39
METODE PENELITIAN Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisis Kandungan Zat Gizi Tujuan: Mendapatkan bahan ekstrak dan data kandungan kimia yang terdapat pada berbagai bagian tanaman pegagan yang bermanfaat untuk kesehatan. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari pegagan segar, etanol teknis 70%, aquades, dan bahan untuk analisis kimia. Untuk analisis fitokimia bahan yang digunakan terdiri dari daun pegagan segar, kloroform, amoniak, H 2 SO 4 , pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, metanol, air, etanol, eter, pereaksi Liebermen Burchard dan FeCl 3 . Bahan yang digunakan untuk analisis bahan aktif terdiri dari etanol p.a, metanol, asetonitrit, toluene, oli vacuum dan silica gel 60F 254. Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat yang digunakan untuk melakukan ekstraksi yang terdiri dari ekstraktor destilasi, rotavapor, blender, eksikator, oven, kertas dan kain saring. Untuk analisis fitokimia dan analisis bahan aktif, alat yang digunakan terdiri dari Thin Layer Chromatography (TLC) Scanner, cawan porselen, aufhauser, hot plate, labu didih, kondensor, eksikator, oven, tanur, alat pendorong dan hitter mantel. Sumber Pegagan Jenis pegagan yang digunakan pada penelitian ini adalah aksesi Bojolali yang berasal dari kebun percobaan Balittro, Gunung Putri, Cipanas yang ditanam pada hamparan terbuka pada kondisi tanah yang seragam. Lokasi kebun tersebut
berada pada ketinggian 1500 m dpl. Pegagan yang digunakan pada penelitian ini berumur lebih kurang 90 hari dan telah dipanen beberapa kali. Penyiapan Bahan Ekstrak dan Skrining Penyiapan bahan ekstrak diawali dengan pemanenan pegagan yang dilakukan pada pagi hari dan selanjutnya segera dilakukan penyortiran di lokasi untuk menghindari kerusakan bahan baku pegagan. Kegiatan penyortiran yang dilakukan adalah memisahkan tanaman pegagan menjadi 3 bagian yaitu daun, tangkai daun dan keseluruhan bagian tanaman (kecuali stolon dan akar). Selanjutnya bagian tanaman yang telah disortir tersebut dimasukkan ke dalam kantong plastik yang terpisah. Jumlah masing-masing bagian tanaman pegagan tersebut adalah sebanyak 3 kg. Sebelum diekstraksi, terlebih dahulu pegagan tersebut dicuci ringan agar tidak banyak zat gizi yang hilang. Setelah pencucian selanjutnya dilakukan pemeriksaan fitokimia untuk mengetahui mutu awal dari pegagan dalam keadaan segar. Ekstraksi dan Maserasi Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengektraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua pelarut diuapkan dan serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Proses ekstraksi bahan nabati atau tumbuhan dapat dilakukan berdasarkan teori penyarian. Penyarian merupakan suatu proses pemindahan massa dari bahan ke cairan penyari. Beberapa metode penyarian antara lain: maserasi, perkolasi, dan soxhletasi. Maserasi merupakan proses penyarian yang paling sederhana dan banyak digunakan untuk menyari bahan obat yang berupa serbuk simplisia halus. Simplisia ini direndam dalam cairan penyari sampai meresap dan melemahkan susunan sel sehingga zat-zat akan larut.
Serbuk simplisia yang akan disari
ditempatkan dalam wadah atau bejana bermulut besar, ditutup rapat kemudian dikocok berulang-ulang sehingga memungkinkan pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia.
Masing-masing bagian pegagan sebanyak 3 kg dicampur dengan pelarut air (aquades) untuk mendapatkan ekstrak air, dan pelarut etanol 70% untuk mendapatkan ekstrak etanol dengan perbandingan 1 bagian daun dan 5 bagian Bahan baku segar, disortasi (daun, tangkai daun, gabungan)
Pencucian (Air)
Ekstraksi
Aquadest
Penghancuran
4 jam, 250-500 rpm
Maserasi
Penyaringan
Bahan: Pelarut = 1:5
Etanol
Penghancuran
Pengadukan
Analisis mutu awal (analisis proksimat, skrining fitokimia, analisis bahan aktif, analisis mineral)
Pengadukan
Maserasi
Ampas
Penyaringan
Filtrat
Filtrat
Penguapan (rotavapor)
Penguapan (rotavapor)
Ekstrak kental (oleoresin)
Ekstrak kental (oleoresin)
Analisis mutu
Analisis mutu
Pengujian pada tikus
Gambar 7 Diagram alir pembuatan ekstrak pegagan pelarut, lalu dihancurkan dengan menggunakan blender. Kemudian masingmasing campuran tersebut diekstrak (diaduk) selama 4 jam. Setelah 4 jam, mixer dimatikan dan didiamkan (dimaserasi) selama 24 jam, lalu disaring secara bertahap menggunakan kain dan kertas saring.
Hasil saringan berupa filtrat
selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotavapor pada 60 oC sehingga dihasilkan ekstrak kental.
Selanjutnya ekstrak kental tersebut dikeringkan dengan
menggunakan freeze dryer. Kemudian dilakukan analisis kandungan bahan aktif pada masing-masing ekstrak dengan menggunakan TLC Scanner.
Dua jenis
ekstrak dari bagian tanaman yang mempunyai kandungan bahan aktif asiatikosida yang paling tinggi dipilih sebagai bahan uji untuk diuji ke tikus model. Semua proses dilakukan sesuai dengan prosedur standar Laboratorium Balittro. Diagram alir penyiapan ekstrak disajikan pada Gambar 7. Variabel yang Diukur Analisis Fitokimia Analisis fitokimia dilakukan berdasarkan Harborne (1987) untuk mengetahui mutu awal dari pegagan segar.
Alasan lain melakukan analisis
fitokimia ialah untuk menentukan ciri senyawa aktif (Harborne, 1996). Identifikasi yang dilakukan adalah uji alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, steroid, dan triterpenoid. Uji Alkaloid: Sebanyak 1 gram daun digerus dan ditambahkan 1,5 mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 5 tetes H 2 SO 4 2M.
Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung kemudian masing-masing
ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon.
Sebanyak 1 g contoh ditambah
metanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditaruh kedalam spot plate (papan uji) dan kemudian ditambahkan NaOH 10% (b/v) atau H2SO4 pekat. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya
senyawa fenolik hidrokuinon sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Uji Saponin: Setengah gram daun ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok selama ± 10 menit. Timbulnya busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya saponin. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 g contoh ditambah 25 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring.
Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter.
Lapisan eter dipipet dan diujikan pada spot plate dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Uji Tannin: Lima gram daun ditambahkan air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Disaring dan filtrat ditambahkan dengan 3 tetes FeCl3. Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Analisis Proksimat Analisis proksimat merupakan analisis kandungan makro zat dalam suatu bahan makanan.
Analisis proksimat dilakukan dengan menggunakan metode
grafimetri dan untuk analisis kadar abu dan abu tak larut asam dilanjutkan dengan menggunakan alat Muffel Furnase. Analisis kadar sari yang terlarut dalam air dan alkohol juga dilakukan dengan menggunakan metode grafimetri. Analisis Kadar Air Analisis kadar air dilakukan untuk mengukur banyaknya kadar air yang terkandung di dalam bahan yang dianalisis yang dinyatakan dalam persen. Penentuan kadar air dalam bahan uji dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu metode pengeringan dengan oven biasa, metode destilasi, metode kimia dan metode khusus (kromatografi dan nuclear magnetic resonance/NMR). Pada penelitian ini pengujian kadar air dilakukan dengan metode aufhauser. Sepuluh gram pegagan segar dihaluskan dan selanjutnya dimasukkan ke dalam labu didih 250 mL. seluruhnya.
Ditambah toluena hingga bahan terendam
Labu didih tersebut dihubungkan dengan alat aufhauser dan
kondensor yang dipasang secara seri. Labu dipanaskan di atas hot plate selama 3 jam, selanjutnya didinginkan.
Setelah dingin, tetesan air yang menempel di
dinding kondensor dan di dinding alat aufhauser didorong dengan menggunakan alat pendorong hingga air berada di dalam leher skala alat aufhauser. Selanjutnya dilakukan pembacaan skala yang menunjukkan jumlah mL air yang dihasilkan. Kadar air adalah volume air yang dihasilkan (mL) dibagi dengan bobot contoh, dikali dengan 100%. Kadar Abu Penentuan abu total digunakan untuk berbagai tujuan, yaitu selain sebagai parameter nilai gizi dalam bahan makanan juga untuk mengetahui baik tidaknya suatu proses pengolahan, serta untuk mengetahui jenis bahan yang digunakan. Pengukuran kadar abu bertujuan untuk mengetahui besarnya kandungan mineral yang terdapat dalam bahan uji.
Mineral sebagai senyawa anorganik dapat
ditetapkan dengan cara pengabuan. Pembakaran akan menghancurkan senyawasenyawa organik ke dalam bentuk gas yang mudah terbang, sedangkan mineral sebagai senyawa anorganik akan tinggal dalam bentuk abu yang kadarnya dapat diketahui melalui penimbangan. Terlebih dahulu cawan porselen dipanaskan selama 15 menit di dalam oven.
Selanjutnya didinginkan dalam eksikator selama 15-20 menit, lalu
ditimbang bobot cawan kosong.
Ke dalam cawan kosong ditambah contoh
sebanyak 2 gram, lalu dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 400 oC dan setelah asapnya hilang suhu dinaikkan menjadi 800 oC dan didiamkan selama 5-8 jam. Selanjutnya didiamkan di dalam eksikator lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu adalah berat cawan kosong yang ditambah contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali 100%. Kadar Sari Larut dalam Air Pengukuran sari larut dalam air dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak komponen dalam bahan uji yang terlarut dalam air. Lima gram bahan contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL.
Selanjutnya ditambahkan
kloroform-air dengan perbandingan 1:1 sebanyak 1/3 volume labu ukur.
Didiamkan selama 24 jam dan sesekali dikocok. Dihimpitkan dengan kloroformair hingga batas tera, lalu disaring dengan kertas saring kasar. Filtratnya dipipet sebanyak 25 mL, dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu diuapkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3-4 jam. Didinginkan dalam eksikator selama 20 menit, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air adalah berat cawan kosong yang ditambah dengan contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali dengan faktor pengeceran, dikali dengan 100%. Kadar Sari Larut dalam Alkohol Pengukuran kadar sari yang larut dalam alkohol dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak komponen dalam bahan uji yang terlarut dalam alkohol. Lima gram bahan contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Selanjutnya ditambahkan alkohol 96% sebanyak 1/3 volume labu ukur. Didiamkan selama 24 jam dan sesekali dikocok. Dihimpitkan dengan alkohol sampai tanda tera, lalu disaring dengan kertas saring kasar. Filtratnya dipipet sebanyak 25 mL, dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu diuapkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3-4 jam. Didinginkan dalam eksikator selama 20 menit, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam alkohol adalah berat cawan kosong yang ditambah dengan contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali dengan faktor pengeceran, dikali dengan 100%. Analisis Kandungan Kimia Pegagan Analisis kimia yang dilakukan terhadap bahan segar dan ekstrak pegagan terdiri dari analisis kadar mineral (K, Na, Mg, Ca, Cu, Zn, Fe, Mn dan P) dan analisis bahan aktif (asiatikosida) dengan metoda TLC Scanner. Analisis Mineral Analisis mineral dilakukan dengan metoda Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) yang merupakan salah satu teknik analisis untuk mengukur jumlah unsur berdasarkan jumlah energi cahaya yang diserap oleh unsur tersebut dari
sumber cahaya yang dipancarkan. Prinsip kerja alat ini berdasarkan penguapan larutan sampel, kemudian logam yang terkandung di dalamnya diubah menjadi atom bebas.
Atom tersebut mengabsorpsi radiasi dari sumber cahaya yang
dipancarkan dari lampu katoda (hollow cathode lamp) yang mengandung unsur yang akan dianalisis.
Banyaknya penyerapan radiasi kemudian diukur pada
panjang gelombang tertentu menurut jenis unsur yang dianalisis. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara diskriptif dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan.
Pengolahan dan analisis data dilakukan secara
bertahap yang diawali dengan pengumpulan dan entri data.
Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model Tujuan: Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan terhadap pertambahan bobot badan, asupan pakan, gambaran darah, aktivitas dan fungsi kognitif pada tikus. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan, tikus jantan breed Wistar yang berumur lebih kurang 2 bulan sebanyak 40 ekor, sonde lambung, kandang dan peralatannya serta maze model Multiple T yang telah dimodifikasi. Pakan tikus yang digunakan adalah pakan standar (PT Indofeed) yang sesuai dengan status fisiologis hewan coba. Kandungan nutrisi pakan yang diberi untuk semua tikus disajikan pada Tabel 5. Sebelum dimulai penelitian, semua tikus terlebih dahulu diadaptasi dengan pakan yang digunakan dalam penelitian ini selama 7 hari. Selama masa adaptasi, pakan dan air minum diberi secara ad libitum dan pada masa perlakuan jumlah
pakan yang diberi adalah sebanyak 10% dari bobot badan. Setiap tikus dari masing-masing perlakuan diberi kesempatan untuk memperoleh pakan dan minuman secara bebas. Pakan diberi dalam wadah khusus dan terhindar dari pencemaran. Bentuk kandang yang digunakan adalah bentuk kandang kelompok yang terpisah, yang dilengkapi dengan wadah pakan, minuman, dan tempat penampungan kotoran. Tabel 5 Kandungan nutrisi pakan tikus Komposis nutrisi Protein Lemak Serat Abu TDN Ca:P
Kandungan 23% 4% 5% 9% 2 650 ME/kkal 1:0,8
Penentuan Level Pegagan Penentuan level yang digunakan mengacu kepada jumlah pegagan yang layak dikonsumsi per hari, dan juga berdasarkan kepada level yang telah digunakan oleh peneliti sebelumnya. Level yang pernah digunakan oleh peneliti sebelumnya tidak mengacu kepada kandungan bahan aktifnya.
Level yang
digunakan adalah berdasarkan gram bahan ekstrak per kg bobot badan hewan coba. Level pemberian oral yang telah pernah dicoba berkisar antara 0,5 – 300 mg per kg bobot badan dengan lama pemberian paling sedikit satu kali dan paling lama 4 bulan. Rao et al. (2006) menggunakan level 0,158 – 0,474 mg ekstrak daun segar per kg bobot badan per hari untuk melihat pengaruhnya terhadap pertumbuhan neuron dendritik hipokampus CA3.
Dilaporkan bahwa level
tertinggi dengan waktu pemberian yang paling lama memberi pengaruh yang lebih baik terhadap pertumbuhan neuron dendritik dibandingkan dengan level rendah dengan waktu pemberian yang singkat (Rao et al. 2006). Oleh karena terdapat variasi level yang sangat tinggi, maka pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan penelitian pendahuluan untuk mendapatkan level yang tepat. Setelah diperoleh level yang tepat, selanjutnya ditetapkan 4 level perlakuan yaitu level 0 (kontrol), 100, 300 dan 600 mg ekstrak/kg bobot badan yang diuji pada tikus selama 8 minggu.
Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok yang terdiri dari satu perlakuan pada empat tingkatan level dan lima ulangan. Desain penelitian dimaksud seperti disajikan Gambar 8. Unit percobaan terdiri dari 40 ekor tikus yang berumur lebih kurang 2 bulan yang diuji dengan ekstrak air dan ekstrak etanol pegagan. Pengujian ekstrak air dan etanol dilakukan pada waktu yang berbeda.
Tikus n = 40 ekor
Ekstrak Air
Ekstrak Etanol
Kontrol 0 mg/kg BB n=5
Kontrol 0 mg/kg BB n=5
Level 1 100 mg/kg BB n=5
Level 1 100 mg/kg BB n=5
Level 2 300 mg/kg BB n=5
Level 2 300 mg/kg BB n=5
Level 3 600 mg/kg BB n=5
Level 3 600 mg/kg BB n=5
Gambar 8 Desain penelitian Untuk mendapatkan validitas eksternal yang tinggi maka masing-masing set percobaan (kontrol dan perlakuan) didesain atas 5 ulangan. Hewan percobaan dan ekstrak pegagan diperoleh dari sumber yang seragam sehingga dapat mengurangi pengaruh variabel lain selain variabel yang diteliti atau variabel perlakuan. Penempatan tikus di masing-masing set percobaan didasarkan kepada pola aktivitasnya yaitu aktif dan tidak aktif. Tikus-tikus yang aktif dan tidak aktif
ditempatkan pada masing-masing set percobaan secara acak sehingga semua tikus dari masing-masing blok tersebut mendapat kesempatan yang sama terhadap setiap set percobaan. Ekstrak pegagan diberi secara oral dengan menggunakan sonde lambung dan ekstrak tersebut terlebih dahulu dilarutkan dengan air suling dalam volume yang sama yaitu 1 mL untuk setiap set percobaan.
Untuk
kelompok kontrol juga diberi air suling sebanyak yang diberi atau yang digunakan pada kelompok perlakuan yaitu 1 mL. Variabel yang Diukur Konsumsi Pakan Total pakan yang dikonsumsi diukur pada setiap harinya dan direkap dalam asupan mingguan. Rata-rata konsumsi pakan per ekor tikus per hari pada masing-masing kelompok percobaan adalah total pakan yang dikonsumsi dibagi dengan jumlah tikus pada masing kelompok percobaan dan selang waktu pengukuran (g/ekor/hari). Bobot Badan Penimbangan bobot badan masing-masing tikus dilakukan pada setiap 2 hari dengan menggunakan timbangan standar. Pertambahan bobot badan harian (g/hari) adalah total bobot badan dikurangi dengan bobot badan awal kemudian dibagi dengan selang waktu pengukuran. Aktivitas dan Tingkah Laku Pengamatan aktivitas dan tingkah laku dilakukan terhadap semua tikus. Kategori aktivitas dibagi atas 4 kategori dengan memberi skor 1-4 yaitu sangat aktif = 4; aktif = 3; kurang aktif = 2 dan tidak aktif = 1. Diskripsi untuk masingmasing skor kategori adalah sebagai berikut: Sangat Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze secara terus-menerus melakukan aktivitas membaui dan berjalan, memanjat dinding T-maze dan mencapai titik finish kurang dari 5 menit. Aktif
: Setelah dimasukkan ke dalam T-maze secara terus-menerus melakukan aktivitas membaui dan berjalan, memanjat dinding T-maze namun tidak mencapai titik finish.
Kurang Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze, aktivitas membaui dan berjalan dilakukan berkisar 0,5 menit, memanjat dinding Tmaze jarang dilakukan, selanjutnya diam dan tidak mencapai titik finish. Tidak Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze, aktivitas membaui dan berjalan dilakukan berkisar 0,5 menit, memanjat dinding Tmaze tidak dilakukan, selanjutnya diam dan tidak mencapai titik finish. Pengamatan dilakukan dengan selang waktu 2 hari sekali dengan menggunakan metoda modifikasi Multiple T-maze (http://www.ratbehavior.org) (Gambar 9).
Gambar 9 Model modifikasi multiple T-maze (http://www.ratbehavior.org) Data yang diamati adalah waktu yang dibutuhkan untuk melewati alat tersebut, persentase tikus yang mencapai titik finish serta data aktivitas dan tingkah laku lainnya yang mungkin muncul selama percobaan tersebut berlangsung. Analisis Darah Rutin Analisis darah rutin terdiri dari pemeriksaan differensial leukosit, kadar Hb, Packet Cell Volume (PCV), benda darah putih (BDP) dan benda darah merah (BDM). Pemeriksaan darah rutin ini dilakukan terhadap semua tikus dari masingmasing blok perlakuan yang dilakukan. Pemeriksaan darah rutin ini dilakukan setelah hewan coba dikorbankan. Pengolahan dan Analisis Data
Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara statistik dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan.
Pengolahan dan analisis data dilakukan secara
bertahap yang diawali dengan pengumpulan dan entri data.
Untuk melihat
perbedaan antar kelompok perlakuan digunakan analisis varian (ANOVA). Untuk mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan dilanjutkan dengan uji beda Duncan. Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus Tujuan: Mendapatkan data tentang pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan terhadap gambaran morfologi hipokampus tikus. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari jaringan otak yang telah difiksasi dengan paraformaldehid 4%, antibodi PGF, antibodi monoclonal anti human calbindin (Novocastra. Lab), antibodi anti-tumor necrosis factor/TNF (Boster (Boster Biological Technology Ltd), antibodi anti-C-reactive protein/CRP (Boster (Boster Biological Technology Ltd), antibodi poliklonal anti-dopamine (Abcam Inc), antibodi anti- glial fibrillary acidic protein (GFAP), antibodi anti-vimentin (VIM), antibodi anti-desmin (DES), antibodi serotonin, antibodi toludin, larutan untuk dehidrasi, larutan untuk clearing, parafin, mikrotom dan mikroskop.
Penyiapan Preparat Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) Pewarnaan HE dilakukan untuk mengamati struktur umum jaringan otak. Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan ini dimulai dengan deparafinisasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukkan preparat ke dalam larutan xylol III, II, I secara berseri.
Tahap selanjutnya adalah rehidrasi, yaitu dengan
memasukkan jaringan otak ke dalam larutan alkohol absolut sampai dengan alkohol 70% secara berseri. Selanjutnya jaringan otak direndam di dalam air keran, kemudian di dalam aquadest. Jaringan otak selanjutnya diwarnai dengan pewarna hematoxylin dan dilanjutkan dengan perendaman dalam aquadest. Selanjutnya jaringan otak diwarnai dengan menggunakan eosin alcohol, dan dilanjutkan dengan perendaman kembali dalam aquadest. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat serta penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol.
Selanjutnya jaringan otak ditutup dengan cover glass
(mounting). Pewarnaan Immunohistokimia Pewarnaan immunohistokimia diawali dengan memasukkan preparat jaringan otak ke dalam inkubator 65 oC selama 5 menit dan selanjutnya didinginkan pada suhu kamar lebih kurang selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan deparafinisasi secara berseri dimulai dari xylol III sampai dengan xylol I masing-masing 3 menit. Berikutnya dilakukan rehidrasi secara berseri dimulai dari alkohol absolut III sampai dengan alkohol absolut I dan alcohol teknis 96% sampai dengan alcohol teknis 70%, dan kemudian preparat direndam di dalam dionize water masing-masing 10-15 menit. Langkah selanjutnya adalah menghilangkan peroksidase endogen pada preparat dengan cara mencelupkan preparat dalam 50 mL larutan metanol yang dicampur dengan 0,5 mL H 2 O 2 dalam keadaan gelap selama 15 menit. Penghilangan peroksidase harus dilakukan dengan segera, kalau terlambat hasilnya positif semua. Selanjutnya preparat dicuci dengan distilled water (DW)
sebanyak 2 kali masing-masing 5-10 menit, dilanjutkan mencuci dengan phosphate buffer saline (PBS) sebanyak 2 kali masing-masing 5-10 menit. Preparat selanjutnya diinkubasi dengan normal serum (10% dalam PBS) selama 30-60 menit untuk memblok antigen non spesifik agar tidak mengacaukan reaksi. Setelah itu, preparat dicuci kembali dengan menggunakan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit. Langkah berikutnya preparat diinkubasi dengan antibodi primer yang telah ditetapkan pada suhu 4°C (disimpan di dalam refrigerator) selama 1-2 malam. Selanjutnya dikeluarkan dari refrigerator dan dibiarkan pada suhu kamar lebih kurang 1 jam, kemudian dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 10 menit. Langkah berikutnya preparat diinkubasi dalam antibodi sekunder dako envision peroxydase system (DEPS) (50-60 µl/preparat pada suhu 37 oC dalam keadaan gelap selama 30-60 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit. Kemudian divisualisasi dengan diaminobenzidin (DAB) 10 mg dalam 50 mL tris buffer dan 50 µl H 2 O 2 . Selanjutnya dicuci dengan DW (stoping point).
Jika dianggap perlu dapat juga dilakukan
counterstain dengan hematoxylin. Langkah akhir pewarnaan ini adalah dehidrasi, clearing, dan mounting. Variabel yang Diukur Data yang diamati pada penelitian ini adalah sel-sel yang positif terhadap masing-masing antibodi yang digunakan dan juga kepadatan sel-sel astrosit. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara diskriptif dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan.
