Metody v histologii Mikroskop 2013 Vj. 4
Organizace praktických cvičení
Příprava histologického preparátu Mikroskop Barvicí metody Práce s mikroskopem (preparáty)
Oraganizace praktických cvičení Prezence Vstupní test (pětiminutovka) Pracovní sešit nutný!!! Prohlížení preparátů v mikroskopu (Opakování- popis elektronogramů nebo preparátů, případně náhrada zrušených praktik)
Zobrazení živých buněk
Jednobuněčné organismy
Mnohobuněčné organismy: gamety, krvinky, buňky z tkáňových kultur
Pozorování buď speciálním mikroskopem (fázový kontrast) nebo po barvení supravitálními barvivy
Zobrazení živých buněk
Odběr
Odběr tkání a buněk:
Ze živého organismu (BIOPSIE) Z mrtvoly (NEKROPSIE) Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA) Blok tkáně pro fixaci ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm3
Fixace
Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů.
Fyzikální metody:
Teplo (mikrovlnná trouba) Zmražení (tekutý dusík – 170 oC)
Chemické metody:
Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) Perfuzní (nástřik cév)
Chemická fixace Aldehydy
Formaldehyd, glutaraldehyd
Alkoholy
Methanol, ethanol
Kyseliny
Kyselina octová, trichloroctová, pikrová
Soli těžkých kovů
Chlorid rtuťnatý, oxid osmičelý,dvojchroman draselný
Fixační tekutiny Formaldehyd 4% Bouinova tekutina
trinitrofenol, formol, kys.octová
Susa
chlorid rtuťnatý, chlorid sodný, kys.octová, kys.trichloroctová, formol Zenkerova tekutina chlorid rtuťnatý, dvojchroman draselný,síran sodný, kys. octová Carnoy ethanol, chloroform, kys.octová Methacarn
Methanol, chloroform, kys.octová
Zalévání a krájení
Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích médií (parafin, celloidin). Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň „projasní“.
Zalévání
V malém množství se tkáň prosycuje parafinem v kádinkách v termostatu Pro provoz na patologii slouží přístroje na automatické zalévání
Přístroj na zalévání
Krájení
Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk, tedy m. Tkáň je pak průhledná a „dobře čitelná“ Přístroje, které se k tomu užívají se jmenují mikrotomy. Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin
Mikrotom
Mikrotomové nože
Barvení Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání. Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin. Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.
Barvení
Z řezů je třeba odstranit parafin a znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit. Většina barviv je rozpustných ve vodě.
Přístroj na barvení
Trvalý preparát Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského balzámu ( má stejný lom světla jako sklo) nebo umělých pryskyřic Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT
Postup Parafínové řezy
Kryostatové řezy
Fixace
Zmražení při – 170 oC
Vypírání Odvodnění řadou alkoholů Prosycení rozpouštědlem Zalití do parafínu Krájení
Krájení v kryostatu
Nalepení řezů na podložní sklo
Nalepení řezů na podložní sklo
Odparafínování a zavodnění
Někdy krátká fixace
Převedení do vody Barvení, histochemická reakce
Zejména histochemické reakce
Odvodnění a projasnění
Někdy odvodnění a projasnění
Montovací medium zpravidla bezvodé
Bezvodé medium nebo glycerin -želatina
Mikroskop
Stativ
Mikrometrický šroub
Optický systém:
Okuláry Objektivy Kondenzor Zdroj
Rozlišovací schopnost
Rozlišovací schopnost je nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty.
Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 m.
Barvení
Přehledná
Hematoxylin eosin Massonovy trichromy Weigert van Gieson Heidenhainův železitý hematoxylin
Selektivní
Weigert resorcin fuchsin Impregnace stříbrem
Hematoxylin - eosin
Hematoxylin barví kyselé součásti buňky (bazofilní struktury) – DNA, RNA, tj. jádro, jadérko, ribozomy a granulární endoplasmatické retikulum Eosin barví zásadité struktury buňky (acidofilní, eosinofilní) – což jsou hlavně proteiny, tj. cytoplasmu, mitochondrie, hladké endoplasmatické retikulum,a kolagen v mezibuněčné hmotě
Hematoxylin - eosin
AZAN
Azokarmín barví jadra červeně Anilínová modř barví kolagenní vlákna a mucin modře Oranž G barví cytoplasmu buněk a svaly oranžově Erytrocyty jsou červené
AZAN
Weigert – van Gieson
Weigertův hematoxylin barví jádra šedě
Saturnová červeň (nebo kyselý fuchsin) barví kolagenní vlákna červeně
Kyselina pikrová barví cytoplasmu buněk a svalovinu žlutě
Weigert van Gieson
Nalepení řezů na podložní sklo
Weigert - van Gieson
Hematoxylin - eosin
Weigert-van Gieson
Zelený Massonův trichrom
Hematoxylin barví jádra modře až černě
Kyselý fuchsin barví svalovinu červeně
Světlá zeleň barví kolagenní vlákna zeleně.
Erytrocyty jsou červené
Zelený Massonův trichrom
AZAN
Žlutý Massonův trichrom
Hematoxylin barví jádra modře až černě
Erythrosin barví svalovinu červeně
Šafrán (Tuchechtgelb) barví kolagenní vlákna žlutě
Erytrocyty jsou červené
Žlutý Massonův trichrom
Weigert resorcin - fuchsin
Resorcin fuchsin barví elastická vlákna fialově
Selektivní barvení na elastiku
Weigert resorcin - fuchsin
Heidenhainův železitý hematoxylin
Heidenhainův železitý hematoxylin barví nejen jádra ale i cytoplasmu šedo-černě.
Používá se pro barvení svalů a v parazitologii na průkaz parazitů (červů) v tkáních
Heidenhainův železitý hematoxylin
Impregnace stříbrem
Stříbro barví kolagenní a retikulární vlákna hnědě až černě.
Impregnace stříbrem se používá i pro barvení neuronů a glie v neurohistologii.
Impregnace stříbrem
Kresylvioleť
Kresyl violeť barví DNA a RNA v buňce fialově. Znázorní tedy jádro, jadérko, granulární endoplasmatické retikulum (Nisslovu substanci) v neuronech
Kresylvioleť
Kresylvioleť
Výsledky barvicích metod Barvení
Barvivo
Jádro
Kolagen
Elastika
Svaly
Poznámka
Hematoxylin-eosin
Hematoxylin Eosin
modré až černé
růžový
růžové
Weigert – van Gieson
Weigertův hematoxylin Saturnová červeň Trinitrofenol
hnědé
červený
žluté
místo Saturnové červeni se používá také kyselý fuchsin, žluté -vše kromě kolagenu
AZAN
Azokarmín Anilínová modř Oranž G
červené
modrý
oranžově červené
červené - erytrocyty modrý - mucin
Modrý Massonův trichrom
Hematoxylin Kyselý fuchsin Anilínová modř
modré až černé
modrý
červené
červené - erytrocyty modrý - mucin
Žlutý Massonův trichrom
Hematoxylin Erytrosin Šafrán
modré až černé
žlutý
červené
červené – erytrocyty možno použít i kyselý fuchsin a Tuchecht gelb
Zelený Massonův trichrom
Hematoxylin Kyselý fuchsin Světlá zeleň
modré až černé
zelená
červené
červené - erytrocyty
Weigertův resorcinfuchsin
Resorcin Fuchsin
Impregnace Ag
AgNO3
šedo-černé
retikulární vlákna - černá
Heidenhainův železitý hematoxylin HŽH
Heidenhainův železitý hematoxylin
fialová hnědý hnědé až černé
šedo-černé
Co je třeba umět?
Co je to fixace? Proč a jak se dělá. Jak se připraví preparát – přehled. Základní barvení. Jak se co obarví. Proč se používají různá barvení? Barvení hematoxylinem – eosinem. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu
