
3 Uterus tomege/testtomeg
■
Normált uterus tömeg
2,5 2 1,5 1
** CON Bontott ZON ZON
0,5 0
Eredmények: ■
Zearalenon bontási hatékonyság (HPLC-analitika) alapján a 87%
■
A BLYES rendszerben a bioluminescencia az ötödik napra 84%-al csökkent a hígítatlan rendszerben
■
Szignifikáns hatás uterus tömegére:
A Zea-biodegradáció követése BLYES-teszttel
Zearalenon kontroll
*A testtömeg-növekedésre egyik kezelés sem volt hatással.
Kriszt etal 2012: A New Zearalenone Biodegradation Strategy Using Non-Pathogenic Rhodococcus pyridinivorans K408 Strain PloS one 2012;7(9):e43608.
4. fázis: Etetési tesztek aflatoxin tartalmú és biodetoxifikált kukoricával Kontaminált takarmány AFB1 konc beállítása: 0,93ppm
Biodetoxifikált takarmány AFB1: 0,17ppm
Aspergillus flavus ZT80 ~10ppm AFB1 termelés
Kontroll AFB1: 0,0 ppm
R. pyridinivorans AK37 Szilárd fázisú fermentáció, 40% nedvességtartalom, 4 nap inkubáció 28 ◦C-on
4. fázis: Brojlercsirke etetési teszt Takarmány Kontrol AFB1 tartalmú (0,93ppm) Biodetoxifikált (0,17ppm)
Tettömeg (g) Elhullás start 3. hét 50
590
1/30
50
454
4/30
50
582
1/30
*a vörös szín szignifikáns különbséget jelez (P0,05)
Brojler csirkék állapota az etetési kísérlet végén. *Balra az Aflatoxinos takarmányon, jobbra a biodetoxifikációval kezelt takarmányon nevelt csirkék láthatóak. A tömegkülönbségen kívül szembeötlő az egészségi állapotban, fittségben, a csüd és a taraj színbeli különbözőségében megnyilvánuló eltérés a biodetoxifikált takarmányt fogyasztó állat javára.
4. fázis: Ponty etetési teszt
Takarmány
Elhullás
Kontroll 1: kukorica
0%
Kontroll 2: kukorica + baktérium
0%
AB1 tartalmú kukorica
20± 8%*
Biodetoxifikált kukorica
2± 2%
Májról készült szövettani metszetek fényképei A: Kontroll kukorica tiszta B: Kontroll kukorica+ bakt C: Kezelt Aflatoxin B1+ bakt D: Aflatoxin B1
AFB1 (felül) és biodetoxifikált kukorica (alul) mintával etetett pontyok húsfelszínéről készült felvétel
Aflatoxin B1 termelő Aspergillus flavus törzsek magyarországi megjelenésének igazolása tandem MS és genotoxicitás vizsgálatokkal
*MS/MS és ion-kromatogram képek az A. flavus ZT55 aflatoxinjáról A=aflatoxin B2, B= aflatoxin B1 (Szegedi Egyetem Microbiológia Tanszéke, Gabonakutató Nonprofit Kft, Szeged) Dobolyi et al. (2011): Identification of aflatoxin producing Aspergillus flavus strains originated from maize kernels. Növényvédelem, 47(4):125-133.
Aspergillus törzsek által fertőzött kukoricaminták
(5.fázis) További célkitűzések: az Aflatoxin és a Zearalenon metabolizmusának kutatása ■
■
■
Sikeres de novo genom projektet indítottunk az Aflatoxin és zearalenon bontó R. pyridinivorans AK37 törzsünkből (genom méret 5,27 Mbp) Aflatoxin és pchratoxin Cupriavidus basilensis ŐR 16 törzsünkből (genom méret 8,55 Mbp) A japán AIST intézettel közösen transzpozon mutagenezis könyvtárat készítünk e törzsből, majd a null-mutánsok keresését SOS-Chromotest-el és BLYES rendszerrel végezzük. A kulcs gének azonosítása után mód nyílhat az enzimek expressziójára és egy potenciális mikotoxin detoxifikáló takarmány adalék kifejlesztésére is
Cserháti et al (2012): De novo genome project of Cupriavidus basilensis OR16 J Bacteriol. 194(8):2109-10 Kriszt et al (2012): De Novo Genome Project of the Aromatic Degrader Rhodococcus pyridinivorans Strain AK37., J Bacteriol 194: (5) pp. 1247-1248.
Köszönöm a figyelmet!
