DAFTAR PUSTAKA Ahn, M.Y., Hahn, B.S., Ryu, S.K., Hwang, S.J., Kim, Y.S., (2005), Purification and characterization of a serine protease (CPM-2) with fibrinolytic activity from the dung beetles, Arch. Pharm. Res , 28, 816–822. Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Strayer, L., (2002), Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman and Florida, 370–373. Bhagavan, N.V., (2002), Medical Biochemistry, Harcourt Academic Press, California, 840– 870. Bhattacharjee, G., Chaudhuri, PS., (2002), Cocoon production, morphology, hatching pattern and fecundity in seven tropical earthworm species – a laboratory-based investigation, J. Biosci., 27, 283–294. Bolger, M.B., (2001), Three-dimensional structure of fibrolase, the fibrinolytic enzyme from southern copperhead venom, modeled from the X-ray structure of adamalysin II and atrolysin C, AAPS Pharmsci, 3, 1–13. Deutscher, M.P., (1990), Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., California, 285–291. Dong, G.Q., Yuan, X.L., Shan, Y.J., Zhao, Z.H., Chen, J.P dan Cong, Y.W., (2004), Molecular cloning and characterization cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from eartworm Eisenia foetida, Acta Biochim. Biophys. Sin., 36 (4), 303–308. Edwards, C.A., Dominguez, J,. Nenhanser,. E.F, (1998), Growth and reproduction of P. excavatus (Megascolecidae) as factors organic waste management, Biol. Fertil. Soils, 27,155–161. Edward., C.A., dan Lofty, J.R., (1972) Biology of earthworm. Chapman nad Hal Ltd:London, 1–36 Elyani, N., (2005), Deteksi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus, Tesis, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. Fan, Q. Wu, C,. Li., Fan, R., WU, C., Hou, Q., He, R., (2001), Some feature of instestinal absorbtion of intact fibrinolytic enzyme III-1 from L. rubellus, Biochem. Biophys. Acta, 1526, 286–292. Fersht, A., (2000), Structure and mechanism in protein science, 3rd Edition, W.H Freeman and Company, New York, 224 – 228. Fulyani, F., (2006), Identifikasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus, Skripsi, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. Hardiany, A., (2002), Identifikasi enzim fibrinolitik cacing tanah Pheretima sp dengan zimografi, Tesis, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung.
37
Mihara, H., Sumi, H., Yoneta, T., Mizumoto, H., Ikeda, R., Seiki, M., Maruyama, M., (1991), A Novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus, Jpn. J. Physiol, 41, 461–472. Nakajima,N., Mihara, N., Sumi, H., (1993), Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus, Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1726–1730. Nakajima, N., Sugimoto, M., Ishihara, K., (2003), Earthworm-serine protease: characterization, molecular cloning, and application of the catalytic function, J. Molec. Catal., 23, 191–212. Nurachman, Z., Hermawan, J., Racmayanti, Y., Bardja, L., (2003), A simple way to visualize fibrinolysis in the classroom, Biochem. Mol. Bio. Edu., 31, 16–18. Murray, R.K.,Garner, D.K., Mayes, P.A., Rodwel, V.W., (1992), Biokimia Harper. Edisi 24. CV. EGC, Jakarta. Mathews, C.K., van Holde, K.E., Ahrn, K.G., (2000), Biochemistry, 3rd Ed., AddisonWesley, Pub. Comp., San Fransisco, 374–375. Pechenick, (2005), Biology of the Invertebrates, 5th Ed., McGraw Hill International, New York, 302–305. Sahlan, M., (2002), Eksplorasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah Pheretima sp galur local, Skripsi, Departemen Kimia, Institut Teknologi Bandung. Smith, E.T., (1991), Exploring Biology, 5th Ed., Harcourt Brace & Word Inc., London Stephenson, J., (1930), The Oligochaeta, Oxford University Press, Oxford. Scopes, K., (1994), Protein purification : Principle and Practice,3rd Ed., Springer, New York. Tao, G., Sun., Z.J., Fu, S. H., Liang, G. D., (2005), Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris, Prot. Expr. Purif., 42, 20–28. Wallwork, J.A., (1920), Ecology of soil animals, Mc Graw-Hill, London. Webb, J., Thompson, C., (1992), Trombolysis for acute myocardial infraction, Can. Fam. Physician, 38, 1415. Wiseman, A., (1986), Handbook of enzyme biotechnology, 2nd Ed., John Willey & Sons, New York, 26–34. Yang, J.S., Ru, B.G., (1997), Purification and characterization of an SDS-actived fibrinolytic enzyme from Esenia fetida, J. Comp.Biochem. Physiol, 118B, 623–637.
38
LAMPIRAN A Penentuan Kadar Protein Enzim A.1 Kurva Standar BSA (dibaca pada A595) No
BSA standar (mg/mL)
A1
A2
A3
Arata-rata
1
2
0,096
0,152
0,130
0,126
2
4
0,280
0,267
0,280
0,262
3
6
0,373
0,386
0,367
0,375
4
8
0,471
0,444
0,532
0,482
5
10
0,665
0,585
0,610
0,620
Kurva Standar BSA 0.7 0.6 0.5
A
0.4
y = 0.0604x + 0.0106
0.3
2
R = 0.998
0.2 0.1 0 0
2
4
6
8
10
12
Konsentrasi BSA Dari kurva tersebut dihasilkan persamaan garis y = 0,0604x + 0,0106 yang dipakai untuk perhitungan kadar enzim,
39
A. 2 Perhitungan Kadar Protein Sampel Perhitungan kadar protein pada sample dilakukan menggunakan persamaan yang didapatkan dari aluran kurva standar, Dengan memperhitungkan faktor pengenceran, diperoleh hasil sebagai berikut: Konsentrasi
A595 nm Sampel Ekstrak kasar Filtrasi gel
pengujian
Faktor
Konsentrasi
pengenceran awal (mg/mL)
A1
A2
A3
Arata-rata
0,345
0,364
0,371
0,360
5,78
2000
11,6
0,673
0,631
0,643
0,649
10,6
20
0,21
(μg/mL)
Konsentrasi Awal
Volume Total
Protein Total
(mg/mL)
(mL)
(mg)
Ekstrak Kasar
11,6
50
580
Hasil Filtrasi
0,21
135
28,4
Sampel
40
LAMPIRAN B Penentuan Aktivitas Enzim B. 1 Kurva Uji Azokaseinolitik Ekstrak Kasar Enzim Waktu (menit) 10 20 30 40
A1
A2
A3
0,187
0,189
0,190
0,184
0,185
0,189
0,423
0,423
0,420
0,404
0,403
0,403
0,592
0,591
0,597
0,595
0,600
0,599
0,773
0,768
0,776
0,774
0,773
0,781
Arata-rata 0,187 0,412 0,596 0,774
Uji Aktivitas Azokaseinolitik Ekstrak Kasar Enzim 0,9 0,8 Absorbansi
0,7 0,6 0,5
y = 0,0194x + 0,0066 2 R = 0,9967
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
10
20
30
40
50
Waktu (Menit)
41
B. 2 Kurva Uji Azokaseinolitik Hasil Filtrasi Gel Waktu (menit) 10 20 30 40
A1
A2
A3
0,312
0,320
0,314
0,283
0,288
0,287
0,577
0,565
0,570
0,517
0,517
0,522
0,804
0,809
0,809
0,775
0,786
0,781
0,925
0,936
0,939
0,944
0,953
0,961
Arata-rata 0,300 0,544 0,794 0,943
Uji Aktivitas Azokaseinolitik Enzim Hasil Filtrasi Gel 1,2
Absorbansi
1 0,8 0,6 y = 0,0218x + 0,1015 2 R = 0,9883
0,4 0,2 0 0
10
20
30
40
50
Waktu (menit)
42
B. 3 Perhitungan Analisis Pemurnian Enzim Unit aktivitas (U) didefinisikan sebagai perubahan absorban sebesar satu satuan yang terjadi per jam per mL sample. Dari kurva dihasilkan persamaan garis y = ax + b, dimana gradien garis merupakan fungsi perubahan absorbansi terhadap waktu (menit) m = dA/dt, sehingga U = (dA/dt) × 60 × fp × 1/mL, fp = faktor pengenceran Maka didapatkan hasil sebagai berikut : Sampel
dA/dt
Faktor pengenceran
Unit aktivitas (U)
Ekstrak kasar
0,0194
1000
1164
Filtrasi gel
0,0218
40
52,3
Aktivitas total enzim didapatkan dari hasil kali unit aktivitas dengan volume total enzim. Sedangkan yield dihitung dari perbandingan aktivitas total ekstrak kasar enzim dengan enzim hasil filtrasi gel. Aktivitas total
Sampel
Unit Aktivitas (U)
Volume total (mL)
Ekstrak kasar
1164
50
58200
100
Filtrasi gel
52,3
135
7063
12
(U mL)
Yield (%)
Aktivitas spesifik enzim adalah hasil bagi dari aktivitas total enzim dengan proteim total. Kelipatan pemurnian didapatkan dari hasil perbandingan aktivitas spesifik antara enzim hasil filtrasi gel dengan ekstrak kasarnya. Aktivitas total
Aktivitas spesifik
(U mL)
(U mL/ mg)
580
58200
100
1
28,4
7063
249
2,5
Sampel
Protein total (mg)
Ekstrak kasar Filtrasi gel
Kelipatan pemurnian
43
LAMPIRAN C Optimasi Suhu dan pH Unit aktivitas (U) pada pengujian optimasi pH dan suhu ini didefinisikan sebagai besarnya perubahan absorbansi sebesar satu satuan. Aktivitas enzim pada pengujian optimasi pH dan suhu ini didefinisikan sebagai besarnya perubahan absorbansi sebesar satu satuan per menit per mL enzim.
Unit aktivitas (U)
=
(Arata-rata – Ablanko) (treaksi – t0)
Aktvitas enzim
=
U × fp × 1/mL
C. 1 Optimasi Suhu Aktivitas relatif merupakan perbandingan dari unit aktivitas berbagai suhu dengan unit aktivitas pada suhu 55oC. Aktivitas
Suhu (oC)
A1
A2
A3
Arata-rata
34
0,414
0,415
0,434
0,421
0,842
31
40
0,620
0,636
0,736
0,664
1,328
48
47
0,949
0,959
0,917
0,940
1,881
68
50
1,069
1,073
0,990
1,044
2,088
75
54
1,148
1,159
1,132
1,146
2,292
83
55
1,367
1,378
1,390
1,378
2,756
100
56
1,331
1,350
1,312
1,331
2,662
96
59
1,214
1,187
1,127
1,176
2,352
85
62
0,979
1,128
1,100
1,069
2,138
77
(U/menit/mL)
Aktivitas relatif (%)
44
Kurva Optimasi Suhu 120
Aktivitas relatif (%)
100 80 60 40 20 0 30
35
40
45
50
55
60
65
suhu
C. 2 Optimasi pH Aktivitas relatif pada pH merupakan perbandingan dari nilai unit aktivitas enzim pada berbagai pH dengan unit aktivitas enzim pH 8. Aktivitas
Aktivitas
(U/menit/mL)
relatif (%)
0,151
0,015
14
0,351
0,377
0,038
36
0,950
0,992
0,967
0,098
91
1,043
1,006
1,043
1,031
0,103
97
8
1,063
1,063
1,070
1,065
0,107
100
9
1,263
1,315
1,210
1,262
0,126
118
10
1,264
1,130
1,009
1,134
0,113
106
11
1,130
1,124
1,136
1,130
0,113
106
12
1,09
1,084
1,123
1,099
0,109
103
pH
A1
A2
A3
Arata-rata
4
0,164
0,137
0,152
5
0,383
0,397
6
0,961
7
45
Kurva Optimasi pH 140
Aktivitas relatif (%)
120 100 80 60 40 20 0 4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
46
