Metodika využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene

www.vurv.cz

Metodika využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene Vypracovaná jako výstup projektu č. QE 1107 “Tvorba a využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene” řešeného v rámci specifického programu výzkumu a vývoje Ministerstva zemědělství “Program III”.

Foto 1 – Pokusné a šlechtitelské parcelky ozimého ječmene – Lužany 2001 Zpracováno a publikováno k 30. listopadu 2003 řešitelským kolektivem SELGEN a.s. Praha a VÚRV Praha-Ruzyně pod vedením Pavla Maříka (ŠS Lužany) Metodika využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene. Výstup projektu MZe ČR č. QE 1107 “Tvorba a využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene“ Pavel Mařík a kolektiv. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby a Selgen a.s., Praha 2003 ISBN: 80-86555-35-6 Obsah: 1. Úvod 2. Metodiky jednotlivých cílů a metod:

2.1. Hodnocení rezistence vůči virózám 2.1.1. Testování na odolnost žluté zakrslosti ječmene 2.1.1.1. Testování rezistence k BYDV v polních infekčních testech 2.1.1.2. Testování rezistence k BYDV za použití molekulárního markeru Ylp etekujícího Yd2 gen 2.1.2. Testování na odolnost žluté mozaice ječmene 2.1.2.1. Testování resistence k BaYMV v infekčních testech v Německu 2.1.2.2. Testování rezistence BaYMV za použití mikrosatelitního markeru BMac29 detekujícího geny rym4 a rym5 2.2. Hodnocení rezistence vůči abiotickým stresům 2.2.1. Testování na odolnost stresům zimního období 2.2.1.1. Polní testy 2.2.1.2. Provokační testy - zimovzdornost - mrazuvzdornost 2.2.2. Testování na odolnost stresům sucha 2.2.2.1. Polní testy 2.2.2.2. Provokační testy – nádobové 2.3. Homogenizace šlechtitelského materiálu 2.3.1. Klasický výběrový postup 2.3.1.1. Rodokmenová metoda s výběrem klasů či rostlin 2.3.2. Homogenizace za pomoci dihaploidizace 2.3.2.1. Použití prašníkových kultur in vitro 2.4. Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu 2.4.1. Sledováním morfologických znaků 2.4.1.1. Sledováním morfologických znaků a fyziologických vlastností v polních testech 2.4.2. Sledováním bílkovinných genetických markerů 2.4.2.1. Elektroforetická analýza hordeinů ve sloupečcích škrobového gelu 2.4.2.2. Elektroforetická analýza hordeinů v polyakrylamidovém gelu 2.4.2.3. Elektroforetická analýza alel esterázových lokusů Est-1, Est-2, Est-4 a Est-5 v polyakrylamidovém gelu 2.4.3. Pomocné metody 2.4.3.1. Testování specifické odolnosti k padlí 2.5. Testování dalších hospodářských vlastností 2.5.1. Sledování odolnosti houbovým chorobám 2.5.1.1. V polních podmínkách 2.5.1.2. Laboratorními infekčními testy ( Padlí travní, Hnědá skvrnitost ) 2.6. Získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů 2.6.1. Prostřednictvím genové banky 2.6.1.1. Získávání, testování, popisování, dlouhodobé ukládání, obnovování sortimentu 2.6.1.2. Režimy poskytování 2.6.2. Na šlechtitelských pracovištích 2.6.2.1. Získávání, testování, popisování, krátkodobé ukládání, obnovování sortimentu 2.6.2.2. Režimy poskytování 3. Zhodnocení jednotlivých metod použitých pro řešení dílčích cílů 3.1. Cíl 1. - Testování na odolnost žluté zakrslosti ječmene 3.1.1. Použité metody 3.1.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.1.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.1.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.2. Cíl 2. - Testování na odolnost žluté mozaice ječmene 3.2.1. Použité metody 3.2.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.2.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.2.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.3. Cíl 3. - Testování na odolnost stresům zimního období 3.3.1. Použité metody 3.3.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.3.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.3.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.4. Cíl 4. - Testování na odolnost stresům sucha 3.4.1. Použité metody 3.4.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.4.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.4.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.5. Cíl 5. - Homogenizace šlechtitelského materiálu 3.5.1. Použité metody 3.5.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost

3.5.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.5.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.6. Cíl 6. - Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu 3.6.1. Použité metody 3.6.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.6.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.6.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.7. Cíl 7. - Sledování odolnosti houbovým chorobám 3.7.1. Použité metody 3.7.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.7.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.7.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 3.8. Cíl 8. - Získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů 3.8.1. Použité metody 3.8.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost 3.8.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod 3.8.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení 4. Zakomponování perspektivních metod do klasického výběrového postupu 5. Závěr

Foto 2 – perspektivní typ ozimého ječmene – bezosinný s dlouhým volným klasem a odolností BYDV 1. Úvod Ve šlechtění ozimého ječmene byly dosud využívány převážně pouze standardní metody, postupy vytvářené a využívané aplikovaným výzkumem byly ve šlechtitelských programech využívány jen sporadicky. Naopak výzkumná pracoviště používala většinou k vytváření a ověřování nových metod rostlinný materiál nevhodný k přímému šlechtitelskému využití. Teprve projekt QE1107 umožnil propojit aktivity šlechtitelských a výzkumných týmů za společným cílem – využití perspektivních metod a optimalizace postupů pro jejich účelné zakomponování do výběrového postupu šlechtění ozimého ječmene. 2. Metodiky jednotlivých cílů a metod

2.1. Hodnocení rezistence vůči virózám 2.1.1. Testování na odolnost žluté zakrslosti ječmene

Foto 3 – Ječmen ozimý – podzimní infekce BYDV - ÚKZÚZ Brno - Chrlice 2002 2.1.1.1. Testování rezistence k BYDV v polních infekčních testech Ing. Jana Chrpová, CSc., VÚRV Podstata metody U vybraných materiálů (novošlechtění a zdroje do křížení) je sledována reakce na infekci virem žluté zakrslosti ječmene (BYDV). Virus je persistentně přenosný 25 druhy mšic. U nás jsou nejdůležitějšími vektory Rhopalosiphum padi, Sitobion avenae a Methopolophium dirhodum. Virus má několik kmenů, které se od sebe liší patogenitou a specifičností přenosu vektory. Na území ČR je převážně rozšířen silně patogenní kmen PAV (VACKE., 1988). Pro hodnocení odolnosti je třeba, aby došlo k časnému přenosu (ve fázi dvou až tří listů), který umožní silný rozvoj choroby, při které lze posoudit genetický potenciál sledovaných materiálů. Shrnutí základních praktických postupů Reakce na infekci virem žluté zakrslosti ječmene (BYDV) je studována v maloparcelkových polních pokusech u vybraných materiálů ječmene ozimého. K přenosu slouží mšice Rhopalosiphum padi ze skleníkových chovů, jejichž reprodukce a infekce probíhaly podle metodiky modifikované ve VÚRV (Vacke et al., 1996). U testovaných materiálů jsou za vegetace studovány symptomatické projevy podle stupnice, kterou vyvinuli Schaller a Qualset (1980). Po sklizni je případně zjišťován vliv viru na výnosové prvky. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Vzhledem k tomu, že testy rezistence probíhají v polních podmínkách, je potřebné technické zázemí pro zpracování půdy. V průběhu vegetace jsou používány přípravky na ochranu rostlin (herbicidy a insekticidy). Pro ochranu kontrolní varianty je potřebná netkaná folie. Chovy mšic probíhají v regulovaných skleníkových podmínkách. Pro potvrzení virové infekce jsou v některých případech potřebná antiséra. Je třeba mít k dispozici klasovou mlátičku, váhu, počítačku semen. Pracovní postup Reakce na infekci virem žluté zakrslosti ječmene (BYDV) je studována v maloparcelkových polních pokusech u vybraných materiálů ječmene ozimého. Rostliny jsou pěstovány na 1 m dlouhých dvouřádkových parcelkách. Pokusy mají 2 opakování vždy s infekční (I) a kontrolní (K) variantu (bez infekce BYDV). Ve fázi dvou až tří listů jsou infikovány vysoce patogenním PAV kmenem BYDV. K přenosu slouží mšice Rhopalosiphum padi ze skleníkových chovů, jejichž reprodukce a infekce probíhaly podle metodiky modifikované ve VÚRV (Vacke et al., 1996). Pro namnožení mšic se používá nahý oves. Vzrostlý oves je kolonizován větším množstvím viroformních mšic cca 5-6 týdnů před použitím. Na každou rostlinu připadá 10-20 mšic různých vývojových stadií. Kontrolní varianta je po dobu sání mšic chráněna krycí tkaninou. Po uplynutí pěti až sedmidenního sání jsou přenašeči usmrceni aphicidním přípravkem. Během vegetace se pokusné parcely i okolní dělící a ochranné pásy udržovaly pod insekticidní clonou. U testovaných materiálů jsou za vegetace studovány symptomatické projevy podle stupnice, kterou vyvinuli Schaller a Qualset (1980). Po sklizni je případně zjišťován vliv viru na výnosové prvky porovnáním infekční a kontrolní varianty.

Vyhodnocení experimentálních dat Symptomatická reakce je hodnocena podle desetistupňové stupnice (0–bez příznaků) kterou vyvinuli SCHALLER a QUALSET (1980). Hodnocení je prováděno v průběhu vegetační doby 2x. Pro posouzení náchylnosti se používá průměr obou získaných hodnot. Materiály hodnocené stupni 1 - 2 jsou považovány za silně rezistentní, 3 - 4 rezistentní, 5 mírně rezistentní, 6 mírně náchylné, 7 náchylné, 8 – 9 silně náchylné jsou považovány Doplňkově se sleduje inkubační doba viru v jednotlivých materiálech. Ve zralosti se měří výška rostlin (cm) a z každé parcely je odebráno ze zapojeného porostu 20 rostlin na posklizňové rozbory. Při těchto rozborech se hodnotí následující znaky: HBS - hmotnost biomasy celého snopku (g), PKS – počet klasů snopku, HZS – hmotnost zrna snopku (g), HTZ – hmotnost tisíce zrn (g). Lze dopočítat následující znaky: HBP – hmotnost biomasy na plochu, HZP – hmotnost zrna na plochu, HSP – hmotnost slámy na plochu, HZR – hmotnost zrna na rostlinu, HZK - hmotnost zrna na klas, PKR – počet klasů na rostlinu, HI – sklizňový index. Na základě průměrných hodnot těchto znaků u infekční a kontrolní varianty je vypočtena procentní redukce znaku po infekci BYDV jako 100-I/K.100. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Testování reakce genotypů v maloparcelkových polních pokusech lze vzhledem k délce vegetačního cyklu považovat za časově náročné. Rozsah pokusů je limitován jednak kapacitou polních ploch a jednak množstvím mšic., jejichž reprodukce a chovy musí probíhat v regulovaných podmínkách. Metoda je velmi pracná, protože se jedná o ruční infikování individuálních rostlin. Náklady na vyhodnocení jednoho vzorku činí činí 800,- (v případě, kdy se hodnotí pouze symptomatické hodnocení 500,- Kč). Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Náročnost metody tkví především v dosažení shody v připravenosti rostlin pro infekci (2.-3. list, začátek odnožování) a současně v namnožení dostatečného množství přenašečů. Jako problematický se též jeví vliv povětrnostních podmínek a případných škůdců, který nelze v polních podmínkách zcela eliminovat. Důležité je dbát na udržení čistoty chovů mšic tak, aby byl stále zachován přenos kmene PAV. Přednosti metody, možnosti rozšíření Jedná se o v současné době již dobře zvládnutou metodu, pomocí které lze určit náchylnost odrůd a nšl. k BYDV. Možnosti rozšíření metody na jiná pracoviště jsou limitované, protože vedení chovů je náročné a převoz infikovaných mšic na jiná pracoviště je poměrně těžko realizovatelný. Seznam literatury VACKE, J. (1988): Výskyt viru žluté zakrslosti ječmene na ozimých obilovinách. In: Sbor. Ref.XI. Konf. Ochr. Rostl., Nitra: 203-204. SCHALLER, C.W., QUALSET,C.O.(1980): Breeding for resistance to barley yellow dwarf virus. In: Proc. Third int. Wheat Conf., Madrid, Spain University of Nebraska Agric. Experiment. Station, public. MP 41: 528-541. Další doporučená literatura OVESNÁ, J., VACKE, J., KUČERA, L., CHRPOVÁ, J., NOVÁKOVÁ, I., JAHOOR, A., ŠÍP, V. (2000): Genetic analysis of resistance in barley to barley yellow dwarf virus. Plant Breeding 119: 481-486. ŠÍP, V., CHRPOVÁ, J., VACKE, J., NOVÁKOVÁ, I. (2001): Possibility of exploitation of the detected BYDV resistance genes in barley breeding. In: Proc. of the 50th Anniversary Conf., Prague, 11-13 September, 2001: 6061. VACKE, J. ŠÍP, V., ŠKORPÍK, M. (1998): Škodlivost viru žluté zakrslosti ječmene na ječmeni ozimém infikovaném v rané růstové fázi (Barley yellow dwarf virus harmfulness on winter barley crops infected at an early growth stage). Czech J. Genet. Plant Breed., 34: 27-29.

2.1.1.2. Testování rezistence k BYDV za použití molekulárního markeru Ylp detekujícího Yd2 gen - Testování rezistence k viru žluté zakrslosti ječmene (BYDV) s použitím molekulárních markérů na bázi ASPCR a CAPS Mgr. Kateřina Poláková, VÚRV Podstata metody Yd2 gen je zodpovědný za rezistenci vůči BYDV. Poprvé byl identifikován v ethiopské odrůdě ječmene v roce 1960. Yd2 gen lze detekovat pomocí molekulárních markérů. Ylp markér leží v oblasti Ylp genu, který kóduje Yd2-linked protein. Genetické analýzy prokázaly velmi úzkou vazbu mezi oběma geny, takže detekce polymorfismu v Ylp genu s použitím molekulárních markérů představuje významnou predikci přítomnosti či nepřítomnosti Yd2 genu (Ford et al., 1998). Molekulární markér CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism) je založen na amplifikaci úseku genu Ylp s následnou restrikční analýzou. Můžeme tak očekávat tři typy výsledků; náchylný homozygot, rezistentní

homozygot nebo heterozygot. Druhým významným markérem je tzv. ASPCR (Allele-Specific PCR) v Ylp genu. Tento markér specificky generuje alelu spojenou s rezistencí vůči BYDV. Potřebné technické vybavení Přístrojové vybavení: - PCR termocykler, elektroforetické vany, transiluminátor s přístrojem na obrazové zpracování výsledku, pipety pro mikro objemy, PCR plast Chemikálie: - specifické oligonukleotidy, enzym Taq polymeráza, restrikční endonukleáza NlaIII, deoxynukleotidtrifosfáty (dNTP), agaróza, ethidium bromid, TAE pufr Pracovní postup CAPS analýza Amplifikace úseku genu Ylp (311bp) s použitím primerového páru YlpPCRMF- 5‘- aatacaggaatctgttgaaagaa-3‘, YlpPCRMR-5‘-TCATCATGGCTCGGAGAAGGTGG-3‘ (Ford et al., 1998) probíhá ve 20 µl reakční směsi obsahující 10x pufr (Qiagen), 200µM dNTP mix (Invitrogene), 6 pmol každého primeru (Invitrogene), 1 jednotka Taq polymerázy (Qiagen) a 100 ng DNA. PCR cyklus na termocykleru PE 2400 (Perkin-Elmer): 40 cyklů při 94 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72°C 1 min. Kvalita PCR produktů byla ověřena separací 10 µl vzorku ve 2 % agarózovém gelu s následnou vizualizací pomocí transiluminátoru po obarvení ethidium bromidem. 5 µl PCR produktu bylo použito pro restrikční analýzu. Reakce obsahuje 10x pufr (New England Biolabs), 1% BSA, 2 jednotky enzymu NlaIII v celkovém objemu 10 µl. Štěpení probíhá při 30 °C 2 hodiny. Štěpené produkty jsou detekovány pomocí transiluminátoru po separaci v 2% agarózovém gelu a po obarvení ethidium bromidem. ASPCR analýza Amplifikace úseku genu Ylp (268 bp) s použitím primerového páru YlpPCRMF (viz. výše) a YlpRAS 5‘CTAGTATCTCTGGCTCAG-3‘ probíhá ve 25 µl reakční směsi obsahující 10x pufr (Qiagen), 3 mM MgCl2, 1,25 mM dNTP mix (Invitrogene), 6 pmol obou primerů (Applied Biosystems), 0,5 jednotky Taq polymerázy (Qiagen) a 250 ng DNA. Teplotní cyklus na termocykleru UNO II (Schöeller Instruments): 94 °C 2 min, 30 cyklů při 94 °C 1 min, 50 °C 2 min, 72 °C 3 min a konečná extenze při 72 °C 5 min. PCR produkty byly vizualizovány pomocí transiluminátoru po separaci ve 2% agarózovém gelu a obarvení ethidium bromidem. Vyhodnocení experimentálních dat Použití obou metod je nutné k přesnému určení, zda jedinec nese gen Yd2 a jestli se jedná o homozygota nebo heterozygota. Alelově specifický PCR markér odhalí nositele Yd2 genu, což detekujeme jako přítomnost proužku po elektroforetické separaci v prostředí agarózového gelu, ale neodhalíme heterozygota (Obr.1). K odhalení heterozygota a i jako zpětnou kontrolu používáme CAPS analýzu (viz. pracovní postup). Jestli je generovaný PCR produkt (311 bp) štěpen za vzniku produktů délky 253 a 58 bp, jedná se o náchylného homozygota, pokud produkt štěpen není a zůstává délka PCR produktu 311 bp, jedná se o rezistentního homozygota, pakliže dostaneme tři délkové produkty po inkubaci PCR produktů s enzymem NlaIII, bude se jednat o heterozygotního jedince (Obr. 2). Obr. 1 Příklad vyhodnocení alelově specifické PCR analýzy po separaci produktů v agarózovém

gelu. N = náchylný R = rezistentní Obr. 2 Příklad vyhodnocení CAPS analýzy po separaci ve 2% agarózovém gelu.

N = náchylný R = rezistentní H = heterozygot

Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Oba typy analýz jsou založeny na detekci PCR produktů a štěpených produktů enzymem NlaIII v prostředí agarózového gelu. Před vlastní analýzou jse nutné vyextrahovat rostlinnou DNA z mladých listů ječmene. Pokud zamýšlíme uspořit čas pracovníka a získat co nejrychleji rostlinnou DNA používáme kit od firmy Qiagen; 2x 96 vzorků vyextrahujeme za 2 hodiny. S použitím levnější metody CTAB budeme stejné množství vzorků extrahovat 14 dní. Extrakce 96 vzorků kitem firmy Qiagen stojí 7400 Kč nepočítaje práci laboranta.CAPS analýza 96 vzorků činí cca 2000 Kč, ASPCR analýza 96 vzorků činí cca 1000 Kč, kde jsou počítány pouze potřebné chemikálie a práce jednoho pracovníka. Celková cena testu rezistence vůči BYDV u 96 vzorků je 10400 Kč, kde nejsou započítány provozní náklady atd. Obě analýzy včetně izolace DNA s použitím zmíněného kitu trvá 2 dny. Metody jsou velice dobře aplikovatelné pro rutinní využití. Seznam literatury Ford C.M., Paltridge N.G., Rathjen J.P., Moritz R.L., Simpson R.J., Symons R.H. (1998): Rapid and informative assays for Yd2, the balrey yellow dwarf virus resistance gene, based on the nucleotide sequence of a closely linked gene. Mol. Breeding, 4: 23-31. Další doporučená literatura Ovesná J., Šíp V, Vacke J., Kučera L (1999): Evaluation of resistance to BYDV with the use of PCR marker linked to Yd2 gene in comparion with the resluts of field infection tests in pring barley.Czech J. Genet. Plant Breed., 35: 37-41. Collins N.C., Paltridge N.G., Ford C.M. Symons R.H. (1996): The Yd2 gene for barley yellow dwarf virus resistance maps close to the centromere on the long arm of barley chromosome 3. Theor. Appl. Genet. 92: 858864. Scheurer K.S., Huth W., Waugh R., Friedt W., Ordon F. (2001): First result on QTL-analysis for barley yellow dwarf virus (BYDV)tolerance in barley (Hordeum vulgare L.).

2.1.2. Testování na odolnost žluté mozaice ječmene 2.1.2.1. Testování resistence k BaYMV v infekčních testech v Německu Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Žlutá mozaika ječmene ( BaYMV ) není dosud rozšířena na našem území. V západoevropských zemích je však nejvážnější chorobou ozimého ječmene a registrace odrůdy bez rezistence nejrozšířenějšímu kmenu ( BaYMV-1 ) není možná např. v Německu, Francii i dalších státech. Všechny 3 kmeny viru (BaYMV-1, BaYMV-2 a BaMMV) jsou přenášeny půdní houbou Polymixa graminis, kmen BaMMV navíc i mechanicky. Infikovaná houba má životnost v půdě až desítky let, na infekčních polích je navíc udržována v rovnoměrném výskytu častými přesevy ozimého ječmene. Šlechtitelské firmy v zemích zasažených výskytem mozaiky vysévají veškerý materiál ozimého ječmene v raných generacích do testů na infekční pole. Tuto možnost má český šlechtitel pouze prostřednictvím zahraničních partnerů, a to v dosti omezeném rozsahu. Od testování odolnosti k BaMMV skleníkovými testy s mechanickým přenosem (šťávou s karborundovým práškem) většina firem ustoupila pro pracnost a nedostatečnou průkaznost. Shrnutí základních praktických postupů Nejdůležitější je výběr zahraničního partnera, který má k dispozici infekční pole se sérologicky ověřeným výskytem viru (kmenu). Nejčastější je testování na polích s čistou infekcí BaYMV-1 nebo směsnou infekcí BaYMV-1 a BaMMV. Z dřívějších testů se ukázalo nevhodné testování na polích s čistou infekcí BaMMV, kde vykazovaly odolnost i materiály bez genu rezistence ( Okal ve Francii ). Testování na polích s výskytem BaYMV-2 ( nejagresivnější ale nejméně rozšířený kmen překonávající odolnost založenou genem rym4 ) má smysl jen u materiálů z křížení donorů genu rym5 ( z japonských zdrojů, prozatím s nízkými hospodářskými parametry ). V rámci projektu bylo využito pracoviště firmy SAATEN-UNION, NORDSAAT Zuchtstation GUDOW (D) , pro poslední rok řešení se podařilo získat další 2 testovací místa a to u Nickerson Seeds Ltd. (GB) a Institut für resistenc Aschersleben (D) všechny tři prozatím bezplatně, na základě reciproční testovací smlouvy. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Infekční pole, kazetový secí stroj, laboratorní vybavení pro Elisa-test (možno i prostřednictvím servisní laboratoře). Pracovní postup Vzorky o hmotnosti 50-100g jsou zasílány smluvnímu partnerovi ve sjednaném počtu poštou či kurýrní službou, vzorky jsou anonymní ( kódové značení ), v kolekci musí být zařazeno několik kontrolních odrůd se známou

rezistencí i náchylností. Testování se provádí velmi jednoduchou metodou – výsevem nemořeného osiva na infekční pole, nejčastěji ve 2 opakováních. Parcelky či řádky jsou vyhodnoceny (hodnocení R/N nebo bodové stupnice 0-4 či 1-9 – dle země či pracoviště) ve 2 termínech (počátek a konec sloupkování) dle vizuálních symptomů napadení (žloutnutí, skvrnitost listů, zakrslost rostlin). Po vyhodnocení jsou testy likvidovány zaoráním, vlastní novošlechtění si zahraniční šlechtitelé na inf. poli dopěstovávají a provádějí zde výběry ( tuto možnost prozatím nemáme ). Vyhodnocení experimentálních dat Data zasílají zahraniční partneři e-mailovou poštou již vyhodnocená (Rezistentní, náchylný, případně štěpící), po rozkódování a kontrole shody výsledků standard je možné výsledky zapsat do šlechtitelské dokumentace. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Běžná cena je 2 až 5 € za testovaný člen, časová náročnost je minimální, kapacita je však limitovaná smlouvou či dohodou se zahraničním partnerem. Podstatným limitem je časný termín výsevu ( začátkem září ), což znamená přípravu testované kolekce a její odeslání na testovací pracoviště koncem srpna. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Využití testování odolnosti k BaYMV na infekčním poli je závislé na možnosti spolupráce se zahraničními partnery. Rozsah testů je limitován nabídkou testovacích pracovišť, zasílání velkých objemů vzorků do zahraničí by metodu prodražilo. Selekce v infekčním poli (výběry rezistentních rostlin v raných generacích) je v současnosti pro šlechtitele v ČR nedostupná a z důvodu možnosti přenosu infikované houby povrchovou kontaminací zrna riziková. Tyto limity mohou přestat platit se vstupem ČR do EU, při těsnější spolupráci šlechtitelských pracovišť (recipročně selekce na mrazuvzdornost a BYDV v ČR, Polsku či Maďarsku a selekce na BaYMV v Německu, Francii, Anglii či Itálii ). Rovněž nalezení lokality s výskytem BaYMV na území ČR by testování zjednodušilo. Přednosti metody, možnosti rozšíření Vlastní testování na infekčním poli je velmi jednoduché, časově i finančně nenáročné, pro šlechtitele v ČR dostupné prostřednictvím zahraničních firem.

2.1.2.2. Testování rezistence BaYMV za použití mikrosatelitního markeru BMac29 detekujícího geny rym4 a rym5 - Testování rezistence ke komplexu mozaikových virů ječmene (BaYMV a BaMMV) s použitím molekulárního markéru Bmac29. Mgr. Kateřina Poláková, VÚRV Podstata metody Geny rym4 a rym5 jsou zodpovědné za rezistenci vůči komplexu mozaikových virů a poprvé byly odvozeny z jihoevropské krajové odrůdy Ragusa (rym4) a čínské krajové odrůdy Mokusekko 3 (rym5). Mikrosatelitní markér Bmac29 (AC/GT repetice) detekuje oba geny (Graner A., 1999). Bmac29 může generovat tři typy PCR produktů odlišující se v jejich délkách. Na základě získaných dat o délce PCR produktů identifikujeme odrůdy nesoucí gen rym4, rym5 a odrůdy náchylné. Potřebné technické vybavení Přístrojové vybavení: PCR termocykler, elektroforetické vany, transiluminátor s přístrojem na obrazové zpracování, pipety pro mikro objemy, PCR plast, genetický analyzátor pro fragmentační analýzu Chemikálie: specifické oligonukleotidy, z nichž jeden je fluorescenčně značen; enzym Taq polymeráza, deoxynukleotidtrifosfáty (dNTP), agaróza, ehtidium bromid, TAE pufr, separační gel pro fragmentační analýzu Pracovní postup Příprava PCR produktů mikrosatelitního markéru Bmac29: Amplifikace Bmac29 s použitím primerového páru Bmac29F-HEX-5’ATCCAGCGATTCAAACACAAC-3‘, Bmac29R-5‘-CTTCTCACTGACCGAC TTATACCA-3‘ (Graner et al., 1999) probíhá ve 20 µl reakční směsi obsahující 10x pufr (Qiagen), 1,5mM MgCl2, 200 µM směs dNTP (Invitrogene), 5 pmolů obou primerů (Applied Biosystems), 1 jednotka enzymu Taq polymeráza (Qiagen) a 100 ng DNA. PCR cyklus na termocykleru UNO II (Schöeller Instruments): 94 °C 3 min, 35 cyklů při 94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 30 s, finální extense při 72 °C 5 min. Kvalita PCR produktů byla ověřena separací 5 µl vzorku v 2% agarózovém gelu s následnou vizualizací pomocí transiluminátoru po obarvení ethidium bromidem. Fragmentační analýza PCR produktů Bmac29: 1 µl PCR produktu byl denaturován spolu s 0,3 µl délkového standardu Tamra-500 (Applied Biosystems) ve 4 µl deionizovaného formamidu (Sigma) při 96 °C 5 min. Takto zdenaturovaný vzorek byl analyzován na přístroji ABI PRISM 310 (Perkin-Elmer). Přesná délka separovaných PCR produktů v jednotkách páru bazí byla stanovena pomocí softwaru Genescan a Genotyper (Applied Biosystems).

Vyhodnocení experimentálních dat Data byla získána po separaci PCR produktů Bmac29 v prostředí kapilární elektroforézy na přístroji ABI PRISM 310. Stanovení přesné délky PCR produktů bylo provedeno pomocí softwaru Genescan a Genoptyper (Applied Biosystem). Vzorky s délkou PCR produktu 149 bp jsou nositelé genu rym5, s délkou 145 bp jsou nositelé genu rym4 a s délkou 169 bp jsou náchylné odrůdy (Obr. 1). Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Použití mikrosatelitního markéru Bmac29 k detekci rezistentních genů rym4 a rym5 závisí na vybavení laboratoře molekulární biologie. Kromě standardního vybavení je zapotřebí takových nástrojů, aby bylo možno s přesností na 1 bp rozlišit PCR produkty k přesnému určení délky. V laboratoři máme k dispozici genetický analyzátor ABI PRISM 310 pro fragmentační analýzu s vyžadovaným stupňem rozlišení. Obr. 3 Příklad délkových produktů markéru Bmac29 po elektroforetické separaci v prostředí kapilární elektroforézy na přístroji ABI PRISM 310.

Před samotnou analýzou je nutné vyextrahovat rostlinnou DNA. Extrakce 96 vzorků s použitím kitu od firmy Qiagen činí 7400 Kč. Pro přípravu PCR reakce je zapotřebí oligonukleotidů, z nichž jeden je fluorescenčně značen pro následné využití fragmentační analýzy na přístroji ABI PRISM 310. Analýza 96 vzorků na přítomnost rezistence vůči komplexu mozaikových virů s využitím fragmentační analýzy na přístroji ABI PRISM 310 činí cca 4000 Kč nepočítaje mzdu pracovníka, provozní náklady atd. Na provedení této analýzy plně stačí jedna pracovní síla. Celková analýza 96-ti vzorků včetně extrakce DNA trvá 3 dny. Metoda je velice dobře aplikovatelná ve specializovaných laboratořích molekulární biologie. Seznam literatury Graner A., Streng S., Kellermann A., Shiemann A., Bauer E., Waugh R., Pellio B., Ordon F. (1999): Molecular mapping and geneic fine-structure of the rym5 locus encoding resistance to different strains of the Balrey Yellow Mosaic Virus Complex. Theor Appl Genet, 98: 285-290. Seznam doporučené literatury Pellio B., Werner K., Friedt W., Graner A. and Ordon F. (2000): Resistance to the barley yellow mosaic virus complex-from mendelian genetics towards map based cloning. Czech J Genet Plant Breed, 36:84-87. Okada Y., Kashiwazaki S., Kanatani R., Arai S., Ito K. (2003): Effects of barley yellow moaic disease resistant gene rym1 on the infection by strains of barley yellow mosaic virus and barley mild mosaic virus. Theor Appl Genet, 106: 181-189. Habekuz A., Krämer I., Proeseler G., Pickering R. (2000): Genetic and molecular characterization of virus resistance in winter barley. Czech J Genet Plant Breed, 36: 79-83.

2.2. Hodnocení rezistence vůči abiotickým stresům 2.2.1. Testování na odolnost stresům zimního období Přístupy a metody hodnocení zimovzdornosti a mrazuvzdornosti ječmenů RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc., VÚRV Ing. Pavla Prášilová, VÚRV

Během přezimování jsou rostliny ječmene vystaveny celé řadě nepříznivých, většinou abiotických faktorů (zaplavení vodou, uzavření v ledové vrstvě, vertikálním zdvihům půdy při střídavém mrznutí a tání, mrazové desikaci při zamrzlé půdě nebo naopak vyčerpání pod sněhovou vrstvou). Na našem území má rozhodující vliv mráz. Nejenže spolupůsobí při vytváření ostatních škodlivých faktorů zimy, ale může vést k přímému poškození rostlin. Ostatní uvedené faktory pokud nevedou k přímému úhynu rostlin, mají za následek snížení mrazuvzdornosti a zeslabení rostlin, což se může projevit v poruchách dalšího vývinu a snížení výnosů. Dosažená mrazuvzdornost ječmenů tedy odráží i vliv ostatních stresů zimy a metodicky je její hodnocení také nejlépe vypracováno a standardizováno. Metody používané pro hodnocení zimovzdornosti a mrazuvzdornosti ječmenů lze podle působení stresových faktorů na rostliny rozdělit na dvě hlavní skupiny: přímé a nepřímé metody. Při přímých metodách jsou rostliny vystaveny přímému působení mrazu či ostatním nepříznivým faktorům a hodnotíme následné poškození nebo odumření rostlin. Nepřímé metody využívají korelaci nebo určitou vazbu mezi některou charakteristikou a úrovní odolnosti vůči vyzimování a mrazu. Rostliny nejsou v tomto případě vystaveny mrazu nebo zimním stresům a hodnotí se podle výskytu sledovaného znaku (charakteristiky) nebo i komplexu několika znaků indukovaných během otužování rostlin. V poslední době dochází k velkému rozvoji studia molekulárních markerů, které jsou ve vazbě či propojení s geny řídícími mrazuvzdornost a zimovzdornost ječmenů. Vzorky rostlin pak lze odebírat bez ohledu na jejich vývojovou fázi a rostliny nemusejí být v otuženém stavu.

Typ metody

Otužování

Pùsobení mrazù

Vyhodnocení

S využitím Polní

pole

pole

- pøežití rostlin - vizuální hodnocení poškození

laboratoø

- regenerace - letální teplota (LT50) - výtok elektrolytù - rychlost Pn, Rd

laboratoø

- aktivita enzymù

ne

fenologické - rychlost vývoje …. morfologické - pøízemní rùst … fyziologické - obsah vody … biochemické - volný prolin… biofyzikální - el.vodivost pletiv ..

ne

molekulární markery

pøímého pùsobení stresù

Polnìlaboratorní

pole

Laboratorní laboratoø

S využitím S pole nebo laboratoø znakù otužováním a markerù

Bez otužování

ne

Přímé metody lze dál dělit podle prostředí, ve kterém jsou rostliny pěstovány a vystaveny stresům na polní, polnělaboratorní a laboratorní. Polní metody se nejvíce přibližují přirozenému prostředí, jsou ale také nejvíce závislé na venkovním výskytu některého stresu. Kriteriem je obvykle stupeň přezimování nebo procento přežití rostlin. Jsou to metody energeticky nejméně náročné, většinou jsou ale zatíženy větší variabilitou a vyžadují obvykle provést testování po několik let. V našich podmínkách není zaručeno každoroční rozlišení přežití ječmenů po zimě na poli, někdy může dojít k vyzimování jen některé skupiny bez rozlišení celé škály odolnosti mezi vzorky ječmenů. Proto je u těchto metod používána řada přístupů a modifikací, které zvyšují šanci na každoroční získaní výsledků. Jeden z přístupů je pěstování odrůd v extremní lokalitě (např. položené ve vyšší nadmořské výšce či v mrazové kotlině) nebo souběžně v několika lokalitách. Jiný postup umožňuje hodnotit každoročně přezimování odrůd na jedné lokalitě pomocí tzv. provokačních testů, kdy různými experimentálními zásahy jsou zesíleny účinky jednotlivých zimních stresů. Zde se nejvíce používá pěstování rostlin v nádobách nebo korytech, kde lze umístěním nádob do různé výšky vystavit rostliny silnějším mrazům, ochranou stříškou zamezit vlivu sněhu a srážek, nebo naopak intenzivním zaléváním navodit stresy spojené s přemokřením ornice a tvorbou ledu. Tento přístup vyžaduje dobrou znalost vlivu jednotlivých stresů na příslušný druh a patřičnou zkušenost s aplikací těchto metod. Polně-laboratorní metody jsou zaměřeny na hodnocení především mrazuvzdornosti ječmenů. Rostliny jsou pěstovány na poli nebo venku v nádobách (květináčcích) a během zimy jsou odebírány a vystaveny mrazovému testu v regulovaných mrazicích zařízeních. Tyto metody jsou poměrně spolehlivé a mají celou řadu modifikací a variant. Jejich výhodou je možnost stanovit nejen aktuální rozdíly v odolnosti vzorků, ale i jejich změny v průběhu zimy, zejména v předjaří, kdy citlivější odrůdy ječmenů velmi rychle ztrácejí svoji odolnost. Při

laboratorních metodách všechny postupy probíhají v regulovaných podmínkách. Tyto metody jsou energeticky nejnáročnější, mají omezení v počtu hodnocených vzorků, na druhé straně jejich výhodou je nezávislost na ročním období a možnost zajištění reprodukovaných podmínek. Cílem je zajistit co nejlepší podmínky pro indukci odolnosti rostlin, neboť jen tak je možno nejlépe rozlišit jejich rozdíly v odolnosti. Toho lze dosáhnout kombinací délky a intenzity osvětlení, regulací nízké teploty, vlhkosti, výživy a volbou vhodného substrátu. Postupů je celá řada a hodnotí se nejen odolnost vůči mrazu, ale i vliv ostatních faktorů jako je např. zaplavení vodou. Nepřímé metody umožňují hodnotit zimovzdornost a mrazuvzdornost na základě měření vybraných charakteristik rostlin ječmenů. Využívána je celá řada znaků od morfologických (přízemní habitus rostlin), přes fyziologickobiochemické (např. aktivita dýchacích enzymů) až po biofyzikální ukazatele (např.elektrická vodivost pletiv). Často jsou uváděny charakteristiky jako je množství cukrů (celkové nebo jen frakce rozpustných ve vodě), obsah a různé formy vody (vázaná voda, hodnoty osmotického tlaku buněčné šťávy), různé složky lipidů (např. mastné kyseliny), z cytologických znaků např. velikost buněk či průduchů na listech. V posledním období byly u ječmenů studovány akumulace kyseliny abscisové, volného prolinu, z cukrů frakce fruktanů a některých COR (cold regulated) proteinů. Zimovzdornost a mrazuvzdornost jsou komplexně podmíněné charakteristiky, na kterých se podílí řada genů a proto užití jen některého znaku má obvykle svoje omezení. Navíc měření některých charakteristik je velmi citlivé na předchozí manipulaci s rostlinami a podmínky za kterých jsou rostliny otužovány (např. obsah vody, kyseliny abscisové, vodivost pletiv). Proto je nutné provádět tato stanovení za standardních a přesně definovaných podmínek. Obvykle se nepřímé metody používají jako doplňkové. S postupným výzkumem podstaty zimovzdornosti a mrazuvzdornosti bude význam využití těchto metod narůstat. Molekulární markery, zejména DNA markery jsou využívány nejen pro zjištění oblastí chromosomů s QTL (quantitative trait loci) řídící zimovzdornost a mrazuvzdornost ječmenů, ale i pro ověření role některých biochemickch charakteristik, které mohou být spojovány s mrazuvzdorností (např. složení membrán či indukce COR proteinů). QTL zimovzdornosti ječmenů byly zjištěny především na chromosomu 5H (dříve 7), kde byl nalezen dokonce shluk několika těchto lokusů. Dále byly QTL mrazuvzdornosti nalezeny na chromosomech 2H, 3H a 6H. Byla zjištěna řada genů, které jsou spojovány s indukcí mrazuvzdornosti ječmenů, jako je cor 14 nebo genové rodiny blt4, blt101, Wcs120, Wcor410 a Dhn. Posledně jmenované jsou geny dehydrinů, jejichž indukce souvisí s dehydratací pletiv, vyvolávanou celou řadou abiotických stresů. Dehydrinů bylo zjištěno u ječmenů 13, z nichž Dhn5, Dhn8 a Dhn13 jsou specificky indukovány chladem. Další Dhn1, 2 a 9 jsou aktivovány při mrazu spojeném s dehydratací buněk. Je pozoruhodné, že právě uvedné QTL na chromosomu 5H leží v těsné blízkosti lokusů Dhn 1 a 2. Dehydrínům podobné jsou produkty genů Wcs120 a Wcor410. Mezi ozimými a jarními formami ječmenů byl nalezen významný rozdíl nejen v indukci posledně uvedených genů, ale i v souvislosti s regulací jejich exprese genem jarovizace (Vrn-H, dříve Sh). Ozimé odrůdy se o od jarních liší délkou doby a intezitou exprese Wcs120 a Wcor410 regulovaných geny, které řídí vývoj ječmenů. Tvorba genetických map a srovnávací (komparativní) mapování umožnily nalézt mezi příbuznými druhy obilnin tj. ječmenem, pšenicí, žitem a některými druhy Aegilopsů podobné oblasti chromosomů, které nesou geny ovlivňující odolnost obilnin vůči abiotickým stresům. To nasvědčuje, že je možno tyto geny resp. alely nejen porovnávat, ale i využívat mezi příbuznými druhy. V současnosti je praktické využití molekulárních markerů zimovzdornosti nákladnější záležitostí. Jejich další studium je bezesporu perspektivní oblastí s výhledem na přesné hodnocení, šlechtění (MAS - MarkerAssisted Selection) a tvorbu genotypů ječmene s požadovanou úrovní zimovzdornosti a mrazuvzdornosti. Další literatura: Cativelli L. et al. 2002: Cromosome regions and stress-related sequences involved in resistance to abiotic stress in Triticeae. Plant Molecular Biology 48, 649-665. Galiba G. 2002: Mapping of genes regulating abiotic stress tolerance in cereals. Acta Agronomica Hungarica 50, 235-247. Fowler B. et al. 2001: Photoperiod and temperature interactions regulate low-temperature-induced gene expression in barley. Plant Physiology 127, 1676-1681. Musil D. et al. 2002: Dehydrinové geny jako markéry tolerance ječmene k chladu. Ve sborníku: Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtení a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk, 155-160. Snape J.W. et al. 2001: Mapping genes for flowering time and frost tolerance using precise genetic stocks. Euphytica 120, 309-315. Zhu B. et al. 2000: Expression of the barley dehydrin multigene family and the development of freezing tolerance. Molecular Genetics and Genomics 264, 145-153.

2.2.1.1. Polní testy zimovzdornosti Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s.

Foto 4 – Společné hodnocení zimovzdornosti v poli – Lužany 2000 Podstata metody Ve šlechtitelské praxi je veškerý materiál v polních výsevech hodnocen na odolnost k vyzimování, a to již od nejranějších generací. Shrnutí základních praktických postupů Nejběžnějším postupem je vyhodnocení a porovnání podzimního a jarního stavu (před zámrzem a v regeneraci), při němž je hodnocen výpadek rostlin, poškození odnoží a žloutnutí porostu. Zároveň je hodnoceno i napadení chorobami, jež zhoršují přezimování ( Paluška travní, Plíseň sněžná, podzimní infekce virózami ). Přesnější, ale pracnější metodou jsou podzimní a jarní odpočty rostlin ( příp. se zohledněním poškození rostlin bonitací). Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Polní zápisníky, výpočetní technika, pro odpočty rostlin kolíky k označení a rámečky 0,25 m2. Pracovní postup Při hodnocení stavu je používána stupnice 9-1 ( 9 bez poškození, 1 zcela vymrzlé ), při hodnocení je brán v úvahu výpadek rostlin, poškození odnoží, žloutnutí porostu způsobené zimou, přičemž st. 5 je brán jako „hranice škodlivosti“ ( poškození, které není schopen porost nahradit ani v optimálních podmínkách ). Porost je hodnocen před nástupem zimy a na jaře v regeneraci, případně i na počátku sloupkování ( v nepříznivých podmínkách pro regeneraci dochází k tzv. „vyjarování“ rostlin zeslabených zimou ). Odpočet rostlin je prováděn na podzim před zámrzem, rámeček pro odpočet (50 x 50 cm) se pokládá na koso ve středu parcely, jeho rohy jsou označeny kolíky pro jarní odpočet (v regeneraci) na stejném místě. Odpočty rostlin jsou prováděny u pokusů státních zkoušek a materiálů ve 2. roce mezistaničních nebo firemních předzkoušek. Další zpřesnění odpočtů rostlin je možné bonitací poškození rostlin ( 1.-100%=bez poškození, 2.-80%=poškození 1 postranní odnože, 3.-60%=poškození 2-3vedlejších odnoží nebo odnože hlavní, 4.-40% =poškození více než 3 odnoží, celkově horší regenerace, 5.-20%=poškození celé nadzemní části, špatná regenerace, 6.-0%=poškození odnožovacího uzlu nebo i kořenů, rostlina odumírá ). Pro značnou pracnost je tato metoda vhodná pro vyhodnocování provokačních nádobových testů, v polních zkouškách jen na omezený rozsah materiálů ( např. nově získané kolekce sortimentu ). Vyhodnocení experimentálních dat

Nejjednodušší je porovnání podzimního a jarního stavu porostu. Odpočty podzimního a jarního stavu se vyhodnocují výpočtem životnosti v % (počet živých rostlin na jaře dělený počtem rostlin na podzim násobený stem). Při bonitaci jsou rostliny roztříděny do 6 kategorií dle poškození mrazem, počty rostlin v kategoriích jsou násobeny koeficientem ( kat.1=koef.1, kat.2=koef.0,8, kat.3=koef.0,6, kat.4=koef.0,4, kat.5=koef.0,2 a kat.6=koef.0,0 ). Součtem bonitací jednotlivých kategorií, jeho dělení podzimním počtem rostlin a násobením stem vznikne bonitační číslo srovnatelné s životností, ale přesněji popisující poškození přeživších rostlin. Velmi přehledné je pak grafické vyhodnocení a porovnání životnosti a bonitace ( sloupcové grafy ), umožňující stanovení minimální požadované úrovně odolnosti a vyřazení slabých linií. U všech způsobů hodnocení platí, že pro objektivní posouzení schopnosti přezimování určitého materiálu v daném ročníku je potřeba vyhodnocení minimálně 3 opakování z minimálně 3 lokalit. Vhodné je pak vyhodnocovat chování materiálů ve více ročnících (u mladších šlechtitelských materiálů vysetých jen na jedné lokalitě je to nutností), což kontinuita šlechtitelské práce umožňuje v případě, že alespoň na některých lokalitách dojde k poklesu teplot na zásahovou hodnotu. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Hodnocení stavu porostu je povinnou součástí šlechtitelských postupů, finančně a časově není náročné, omezeno je pouze celkovou kapacitou šlechtitelského či testovacího pracoviště. Jde o subjektivní hodnocení závislé do značné míry na zkušenostech hodnotícího pokusníka, a to jak co do přesnosti, tak i do rychlosti, tedy do objemu vyhodnoceného materiálu. Odpočet rostlin je časově i pracovně náročnější, lze jej provádět u pokusů vyžadujících přesnější, objektivnější, vyhodnocení přezimování ( registrační zkoušky, předzkoušky ze kterých jsou materiály vybírány k přihláškám do registračních zkoušek ). Metoda je omezena na krátké časové období a limitovaná pracovní kapacitou pracoviště. Bonitace je velmi pracovně i časově náročná, v polních podmínkách ji lze využít pro vyhodnocení malých kolekcí nejcennějších materiálů ( nové genové zdroje ). Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Polní testy na zimovzdornost jsou závislé na vlivu počasí, a to od zásevu až do sloupkování. Nejdůležitější je období otužování ( indukce mrazuvzdornosti ) a průběh mrazových vln ( ztráta či druhotná indukce odolnosti a dosažení zásahových teplot ). V letech 1997-2002 nedošlo v ČR k dostatečnému prověření zimovzdornosti ozimých ječmenů, jelikož teploty nepoklesly na úroveň zásahových hodnot ( pod -11°C v hloubce odnožovacího uzlu ), naopak v zimě 2002/2003 došlo na mnohých lokalitách k úplnému vymrznutí bez možnosti vyhodnocení ( pokles teplot pod hranici rozpětí odolnosti v rámci druhu, tj. pod -17°C v hloubce odnožovacího uzlu ). Přednosti metody, možnosti rozšíření Polní hodnocení odolnosti k vyzimování jsou běžně používána na všech šlechtitelských a pokusných pracovištích zabývajících se ozimy. Jednotlivé postupy zvládají po zapracování ( dle individuálních schopností ) střední technici i středoškoláci v dělnických profesích. Seznam literatury Metodiky ÚKZÚZ OOZ

Foto 5 – Odrůdové rozdíly způsobené vyzimováním – Chrudim 2003 2.2.1.2. Provokační testy - zimovzdornost - mrazuvzdornost RNDr. Ilja Prášil, CSc., VÚRV Ing. Pavla Prášilová, VÚRV Pro testování zimovzdornosti a mrazuvzdornosti ozimých ječmenů je využíváno několik metod provokačních testů, které se uplatňují v různých fázích šlechtitelského procesu, liší se různou úrovní vlivu vnějších faktorů, stabilitou, přesností a průkazností výsledků, ale i náročností a dostupností. V rámci projektu byly využívané a ověřované 3 metody přímých (provokačních) testů na odolnost stresům způsobených nízkými teplotami: a) Provokační nádobová metoda hodnocení zimovzdornosti b) Polně–laboratorní metoda hodnocení mrazuvzdornosti oz. ječmene c) Laboratorní, přesné stanovení mrazuvzdornosti ječmenů

a) Provokační nádobová metoda hodnocení zimovzdornosti Ing. Pavla Prášilová, VÚRV Podstata metody Sledovaný materiál ozimých ječmenů je po celou zimu pěstován v přirozených podmínkách v nádobách. Vzhledem k výskytu různě silných zim, v poslední době spíše mírných zim, jsou rostliny vystavovány stresovým podmínkám v nádobách umístěných v různé výšce nad zemí (na zemi a 50 cm nad zemí), tak aby byly odrůdy ječmenů v době regenerace dostatečně rozlišeny. Silnější účinek mrazu a dalších zimních faktorů se daleko více projevuje na vyvýšeném parapetu. Shrnutí základních praktických postupů V nádobách (bedýnkách) je užita prosetá zemina, ozimé ječmeny jsou každoročně vysévány ve stejném termínu a zůstávají na stejném stanovišti po celé zimní období až do jarní regenerace a hodnocení. Velmi důležité je zajistit rozložení nádob jedné varianty, aby působení zimních stresů bylo u všech nádob shodné. Potřebné technické vybavení Stavebně upravený, nejlépe oplocený areál se zpevněnými plochami nebo štěrkovou úpravou pro umístění nádob, betonové sloupky na vyvýšený parapet, železné trubky na držení nádob, systém automatického sběru dat teploty vzduchu a půdy pomocí čidel v nádobách (teplota půdy kolem odnožovacího uzlu), dřevěné bedýnky. Pracovní postup Kvalitně připravená prosetá zemina je uložena koncem srpna do nádob, aby dostatečně slehla. V polovině září je proveden přesný ruční výsev – pro bedýnku 6 řádek po 16 semenech a 3 odrůdy v řádcích 1 a 4, 2 a 5, 3 a 6, poté zasypána, mírně utužena a vždy opatřena ochranou proti ptactvu. Při nedostatku vláhy v době vzcházení

a bezprostředně po vzcházení jsou rostliny v bedýnkách zalévány. Po ukončení vzcházení jsou rostliny v nádobách spočítány a jejich hodnota zaznamenána jako výchozí stav pro výpočet % životnosti. Od této doby jsou bedýnky pravidelně kontrolovány a sledována teplota a vlhkost v nádobách. Hlavní hodnocení nastává až počátkem jarní regenerace, (zpravidla začátkem dubna), kdy jsou živé rostliny odpočítány. Vyhodnocení experimentálních dat Vypočítaná průměrná životnost pro každou odrůdu a variantu uložení bedýnek je zpracována programem, vytvořeným na pracovišti VÚRV, společně jsou vyhodnocována data získaná z více let a pomocí matematické metody setříděna podle průměrného % přežití. (Palovský a kol.) Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Kromě pořízení upraveného areálu na nádobový pokus se snímáním teplot a vlhkosti jsou ostatní náklady malé. Metoda představuje náročnost kapacitní a časovou v období zakládání pokusu, tj. naplňování nádob, vysévání, odpočty a vyhodnocení včetně následného vkládání dat do PC. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Nevýhodou metody je náročnost na umístění areálu (dostatečná vzdálenost od budov), nutný je zdroj vody pro zalévání. Při zakládání je potřeba zachovat pravidla, tak aby odrůdy měly různé prostorové umístění v pokusu, dostatečný počet opakování umístění nádob, nutné je zachování homogenity povrchu v celém pokusném areálu. Nevýhodou je velmi silný účinek mrazu na vyvýšeném parapetu, který může poškodit celou variantu pokusu. Přednosti metody, možnosti rozšíření Na základě statistického vyhodnocení za několik let , lze dle výpočtu průměrného % přežití stanovit stupně zimovzdornosti jako odrůdovou charakteristiku. Metoda umožňuje získání výsledků tj. rozlišení jednotlivých šlechtitelských materiálů i při slabších zimách. Metodou lze sledovat též působení dalších nepříznivých faktorů zimy jako jsou např. ledová vrstva, půdní zdvihy a další. Seznam literatury Segeťa, V. : 1957. Jednoduchá metoda určení odolnosti ozimých obilovin proti některým škodlivým činitelům zimy. Vědecké práce VÚRV Ruzyně, 3 : 85 -96 Prášil, I., Rogalewicz, V.: 1989, Accuracy of Wheat Winterhardinnes Evaluation by a Provocation Metod in Natural Conditions. Genetika a Šlechtění, 25 (LXII), č.3, s. 223 – 230. Palovský, R., Rogalevicz, V., Prášil, I.: 1992, Genotype Evaluation and Sorting from Multi-year Unbalanced Series of Trials. Genetika a Šlechtění, 28, 1992 (3): 165 - 175. Prášilová, P., Prášil, I., Jurečka, D.: Zimovzdornost a mrazuvzdornost odrůd ozimé pšenice a ozimého ječmene registrovaných v České republice. Czech J. Genet. Plant Breed.,35, 1999 : 17 -23

b) Polně – laboratorní metoda hodnocení mrazuvzdornosti ozimého ječmene Ing. Pavla Prášilová, VÚRV Podstata metody Stanovení aktuální mrazuvzdornosti rostlin ozimého ječmene odebíraných během zimy z pole v laboratorních podmínkách. Shrnutí základních praktických postupů Vzhledem k tomu, že se jedná o testy rostlin pěstovaných v přirozených podmínkách na poli, základem je kvalitní a včasná příprava půdy před setím, s předpokladem maximálního udržení zásoby půdní vody, zasetí v optimálním termínu, a dostatečným nárůstem biomasy na podzim. Neméně důležitá je volba termínu odběrů rostlin z pole, aby byla zachycena fáze, kdy odolnost vůči mrazu narůstá nebo dosahuje co nejvyšších hodnot. Ke zjištění aktuální polní mrazuvzdornosti je nutné vystavit rostliny mrazovému testu ve speciálních boxech a po regeneraci stanovit aktuální kritickou teplotu (LT50). Potřebné technické vybavení Polní technika pro zpracování půdy, secí stroje, mrazící boxy s naprogramovatelnou mrazovou teplotou, přesnou regulací rychlosti poklesu a zvyšování teploty, skleník s regulovanými podmínkami ( teplotou) na regeneraci rostlin po mrazovém testu. Pracovní postup Do dobře připraveného pozemku zasejeme v optimálním termínu agrotechnické lhůty ozimé ječmeny. Po vzejití sledujeme stav porostu (počet listů, počet odnoží), průběh povětrnostních podmínek (teploty, srážky) a před nástupem zimy tj. zhruba v první polovině prosince, kdy je předpoklad, že odolnost porostu ozimého ječmene je dostatečně indukována přízemními mrazy, odebereme z polních parcel vzorky na stanovení aktuální

mrazuvzdornosti. Po odebrání rostliny svazkujeme tak, aby každá zvolená teplota měla 2 svazky po 10 rostlinách z každé odrůdy (celkem 100 rostlin na pět zásahových teplot). Svazky necháme do druhého dne v boxu na teplotě 0 °C přikryté folií. Následuje vlastní mrazový test v mrazicích boxech většinou s pěti intenzitami mrazu, kde zvolená mrazová teplota působí na rostliny 24 hodin. Rychlost mrznutí a tání se pohybuje 2 °C za hodinu. Regenerace probíhá po tři týdny ve skleníku při 20 °C a 16 hodinové fotoperiodě. Vyhodnocení experimentálních dat Počet živých rostlin udává % přežití pro každou mrazovou teplotu. Pro vypočítání letální teploty, (tj. teplota, při které dojde k uhynutí 50 % rostlin) potřebujeme několik zásahových teplot, zpravidla 4 nebo 5 i více. Výpočet je standardně proveden podle modelu Janáčka a Prášila (1991). Vypočítaná LT 50 udává aktuální mrazuvzdornost testovaného vzorku . Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Finančně náročné je pořizování strojů, mrazových boxů a skleníku. Poměrně dlouhotrvající období předchází vlastní stanovení kritické teploty (pěstování na poli 3 měsíce, test trvá 4 týdny, celková délka stanovení LT 50 jsou 4 měsíce). Kapacitní náročnost je hlavně při odběru vzorků (vyžaduje větší počet pracovní kapacity v co nejkratším časovém úseku - několika hodin) a v době výsadby do kultivačních nádob po zásahu. Po další tři týdny, v době regenerace, denní ošetřování a zalévání. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití V první části metody, kdy jsou rostliny pěstovány na poli, nejsou žádná úskalí při běžném použití (setí, vzcházení, růst a vývoj). Nevýhodou je, že průběh počasí bývá v každém ročníku jiný a nemusí vždy dojít k dostatečné indukci odolnosti. Druhá část metody vyžaduje kapacitní nasazení pracovníků, kvalitu práce s materiálem, spolehlivost mrazícího zařízení a zkušený dohled. Přednosti metody, možnosti rozšíření Přesné stanovení aktuálního stavu mrazuvzdornosti šlechtěného materiálu pěstovaného v přirozených podmínkách, sledování dynamiky vývoje odolnosti v celém zimním období. Seznam literatury Janáček, J., Prášil, I. : 1991. Quantification of plant frost injury by non linear fitting of an S – shaped function , Cryo – Letters, 12, p.47-52 Prášilová, P., Prášil, I., Papazisis, K.: 1993. Mrazuvzdornost ozimých ječmenů ve vztahu k jejich růstu a vývoji. Rostlinná výroba, s. 619-626

c) Laboratorní, přesné stanovení mrazuvzdornosti ječmenů RNDr. Ilja Tom Prášil,CSc., VÚRV Podstata metody Pěstování, otužování, zmrazování a regenerace rostlin ječmenů probíhá za standardních podmínek v regulovaném prostředí. Rostliny mají být napěstovány a otuženy za podmínek, které umožňují indukci maximální odolnosti rostlin vůči mrazu. Tehdy jsou rozdíly v mrazuvzdornosti mezi vzorky největší. Shrnutí základních praktických postupů Napěstované rostliny ječmenů by měly být na počátku odnožování, zdravé, nepřerostlé a vystaveny postupnému snižování teploty, což vede k optimální indukci mrazuvzdornosti vzorků. Bezprostředně po otužení musí být rostliny vystaveny mrazovým teplotám, aby nedošlo ke ztrátě jejich odolnosti např. manipulací za vyšších teplot. Použití většího počtu mrazových teplot odstupňované intenzity během mrazového testu, umožňuje lepší roztřídění materiálů podle odolnosti. Pro výpočet letální teploty (LT50) je nutné použít nejméně 4 až 5 intenzit mrazu. Rychlost mrznutí a tání má být nejvýše 2 až 3 °C za hodinu, aby nedošlo k poškození pletiv v důsledku vnitrobuněčného mrznutí. Vystavení rostlin mrazu má být po standardní dobu a zaručovat rovnoměrné promrznutí všech vzorků. Celý postup, včetně regenerace rostlin po mrazovém testu by měl proběhnout pokud možno za standardizovaných podmínek, aby byla zaručena reprodukovatelnost výsledků. Potřebné technické vybavení Kultivační a otužovací komory (místnosti) s regulovanou teplotou a osvětlením. Mrazicí box(y) s přesnou regulací rychlosti poklesu a zvyšování teploty. Vhodné regulované prostory pro regeneraci rostlin po mrazovém testu. Nádoby a pěstební substrát definovaného složení. Pracovní postup ve VÚRV-Ruzyni Po opláchnutí a povrchové sterilizaci obilek probíhá jejich klíčení ve tmě při 24 °C. Naklíčené obilky jsou vysazeny do květináčků (6 x 6 cm) naplněných upravenou (půda:substrát:jemný písek) a předem autoklávovanou zeminou. Do každého květináčku je vysázeno 10 až 12 obilek a počet květináčků pro jeden vzorek odpovídá počtu

plánovaných mrazových teplot. Kultivace rostlin probíhá při 17 °C, 12 hodinové fotoperiodě do fáze 3 až 4 listů cca 3 týdny. Podle potřeby jsou rostliny zalévány vodou, poslední týden přihnojeny zředěným živným roztokem s nižším obsahem dusíku. Otužování probíhá ve dvou fázích. Nejprve jsou rostliny otužovány při 3 °C a 12 hodinové fotoperiodě po dobu 3 týdnů. Následující druhá fáze otužování probíhá při teplotě +3/-3 °C (den/noc,14/10 hodin) a trvá 1 týden. Před mrazovým testem jsou rostliny s květináčky ponechány na –4 °C po dobu 20 hodin. Pak jsou jednotlivé vzorky vystaveny 4 až 5 mrazovým teplotám (odstupňovaných po 2 °C) v oddělených mrazničkách po dobu 24 hodin. Rychlost mrznutí a tání je 2 °C za hodinu a teplota půdy v květináčcích je monitorována pomocí teplotních čidel. Regenerace rostlin po mrazovém testu probíhá 3 týdny, ve skleníku, při 16 hodinovém osvětlení a teplotě 20 °C. Vyhodnocení experimentálních dat Pro každou mrazovou teplotu je vypočítáno přežití rostlin v procentech. V případě použití většího počtu mrazových teplot lze vypočítat letální teplotu (LT50 = mráz způsobující 50% odumření rostlin), která charakterizuje dosažený stupeň mrazuvzdornosti vzorku. Příklad:

VZOREK Akcent Igri Okal

Mrazový test (% pøežití) -8,0 -10,0 -12,0 -14,0 -16,0 95 70 10 0 0 100 100 67 35 5 100 100 98 87 30

Prùmìr (%) 35 61 83

LT50 (°C) -10,8 -13,2 -15,4

Význ.* a b c

LT10 (°C) -8,8 -11,3 -13,8

LT90 (°C) -12,8 -15,1 -17,1

* hodnoty LT50, které mají jiné písmeno se významně liší na 5% úrovni LT10 = mráz, který způsobuje první usmrcení rostlin, LT90 = mráz, který způsobuje úplné vymrznutí rostlin Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Metoda je náročná z hlediska prvotní investice (kultivační a mrazové boxy) a zajištění provozu všech regulovaných zařízení. Časově jedno hodnocení souboru vzorků trvá 11 týdnů. S počtem vzorků narůstá nárok na pracovní činnost. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní použití Nevýhodou, oproti ostatním metodám je pracnost a náročnost na manipulaci s rostlinami. Jednotlivé postupy lze zautomatizovat (např. převoz vzorků na vozíčku). Počet vzorků, které lze zpracovat najednou je omezen prostorovou kapacitou kultivačních a mrazových boxů. Metoda vyžaduje značné zkušenosti, pravidelný dohled a bezporuchový chod technického zařízení. Přednosti metody, možnosti rozšíření Metoda probíhá v plně regulovaném prostředí a je nezávislá na vnějších podmínkách. Při dodržení všech postupů poskytuje metoda standardní, podrobné hodnocení mrazuvzdornosti materiálu a ukazuje na potenciální možnost odolnosti studovaných genotypů. Metoda umožňuje i významné modifikace, které rozšiřují znalosti o mechanismu indukce mrazuvzdornosti a jejich závislosti na nejrůznějších podmínkách (např. na vlhkosti půdy, stáří a vývojové fázi rostlin).

2.2.2. Testování na odolnost stresům sucha 2.2.2.1. Polní testy Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Sledování suchovzdornosti v polních podmínkách je prováděno porovnáním reakce odrůd či novošlechtění na pokusných lokalitách s různou úrovní přirozených srážek. Shrnutí základních praktických postupů Pro účely otestování suchovzdornosti v polních podmínkách je třeba mezi zkušební lokality zařadit stanoviště s pravidelnými intenzivními přísušky a podprůměrným ročním úhrnem srážek. Pro účely projektu byla vybrána lokalita Branišovice. Potřebné technické vybavení Standardní vybavení pokusné lokality Pracovní postup

Standardní postup pro zakládání, vedení a hodnocení polních pokusů. Vyhodnocení experimentálních dat Lokalita s nižší úrovní srážek je zařazena mezi pokusné lokality předzkoušek, výsledky (hodnocení stavu, počet produktivních stébel, data metání a zrání, výška porostu, výnos, hmotnost tisíce zrn a podíl předního zrna) jsou porovnávány s lokalitami s průměrnou úrovní srážek, pro porovnání rozdílné reakce pokusných členů je vypočítávána redukce jednotlivých znaků na aridním stanovišti oproti průměru ostatních stanovišť. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Požadavky na pokusnou lokalitu jsou zcela shodné s požadavky na běžné lokality provádějící polní pokusy či výkonové zkoušky ozimého ječmene. Náklady na 1 desetimetrovou parcelu se pohybují od 300 do 450 Kč ( dle intenzity ošetřování a rozsahu hodnocení ), při 4 opakováních tedy představují náklady 1200-1800 Kč na 1 pokusný člen. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Hodnocení je silně závislé na ročním průběhu počasí. V zimě 2002/3 na lokalitě Branišovice ozimé ječmeny zcela vymrzly, takže hodnocení nebylo možno provést. Dalším úskalím, jež by mohlo být považováno za nevýhodu metody je obtížné oddělení dalších vlivů, například rozdílné napadení chorobami ( houbové choroby, příp. virózy ) na suché lokalitě oproti lokalitám s průměrnými či vyššími srážkami. To je možné eliminovat hodnocením pokusů ve 2 variantách – neošetřovaná a s fungicidním, příp. insekticidním ošetřením. Přednosti metody, možnosti rozšíření Volba vhodné lokality nezvyšuje náklady na zkoušení, zařazení výsušné lokality umožňuje otestování reakce zkoušených linií v okrajových oblastech pěstování a ověření stability výkonu ve stresových podmínkách.

2.2.2.2. Provokační testy – nádobové Ing. Jana Chrpová, CSc., VÚRV Podstata metody Cílem pokusu je vyhodnotit schopnost vybraných materiálů vyrovnat se se stresem sucha. Rostliny jsou vystaveny suchu od období sloupkování. Snahou je navodit podmínky suchého jara. Poškození suchem je srovnáváno vzhledem ke kontrolní variantě. Shrnutí základních praktických postupů Hodnocení vybraných materiálů probíhá v nevytápěném skleníku jako nádobový pokus s “redukovanou” a s kontrolní variantou. Od zasetí až do sloupkování jsou obě varianty zalévány stejně. Od sloupkování je zálivka redukované varianty snížena, kontrolní zálivka je prováděna standardně pro dosažení optimální zásobenosti rostlin vodou. Po sklizni je vyhodnocena redukce jednotlivých výnosových prvků u varianty s redukovanou zálivkou vzhledem ke kontrole. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd.) Pokus probíhá v desetilitrových nádobách v nevytápěném skleníku. Pro nádobové pokusy je třeba mít k dispozici kvalitní zeminu, v případě výskytu chorob (nejčastěji padlí) je třeba aplikovat fungicid, popř. živný roztok. Nezbytné je zázemí pro vyhodnocení pokusů (klasová mlátička, váha, počítačka semen). Pracovní postup Vybrané materiály jsou vysety do nádob ve dvou opakováních a ve dvou variantách “redukované” a kontrolní. Rozdíl mezi variantami se projevuje až od sloupkování, kdy je zálivka u “redukované” varianty snížena celkově o 60%. Zálivka je prováděna podle potřeby s tím, že u „redukované“ varianty je mezi jednotlivými zálivkami delší interval a dávka je nižší. Po dosažení zralosti je pokus sklizen, je proveden výmlat a vyhodnocení výnosových prvků. Tab.1 - Průběh zálivky v roce 2003 datum Redukovaná varianta Kontrolní varianta datum Redukovaná varianta Kontrolní varianta Út 15.IV - 700 Pá 9.V - 600 Pá 18.IV 400 600 Po 12.V - 600 Út 22.IV - 600 Pá 16.V 400 600 Pá 25.IV 400 600 Po 19.V - 600 Po 28.IV - 600 Čt 22.V - 600 Út 29.IV 400 - Po 26.V - 600 Pá 2.V 400 600 Čt 29.V - 600 Po 5.V 400 600 Pá 30.V 400 St 7.V - 600 Út 3.VI - 600

celkem 2800 9700 Vyhodnocení experimentálních dat V průběhu vegetace jsou zaznamenávány údaje o množství zálivky. Před sklizní je změřena výška rostlin. Po sklizni je zvážena celková nadzemní biomasa a po výmlatu jsou stanoveny následující údaje: hmotnost zrna na rostlinu, hmotnost zrna na klas, hmotnost tisíce semen, počet zrn na rostlinu, počet zrn na klas, HI. Je vypočtena redukce výnosových prvků suchem podle vzorce 100-S/K.100 (S- redukovaná varianta, K – kontrolní varianta). Údaje jsou zpracovány statistickým programem UNISTAT pomocí analýzy rozptylu. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Testování reakce genotypů v nádobových pokusech lze vzhledem k délce vegetačního cyklu považovat za časově náročné. Pokusy jsou limitovány především kapacitou skleníku. Finanční náročnost pokusů je daná především pracovní kapacitou provádějícího. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Uvedená metoda simuluje pouze stres sucha v období jara. Nelze zjistit odlišnou reakci genotypů na sucho např. v období vzcházení. Přednosti metody, možnosti rozšíření Metoda nevyžaduje žádné zvláštní vybavení, takže je využitelná na všech pracovištích, kde je k dispozici nevytápěný skleník. Doporučená literatura Hnilička, F., Bláha, L., Zámečník, J., Novák, V., Ottová, M. (2000): Influence of abiotic stresses on the content of net energy in winter wheat (Triticum aestivum L.) grains. Rostlinná Výroba. 2000, 46, 12: 549-554 2.3. Homogenizace šlechtitelského materiálu 2.3.1. Klasický výběrový postup 2.3.1.1. Rodokmenová metoda s výběrem klasů či rostlin Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Výběry klasů nebo rostlin od nejranějších generací po křížení za účelem homogenizace materiálu – získání neštěpících linií. Shrnutí základních praktických postupů Od raných generací ( F2 ) jsou vybírány klasy či rostliny pro zásev kmenů - klasových (A-KM) či rostlinných (BKM) potomstev. Jedná se o tzv. pozitivní selekci. V rozmnožovacích parcelách finálních materiálů je prováděna i tzv. negativní selekce, což představuje vytrhání případných příměsí ( mechanických či z cizosprášení ). Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Polní zápisník, papírové sáčky, návěsky, klasová mlátička, secí stroj na výsev kmenů, materiál a technika pro ruční sklizeň a strojový výmlat kmenů (srpy, plastová vědra, sklízecí mlátička, sáčky, návěsky). Pracovní postup Výběry klasů či rostlin na homogenizaci začínají od F2 generace a pokračují až do dosažení homogenních linií, jež jsou zařazeny do zkoušek výkonu (obvykle v F5 až F6 generaci), dále navazují výběry pro zachování stálosti novošlechtění a u pokročilých materiálů ( obvykle od F10 – F15 ) navazuje založení udržovacího šlechtění. Vybrané klasy či rostliny jsou vysety do kmenů, ty jsou vizuálně hodnoceny v průběhu celé vegetace na homogenitu a hospodářské vlastnosti a vybrané kmeny jsou sklizeny vyžnutím nebo opakovaným výběrem klasů. Vyhodnocení experimentálních dat U ozimého ječmene je převážně používána homogenizace prostřednictvím výběrů klasů a výsevu klasových potomstev. Výběry rostlin jsou využívány výjimečně v raných generacích z výsevů v řidším sponu. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Technické řešení v klasickém výběrovém postupu (výběry, výmlat, výsev a sklizeň) není náročné, nejvyšší nároky jsou na polní hodnocení po celou vegetaci. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Homogenizace prostřednictvím výběrů klasů je omezena pouze kapacitou šlechtitelského pracoviště, a to plochou použitelnou pro novošlechtění a pracovní kapacitou šlechtitelského pracoviště, především schopností šlechtitelského kolektivu vysetý rozsah vyhodnotit a dále zpracovat. U potomstev rostlin může dojít k příměsím v případě výběru sesetých rostlin, proto považujeme tento způsob za vhodný pouze u raných generací setých v řidším sponu a pro výběry v extrémních ročnících, kdy dojde k výraznému snížení počtu zrn v klasu ( např. ke zkrácení klasů u 2-řadých ječmenů ) a zrna z 1 klasu by nepostačovala pro výsev klasových potomstev. Přednosti metody, možnosti rozšíření

Homogenizace klasickým výběrovým postupem umožňuje rozkmenování velkého rozsahu materiálu od nejranějších generací, je rutinně používána na všech šlechtitelských pracovištích. Seznam literatury ROD a kolektiv: Šlechtění rostlin, SZN 1982

Foto 6 a), b) – Klasová potomstva A-KM – Lužany 2003

2.3.2. Homogenizace za pomoci dihaploidizace 2.3.2.1. Použití prašníkových kultur in vitro - Tvorba dihaploidních linií u ječmene ozimého aplikací indukované androgeneze in vitro Ing. Ladislav Kučera, CSc., VÚRV Podstata metody Metoda tvorby dihaploidních linií ječmene využívá indukovanou androgenezi v prašníkových kulturách in vitro pro odvození haploidních rostlin ječmene. Kultivací prašníků in vitro s mikrosporami ve vhodném vývojovém stádiu a ovlivněnými vhodným stresovým zásahem (chladovým, osmotickým) lze na specielních kultivačních médiích se vhodnou kombinací růstových látek (auxinů, cytokininů) dosáhnout změny vývojového schematu mikrospor a indukovat u nich regenerační procesy (pylovou embryogenezi, případně tvorbu mikrosporiálních kalusů) vedoucí k vývoji kompletních rostlin. Následnou polyhaploidizaci zelených regenerovaných rostlin generace A1 jsou odvozovány fertilní dihaploidní rostliny.

Shrnutí základních praktických postupů Základní praktické postupy lze shrnout do několika hlavních bodů: 1. Příprava donorového rostlinného materiálu 2. Aplikace vhodných stresorů 3. Odběr prašníků s mikrosporami ve vhodném vývojovém stádiu 4. Kultivace prašníků in vitro za řízených podmínek na indukčním médiu 5. Indukce regenerace celistvých rostlin in vitro na regeneračním médiu (médiích) 6. Převedení regenerujících rostlin ex vitrum 7. Polyhaploidizace regenerovaných rostlin s využitím kolchicinu, případně jiného polyploidizačního agens 8. Dopěstování rostlin a odvození následné generace (získání dihaploidní linie) Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Požadavky na potřebné provozní vybavení lze shrnout do několika souborů zařízení: a. Technické požadavky na zařízení pro předpěstování donorových rostlin a aplikaci chladového stresu Pro dosažení maximální výtěžnosti zelených regenerovaných rostlin je potřebné zajistit i optimální podmínky pro růst a vývoj donorových rostlin. Především se jedná o zajištění teplotního a světelného režimu, zajištění dostatečné výživy a optimálních vláhových potřeb. Vhodná jsou především zařízení umožňující celoroční kultivaci v regulovaných podmínkách. V řadě praktických aplikací při práci se šlechtitelskými materiály z polních pěstebních pozemků, však tyto předpoklady nelze zajistit. U ozimého ječmene, obdobně jako u některých dalších obilnin, je pro indukci androgeneze in vitro nezbytné aplikovat vhodný stresový zásah. Nejčastěji se na klasy donorových rostlin působí nízkou teplotou po přiměřenou dobu (u ječmene 14 – 21 dnů při teplotě 2-5o C). Pracoviště proto musí být vybaveno chladovými komorami, případně boxy s regulovatelnou teplotou. b. Technické požadavky na vybavení pracoviště pro práci s explantátovými (prašníkovými) kulturami in vitro Vybavení pracoviště musí umožnit přípravu kultivačních médií, přípravu kultivačních nádob, sterilizaci médií, sterilizaci preparačních nástrojů a pomůcek. Kromě základního laboratorního vybavení (přesné váhy, pH metry, horkovzdušné sušárny, ledničky, mrazničky) musí být vybaveno autoklávem, laminárním boxem pro práci s explantáty v aseptických podmínkách, a zařízením pro kultivaci explantátů v řízených podmínkách (termostaty a klimatizované kultivační boxy nebo růstové komory s osvětlením). c. Technické požadavky na pracoviště pro kultivaci regenerovaných rostlin ex vitro Po převodu regenerovaných rostlin z in vitro musí být zajištěny vhodné pěstební podmínky ve skleníkových prostorech s dostatečným osvětlením do doby získání semenného materiálu z regenerovaných rostlin po provedené polyploidizaci. Pracovní postup a. Příprava donorových rostlin před odběrem prašníků, kontrola vývojového stádia mikrospor b. Odběr klasů ve vhodné vývojové fázi (jednojaderné střední až pozdní vývojové stádium mikrospor) a jejich umístění do chladové komory na dobu 14 – 21 dnů při 2-5o C c. Extirpace prašníků a jejich nasazení na kultivační médium s NAA a kinetinem, maltózou a Gelritem d. Kultivace prašníků při 28oC v termostatu – indukční fáze 4-6 týdnů e. Pasážování mikrosporiálních kalusů případně pylových embryí na regenerační médium a kultivace v kultivační komoře s regulovaným světelným a teplotním režimem. V případě nutnosti pasážování na médium pro podporu tvorby kořenů. f. Převedení zelených regenerujících rostlin ex vitrum a jejich kultivase ve skleníku s řízeným světelným a teplotním režimem g. Kolchicinace mladých rostlin aplikací 0,05% vodného roztoku kolchicinu v DMSO h. Dopěstování regenerantů a získání semenného materiálu v technickém izolátu (zaizolované klasy) Vyhodnocení experimentálních dat Z výsledků četností tvorby pylových embryí, případně mikrosporiálních kalusů, v závislosti na použitém genotypu, lze odvodit parametr účinnosti indukční fáze, z frekvence tvorby zelených regenerantů pak podíl albikátních rostlin a celkovou regenerační schopnost. Podíl dihaploidů po aplikaci kolchicinu vypovídá o účinnosti polyhaploidizace. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Kritické místo pracovního postupu je jeho náročnost na pracovní kapacity při odvozování prašníkových kultur. Finančně náročná je kromě pracovních kapacit i oblast kultivace explantátů a regenerantů v řízených podmínkách kultivačních komor a skleníků. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Účinnost produkce dihaploidních linií s využitím prašníkových kultur je ve své podstatě ovlivněna genotypem. Indukční schopnost, schopnost regenerace a podíl albikátních rostlin jsou tři hlavní komponenty, které jsou řízeny různými soubory genů a tím je dána poměrně významná závislost produkce dihaploidních rostlin na výchozím genotypu. Nevýhodou je omezení pro odběr explantátů na poměrně úzké vývojové období mikrospor, proto je optimální pro aplikaci prašníkových kultur rozložit pěstební období do celoročního provozu, například využitím růstových komor pro napěstování donorových rostlin. Tím se zároveň řeší kapacitní omezení daná pracovní náročností při zakládání prašníkových kultur.

Přednosti metody, možnosti rozšíření Tvorba dihaploidních linií je jednou z alternativních postupů přípravy stabilních homozygotních materiálů, jak pro případné šlechtitelské aplikace, tak i pro genetické analýzy. metoda umožňuje rychlou fixaci rekombinantních sestav. Na podchycení vhodné sestavy genů je zapotřebí i menší rozsah linií. Odvozené sady dihaploidních linií umožňují i poměrně vhodný materiál pro posouzení šlechtitelské hodnoty zvolené kombinace křížení. Seznam literatury MANNINEN, O.M. (2000). Associations between anther-culture response and molecular markers on chromosomes 2H, 3H and 4H of barley (Hordeum vulgare L.). Theor. Appl. Genet. 100: 57-62. MARCHETTI, S., GIORDANO, A., PAPPALARDO, C., and OLIVIERI, A.M. (1995). Nuclear and cytoplasmic control of anther culture response in barley (Hordeum vulgare L.) Journal of Genet. & Breed. 49: 15-20. Ohnoutková L., Novotný, J., Müllerová, E., Vagera, J., Kučera, L.: Is a could pretreatment really needed for induction of in vitro androgenesis in barley and wheat? In: „Biotechnological Approaches for Utilization of Gametic Cells,COST Action 824 final meeting, Bled, Slovenia,1 to 5 July 2000“, Ed.Borut Bohanec,Ljubljana,2000,p.33370 Ritala A. Mannonen L., Oksman-Caldentey K.-M. (2001) cell biology and morphogenesis: Factors affecting the regeneration capacity of isolated barley microspores (Hordeum vulgare L.) Plant Cell Reports 20: 403-407 Touraev, A., Vincente, O., and E. Heberle-Bors. 1997. Initiation of microspore embryogenesis by stress. Trends Plant. Sci. 297-302. Vagera, J., Ohnoutková, L. (1993): In vitro induction of androgenesis in wheat and barley. Rostl. Výr. 39: 97-114 Další doporučená literatura FORSTER, B.P., and POWELL, W. (1997). Chapter 4, Haploidy in barley. In: In vitro haploid production in higher plants, Vol.4 (Eds Jain SM, Sopory SK and Veilleux RE), pp 99-115. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.

2.4. Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu 2.4.1. Sledováním morfologických znaků 2.4.1.1. Sledováním morfologických znaků a fyziologických vlastností v polních testech Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody U samosprašných obilovin, kam patří i ozimý ječmen, je šlechtitelským cílem dosažení nových rekombinací znaků, homogenity a stálosti vybraných linií. Homogenita je v klasickém výběrovém postupu sledována od genových zdrojů, raných generací po křížení (F3), až po udržovací šlechtění registrovaných odrůd. Shrnutí základních praktických postupů V průběhu celého šlechtitelského procesu jsou sledovány morfologické znaky a fyziologické vlastnosti. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Polní zápisníky, měřící latě, milimetrové měřítko, lupa či binokulár. Pracovní postup Od nejranějších generací jsou sledovány tzv. „třídící“ znaky, u nichž je hodnocení zpravidla jednodušší, rychlejší a s menším počtem variant ( např. 2-řadý nebo 6-řadý, osinatý nebo bezosinný, antokyanové zbarvení oušek listové pochvy, špiček osin či nervů pluchy je nebo není …), z fyziologických vlastností je sledována především ranost a vyrovnanost metání. U kmenů a zkoušek výkonu středních generací pak jsou popisované znaky rozšířené o znaky podrobněji popisující stupeň či intenzitu projevu ( např. růstový habitus, intenzitu antokyanových znaků, postavení praporcovitého listu a klasu, výška porostu … ) a o pracovně náročnější znaky ( chloupkatost listové pochvy, chloupkatost bazální štětičky, postavení postranních sterilních kvítků u 2-řadých ), dále je sledována ranost a vyrovnanost zrání. Jednotlivé homogenní linie jsou popisovány a tříděny, štěpící materiály dále rozkmenovány. U finálních materiálů zařazovaných do předzkoušek je pak vytvořen popis dle klasifikátoru UPOV, je sledována homogenita všech znaků dle klasifikátoru včetně zkoušek na jarovost. Pro popis znaků na klasu a zrnu jsou odebírány vzorky klasů ve voskové zralosti a tyto znaky jsou popisovány za pomoci měřítka a binokuláru ( hustota klasu, chloupkatost břišní rýhy, zoubkatost laterálních nervů pluchy …). Je zakládáno udržovací šlechtění, kde odchylka v kterémkoli znaku znamená vyřazení odlišné linie z UŠ. Vyhodnocení experimentálních dat Sledování homogenity klasových řádků, parcel rostlinných potomstev, zkoušek výkonu a ve vyšších generacích i rozmnožovacích parcel je nutné provádět po celou dobu vegetace, jelikož jednotlivé morfologické znaky mají různé optimální termíny hodnocení. Popisy jednotlivých linií jsou uloženy do protokolů nšl. a v nich jsou dle rodokmenu a popisu v pokročilejších generacích setříděny linie do „rodin“, v rámci nichž jsou izolinie ( linie se shodným popisem ) selektovány na hospodářské znaky. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti

Sledování homogenity šlechtěných materiálů představuje spolu s hodnocením chorob stěžejní část šlechtitelské práce, u materiálů v pokročilejších generacích náročnost s přibývajícími hodnocenými znaky narůstá. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Hodnocení některých znaků může být ovlivněno vnějšími podmínkami, především ročníkovým průběhem počasí. U znaků, kde se jedná o subjektivní hodnocení může být hodnocení ovlivněno chybou ( přehlédnutím odchylky ). Metoda je náročná na odhadnutí optimální fáze vegetace pro některá hodnocení, zvláště těch znaků, které mají jen dočasný projev. Přednosti metody, možnosti rozšíření Tato metoda hodnocení homogenity je rutinně používána šlechtitelskými pracovišti, je nenahraditelná jinými metodami. Popis znaků dle klasifikátoru UPOV je povinnou součástí přihlášek do registračních zkoušek, materiál nehomogenní v některém ze znaků nemůže být v zemích respektujících pravidla konvence UPOV zaregistrován. Seznam literatury Foral, Růžička, Bobek: Klasifikátor rodu Hordeum L., ČAZ-VÚOb Kroměříž (1969) Klasifikátor UPOV TWA/22/16 Rev., 1993

Foto 7 a), b) – Třídícími morfologickými znaky jsou například chloupkatost bazální štětičky a chloupkatost listové pochvy.

2.4.2. Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu sledováním bílkovinných genetických markerů Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., VÚRV Ing. Jana Bradová, VÚRV Použité metody – souborné zhodnocení. 1. Elektroforetická analýza hordeinů ve sloupečcích škrobového gelu 2. SDS PAGE hordeinů 3. PAGE alel esterázových lokusů · Podstata metodického přístupu: Všechny tři metody vycházejí ze skutečnosti, že zásobní proteiny zrna obilovin (u ječmene hordeiny) i enzymový systém esteráz jsou geneticky determinovány určitými lokusy (t.zn. nejsou závislé na vnějších podmínkách – ročníku, výživě, lokalitě, jsou polymorfní a mohou tedy sloužit jako genetické bílkovinné markery pro identifikaci genotypů i pro stanovení jejich homogenity a homo- či heterozygotního stavu. Metody jsou na pracovišti OŠM ve VÚRV prováděny standardním postupem, personál laboratoře má požadovanou erudici a odbornou způsobilost. · Shrnutí základních praktických postupů Základní metodou je SGE hordeinů, kterou lze zjistit poměrně přesně sestavu hordeinových alelických bloků jednotlivých šlechtěných materiálů (linií) – to znamená zjistit jejich rozdílnost a šíři genetického vybavení. Touto metodou lze rovněž zjistit homogenitu jednotlivých linií – jak analýzou dostatečného počtu jednotlivých zrn, tak i analýzou směsného vzorku.U nehomogenních (případně heterozygotních) materiálů je zjištěno více hordeinových linií, buď příbuzných (některé alely shodné) nebo nepříbuzných (možná příměs nebo cizosprášení). Takové materiály je možno z dalšího šlechtění buď vyloučit nebo je ještě dále selektovat. Alternativou k SGE je SDS PAGE hordeinů, od níž lze očekávat přibližně totéž co od SGE, je pracovně i finančně poněkud náročnější, její výhodou je to, že je doporučena UPOV. Metoda PAGE estráz představuje další stupeň zjištění polymorfismu, je vhodná při základní charakterizaci výchozích materiálů. Pro hodnocení homogenity v pokročilém stupni šlechtění již není nutná.

2.4.2.1. Elektroforetická analýza hordeinů ve sloupečcích škrobového gelu Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., VÚRV Ing. Jana Bradová, VÚRV Podstata metody Metoda vychází ze skutečnosti, že zásobní proteiny zrna obilovin (u ječmene hordeiny) jsou geneticky determinovány určitými lokusy (tzn. nejsou závislé na vnějších podmínkách – ročníku, výživě, lokalitě, jsou polymorfní a mohou tedy sloužit jako genetické bílkovinné markery pro identifikaci genotypů i pro stanovení jejich homogenity a homo- či heterozygotního stavu. Metoda je prováděna podle ČSN 46 1085-1 (Pšenice obecná a ječmen, Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty, část 1: elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE). Shrnutí základních praktických postupů Elektroforetické rozdělení příslušné frakce (prolaminy – hordeiny) zásobních bílkovin zrna ječmene ve škrobovém gelu v kyselém prostředí. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Chemikálie: etanol, methylenová zeleň, mléčnan hlinitý, kyselina mléčná, škrob pro elektroforézu, močovina, kyselina trichloroctová, nigrosin rozpustný ve vodě. Přístroje: přístroj pro elektroforézu ve skleněných trubičkách, zdroj stejnosměrného proudu (min. 300V, 100mA), lab. centrifuga, olejová vývěva, analytické váhy, laboratorní předvážky. Sklo, laboratorní pomůcky: skleněné trubičky o vnitřním průměru 5,5-6,0 mm a délce 120-130 mm, 250 ml zábrusová baňka s kulatým dnem, skleněný nástavec pro odvzdušnění gelu, kádinky, plynový kahan, vodní lázeň, automatická pipeta, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), gumová hadička o vnitřním průměru 4 mm, plastové kroužky o vnějším průměru 21 mm, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, gumový balonek s hadičkou, stojany, skleněné zkumavky, plastová střička 250 ml, laboratorní teploměr, třepačka Vortex. Pracovní postup Roztoky: extrakční roztok: 65% etanol (V/V) s 0,1 g methylenové zeleně ve 100 ml; elektrodový pufr: 1,5 g mléčnanu hlinitého a 2,5-2,8 ml kyseliny mléčné (h=1,2 g . cm-3) se doplní do 1000 ml destilovanou (deionizovanou vodou) – pufr má mít pH 3,1-3,2. Pufr lze uchovávat při teplotě 4° – 8°C nejdéle 1 týden; gelový pufr: 0,75 g mléčnanu hlinitého a 1,5 – 1,7 ml kyseliny mléčné se doplní do 500 ml destilovanou vodou. Pufr lze uchovávat při teplotě 4° – 8°C nejdéle 1 týden; fixační roztok: 100 g kyseliny trichloroctové se doplní vodou do 1000 ml; barvicí roztok: 0,2 – 0,3 g nigrosinu se rozpustí a dobře rozmíchá v 1000 ml destilované vody. Příprava gelu a gelových sloupečků: pro přípravu 25 sloupečků škrobového gelu se do 250 ml skleněné zábrusové baňky odváží 8,5 g škrobu pro elfo a důkladně se smísí s 80 ml gelového pufru. Směs se během 5 minut zahřeje na vodní lázni na teplotu 72°-75°C a přidá se 9,6 g močoviny, která se dokonale rozpustí. Směs se

stále míchá a ochladí se pod tekoucí vodou na telotu cca 55°C a během 15 s se zbaví vzduchových bublin pomocí olejové vývěvy. Škrobový gel teplý přibližně 50°C se poté nasáváním naplní do skleněných trubiček až ke značce ve výšce 110 mm. K nasávání a ke stabilizaci gelu v trubičce se uplatní nasazená gumová hadička o délce cca 100 mm, která se přehne a zajistí kroužkem. Trubičky naplněné gelem se po 25 ks umístí do kádinky o objemu 250 ml, na jejíž dno se předem nalije vrstva cca 10 mm gelu. Sloupce gelu se nachají v trubičkách ztuhnout při laboratorní teplotě po dobu 16 – 24 hodin. Extrakce proteinů (hordeinů): Zrna ječmene se jednotlivě rozdrtí (např. kladívkem mezi listy hladkého papíru) a drť* se vloží do plastové centrifugační kyvety, přidá se 0,2 ml extrakčního roztoku , kyvety se uzavřou, směs se promíchá pomocí Vortexu, ponechá se stát při laboratorní teplotě 20 minut, poté se znovu promíchá a uloží na 16 hodin do chladničky. Následně se extrakty odstředí po dobu 2 minut a supernatanty se nanesou pomocí automatické pipety na povrch připravených sloupečků škrobového gelu (0,04 ml /trub.) a zasypou se škrobem pro elektroforézu tak, aby na povrchu sloupce zůstala tenká vrstvička sypkého škrobu. *) v případě směsného vzorku se do centrifugační kyvety odváží 0,05 g šrotu Elektroforéza: Skleněné trubičky se škrobovým gelem a extrakty se upevní do horní nádoby elektroforetického přístroje a jeho dolní katodová část se naplní elektrodovým pufrem vytemperovaným na 20°C. Tímtéž elektrodovým pufrem se opatrně převrství (např. injekční stříkačkou s jehlou) škrobem zasypané extrakty ve skleněných trubičkách, potom se elektrodovým pufrem doplní horní anodová nádoba přístroje. Ze stabilizovaného zdroje se na elektrody přivede proud o stálé intenzitě 1,5 mA/trub. Potřebné napětí se nastaví automaticky. Tyto podmínky se udržují po dobu 15 – 20 minut, kdy vstoupí extrahované bílkoviny do gelu. Pak se proud přeruší, trubičky s gelem se vyjmou z přístroje, zasypávací škrob se z nich odstraní proudem destilované vody ze střičky , potom se trubičky vloží zpět do elektroforetického přístroje, převrství znovu pomocí injekční stříkačky elektrodovým pufrem, kterým se znovu naplní horní nádoba přístroje a přivede se proud v dané polaritě a stálé intenzitě 1,5 mA/trub. Celková doba trvání elektroforézy se určí podle průchodu barevného markeru (methylenové zeleně) tak, že se doba průchodu markeru násobí koeficientem 1,5. Fixace, barvení, odbarvení: Po ukončení elektroforézy se přeruší proud, trubičky se vyjmou z přístroje, gely se z trubiček vytěsní mírným tlakem vzduchu (např. pomocí gumového balonku s hadičkou) do připravených skleněných zkumavek s fixačním roztokem, kde se ponechají v klidu 30 minut. Fixační roztok se slije a do zkumavek se nalije barvicí roztok nigrosinu. který přes noc obarví rozdělené bílkovinné složky. Pak se barvicí roztok slije a přebytečné barvivo se z gelu odstraní vodou z vodovodu, která se během 3 hodin celkem 3x vymění. Vyhodnocení experimentálních dat Identifikace alel hordeinových lokusů Hrd A, Hrd B a Hrd F se provede podle publikovaného katalogu hordeinových alelických bloků (Šašek et al., 1990). Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Použití uvedené metody je ve srovnání s metodami elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE) relativně nerizikové z hlediska bezpečnosti práce, finančně méně náročné než PAGE, časová, pracovní a kapacitní náročnost je u obou metod (SGE a PAGE) shodná. Výsledky elektroforetických analýz 24 jednotlivých zrn (nebo směsných vzorků) mohou být k dispozici za 48 hodin. Odborně nejnáročnější část analýz představuje vlastní vyhodnocení výsledků – identifikace alel hordeinových lokusů, které vyžaduje vysoce erudovaného zkušeného odborníka. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody může být nedodržení přesného pracovního postupu v jakémkoli kroku (např. příprava gelu, pH pufru, atd.), nevýhodou elektroforézy v trubičkách obecně je obtížná porovnatelnost jednotlivých elektroforeogramů ( u uvedené metody je však tato nevýhoda zeslabena genetickou interpretací výsledků). Přednosti metody, možnosti rozšíření Předností metody je její relativní zdravotní nezávadnost a zvláště možnost genetické interpretace (vyjádření výsledků ve formě hordeinového vzorce) získaných výsledků. Seznam literatury Šašek, A.,Bradová, J., Černý, J., Necvetajev, V.P.: A Catalogue of lektrophoretic Hordein spectra in assortment of Winter Barley varieties and new varieties. Sci. Agric. Bohemoslov. 22,1990,No 1, 11-22. Bradová ,J., Sýkorová, S., Šašek, A., Černý,J.: Identification of common barley varities by parallel electrophoresis of hordeins and esterases. Rostl. Výroba,47,2001(4):167-173. Další doporučená literatura ČSN 46 1085-1 Český normalizační institut Praha Černý, J., Šašek,A.: Využití elektroforetické analýzy BGM k charakteristice odrůd odrůd pšenice a ječmene.ÚZPI Praha 1998 Černý, J., Šašek,A.: Stanovení odrůdové pravosti pšenice a ječmene elektroforézou bílkovinných genetických markerů. Metodiky pro zemědělskou praxi. ÚZPI Praha 1998

Šašek, A., Černý, J., Sýkorová,S., Bradová, J.: Inovvané katalogy bílkovinných genetických markerů pšenice seté a ječmene. ÚZPI Praha 2000.

2.4.2.3. Elektroforetická analýza alel esterázových lokusů Est-1, Est-2, Est-4 a Est-5 v polyakrylamidovém gelu Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., VÚRV Ing. Jana Bradová, VÚRV Podstata metody Elektroforéza esteráz v 7 denních listech ječmene (modifikovaná metoda podle Davise a Jonese) modifikace Sýkorová (VÚRV) představuje další možnost jak rozšířit škálu genetických markerů u odrůd ječmene, u nichž je genetický základ poměrně úzký. Esterázy v listech ječmene jsou poměrně polymorfní enzymový systém. Shrnutí základních praktických postupů Pro analýzy je třeba vypěstovat v laboratoři 7 denní zelené listy, při extrakci enzymů a manipulaci s extrakty je třeba pracovat při nízkých teplotách, aby nedošlo ke ztrátě aktivity nebo k denaturaci. Potřebné technické vybavení Chemikálie: Akrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Bisakrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Tris(hydroxymethyl)methylamin (TRIS) Persíran amonný (APS), TEMED (NNN´N´- tetramethylaethylendiamin) Ledová kyselina octová, Glycin, Dimethylformamid (DMF), Riboflavin, Sacharoza, Glycerol, NaH2PO4, Na2 HPO4, 1-naftylacetát, 2- naftylacetát Fast Blue RR , Bromfenolová modř. Přístroje: Může být použit libovolný systém pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu ne více než 1.5 mm. (např. OWL Pinguin 14x16 cm) použitý zdroj stejnosměrného proudu by mít možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí (např. zdroj Desaga PS 600 ), chladicí termostat (např. Frigostat Desaga), chladnička, chlazená centrifuga, prosvětlovací panel, zdroj UV světla (zářivka), analytické váhy, laboratorní předvážky, laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo,porcelánové třecí misky s tloučky, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), skleněné nádoby na inkubaci gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná syringe Hamilton, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky – rouška, rukavice! Pracovní postup Roztoky: Extrakční pufr: 0,1 M Tris – HCl pH 7,5 s 10% glycerolu ( 2,42 g Tris, 1,125 ml konc.HCl a 20 ml glycerolu) doplnit do 200 ml destilovanou vodou. Elektrodový pufr pH 8,3: 0,025 M Tris a 0,19 M glycin : 3,02 g Tris a 14,2633 g glycinu – doplnit do 1 l destilovanou vodou, pH upravit 0,175 ml konc. HCl Gelové roztoky: A: pH 8,9 Tris 73,2 g; TEMED 0,46 ml; 13,8 ml konc.HCl; dest. voda do 200 ml – skladovat v lednici B: pH 6,7 Tris 2,99 g; TEMED 0,2 ml; 19-23 kapek konc.HCl; dest. voda do 50 ml – skladovat v lednici C: Akrylamid 56 g; BIS – akrylamid 1,468 g ; dest. voda do 200 ml (koncentrace je 28,73% - neskladovat v lednici) – opatrně manipulovat v rukavicích!! D: Akrylamid 10 g; BIS – akrylamid 2,5 g ; dest. voda do 100 ml (koncentrace je 12,5% - neskladovat v lednici) – opatrně manipulovat v rukavicích!! E: Persíran amonný 70 mg / 100 ml roztoku (voda) – vždy čerstvě! F: Riboflavin: 2 mg / 50 ml roztoku (voda) – vždy čerstvě! G: Sacharoza 40% : 40 g sacharozy a 60 ml dest. vody Fosfátový pufr pH 6,4: 9,1 g NaH2PO4 a 12,1 g Na2 HPO4 doplnit do 1 l destilovanou vodou (rozpouští se pomalu) Pufr 0,25 M Tris-HCl pH 6,8: 6,1 g Tris; 3,56 – 4,12 ml konc. HCl (podle šarže) – doplnit do 200 ml dest. vodou – měřit pH pomocí phan papírků Vzorkový pufr: („sample buffer“ – Jones): 10 ml 0,25 M Tris-HCl pH 6,8; 0,9926 g sacharozy; 2 mg bromfenolové modři (lze dlouho skladovat v lednici) Zastavovací roztok: 7 % kyselina octová: 70 ml ledové kys. octové a 930 ml destilované vody Substráty a kopulační barvivo: na 1 gel : 10 mg 1-naftylacetátu + 10 mg 2- naftylacetátu – rozpustit v 1 ml dimethylformamidu 100 mg Fast Blue RR rozpustit v 1 ml dimethylformamidu vše vmíchat do 100 ml fosfátového pufru (5) – těsně před detekcí a tak připravit detekční roztok. Příprava gelů - veškerá manipulace v rukavicích! spodní dělicí gel: A 9 ml , C 18 ml, voda 9 ml , E persíran 36 ml – smíchat, nalít mezi skleněné desky, opatrně injekční stříkačkou převrstvit vodou a nechat cca 30 minut polymerovat, potom vodu slít a opatrně vysušit povrch

gelu filtračním papírem horní zaostřovací gel: B 3,5 ml, D 11,2 ml, F riboflavin 3,5 ml, G sacharoza 14 ml, smíchat v uvedeném pořadí, nalít na spodní gel, vložit hřebeny a nechat cca 20 minut polymerovat na UV světle (zářivky). (Při míchání gelu chránit před přímým slunečním světlem, jinak zpolymeruje velmi rychle ještě v kádince!), po zpolymerování horního gelu vyjmout hřebeny, vyjmout desky s gelem ze sáčků, promýt jamky injekční stříkačkou s elektrodovým pufrem, naplnit jamky el. pufrem a vložit desky s gelem do přístroje a nanést vzorky. Extrakce enzymů První list z každého klíčence ustřihnout, každý zvážit, rozstříhat na malé kousky a ve vychlazené třecí misce rozetřít s 10násobným objemem vychlazeného extrakčního pufru, přenést do malých (1,5 ml) centrifugačních kyvet bez víček – ty vložit do větších (10 ml) kyvet pro centrifugu K 24. Centrifugovat při -4°C 10 minut při 10 000 ot/min., potom přepipetovat 100 ?l čirého supernatantu do jamek titrační destičky, kde je 5 ?l vzorkového pufru . V jamkách promíchat skleněnou tyčinkou a uchovávat v lednici. Takto připravené extrakty nanášet na gel (30 ?l/kapsu). Elektroforéza Vychladit elektroforetický přístoj pomocí Frigostatu na 2°C (trvá to cca 1 hod.). Do jamek v gelu nanést Hamiltonkou po 30 ?l vzorku (podvrstvit opatrně pod pufr), naplnit vychlazeným elektrodovým pufrem vrchní (+) a spodní (-) elektrodový prostor (celkem 600 ml), uzavřít víkem a připojit ke zdroji proudu. Nastavit počáteční podmínky elfo: 50 mA a 300 V. Spustit zdroj. Stabilizuje se proud 50 mA . Jakmile markerovací modré čelo projde horním gelem (cca po 30 minutách), zvýšit proud na 75 mA. stabilizuje se napětí cca 300 V. Elektroforéza probíhá tak dlouho, dokud modré čelo nedoputuje cca 2 cm k dolnímu okraji gelu (cca za 2 hod. 50 min.).Vypnout zdroj, vyjmout gel z přístroje a vložit jej do detekčního roztoku Detekce esterázových alel - veškerá manipulace s detekčním roztokem v rukavicích ! Gely ponechat cca 15 – 20 minut v detekčním roztoku, mírně nakláněním nádoby promíchávat roztok, chránit před přímým slunečním světlem. Jakmile se objeví hnědé a červené proužky esteráz, nenechat je příliš rozdifundovat. Slít detekční roztok, který poměrně rychle tmavne, a přelít gely zastavovacím roztokem, ponechat je v něm cca 20 min. za mírného promíchávání nakláněním, potom slít zastavovací roztok a přelít gely destilovanou vodou. Takto jsou již esterázy ustáleny. Vyhodnocení experimentálních dat Vyhodnocení provést na plošném prosvětlovači pomocí publikovaných alel etalonových odrůd, které byly naneseny na gel současně se vzorky. Osvědčilo se použití odrůd Atlas(Al, Fr, At, Pi); Drost ( Ca,Dr,Nz,Pi) a Rikote ( Pr,Fr,Su, Ri), které mají rozmanitou sestavu esterázových alel. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Uvedená metoda je časově náročnější i pracovně náročnější než SGE a SDS PAGE hordeinů vzhledem k tomu, že enzym se extrahuje z listů. Testované materiály musejí mít dostatečnou klíčivost, aby bylo možno získat 7denní zelené listy, také příprava gelů a detekce enzymových alel je poněkud citlivější na dodržení všech metodických podmínek. Podmínkou je přítomnost etalonových spekter z odrůd etalonů na gelu společně se vzorky. Také tyto materiály je třeba udržovat a obnovovat. Rovněž u této metody je při vyhodnocování výsledku použita genetická interpretace pomocí známých alel, což je výhodou. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Neklíčivé materiály nemohou být tímto způsobem analyzovány. Roztoky akrylamidu a bisakrylamidu, jakož i detekční roztoky substrátů jsou vysoce toxické, proto je třeba bezpodmínečně používat OOPP, tato metoda klade vyšší nároky na kvalitu provedení (vyškolení pracovníků). Vyhodnocení výsledků vyžaduje určitou zkušenost. Přednosti metody, možnosti rozšíření Použití metody je vhodné pro případy, kdy zjistíme shodnou sestavu hordeinových lokusů u genotypů, které chceme dále rozlišit – tento další systém může, ale také vždy nemusí znamenat rozšíření polymorfismu genetických markerů. Seznam literatury Sýkorová,S.-Šašek, A.: Alely esterasových lokusů u souboru českých odrůd jarního a ozimého ječmene obecného (Hordeum vulgare L.). Gen. a Šlecht., 32,1996(2):123-134. Další doporučená literatura Černý, J., Šašek,A.: Využití elektroforetické analýzy BGM k charakteristice odrůd odrůd pšenice a ječmene.ÚZPI Praha 1998 Černý, J., Šašek,A.: Stanovení odrůdové pravosti pšenice a ječmene elektroforézou bílkovinných genetických markerů. Metodiky pro zemědělskou praxi. ÚZPI Praha 1998 Šašek, A., Černý, J., Sýkorová,S., Bradová, J.: Inovvané katalogy bílkovinných genetických markerů pšenice seté a ječmene. ÚZPI Praha 2000.

2.4.3. Pomocné metody Jako pomocné metody ověřování homogenity lze využít veškeré testovací postupy, při nichž je identifikováno genetické založení, především testy na specifickou odolnost chorobám. V rámci projektu bylo ověřováno využití testování na specifickou odolnost k padlí (Podobně lze využít i např. testování specifické odolnosti rzi ječné, testování rezistencí pomocí molekulárních markerů a pod. ). Tyto pomocné metody jsou cenné zvláště v případě, že nelze jednotlivé linie odlišit na základě morfologických znaků. 2.4.3.1. Testování specifické odolnosti k padlí Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Při testech na specifickou odolnost padlí je provedena identifikace genů odolnosti testovaných rostlin. U některých materiálů, ač morfologicky homogenních, se může ukázat, že jde o materiál složený z více linií s rozdílnými geny odolnosti k padlí. Shrnutí základních praktických postupů Identifikace genů specifické odolnosti k padlí slouží rovněž jako pomocná metoda ověření homogenity testovaných linií v pokročilých generacích výběrového postupu. Slouží především pro založení udržovacího šlechtění tak, aby nedošlo ke ztrátě požadované rezistence či změně materiálu v průběhu UŠ. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Specializované pracoviště zabývající se testy specifické odolnosti. V rámci projektu bylo využito testů specifické odolnosti padlí travnímu na externím pracovišti – ZVÚ Kroměříž, s.r.o., za laskavé spolupráce Ing. Antonína Dreiseitla, CSc. Pracovní postup Každoročně sestavená kolekce materiálů ozimého ječmene z pokročilých generací je zařazována do testů na specifickou odolnost padlí. Vyhodnocení experimentálních dat Materiály nehomogenní ve specifické odolnosti k padlí nemohou být považovány za čisté linie, přestože klasifikátor UPOV tento znak neuvádí. Pro zachování stálosti vlastností je nutné dosažení homogenity specifických odolností. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Testy na specifickou odolnost jsou náročné na speciální vybavení pro samostatné udržování ras ( izolátů ) patogena a velmi náročné na odbornost a zkušenost hod-notitele. Cena za otestování 1 vzorku ve 2 opakováních je v současnosti 1600,- Kč. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Testování celou škálou izolátů, jež je pro posouzení homogenity nezbytné, je nad kapacitní možnosti šlechtitelských stanic a je možné je provádět (na limitovaném počtu vzorků) na specializovaných výzkumných pracovištích, na nich zároveň probíhá i sběr a identifikace nových ras patogena. Přednosti metody, možnosti rozšíření Metoda zpřesňuje hodnocení homogenity šlechtitelských materiálů. Na výzkumných pracovištích ( ZVÚ Kroměříž ) je používána, neustále zpřesňována (zařazováním nových izolátů) a je formou servisu k dispozici šlechtitelským firmám. Seznam literatury Dreiseitl, A., Metodiky a výsledky testů 2000-2003

2.5. Testování dalších hospodářských vlastností Nedílnou součástí šlechtitelského postupu je sledování všech hospodářských vlastností (ranost, nepoléhavost, vhodnost pro mechanizovanou sklizeň, odolnost stresovým faktorům, výnos, kvalita zrna atd.). Jelikož klíčovou součástí projektu je resistentní šlechtění, byly do rámce projektu zahrnuty i používané postupy sledování a testování odolnosti k houbovým chorobám. 2.5.1. Sledování odolnosti houbovým chorobám 2.5.1.1. V polních podmínkách Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Sledování intenzity napadení houbovými chorobami v přirozeném výskytu a zachycení rozdílů v napadení patří ke stěžejním součástem šlechtitelské práce. Shrnutí základních praktických postupů Šlechtitelský materiál je od nejmladších generací sledován na odolnost k chorobám v přirozeném výskytu polních

podmínek. Z houbových chorob jsou u ozimého ječmene hodnoceny ( bonitací ) choroby způsobující (zhoršující) vyzimování, listové choroby, choroby v klasu a choroby pat stébel. Choroby způsobující (zhoršující) vyzimování Paluška travní (Typhula itoana) Plíseň sněžná ( Fusarium nivale ) Listové choroby ( na listu, listové pochvě, stéble ) Padlí travní (Blumeria graminis) Rez ječná (Puccinia hordei) Rez travní (Puccinia graminis) Rez plevová (Puccinia striiformis) Rhynchosporiová skvrnitost (Rhynchosporium secalis) Hnědá skvrnitost „net typ“ (Pyrenophora teres ssp. teres) Ramulariová skvrnitost (Ramularia collo-cygni) Komplex hnědých skvrnitostí „spot typ“ (Pyrenophora teres ssp. maculata, Helmintosporium sativum, nespecifické skvrnitosti) Choroby klasu Listové choroby přecházející do klasu (na klasové vřeteno, osiny, plevy, pluchy či zrno ) Fusariozy klasů (Fusarium culmorum, F. nivale aj. fuzaria) Choroby pat stébel ( bonitace výskytu „běloklasosti“, nebo na odebraných stéblech ) Ophiobolus graminis, Pseudocercosporella herpotrichoides, Fusarium spp., Rhizoctonia spp. Dále je sledován výskyt snětí (Ustilago nuda, U. hordei) a pruhovitosti (Helmintosporium gramineum), výskyt však není bonitován, napapadené rostliny jsou vyselektovány a je poznamenán počet napadených rostlin na parcelu. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Polní zápisníky, výpočetní technika. Pracovní postup Napadení jednotlivými chorobami je hodnoceno ve 2 fázích, a to zaznamenání prvního výskytu a bodové vyhodnocení maximálního výskytu. Při bodovém hodnocení je používána stupnice 9-1 (9 bez napadení), přičemž u hodnocení kmenů a mladších zkoušek výkonu jsou používána většinou pouze lichá čísla stupnice, při hodnocení pokročilejších zkoušek výkonu (od cca F7 generace), pokusů a udržovacího šlechtění je hodnocení zpřesněno využitím celé bodové škály. Hodnocení se provádí dle metodik vydávaných ÚKZÚZ OOZ. Vyhodnocení experimentálních dat Data získaná bonitací jsou ukládána do protokolů, v případě více opakování zprůměrována a porovnávána s kontrolními odrůdami. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Hodnocení chorob je spolu s hodnocením homogenity nejnáročnější a nejobsáhlejší částí šlechtitelské práce. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Hodnocení chorob v polních podmínkách je limitováno jejich přirozeným výskytem v daném ročníku a lokalitě. Umělé infekce lze využít jen na omezeném rozsahu materiálu, pouze u některých chorob, a nemohou tudíž nahradit hodnocení při plošném výskytu choroby. Metoda je vhodná pro dosažení polní odolnosti, odolnost specifickou je nutné testovat jinými metodami. Při polním hodnocení chorob jde z větší části o subjektivní hodnocení, jež je do značné míry závislé na zkušenostech hodnotícího pokusníka, a to jak co do přesnosti, tak i do rychlosti, tedy do objemu vyhodnoceného materiálu. Důležitá je správná volba termínu hodnocení. Náročnost hodnocení se zvyšuje při výskytu více chorob současně ( což je obvyklé ). Výsledky s dostatečnou vypovídací schopností lze získat z více ročníků, lokalit a opakování s výskytem choroby. Přednosti metody, možnosti rozšíření Polní hodnocení chorob je standardní, rutinně používanou metodou na všech šlechtitelských pracovištích, umožňuje vyhodnocení velkého objemu materiálu. Seznam literatury Metodika Ústředního kontrolního a zkušebního ústavu zemědělského v Brně pro zkoušky užitné hodnoty odrůd ozimého ječmene (srpen 2000, doplňky 2001-2003)

Foto 8 – Bloky pokusů – Lužany 2003

2.5.1.2. Laboratorními ( skleníkovými ) infekčními testy Padlí travní Hnědá skvrnitost Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Vybraná kolekce finálních materiálů (linií v pokročilých generacích šlechtění) je každoročně testována na specializovaných testovacích pracovištích pomocí laboratorních (skleníkových) testů na odolnost k houbovým chorobám. V rámci šlechtitelského programu ozimého ječmene je využíváno testování na specifickou odolnost k padlí travnímu (Ing. Dreiseitl, CSc., ZVÚ Kroměříž, s.r.o.) a testování na odolnost hnědé skvrnitosti (Ing. Minaříková, ZVÚ Kroměříž, s.r.o.). Do těchto testů byly zařazeny i kolekce sestavené v rámci projektu QE1107. Shrnutí základních praktických postupů Padlí travní (Blumeria graminis) – kolekce vzorků ozimého ječmene je testována umělou infekcí klíčních rostlin rasami ( izoláty ) patogena se známou virulencí (překonávající určitou část genů specifické rezistence). K identifikaci genů specifické odolnosti je od roku 2003 používáno 32 patotypů padlí travního, jež jsou v izolaci udržovány a kultivovány. Projev napadení patotypy padlí na jednotlivých rostlinách je obodován stupnicí 0-4 a dle reakce vůči všem patotypům kolekce jsou identifikovány geny specifické odolnosti testovaného materiálu k padlí travnímu. Hnědá skvrnitost (Pyrenophora teres) - kolekce vzorků je testována umělou infekcí klíčních rostlin ve skleníku sběry z několika lokalit vyčištěnými a namnoženými v izolaci, napadení jednotlivými izoláty je obodováno stupnicí 0-4, data jsou zanesena do tabulek, samostatně je pak vypočítán průměr hodnocení odolnosti k čárkovité ( síťovité ) formě = „net typ“ (P. teres ssp. teres) a ke skvrnité formě = „spot typ“ (P. teres ssp. maculata). Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Specializované pracoviště vybavené na sběr, izolaci a kultivaci patogenů. Pracovní postup Vzorky o hmotnosti 50g jsou zasílány smluvnímu partnerovi ve sjednaném počtu poštou nebo vlastní dopravou, v kolekci je vždy zařazeno několik kontrolních odrůd se známou rezistencí. Vlastní testování probíhá dle metodik testovacích pracovišť a to minimálně ve 2 opakováních. Vyhodnocení experimentálních dat Data jsou zasílána z testovacích pracovišť v tabulkové podobě s komentářem. Po kontrole a porovnání zařazených standardních odrůd jsou protokoly z testů zařazeny do šlechtitelské dokumentace. K výsledkům testů je přihlíženo ve výběrovém postupu ( selekce linií ) a jsou používány k popisům finálních materiálů. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Testy na specifickou odolnost jsou náročné na speciální vybavení pro samostatné udržování ras ( izolátů )

patogena a velmi náročné na odbornost a zkušenost hod-notitele. Cena za otestování 1 vzorku ve 2 opakováních je v současnosti 1600,- Kč za testování specifické odolnosti padlí (identifikací genů odolnosti) a 600,- Kč za otestování 1 vzorku na hnědou skvrnitost. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Testování širokou kolekcí izolátů pro identifikaci genů odolnosti je nad kapacitní možnosti šlechtitelských pracovišť. Běžně je však používáno testování umělou infekcí užším spektrem patotypů (příp. i směsí patotypů), jež překonávají geny rezistence bez praktického významu ( v praxi neúčinné ) a pomocí nichž lze identifikovat geny s vysokou či plnou účinností. Přednosti metody, možnosti rozšíření Metoda identifikace specifických genů odolnosti k padlí umožňuje přesný popis založení rezistence testovaných linií a zároveň je využívána pro ověření homogenity. Skleníkové infekční testy jsou méně závislé na průběhu počasí a nezávislé přirozeném výskytu patogena, než polní hodnocení, mohou být prováděny téměř celoročně ( s výjimkou nejteplejších měsíců ), předností je obzvláště využití období vegetačního klidu. Testování umělou infekcí užším spektrem patotypů pomocí nichž lze identifikovat geny s vysokou či plnou účinností je zvládnutelné na šlechtitelských pracovištích. Zkušenosti získané při skleníkových testech lze uplatnit pro zavedení polních infekčních testů.

2.6. Získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů 2.6.1. Prostřednictvím genové banky 2.6.1.1. Získávání, testování, popisování, dlouhodobé ukládání, obnovování sortimentu - Metodika hodnocení GZ ozimého ječmene Ing. Zdeněk Stehno, VÚRV Podstata metody Hodnocení genetických zdrojů (GZ) ozimého ječmene je obdobné jako u GZ ostatních obilnin. Obecným cílem je zhodnocení co nejširšího spektra znaků a vlastností, důležitých pro praktické využití shromážděných vzorků v kolekci. Z pracovních důvodů však je většinou nutné soustředit se na charakteristiky nejvýznamnější, které mají současně nízkou interakci s prostředím. Základním principem systému je každoroční hodnocení přírůstků kolekce GZ ozimého ječmene a jejich porovnání s dlouhodobě používanými kontrolními odrůdami. Setrvalé používání kontrol umožňuje i určité porovnání vzorků, hodnocených v různých letech za odlišných podmínek pěstování. Shrnutí základních praktických a pracovních postupů Systém hodnocení sestává z polních pokusů a následných laboratorních rozborů zrna na které navazuje uložení vzorků osiva do genové banky. 1. Polní experimenty Předběžné hodnocení Nově získané vzorky genetických zdrojů ozimého ječmene jsou předběžně hodnoceny ve školce nových genetických zdrojů. Patří mezi ně nově povolené odrůdy v ČR i v zahraničí, šlechtitelské materiály získané z výzkumných pracovišť i krajové odrůdy a příbuzné plané druhy, získané sběrovými expedicemi. Způsob výsevu ve školkách nových GZ závisí na velikosti získaného vzorku. Malé vzorky z genových bank či jiných pracovišť jsou vysévány v řádcích podle množství osiva. Větší vzorky se vysévají bezezbytkovým secím strojem na parcelkách o velikosti 1 - 2,5 m2 V této etapě převažuje jednoduché, subjektivní hodnocení s důrazem na kontrolu zdravotního stavu. Vzhledem k tomu, že se jedná o počátek práce s příslušnou skupinou GZ je důležité co nejpodrobněji podchytit veškeré pasportní údaje tak, aby byly v době zařazení vzorků do kolekce co nejkompletnější. V této fázi se provádí též taxonomické zařazení GZ, včetně odběru kontrolního klasového vzorku (herbářové položky). Z hlediska tvorby kolekce je úkolem předběžného hodnocení zejména vyloučení nevhodných GZ (duplicitní materiály, ekologicky nevhodné GZ, vzorky nevyrovnané nebo mající příliš nízké parametry významných znaků). Údaje získané z předběžného hodnocení slouží především pro řešitele kolekce nebo k doplnění pasportních charakteristik (taxonomické zařazení). Podle výsledků předběžného hodnocení rozhoduje řešitel kolekce o zařazení vzorků do sbírky GZ, což realizuje přidělením národního evidenčního čísla (ECN) a převedením vzorků do vyššího stupně hodnocení. Základní hodnocení Základní hodnocení genetických zdrojů je rozhodující etapou v systému hodnocení GZ ozimého ječmene. Zdrojem materiálů pro tento krok je předchozí stupeň předběžného hodnocení a v některých případech (vzorky nových odrůd získané v dostatečném množství z ekologicky blízkých podmínek) též nově získané GZ. Pokusy jsou zakládány na parcelkách v jednom opakování, vysévaném bezezbytkovým secím strojem v pásech vedle sebe. Rozměry parcelek přesahují velikost jejich sklizňové části a odděleně sklízené čelní okraje slouží k omezení tzv. okrajového efektu. K zajištění relativního porovnání GZ slouží co nejhustší síť parcelek (např. po každých 5 - 10 GZ) s kontrolními odrůdami (v současné době ‚Luran‘ a ‚Tiffany‘).. Hodnocení každého genetického zdroje probíhá po dva roky. Získané údaje mají buď formu bodového ohodnocení znaku, nebo metrického údaje. Metrická data se do podoby

bodového vyjádření převádí následně pomocí ‚Klasifikátoru – genus Hordeum L.‘ ale současně jsou uchovávána v původní podobě. Během základního hodnocení jsou hodnoceny znaky morfologické, fenologické charakteristiky, odolnosti biotickým a abiotickým stresům, je odhadována produktivita GZ, její základní struktura a jsou odebírány vzorky k analýze struktury klasu. Odolnost k biotickým stresům je testována v podmínkách přirozeného výskytu chorob na pokusném stanovišti. Pokusné parcelky a získaná popisná data jsou posuzovány společně s předními šlechtiteli této plodiny a jsou vybírány vhodné zdroje pro šlechtitelské postupy. 2. Laboratorní postupy V laboratorních podmínkách jsou prováděny posklizňové analýzy ke stanovení výnosových prvků. Klasickými postupy je stanovována struktura klasu včetně významné hodnoty, kterou je hmotnost 1000 semen (HTS). Významná jsou laboratorní stanovení ukazatelů kvality zrna, které je hlavním produktem této plodiny. Obsah Nlátek je stanovován modifikovanou automatizovanou Kjeldahlovou metodou. Po upřesnění kalibrace je možno k tomu účelu využívat přístroj NIRS 6500. 3. Uložení vzorků osiva do genové banky Do genové banky jsou ukládány vzorky v objemu doporučovaném pro samosprašné rostliny tj. nejméně 7 000 semen od vzorku. Zásadou je ukládat vzorky z nejčasnějších fází hodnocení z důvodu narůstající možnosti kontaminace (případně záměny) vzorku v průběhu jeho přesévání.

Foto 9 – Školky hodnocení genových zdrojů - Ruzyně Vyhodnocení experimentálních dat Z výsledků dvouletých hodnocení jsou získávány průměry a ty jsou převáděny na bodová ohodnocení jednotlivých znaků. V této formě se získaná data stávají součástí popisné části informačního systému genetických zdrojů EVIGEZ. Potřebné technické vybavení Oddělení genové banky je vybaveno potřebnou maloparcelkovou mechanizací jako je bezezbytkový secí stroj Oyord, sklízecí kombajn Nursery Master Elite a malotraktor pro údržbu cest mezi pokusnými parcelkami. Předseťová příprava a ochrana proti plevelům jsou zajišťovány formou zakázek. Z chemikálií jsou spotřebovávána především umělá hnojiva a pesticidy. Pro laboratorní rozbor jsou k dispozici laboratorní váhy, přístroj Kjeltec a NIRS 6500. Časová a finanční náročnost Časově náročná jsou především příprava a výsev pokusů, provádění záznamů během vegetace a posklizňové

rozbory. Podstatnou část nákladů na hodnocení tvoří mzdy pracovníků dále pak spotřeba chemikálií a PHM . Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Postup hodnocení genetických zdrojů ozimého ječmene je součástí standardní metodiky hodnocení GZ obilnin. Určité úskalí vyplývá z ozimého charakteru plodiny a z relativně nižší zimovzdornosti některých odrůd za nepříznivých podmínek (viz. zimní období 2002/03). Seznam literatury Lekeš, J., Zezulová, P., Bareš, I., Sehnalová, J., Vlasák, M.: Klasifikátor – genus Hordeum L. Genové zdroje č. 27 (1986) 46 p.

2.6.1.2. Režimy poskytování GZ Z genové banky jsou poskytovány vzorky pro výzkumné, šlechtitelské a vzdělávací účely, nikoliv však pro přímé komerční využití. V dohledné době bude genová banka postupovat podle zásad ‚Dohody o výměně GZ‘ (MTA). Převážná část kolekce genových zdrojů ozimého ječmene je v GB VÚRV přístupná pro nekomerční využití (tedy ne pro množení či další prodej) včetně popisu deklarovaných znaků či vlastností, jen u malé části uložených materiálů je poskytování vázané na souhlas autorského pracoviště. 2.6.2. Na šlechtitelských pracovištích 2.6.2.1. Získávání, testování, popisování, krátkodobé ukládání, obnovování sortimentu Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Podstata metody Genové zdroje jsou výchozím materiálem pro šlechtitelskou práci. Dostatečný sortiment GZ s co nejširším spektrem vlastností by měl být k dispozici přímo na šlechtitelském pracovišti. Shrnutí základních praktických postupů Sortiment GZ je udržován, hodnocen a využíván ke křížení. Udržování je prováděno krátkodobým přeskladněním (cca 5 let) a cyklickým přesevem (obnovením), při němž se provádí hodnocení, doplnění popisu a je proveden výběr pro křížení, výběr pro uložení, nebo vyřazení z kolekce. Nejvíce sledovanou součástí kolekce bývají nově získané materiály. Šlechtitelská pracoviště mají možnost získání nových GZ z několika zdrojů: 1. z vlastního novošlechtění, 2. z kolekcí genových bank (nově registrované odrůdy, sběry, …), 3. z jiných šlechtitelských pracovišť (např. výměnou GZ), 4. z výstupů výzkumných pracovišť (prebreeding), 5. z jiných zdrojů (vlastní sběry apod.). Nejcennější GZ pocházející z vlastního novošlechtění jsou ukládány v genové bance k dlouhodobému uložení. Potřebné technické vybavení (chemikálie, přístroje, atd...) Standardní vybavení šlechtitelského pracoviště. Pracovní postup Výsev je prováděn kazetovým secím strojem (např. Wintersteiger Plot-matic), ošetřování dle běžné agrotechniky bez použití fungicidů či morforegulátorů, po celou dobu vegetace je prováděno hodnocení morfologických znaků, fyziologických a hospodářských vlastností, je vytvořena kolekce pro křížení, pro další uložení a vyřazeny materiály nesplňující požadavky na GZ. Vyhodnocení experimentálních dat Kolekce sortimentu s popisem je na šlechtitelském pracovišti evidovaná ve šlechtitelské dokumentaci, každoročně doplňovaná o nové materiály a v ročnících, kdy je prováděna obnova přesevem, je seznam aktualizován. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Udržování sortimentu genových zdrojů na šlechtitelském pracovišti není náročné, vyšší nároky jsou v ročnících, kdy je provedena obnova ( přesev ) kolekce, a to především na hodnocení většího rozsahu vysetého sortimentu. Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Udržování GZ na šlechtitelském pracovišti je rutinní záležitostí, limitován je pouze celkový rozsah udržované kolekce pracovní kapacitou šlechtitelského pracoviště. Pro udržení klíčivosti, při skladování bez možnosti uložení v regulovaných podmínkách, je nutno sortiment častěji obnovovat, než při uložení v GB. U ozimého ječmene je částečné riziko v slabé zimovzdornosti některých GZ. Při častějších přesevech je vyšší riziko kontaminace (příměsí), podmínkou je přesnost a čistota práce při výsevu, sklizni a zpracování a rovněž provádění negativních selekcí.

Přednosti metody, možnosti rozšíření Pro šlechtitele je výhodou stálý kontakt s kolekcí GZ, vyhodnocení sortimentu v podmínkách šlechtitelského pracoviště a nepřetržitá dostupnost osiva, jde o běžný obecně rozšířený postup. 2.6.2.2. Režimy poskytování Část materiálu genových zdrojů je možno poskytovat dalším zájemcům (výzkumná a testovací pracoviště, šlechtitelské firmy). Pracovištím, jež se nezabývají komerčním šlechtěním, je možné poskytování GZ na základě ujednání (smlouvy, dohody), že nebudou poskytnuty třetí osobě ani komerčně využívány. Šlechtitelským pracovištím zabývajícím se šlechtěním mohou být poskytovány pouze GZ pocházející z vlastního šlechtitelského programu a to na základě smlouvy o výměně GZ (může být součástí např. vzájemné testovací smlouvy). Část materiálu z vlastního šlechtění (polotovary s cennými vlastnostmi, např. s novou kombinací vlastností) může být ukládána v genové bance (např. VÚRV) a GB dále poskytována se souhlasem autorského pracoviště, nově registrované právně chráněné odrůdy (uložené v GB již v průběhu registračních zkoušek) mohou být poskytovány jako GZ volně (v případě, že nejsou patentově chráněny, což prozatím u žádné odrůdy ozimého ječmene není). 3. Zhodnocení jednotlivých metod použitých pro řešení dílčích cílů Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. 3.1. Cíl 1. - Testování na odolnost žluté zakrslosti ječmene 3.1.1. Použité metody Při testování rezistence k BYDV byly použity 2 metody: 1) polní infekční testy (standardní) 2) použití molekulárního markeru Ylp detekujícího Yd2 gen (perspektivní) 3.1.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Obě použité metody jsou efektivní, s přímým účinkem na selekci tolerantních, odolných až rezistentních typů. Pro dosažení šlechtitelského cíle vyšlechtění typů ozimého ječmene odolných k BYDV se ukázalo jejich využití nezbytné a šlechtitelský pokrok průkazný. Obě metody však jsou limitovány rozsahem možných testů pro jejich náročnost na materiální, technické a personální zázemí. 3.1.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Metodou polních infekčních testů je zjištěna skutečná odolnost ( úroveň tolerance ) či náchylnost materiálů ozimého ječmene k viru žluté zakrslosti ječmene, nelze jí však odlišit genetické založení odolnosti. V testech byly zařazeny materiály s odolností založenou genem Yd2 a s odolností pocházející z genového zdroje Sigra. V polních testech potomstva obou genových zdrojů vykazovaly podobně různou úroveň tolerance. Naopak metoda použití molekulárního markeru Ylp je schopna detekovat gen Yd2, typ odolnosti pocházející ze Sigry není možné touto metodou zjistit ( molekulární marker pro ni prozatím nebyl zjištěn ). Na základě zjištěných výsledků lze doporučit návaznost obou metod – po otestování v polním infekčním testu materiály se střední tolerancí až rezistencí dále testovat za pomoci molekulárního markeru Ylp k identifikaci genetického založení odolnosti ( genu Yd2 ). 3.1.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Obě metody jsou nezastupitelné, pro testování odolnosti BYDV lze za nezbytnou považovat metodu polních infekčních testů ( pouhé hodnocení v poli při přirozeném výskytu je u BYDV nedostatečné ), nejúčinnější je však využití obou metod v návaznosti, s tím, že pomocí molekulárního markeru je zbytečné testovat materiály, jež v polním testu vykázaly náchylnost. 3.2. Cíl 2. - Testování na odolnost žluté mozaice ječmene 3.2.1. Použité metody Při testování resistence k BaYMV byly použity 2 metody: 1) infekční testy v zahraničí (Německu) na infekčním poli (standardní) 2) použití mikrosatelitního markeru BMac29 detekujícího geny rym4 a rym5 (perspektivní) 3.2.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Obě použité metody jsou vysoce efektivní, s přímým účinkem na selekci rezistentních typů, vliv na šlechtitelský pokrok mají vysoce průkazný. Pro dosažení šlechtitelského cíle vyšlechtění typů ozimého ječmene odolných k BaYMV se ukázalo nezbytné využití alespoň jedné z těchto metod. Dostupnost obou metod se jistě bude lišit dle možností šlechtitelského pracoviště (kontakt na zahraničního partnera či na specializovanou laboratoř molekulární biologie). Využití těchto metod přímo na českém šlechtitelském pracovišti je prozatím nereálné, obě metody jsou však dostupné ve spolupráci s partnery z českého výzkumu a zahraničního šlechtění. 3.2.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod

Tyto 2 metody vykazují vysokou shodu výsledků. Z hlediska dosažených výsledků jsou obě metody rovnocenné. I z výsledků polních infekčních testů lze, při splnění určitých podmínek, odvodit genetické založení zjištěné odolnosti - pokud je provedena vhodná volba alespoň dvou testovacích lokalit, z nichž se na jedné vyskytuje kmen BaYMV-1 (příp. ve směsi s BaMMV ) a na 2. lokalitě je rovnoměrný výskyt BaYMV-2, pak materiály odolné pouze na 1. lokalitě mají s největší pravděpodobností rezistenci založenou genem rym4, materiály vykazující rezistenci na obou lokalitách pak genem rym5. 3.2.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Pro účinnou selekci lze, jak vyplývá z výše uvedeného, volit jednu z obou vyzkoušených metod. Jako nejefektivnější se však jeví jejich využití v návaznosti – po otestování v infekčním poli ( postačuje 1 lokalita v min. 2 opakováních s výskytem BaYMV-1 ) jsou odolné materiály dále testovány pomocí mikrosatelitního markeru BMac29 k detekci genů rezistence. Tím se významně sníží rozsah obou testů a odstraní se duplicita testování náchylných typů. Přitom je dosaženo nejvyššího selekčního účinku a zároveň jsou identifikovány geny rezistence bez nutnosti testování na více lokalitách. 3.3. Cíl 3. - Testování na odolnost stresům zimního období 3.3.1. Použité metody Při testování odolnosti stresům zimy (zimovzdornost, mrazuvzdornost) byly použity a ověřeny 4 metody: 1) Polní testy (standardní) 2) Provokační nádobová metoda hodnocení zimovzdornosti (standardní) 3) Polně–laboratorní metoda hodnocení mrazuvzdornosti ozimého ječmene (standardní) 4) Laboratorní, přesné stanovení mrazuvzdornosti ječmenů (perspektivní) 3.3.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Všechny ověřované přímé metody testování zimovzdornosti a mrazuvzdornosti se ukázaly jako vhodné, efektivní a přímo ovlivňující šlechtitelský pokrok. Každá z metod má své přednosti i negativa. Polní testy je možné provádět v největším rozsahu, jsou nejméně nákladné, umožňují komplexní hodnocení zimovzdornosti, je však nutný vyšší počet opakování, lokalit či ročníků, jsou nejvíce ovlivněny vnějšími podmínkami (průběh počasí, půdní nevyrovnanost apod.), výsledků nebývá dosaženo každoročně. Provokační nádobová metoda umožňuje testovat poměrně velký rozsah materiálu, při použití více variant a lokalit je použitelných výsledků dosahováno pravidelně, negativně se zde však uplatňuje vliv omezeného prostoru pro kořeny, vliv použitého substrátu a povětrnostní vlivy, takže je potřeba více opakování, lépe ročníků. Polně-laboratorní metoda je ze standardních metod nejpřesnější, avšak kapacitně limitovaná (mrazicí boxy, skleník…) a rovněž je nákladnější, než předchozí metody. Ani u této metody se nevyhneme vnějším vlivům (aktuální mrazuvzdornost dle průběhu počasí a vegetace). Při laboratorním přesném stanovení mrazuvzdornosti je možné eliminovat vlivy prostředí, je metodou, jíž je možno stanovit nejvyšší schopnost otužení testovaného genotypu, je však pracovně, kapacitně i finančně nejnáročnější. 3.3.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Jednotlivé přímé metody vykazují dobrou shodu výsledků, mohou být využity souběžně, jako vhodnější se však jeví jejich postupné využití ve šlechtitelském procesu od nejmladších generací (hodnocení v poli od F2), přes střední generace materiálů ve velkých zkouškách výkonu (nádobová provokační metoda cca od F7), po materiály v předzkouškách a registračních zkouškách (polně-laboratorní metoda za dané kapacity nejdříve od F9 generace), laboratorní stanovení mrazuvzdornosti se jeví nejefektivnější u nově získaných genových zdrojů a finálních materiálů – odrůd před registrací (např. pro účely rajonizace a doporučování). 3.3.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Ověřované přímé metody jsou zastupitelné pouze částečně, postupným zařazením ve výběrovém postupu je využito jejich předností a dosažené výsledky jsou cíleně zpřesňovány, aniž by byl šlechtitelský proces limitován kapacitními možnostmi a náročností jednotlivých metod. Teoreticky byly rovněž zvažovány možnosti využití nepřímých metod ve šlechtitelském procesu, ty se však prozatím ukazují jako velmi nákladné. Dosud získané výsledky (viz literatura k bodu 2.2.1.) vykazovaly značnou variabilitu v průkaznosti a shodě s metodami přímými, především v závislost na jednotlivých kombinacích. Nepřímé metody uvedené v bodu 2.2.1. jsou předmětem výzkumu, jejich ověření a zpřístupnění pro šlechtitelské využití by mělo být řešeno v navazujících projektech, prozatím nelze uvažovat, že by jimi byly nahrazeny metody přímé. 3.4. Cíl 4. - Testování na odolnost stresům sucha 3.4.1. Použité metody Při testování odolnosti stresům sucha byly použity 2 metody: 1) Polní testy (standardní) 2) Provokační testy – nádobové (standardní) 3.4.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Obě ověřované přímé metody testování suchovzdornosti se ukázaly jako vhodné, ve šlechtitelském postupu

použitelné, jejich vliv na šlechtitelský pokrok však bude nutno dále ověřovat. Každá z metod má své přednosti i negativa. Polní testy i provokační nádobové testy lze provádět na přibližně shodném rozsahu pokusných členů, obě pro dosažení průkazných výsledků vyžadují minimálně 3 opakování, lokality či ročníky, jsou různou měrou ovlivněny vnějšími podmínkami – u polních testů je větší vliv průběhu počasí a půdní nevyrovnanosti, výsledků nebývá dosaženo každoročně, provokační nádobová metoda při použití více opakování dosahuje použitelných výsledků pravidelně, negativně se zde však uplatňuje vliv omezeného prostoru pro kořeny, vliv použitého substrátu, je závislá na technickém zázemí (skleníky) a je pracnější. 3.4.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Obě metody mohou být využity souběžně nebo postupně u materiálů v předzkouškách a registračních zkouškách (cca od F9 generace), dále pak u nově získaných genových zdrojů a finálních materiálů – odrůd před registrací (např. pro účely rajonizace a doporučování). Testování v ranějších generacích se nejeví jako účelné, mladé materiály jsou v podmínkách ČR selektovány dle adaptace na pravidelně přicházející přísušky v polních podmínkách šlechtitelských pracovišť. 3.4.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Při použití obou metod testování suchovzdornosti nebylo dosaženo optimální shody výsledků, jako účelné pro dosažení šlechtitelského pokroku směrem k suchovzdorným materiálům ozimého ječmene se jeví využití obou metod zároveň. Stejně jako u zimovzdornosti byly i u suchovzdornosti teoreticky zvažovány možnosti využití nepřímých metod stanovení, rovněž zde prozatím nelze uvažovat, že by jimi byly nahrazeny metody přímé. 3.5. Cíl 5. - Homogenizace šlechtitelského materiálu 3.5.1. Použité metody K homogenizaci šlechtitelského materiálu byly využity 2 metody: 1) Klasický výběrový postup (rodokmenová metoda s výběrem klasů či rostlin - standardní) 2) Homogenizace za pomoci dihaploidizace (použití prašníkových kultur in vitro - perspektivní) 3.5.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Rodokmenová metoda je nezbytnou ve výběrovém postupu. Je časově náročná na ustálení některých, zvláště polygenně založených znaků. Využití dihaploidizace lze považovat za nadstavbovou metodu, jež umožňuje homogenizaci znaků, jejichž ustálení klasickým postupem je velmi zdlouhavé, především pro homogenizaci při tvorbě genových zdrojů a materiálů určených pro genetické analýzy a kombinaci geneticky vzdálenějších rodičovských komponent. Účinnost produkce dihaploidních linií je značně závislá na velmi rozdílné responzivitě jednotlivých kombinací, u části kombinací lze dosáhnout velmi dobré výtěžnosti dihaploidních zrn, u těchto linií byl vliv dihaploidizace na šlechtitelský pokrok stabilizací požadovaných rekombinací znaků znatelný, naopak z některých kombinací se nepodařilo dihaploidní rostliny vůbec získat. 3.5.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Při využití dihaploidizace pro přímou tvorbu odrůd se neprokázal vliv na zkrácení šlechtitelského procesu, jelikož i po využití dihaploidizace musí navazovat klasický výběrový postup. Urychlení výběrového postupu je možné některými dalšími metodami, které však nebyly v rámci tohoto projektu ověřovány – metody pěstování více generací v roce: 1) metoda pěstování 2 – 2,5 generace v roce ve skleníku či foliovém krytu (Špunar, et.al.), 2) metoda pěstování druhé generace na jižní polokouli (běžně využívaná šlechtiteli jařin, u ozimů však poněkud problematická pro nutnost jarovizace), 3) metody embryokultur in vitro ke zkrácení generačního cyklu (metoda, jež by mohla vhodně navazovat na využití dihaploidizace, její ověření a využití by mělo být předmětem prací navazujících na projekt QE1107 a doplňujících tuto metodiku). 3.5.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Klasický výběrový postup je nezastupitelnou součástí šlechtitelského procesu, metody dihaploidizace i další metody urychlující šlechtitelský proces lze považovat za nadstavbové, umožňující rychlejšího dosažení šlechtitelského pokroku. 3.6. Cíl 6. - Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu 3.6.1. Použité metody Pro ověřování homogenity šlechtitelského materiálu bylo použito 5 metod: 1) Sledováním morfologických znaků a fyziologických vlastností v polních testech (standardní) 2) Elektroforetická analýza hordeinů ve sloupečcích škrobového gelu (perspektivní) 3) Elektroforetická analýza hordeinů v polyakrylamidovém gelu (perspektivní) 4) Elektroforetická analýza alel esterázových lokusů Est-1, Est-2, Est-4 a Est-5 v polyakrylamidovém gelu (perspektivní)

5) Pomocné metody - Testování specifické odolnosti k padlí (standardní) 3.6.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Všechny použité metody ověřování homogenity vykázaly vysokou efektivitu, mají přímý vliv na šlechtitelský pokrok. Všechny metody jsou pro šlechtění dostupné a přes jejich náročnost využitelné. 3.6.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Sledování morfologických znaků a fyziologických vlastností na šlechtitelských pracovištích je základní a nezastupitelnou metodou, už z toho důvodu, že morfologický popis je základem pro právní ochranu odrůd a homogenitu v těchto znacích ukládají pravidla klasifikátoru UPOV. Metody elektroforetické analýzy hordeinů jsou nadstavbovými metodami zjištění homogenity a odlišnosti šlechtitelských linií. Obě metody jsou prakticky rovnocenné, při využití kompletně popsané kolekce etalonových odrůd zaměnitelné, pouze odrůdy náležející k etalonům E2 a E4 nelze rozlišit SGE, ale pouze SDS-PAGE. Metoda SGE hordeinů je méně náročná a pro pracovníky v laboratoři s nižšími zdravotními riziky, SDS PAGE hordeinů je pracovně i finančně poněkud náročnější, je nutné přísné dodržování bezpečnosti práce s toxickými látkami, její výhodou je to, že je doporučena jako nepovinná součást klasifikátoru UPOV. Obě metody jsou šlechtitelům dostupné, využitelné i v laboratořích šlechtitelských firem. Metoda PAGE estráz představuje další stupeň zjištění polymorfismu, je vhodná při základní charakterizaci výchozích materiálů (genových zdrojů) a k popisu finálních materiálů (vstupních a výstupních odrůd a linií), efekt při použití této metody v průběhu vlastního výběrového postupu nevyvažuje náročnost této metody. Pomocné metody, jako je testování specifické odolnosti k houbovým chorobám, dále zpřesňují posouzení homogenity materiálu, jsou cenné zvláště při zakládání udržovacího šlechtění. 3.6.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení S výjimkou dvou metod elektroforetické analýzy hordeinů jsou jednotlivé metody ověřování homogenity šlechtitelského materiálu nezastupitelné. Jejich postupným využitím ve šlechtitelském procesu je systematicky doplňován popis homogenních šlechtitelských linií a zároveň eliminován (vyřazení či reselekce) heterogenní materiál. 3.7. Cíl 7. - Sledování odolnosti houbovým chorobám 3.7.1. Použité metody V rezistentním šlechtění na odolnost k houbovým chorobám je možné využití mnoha metod od polních pozorování, přes polní infekční testy, laboratorní infekční testy až po využití molekulárních markerů identifikujících některé geny rezistence. Do projektu byly zahrnuty 2 nejčastěji používané metody sledování odolnosti houbovým chorobám: 1. V polních podmínkách (standardní) 2. Laboratorními infekčními testy ( Padlí travní, Hnědá skvrnitost - standardní) 3.7.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok, operativnost a náročnost Obě použité metody jsou efektivní, mají přímý vliv na šlechtitelský pokrok, metoda polních pozorování je méně nákladná, umožňuje selekci na „polní“ rezistenci, je více ovlivněna vnějšími podmínkami a nezaručuje ani při využití dostatku lokalit každoroční výsledky (závisí na infekčním tlaku patogena v daných letech a lokalitách). Laboratorní infekční testy dosahují použitelných výsledků každoročně, umožňují identifikaci specifické odolnosti, jsou však náročnější a nákladnější. 3.7.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Každá z použitých metod má své klady a zápory, výsledky dosažené těmito metodami se vzájemně doplňují. Polní pozorování je nutné provádět od nejranějších generací, využití laboratorních infekčních testů se ukázalo jako nejvhodnější u materiálů, jež pokročily do předzkoušek. 3.7.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Obě metody jsou vzájemně nezastupitelné, využitím obou metod se výsledky doplňují. Jako velmi hodné se jeví využití zkušeností z obou metod k zakládání polních infekčních testů, v nichž dojde ke skloubení předností a eliminaci nevýhod obou použitých metod. Využití molekulárních markerů k identifikaci genů rezistence houbovým chorobám je prozatím u ozimého ječmene nedostupné. Známé markery (k identifikaci mlo genů rezistence k padlí, které jsou mezinárodními dohodami určené pro využití v jarní formě ječmene) jsou využívané šlechtiteli ječmene jarního, získání a ověření funkčnosti nových markerů je předmětem základního výzkumu. 3.8. Cíl 8. - Získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů 3.8.1. Použité metody 1. Prostřednictvím genové banky (standardní) 2. Na šlechtitelských pracovištích (standardní) 3.8.2. Efektivita jednotlivých metod, jejich účinek na šlechtitelský pokrok,

operativnost a náročnost Obě použité metody jsou pro šlechtění nezbytné. Získávání či naopak dlouhodobé ukládání genových zdrojů prostřednictvím genové banky je pro šlechtitelská pracoviště výhodné, je však přece jen kapacitně limitované a nákladnější. Udržování genových zdrojů na šlechtitelském pracovišti je nezbytné, operativnější a není tak náročné na technické zázemí, je však náročnější na obnovování sortimentu přesevem pro udržení klíčivosti přeskladňovaného materiálu. 3.8.3. Srovnání alternativních metod, kompatibilita, možnosti synchronizace souběžnosti či návaznosti jednotlivých metod Obě metody se vzájemně doplňují, nejvyššího efektu je dosahováno v těsné součinnosti šlechtitelského pracoviště s genovou bankou. 3.8.4. Zastupitelnost jednotlivých metod, možnosti eliminace duplicity řešení Obě metody získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů jsou vzájemně zastupitelné jen částečně, krátkodobě. Nejvyššího efektu je dosahováno při jejich postupném či souběžném koordinovaném použití.

Foto 10 – Šlechtitelské parcelky – Lužany 2001

4. Zakomponovanání perspektivních metod do klasického výběrového postupu Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. V průběhu řešení projektu byla ověřována možnost rutinního využití jednotlivých metod a možnost zařazení perspektivních metod do výběrového postupu tak, aby měly co největší přínos ve šlechtitelském procesu, využilo se co nejlépe jejich přednosti a v co největší míře byly eliminovány nedostatky jednotlivých metod nebo případná duplicita řešení. Na základě dosavadních výsledků lze doporučit nejúčelnější využití jednotlivých metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene pro fázi šlechtitelského výběrového postupu, kdy se jeví nejefektivnější, následovně: Testování na odolnost žluté zakrslosti ječmene v polních infekčních testech (standardní) materiály v pokročilých zkouškách výkonu, předzkouškách a nově získané genové zdroje Testování na odolnost žluté zakrslosti ječmene za použití molekulárního markeru Ylp detekujícího Yd2 gen (perspektivní) nově získané genové zdroje, materiály, jež vykázaly střední až silnou rezistenci v polních infekčních testech, linie z kombinací s donory Yd2 genu Testování na odolnost žluté mozaice ječmene infekčními testy v zahraničí na infekčním poli (standardní) nově získané genové zdroje, materiály v předzkouškách (při získání dostatečné kapacity v testech je vhodné začít co nejdříve, při možnosti výběrů v infekčním poli by byl šlechtitelský pokrok významně urychlen) Testování na odolnost žluté mozaice ječmene pomocí mikrosatelitního markeru BMac29 detekujícího geny rym4

a rym5 (perspektivní) nově získané genové zdroje a materiály v předzkouškách, které v testech na infekčním poli (BaYMV-1) prokázaly rezistenci Testování na odolnost stresům zimního období v polních testech a pozorováních (standardní) veškerý šlechtitelský materiál od nejranějších generací Testování na odolnost stresům zimního období provokační nádobovou metodou hodnocení zimovzdornosti (standardní) šlechtitelský materiál ve středních generacích - ve velkých zkouškách výkonu (cca od F7. generace). Testování na odolnost stresům zimního období polně–laboratorní metodou hodnocení mrazuvzdornosti ozimého ječmene (standardní) materiály v předzkouškách a registračních zkouškách, v případě, že je k dispozici technické vybavení (mrazicí boxy) přímo na šlechtitelském pracovišti, je vhodné dle kapacity začít s touto metodou, či její modifikací co nejdříve Testování na odolnost stresům zimního období laboratorním přesným stanovením mrazuvzdornosti ječmenů (perspektivní) u nově získaných genových zdrojů a finálních materiálů – odrůd před registrací (např. pro účely rajonizace a doporučování) Testování na odolnost stresům sucha polními testy (standardní) materiály v předzkouškách Testování na odolnost stresům sucha v provokačních nádobových testech (standardní) materiály v předzkouškách, souběžně s polními testy Homogenizace šlechtitelského materiálu klasickým výběrovým postupem (standardní) veškerý šlechtitelský materiál, včetně části šlechtitelského materiálu z kombinací vybraných pro dihaploidizaci Homogenizace za pomoci dihaploidizace - použití prašníkových kultur in vitro (perspektivní) vybrané kombinace v F2 a F3 generacích, nově vytvářené genové zdroje (donory) Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu sledováním morfologických znaků a fyziologických vlastností v polních pozorováních a testech (standardní) od nejranějších generací (F3 generace) s postupným rozšiřováním počtu sledovaných znaků a vlastností Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu pomocí elektroforetický analýzy hordeinů ve sloupečcích škrobového gelu (perspektivní) genové zdroje, materiály v předzkouškách, registračních zkouškách a UŠ Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu pomocí elektroforetické analýzy hordeinů v polyakrylamidovém gelu (perspektivní) genové zdroje, materiály v předzkouškách, registračních zkouškách a UŠ, metody elektroforetické analýzy hordeinů jsou alternativní Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu pomocí elektroforetické analýzy alel esterázových lokusů Est-1, Est-2, Est-4 a Est-5 v polyakrylamidovém gelu (perspektivní) charakterizace výchozích materiálů (genových zdrojů) a popis finálních materiálů Ověřování homogenity šlechtitelského materiálu pomocnými metodami, jako je testování specifické odolnosti k padlí (standardní) genové zdroje, materiály v předzkouškách, zakládání udržovacího šlechtění Sledování odolnosti houbovým chorobám v polních podmínkách (standardní) od nejranějších generací Sledování odolnosti houbovým chorobám v laboratorních infekčních testech ( Padlí travní, Hnědá skvrnitost standardní) materiály v předzkouškách a registračních zkouškách žádoucí posunutí testování do mladších generací umožní polní infekční testy využití molekulárních markerů identifikujících některé geny rezistence je možností, kterou může v budoucnu do šlechtění přispět základní výzkum Získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů prostřednictvím genové banky (standardní) genové zdroje (vstupní i výstupní), registrované odrůdy, donory cenných znaků Získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů na šlechtitelských pracovištích (standardní) genové zdroje (vstupní i výstupní), registrované odrůdy, donory cenných znaků, šlechtitelské materiály využívané pro křížení a do kontrol (srovnání výchozích materiálů s jejich kříženci) nejvyššího efektu při získávání, testování, popisování, ukládání a poskytování genových zdrojů je dosahováno koordinovanou spoluprací šlechtitelského pracoviště a genové banky

Foto 11 – Zkoušky výkonu – Lužany 2003

4. Závěr Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc. , VÚRV Metodika využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene byla vypracovaná jako výstup projektu č. QE 1107 “Tvorba a využití perspektivních metod ve výběrovém postupu šlechtění ozimého ječmene” řešeného v rámci specifického programu výzkumu a vývoje Ministerstva zemědělství - “Program III” dle doporučené osnovy ÚEB AV ČR pro publikování metodik. Cílem tohoto výstupu bylo vypracovat metodiku využívání perspektivních metod ve šlechtitelském postupu ozimého ječmene a porovnat jejich účinnost s metodami standardními. Je v ní zachycen přehled metod aplikovaných v projektu. Některé metody byly ověřeny, jiné upraveny či zpracovány pro potřeby šlechtění ozimého ječmene. Autoři sborníku se snažili zachytit aktuální stav i možné cesty dalšího vývoje metod vhodných pro šlechtitelské využití a navrhli jejich zapracování do šlechtitelského postupu v komplexní metodice. Většina postupů byla aplikována a je dále využívána v šlechtitelském programu ozimého ječmene. Publikováním této metodiky dávají autoři návod k využití odzkoušených metod a postupů, jež je možné po úpravě aplikovat i ve šlechtění dalších plodin. Kolektiv autorů Ing. Pavel Mařík, SELGEN a.s. Ing. Jana Chrpová, CSc., VÚRV Mgr. Kateřina Poláková, VÚRV RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc. , VÚRV Ing. Pavla Prášilová, VÚRV Ing. Ladislav Kučera, CSc., VÚRV Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., VÚRV Ing. Jana Bradová, VÚRV Ing. Zdeněk Stehno, VÚRV

Poděkování Autorský kolektiv si dovoluje poděkovat za spolupráci, podporu a přímou či nepřímou pomoc v řešení projektu a vydání tohoto sborníku: Pracovníkům a firmám externích smluvních testovacích pracovišť, především: Ing. Antonínu Dreiseitlovi, CSc., ZVÚ Kroměříž, s.r.o., Ing. Věře Minaříkové, ZVÚ Kroměříž , s.r.o., SAATEN-UNION, NORDSAAT Zuchtstation GUDOW (D), Nickerson Seeds Ltd. (GB), Institut für Resistenc Aschersleben (D), Spoluřešitelům a pracovníkům šlechtitelských týmů ŠS Lužany a ŠS Chlumec nad Cidlinou a výzkumných týmů VÚRV Praha-Ruzyně, kteří se podílejí na řešení projektu,

Generálnímu řediteli a. s. SELGEN Ing. Ladislavu Rosenbergovi, CSc., Řediteli VÚRV Praha – Ruzyně Mgr. Janu Lipavskému, CSc.