METODIKA TESTOVÁNÍ MNOŽITELSKÉHO MATERIÁLU RÉVY NA PŘÍTOMNOST BAKTERIÍ RODU AGROBACTERIUM A LEDOVĚ NUKLEAČNĚ AKTIVNÍCH BAKTERIÍ RODU PSEUDOMONAS V XYLÉMOVÉ TEKUTINĚ.
KOLEKTIV AUTORŮ METODIKA PRO PRAXI UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2012
Kolektiv autorů: Ing. Václav Krejzar, Ph.D., Ing. Iveta Pánková, Ph.D., Prof. Ing. Václav Kůdela, DrSc., Ing. Petr Ackermann, CSc. - Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Metodika byla vypracována v rámci řešení projektu NAZV QH71248 „Detekce prokaryotických patogenů révy vinné a specifikace podmínek pro patogenezi jako předpoklad pro jejich účinnou regulaci“. Metodika je přednostně určena pro zemědělské podniky, které se zabývají udržovacím šlechtěním révy vinné a podnožové révy. Metodika je rovněž využitelná v diagnostických laboratořích SRS a ÚKZÚZ. Metodika zjednodušuje a urychluje postup stanovení původců bakteriální nádorovitosti révy u výchozího množitelského materiálu odrůd révy vinné a podnožové révy. Metodika byla schválena Státní rostlinolékařskou správou, OSVĚDČENÍ č. j. SRS 055793/2012 o uznání uplatněné certifikované metodiky bylo vydáno v souladu s podmínkami „Metodiky hodnocení výsledků výzkumu a vývoje“. Oponenti Ing. Jana Víchová, Ph.D. - Mendelova univerzita v Brně RNDr. Jan Juroch - Státní rostlinolékařská správa Adresy oponentů Ing. Jana Víchová, Ph.D. Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Zemědělská 1/1665, 613 00 Brno tel.: 545133050, e-mail:
[email protected] RNDr. Jan Juroch Státní rostlinolékařská správa Sekce ochrany proti škodlivým organizmům Oddělení metod integrované ochrany rostlin Zemědělská 1a, 613 00 Brno - Černá Pole tel.: 545110447, e-mail:
[email protected] Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2012 ISBN: 978-80-7427-128-1 Tato publikace nesmí být přetiskována vcelku nebo po částech, uchovávána v médiích, přenášena nebo uváděna do oběhu pomocí elektronických, mechanických, fotografických či jiných prostředků bez výslovného svolení VÚRV, v.v.i.
2
Obsah:
1 Úvod do problematiky
4
2
Cíl metodiky
5
3
Vlastní popis metodiky
5
3.1 Odběr xylémové tekutiny
5
3.2
Mikrobiologická analýza xylémové tekutiny
5
3.3
Determinace bakteriálních izolátů
6
4
Srovnání novosti postupů
6
5 Popis uplatnění certifikované metodiky
6
6 Ekonomické aspekty
7
7
Seznam použité literatury
7
8
Seznam literatury, která předcházela metodice
8
9
Obrazová část
9
3
1
Úvod do problematiky
Réva vinná (Vitis vinifera L.) je hostitelskou rostlinou pro několik fytopatogenních bakterií. V letech 2004-2007 byl v českých a moravských vinicích zaznamenán zvýšený výskyt bakteriální nádorovitosti révy, způsobované bakteriemi A. vitis OPHEL & KERR 1990 (=R. vitis OPHEL & KERR 1990) YOUNG et al. 2001)) a Agrobacterium tumefaciens BEIJERINCK & VAN DELDEN 1902 (=Rhizobium radiobacter (BEIJERINCK & VAN DELDEN 1902) YOUNG et al. 2001)). Až na výjimky se jednalo o mladé porosty révy, vysázené v období před vstupem České republiky do Evropské unie. Bakteriální nádory se na postižených rostlinách nacházely v místech primárně poškozených působením mrazu (obr. 1, 2). Původci bakteriální nádorovitosti révy, bakterie A. tumefaciens a A. vitis, jsou gramnegativní aerobní bakterie tyčinkovitého tvaru (0,6–1 x 1,5–3,0 µm), které nesporulují. Běžně se vyskytují v půdě a na povrchu kořenů, přes poranění pronikají do kořenů a odtud cévními svazky xylému do nadzemních částí rostlin révy. V ochraně proti původcům bakteriální nádorovitosti révy se doporučuje používání reprodukčního materiálu, který je prostý patogenu. Vzhledem k prokázané souvislosti mezi vznikem bakteriální nádorovitosti a působením jarního mrazu (PÁNKOVÁ et al. 2011) je opodstatněna protimrazová ochrana. Keře systemicky infikované bakteriemi rodu Agrobacterium mohou být po řadu let bez příznaků. Pro vznik nádorů na révě (obr. 3, 4, 5, 6) jsou nezbytné následující podmínky: (1) přítomnost patogenu; (2) dostatečně teplé a vlhké počasí v předjaří - podmínky nutné k dosažení kořenové tlaku, který vytlačuje vodu a s ní patogenní bakterie z kořenů do nadzemních orgánů; (3) přítomnost ledově nukleačně aktivních (INA+) bakterií v cévách xylému; (4) působení teplot v rozmezí -4 až -6 °C v době od počátku rašení oček, které má za následek tvorbu ledových krystalů v xylému a poranění okolních (dřevních) parenchymatických buněk. Poranění je nezbytným předpokladem předání části genetické informace obsažené v bakteriálním plazmidu bakterií A. vitis a A.tumefaciens s rostlinné buňce a nastartování nekoordinovaného množení buněk, které vyústí ve vznik nádoru; (5) optimální teplota pro vývoj nádoru v rozmezí 20–27 °C. S cílem detekovat a identifikovat původce nádorovitosti byly na předem vytipovaných lokalitách v letech 2006–2011 na jaře ze slzejícího réví napadených rostlin révy opakovaně odebírány před rašením vzorky xylémové tekutiny. Tyto vzorky byly následně mikrobiologicky analyzovány. Výsledek mikrobiologické analýzy v xylémové tekutě potvrdil jednak přítomnost původců bakteriální nádorovitosti révy, bakterií A. vitis a A. tumefaciens (KREJZAR et al. 2009), jednak vysokou četnost bakterií rodu Pseudomonas, u nichž byla zjištěna ledová nukleační aktivita (INA+) v teplotním rozmezí -2 až -3 °C (KREJZAR, PÁNKOVÁ 2008). S cílem objasnit souvislost mrazového poškození révy s následnou tvorbou nádorů vyvolanou bakteriemi rodu Agrobacterium byly pro pokusné účely shromážděny rostliny dvou odrůd révy, Müller Thurgau a Svatovavřinecké, u nichž bylo poškození mrazem a bakteriální nádorovitost zaznamenána v přirozených podmínkách v největší četnosti. Rostliny révy byly inokulovány jednak kulturami typových kmenů a vlastními izoláty bakterií A. vitis a A. tumefaciens, jednak směsnou kulturou ze dvou vlastních izolátů ledově nukleačně aktivní (INA+) bakterie Pseudomonas syringae pv. syringae s teplotami ledové nukleace -3,8 a -4,9 °C. Inokulované rostliny révy byly následně vystaveny účinku mrazu v podmínkách chladové místnosti. Rostliny byly poté umístěny do venkovních podmínek a v pravidelných intervalech hodnoceny. Nádory způsobované bakteriemi rodu Agrobacterium byly následně zaznamenány na 80 % rostlin révy (PÁNKOVÁ et al. 2011) (obr. 7).
4
2
Cíl metodiky
Prevence bakteriální nádorovitosti a předčasného odumírání rostlin révy vinné v českých a moravských vinicích testováním výchozího množitelského materiálu na přítomnost bakterií rodu Agrobacterium a ledově nukleačně aktivních (INA+) bakterií rodu Pseudomonas v xylémové tekutině odebírané na jaře před nebo při rašení ze slzejících rostlin révy. 3
Vlastní popis metodiky
Metodika se skládá z těchto částí: odběr xylémové tekutiny; mikrobiologická analýza xylémové tekutiny; determinace bakteriálních izolátů. 3.1
Odběr xylémové tekutiny
Xylémová tekutina je odebírána na jaře před nebo při rašení ze slzejících testovaných rostlin révy do sterilních, víčkem uzavíratelných, polypropylénových zkumavek o objemu 15 ml. Po zakrácení réví pomocí zahradnických nůžek, jeho ohnutí do optimální polohy pro vykapávání xylémové tekutiny (co nejvíce kolmo k zemskému povrchu) a jeho fixaci, se k čerstvé řezné ráně přiloží zkumavka a upevní se ke koncové části výhonu pomocí izolační pásky. V případě, že slzení xylémové tekutiny je málo intenzívní, nejprve se provede rozmístění odběrových zkumavek na všechny testované rostliny a po uplynutí časového intervalu, jehož délka se stanoví v závislosti na intenzitě slzení xylémové tekutiny, zkumavky sejmeme ze všech rostlin najednou. Víčkem uzavřené zkumavky se umístí až do zpracování do chladícího boxu. Optimální doba od odběru xylémové tekutiny do jejího zpracování je 24 hodin. 3.2
Mikrobiologická analýza xylémové tekutiny
Zpracování xylémové tekutiny: Metodika zpracování xylémové tekutiny se upravuje v závislosti na získaném objemu. Při objemu získané xylémové tekutiny do 2 ml se xylémová tekutina ihned roztírá na živná média pomocí bakteriologické kličky. Při objemu získané xylémové tekutiny nad 2 ml se xylémová tekutina nejprve zkoncentruje centrifugací (10 000 g, teplota 10 °C), získaný pelet se resuspenduje ve 2 ml sterilní destilované vody a následně roztírá na živná média. Živná média: K mikrobiologické analýze se používají tato živná média: (i) médium YDC (SCHAAD et al. 2001) pro kultivaci bakterií rodu Agrobacterium, zejména obtížněji kultivovatelného A. vitis; (ii) masopeptonový agar MPAg (SCHAAD et al. 2001) pro kultivaci bakterií rodu Agrobacterium a rodu Pseudomonas; (iii) médium King B (KING et al. 1954) pro kultivaci bakterií rodu Pseudomonas; (iv) médium 1A (BRISBANE, KERR 1983), které je semiselektivní pro A. tumefaciens; (v) médium Roy, Sasser (ROY, SASSER 1983), které je semiselektivní pro A. vitis. Živná média inokulovaná xylémovou tekutinou se uchovávají v termostatu při teplotě 28°C po dobu 4-7 dnů.
5
Výběr bakteriálních kolonií: V intervalu 4–7 dnů po inokulaci jsou pomocí stereomikroskopu hodnoceny kultivační znaky narostlých kolonií. Z inokulovaných živných médií YDC, MPAg a King B se odebírají tyto typy kolonií: (i) okrouhlé, vypouklé, lesklé, bez pigmentu nebo slabě béžové kolonie s jemně zrnitou strukturou (charakteristické pro bakterie rodu Agrobacterium) (obr. 8); (ii) bílé až žlutozelené, drsné kolonie nepravidelného tvaru, charakteristické pro bakterie rodu Pseudomonas (obr. 9). Na semiselektivním médiu podle ROYe a SASSERa (1983) mají kolonie bakterie A. vitis obvykle tmavě červený střed s bílým okrajem (obr. 10). Kolonie jsou nejprve bílé, poloprůhledné, intenzita tmavě červeného zbarvení na středu se zvyšuje v závislosti na stáří bakteriální kolonie. Kolonie bakterie A. tumefaciens vytvářejí na semiselektivním médiu 1A (BRISBANE, KERR 1983) rovněž tmavě červený střed, avšak okraj kolonií je spíše béžové barvy. Na počátku jsou bakteriální kolonie poloprůhledné s béžovým nádechem, bez tmavě červeného středu, který se vytváří později a je intenzivnější v závislosti na stáří bakteriální kolonie. 3.3
Determinace bakteriálních izolátů
Získané morfologicky charakterizované bakteriální izoláty se identifikují pomocí těchto metod: imunochemicky (sklíčkovou aglutinací); biochemicky (Biolog GEN III MicroPlateTM System; Biolog GN2 MicroPlateTM System) (obr. 11); metodou analýzy mastných kyselin (systém Sherlock); pomocí testů patogenity na rostlinách rajčete (Solanum lycopersicum L.) (obr. 12), kalanchoe (obr. 13, 14), oleandru (Nerium oleander L.) (obr. 15). Pro sklíčkovou aglutinaci lze použít polyklonální protilátky připravené na Oddělení rostlinolékařské bakteriologie ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby v.v.i. Praha - Ruzyně proti kmenům LMG 8750T (kultura typového kmene bakterie A. vitis) a LMG 187T (kultura typového kmene bakterie A. tumefaciens). 4
Srovnání novosti postupů
Původci bakteriální nádorovitosti révy, bakterie Agrobacterium tumefaciens a A. vitis, jsou gramnegativní aerobní bakterie tyčinkovitého tvaru (0,6–1 x 1,5–3,0 µm), které nesporulují. Běžně se vyskytují v půdě a na povrchu kořenů, přes poranění pronikají do kořenů a odtud se přemísťují cévními svazky xylému do nadzemních částí rostlin révy. Novost navrhovaného postupu testování spočívá: (i) ve využívání přirozeného slzení (xylémové tekutiny) z réví, ke kterému dochází v jarním období před a při rašení révy, ke stanovení přítomnosti agrobakterií v matečných rostlinách révy používaných jako zdroj oček a řízků; (ii) v jednorázovém stanovení dvou faktorů nutných ke vzniku nádorovitosti, tj. původců nádorovitosti révy a ledově nukleačně aktivních bakterií. 5 Popis uplatnění certifikované metodiky Metodika je přednostně určena pro zemědělské podniky, které se zabývají udržovacím šlechtěním révy vinné a podnožové révy. Metodika je rovněž využitelná v diagnostických laboratořích SRS a ÚKZÚZ. Metodika zjednodušuje a urychluje postup stanovení původců bakteriální nádorovitosti révy u výchozího množitelského materiálu odrůd révy vinné a podnožové révy.
6
6
Ekonomické aspekty
Výchozí parametry výpočtů: Odrůda spon Bílá Modrá
1 x 2,5 1 x 2,5
Výsadba počet (keř/ha) 4000 4000
Výnos keř (kg) 2,5 2,5
cena za ks (Kč) 40 40
ha (t) 10 10
kg (Kč) 13 11
Výnos keř (Kč) 32,5 27,5
ha (Kč) 130.000 110.000
Ztráty způsobené původci bakteriální nádorovitosti révy (Agrobacterium vitis, A. tumefaciens) za spoluúčasti ledově nukleačně aktivních (INA+) bakterií z rodu Pseudomonas (zejména modré odrůdy, nejčastější výskyt na odrůdě Svatovavřinecké):
nově vysázené vinice: průměrné ztráty úhynem keřů činí 5–15 %. S ohledem na průměrnou cenu sazenice révy vinné cca 40,- Kč/ks, počet rostlin na 1 ha vinice a práci spojenou s výsadbou 1 ha vinice se ztráty pohybují v rozmezí 8–24 tis. Kč/ha; plodné vinice: průměrné ztráty na výnosu způsobené předčasným odumřením napadených rostlin a snížením plodnosti rostlin v rozmezí 5–15 % v závislosti na ročníku, tj. u modrých odrůd 5,5–16,5 tis. Kč/ha, u bílých odrůd 6,5–19,5 tis. Kč/ha.
Závěr: Při uplatnění doporučovaných opatření (výsadba sazenic révy vinné systemicky neinfikovaných původci bakteriální nádorovitosti) lze předpokládat snížení vyčíslených ztrát o 50 %. 7
Seznam použité literatury
BURR T. J. (1998): Crown gall. In: PEARSON R. C., COHEEN A. C.: Compendium of Grape Diseases. St. Paul, APS Press, 1998: 41-42. BRISBANE P. G., KERR A. (1983): Selective media for three biovars of Agrobacterium. J. Appl. Bacteriol. 54, 1983:425-431. KING E. O., WARD M. K., RANEY D. E. (1954): Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. Clin. Med. 44, 1954: 301-307. ONDŘEJ M. (1992): Genové inženýrství kulturních rostlin. Praha, Academia, ISBN 80-2000310-X. ROY M., SASSER M.: (1983): A medium selective for Agrobacterium tumefaciens biotype 3. Phytopathology 73, 1983: 810. SCHAAD N.W, JONES J.B, CHUN W. (eds) (2001): Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. 3rd ed. St. Paul, MN, USA: APS Press.
7
8
Seznam literatury, která předcházela metodice
PÁNKOVÁ I., KREJZAR V., KŮDELA V., ACKERMANN P. (2011): Indukce mrazového poškození révy vinné INA+ bakteriemi ve spojitosti s následnou tumorogenezí vyvolanou bakteriemi rodu Agrobacterium. Úroda 12, vědecká příloha, s. 247-251. KREJZAR V., PÁNKOVÁ I., ACKERMANN P., KORBA J., KŮDELA V. (2009): Systémové šíření Agrobacterium vitis a A. tumefaciens v xylémových cévách révy vinné. Věd. příloha čas. Úroda, p.:165-169. KREJZAR V., PÁNKOVÁ I., ACKERMANN P., KORBA J., KŮDELA V. (2009): Systémové šíření Agrobacterium vitis a A. tumefaciens v xylémových cévách révy vinné. S.52. In: Šafránková I.& Šefrová H. (eds): XVIII. Česká a slovenská konference o ochraně rostlin. Sborník abstraktů. MZLU v Brně, 2-4.září 2009, 239 s. KREJZAR V., PÁNKOVÁ I. (2008): Vliv mrazového poškození na výskyt bakteriální nádorovitosti révy vinné. Sborník příspěvků Eds.: L. Bláha & F. Hnilička. Česká zemědělská univerzita v Praze a Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha - Ruzyně, Praha 2008. ISBN: 978-80-87011-18-8, s. 245-248. KREJZAR V., PÁNKOVÁ I. (2008): The incidence of INA+ bacteria in vineyards with crown gall symptoms. In: book of abstracts of the Int. conf. “Advances in Plant Protection Strategie“, Druskininkai, Lithuania, 10-12.9.2008, eds.: Lithuanian Institute of Agriculture, ISBN: 978-9955-650-26-3, p.42.
8
9
Obrazová část
Obr.1: Příznaky bakteriální nádorovitosti révy vinné.
Obr. 2: Mrazové poškození keře révy vinné.
Obr. 3, 4: Nádor na bázi rostliny révy vinné cv. Müller Thurgau způsobený bakteriemi rodu Agrobacterium.
9
Obr. 5, 6: Nádor a průřez nádorem z révy vinné cv. Müller Thurgau způsobený bakteriemi rodu Agrobacterium.
Obr. 7: Nádor na pokusné rostlině révy vinné cv. Müller Thurgau infikované bakteriemi rodu Agrobacterium a INA+ bakteriemi rodu Pseudomonas.
Obr. 9: Kolonie INA+ bakterie Pseudomonas syringae pv. syringae na živném médiu King B (KING et al. 1954).
Obr. 8: Kolonie bakterie Agrobacterium tumefaciens na živném médiu MPAg (SCHAAD et al. 2001).
Obr. 10: Kolonie bakterie Agrobacterium vitis na semiselektivním médiu podle ROYe a SASSERa (1983).
10
Obr. 11: Identifikace izolátu bakterie Pseudomonas syringae pv. syringae metodou Biolog GN2 MicroPlateTM System.
Obr. 12: Nádory na stonku rostliny rajčete (Solanum lycopersicum L.). po inokulaci kmenem bakterie Agrobacterium tumefaciens.
Obr. 13, 14: Nádor na listu rostliny kalanchoe po inokulaci kmenem bakterie Agrobacterium vitis.
11
Obr. 15: Nádory na stonku rostliny oleandru (Nerium oleander L.) po inokulaci kmenem bakterie Agrobacterium tumefaciens.
12
