MEKANISME PENGHAMBATAN W U L E N S I BAKTERI ENTEROPATOGEN OLEH EKSTRAK RIMPANG JAHE (&giber oflcirtale Roscoe)
Oleh: Lilik Eka Radiati
N W . 965045
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2002
ABSTRACT
Mechanism of virulence inhibition o f entemphatogenic Lilik Eka hdiati, bacteria by ginger (Zingikr ofici~~ale Roscoe) rhizome extract. Under the guidance of Dedi Fardiaz as the chairman, Fransiska-Rungkrt Zmkaria, Idwan Sudirman and Ratih Dewanti-Hariyidi as advisory committee members. Fresh ginger is a flavoring ingredient which is commonly applied to most food dishes. It also knctions as a non toxic preservative, and can stimulate, inhibit or kill microbes depending on the dose applied. The principle compounds of ginger are essential oil and non volatile compounds, which have antimicrobial activity and comrnonlv used as traditional medicine. The objectives of this investigation are: ( 1 ) t o examine the antimicrobial activity of hexane, dicthoromethane and ethanol extracts of ginger against foodborne pat hogen such as Echerickia coli 0157:H 7, Snlmot~ellatyphi and l-,i'briocholerac 01, (2) to study the inhibition mechanism of bacteria by ginger extract by measuring hydrophobicity changes on the bacterial cell surface, (3) t o study the effect of ginger extract on hemolysin activity, (4) to study the effect of ginger extract in blocking cholera toxin binding to receptors of hybridorne and Caco-2 cells. The investigation consisted of several experiments and andyses. Ginger was extracted with hexane, and the residue was reextracted with dichtoromethane, and then with ethanol. The results were three types of extracts which was non polar (hexane), semi polar (dichloromethane) and polar (ethanol). The antimicrobia1 activity of the extracts were determined by agar difision method against E. coli 01 57:H7, pphi and K cholerae 01 The antimicrobial activity of the dichloromet hane extract was higher than hexane and ethanol extracts. The minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MRC) were determined in ginger dichlorometthane extract (GDE)that was shown a s the most effective antimicrobial extract. The MIC value t o E. coli 0 1 5 7:H7, S. &phi and F ccholerae 01 were 10, 10 and 5 mglml respectively and the MBC value were 15, 20 and 8 mgml respectively. The ability of GDE as antimicrobial caused by the GDE could be due to the nature of the extract that could easily interact with the outer membrane bacterial. The fractionation of the GDE using TLC of silica G60 F 2 d 5 p r o d u d 8 fractions, four of those showed the antimicrobial activity. These compounds are suggested t o interact with the membrane compound of the bacteria through hydrophobic interaction. The hydrophobicity of bacteria. was determined using BATH (Bacteria adhesiotr to hydrocarbotl) test. This information was used to explain the inhibition mechanism. All bacteria showed to give positive response t o 0,9 ml n-octane exposure, indicating that E. coli 0 15 7:H7 was categorized as moderate hydrophobic bacteria, while S. r y b i and C: cholerrre 01 were catagorized as highly hydrophobic bacteria Ginger water extract and GDE increased hydrophobicity of E.
c ~ t l i0 I 57,H7 by 24.40 and 1.65 percent respectively but decreased hydrophobicity of S. !\phi by 47.56 and 43.97 percent and tr chnlerm 01 by 70.14 and 33.22 percent. This finding shows that one of the inhibition mechanism may be caused by an interact ion of phenolic conlpounds with cell membrane, in which hydrophobic sites o f ginger extract modified the hydrophobicity of the bacteria cell surface. The hydrophobicity modification in bacterial cell wall might result inhibition of hemolysin
production L'ibrio cholerac! 01 on blood agar showed P-hemolysis activity, while E. coli 0 1 57:H7 and S. yphi showed a-hemolysis activity. Ginger water extract inhibited the activity of a-hemolysis and partial inhibited of P-hemolysis but the GDE inhibited both hemolysis activity. The analysis of I,: choleruc 01 hemolysin extract activity in erythrocyte suspension was determined by the hemoglobin release of rabbit erythrocyte at 37OC for 90 minutes incubation. The concentration of 2.5 and 5 pg/d of hemolysin extract released 16.48 2.22 and 25.40 f 3.23 percent hemoglobin respectively. The effect of 7 5 and 150 p~Jml GDE to the 5 p g / d hemolysin extract inhibited 67.25 +_1.89 and 57.88 5 7.60 percent of the activity. Research was extended to observe the effect of GDE on FITC conjugated cholera toxin binding on the receptor of hybridome and Caco-2 cells. A total of los cellsld were incubated with 0-5 pg/d toxin 0-FITC and 25 or SO pglml GDE in RPMI. at 4OC for one hour. Analysis of toxin binding by flow cytometry showed that the addition of GDE inhibited the toxin binding. The binding inhibition respectively were 4.76-15.66 and 12.55-24.60 percent to Caco-2 cells, and 3.55-1 7.95 and 3.58-27.83 percent to hybridome cells. The inhibition on the toxin binding may be due to modification of the receptor by GDE or interaction of GDE with the toxin.
+
ABSTRAK
Lilik Eka Radiati Mekanisme penghambatan virulensi bakteri enteropatogen oleh ekstrak rirnpaag jahe {Zingikr oficinale Roscoe). Dibawab bimbingan Dedi Fardiaz setagai ketua kornisi pembimbing, Fransiska-Rungkat Zakaria, Idwan Sudirman dan Ratih Dewanti-Rariyadi sebagai anggota.
Jahe segar merupakan bahan pemberi citarasa, yang biasanya ditambahkan dalam bahan pangan. Jahe berhngsi sebagai pengawet yang tidak toksik, dapat menstimulir, menghambat atau membunuh mikroba tergantung pada dosis yang digunakan. Senyawa utama pada jahe adalah senyawa minyak atsiri dan non volatil, yan2 mernpunyai aktivitas antimikroba dan digunakan sebagai obat tradisional Tujuan penelitian ini adalah: (1) menguji aktivitas antimikroba ekstrak heksan, diklorometan dan etanol jahe terhadap bakteri . f d h o r uparhoge~tseperti Escherichia cof i 0 15 7: H7, SaIm011ella&phi and Vibrio cholerae 01. (2) mempelajari rnekanisme penghambatan bakteri terhadap ekstrak jahe denrnengukur perubaham hidrofobisitas permukaan sel bakteri, (3) mempelajari pengaruh ekstrak jahe terhadap ahivitas henlolisin, (4) mempelajari pengaruh ekstrak jahe terhadap penghambatan pengika t an kolera toksin pada reseptor dari sel hibridoma dan Caco-2. Penelitian ini terdiri atas beberapa percobaan dan analisis. Ekstraksi jahe pert ama dilakukan dengan menggunakan pelarut fie ban, dan resi du diekstraksi kembali dengan diklorometan dan kemudian d q a n etanol. Hasil ekstraksi adaiah ekstrak non polar (heksan), semi polar (diklorometan) dm polar (etanol). Aktivitas antimikroba ekstrak ini ditentukan dengan metoda difusi agar terhadap E coli 0 1 57:H7, S. vphi and F cholerae 01 . Aktivitas antimikroba ekstrak diklorometan lebih tinggi daripada ekstrak heksan dan etanol. Konsentrasi minimal pengharnbat (MIC)dm konsentrasi minimal bakterisidal (MBC) ditentukan pada ekstrak diklorometan, yang menunjukkan antimikroba yang efektif Nilai MlC pada E. coli 0157:H7,S. typhi and P: cholrrae 0 1 berturut-turut adalah 10, 10 dan 5 mglml, sedangkan MBC berturut-tumt 15, 20 dan 8 m g l d . Kemampuan ekstrak diklorometan sebagai antimikroba disebabkan ekstrak tersebut mudah berinteraksi dengan komponen mernbran bakteri. Fraksinasi terhadap ekstrak diklorometan secara KLT menggunakan silika G60FZJ5 rnenghasi lkan 8 fraksi, 4 fraksi dari fraksi-fraksi tersebut menunjukkan aktivitas antimikroba. Senyawa tersebut diduga berinteraksi kuat dengan komponen membran bakteri melalui interaksi hidrofobik. Hidrofobisitas bakteri ditentukan dengan uji BATH (Bacteria adhesiorl to hjdrocnr-bot~). Informasi ini digunakan untuk menerangkan mekanisme pengharnbatan. Semua bakteri dinyatakan memberikan respon positif terhadap hidro karbon 0,9 ml n-oktana, t.;. cult 0 1 57337 merupakan hidrofobik moderat, S. (\phi dan I: cholerae 01 merupakan hidrofobik kuat. Sari jahe dan ekstrak
SURAT PERNYATAAN
Densan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul:
MEKANISME P E N G W A T A N VRULENSI BAKTERI ENTEROPATOGEN OLEI-I EKSTRAK RIMPANG JAHE (Zingiber oflicinale Roscoe) Adalah benar meru pakan hasil k arya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelrrs dan dapat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Januari 2002
Lilik Eka Radiati NRF. 965045lIPN
MEKANISME PENGIZQMBATAN VIRULENSI BAKTERI ENTEROPATOGENOLEHEKSTRAK RIMPANG J AHE (Zingiber oficinale Roscm)
Oleh: Lilik Eka Radiati NRP. 965045 Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi llmu Pangan
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANTAN BOGOR BOGOR 2002
Judul Disertasi: Mekanisme Pengharnbatan Virulensi Bakteri Enteropatogen Oleh Ekstrak Rimpang Jahe (Zingibm oficinale Roscoe) Narna
: Lilik Eka Radiati
NIP
: 9650451IPN
Program Studi : Ilmu Pangan
Menyetujui: 1. Komisi Pembimbing
/
Prof. Dr. Ir. H.Dedi Fardiaz. M.Sc. Ketua
P.Ir. Fransiska Rungkat Zakaria M.Sc
Dr.drh.kk. Idwan Sudirman
Anggota
Dr.Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi. M.Sc. Anggota Mengetahui : 2. Ketua Program Studi
vfak-Prof. Dr.Ir. Bettv Sri Laksmi Jenie. MS Tanggal lulus: 16 Januari 2002
v
Anggota
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Probolinggo pada tanggal 23 Agustus 1959 sebagai putri dari pasangan Moh. Zen Nawawi dan Supadmi Soekmopranoto. Pendidikan sarjana ditempuh di program studi Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya di Malang, lulus pada tahun 1984. Pa& tahun 1988, penulis diterima di Program Studi Ilmu Pangan Pascasajana LPB dan menarnatkannya pada tahun 1991. Kesempatan untuk melanjutkan ke program doktor pada program studi dan perguruan tinggi yang sama diperoleh pada lahun 1996, dengan beasiswa dari Universitas Brawijaya. Penulis bekerja sebagai staf pengajar di Universitas Brawijaya sejak tahun 1985. Selanla mensikuti program S3, semerijak tahun 1996 sampai dengan 200 I Pada tahu~l 2000 penulis rnelakukan sebayian penelitian di Universitas Henri Poincare, Nancy Perancis. Kary a ilmiah yang berjudul Pengaruh Ekstrak Jahe Terhadap Aktivitas Hemolisin telah disajikan pada seminar Kongres Nasional Biokimia, IPB di Bogor pada bulan Juli 7,000. sulung
PRAKATA
Tiada kata yang paling pantas diaturkan kecudi rasa syukur pa& Tuhan Yang Maha Esa atas segala rachat yang telah diberikan pada kami, sehingga kami dapat menikmati proses belajar di Program Studi Ilmu Pangan, Institut Pertanian Bogor yang saya cintai. Di Program Studi ini kami dipertemukan dengan pembimbingpembimbing yang karni hormati, dengan bimbingan mereka kami dapat menghiasi dan mewarnai pengetahuan dan tulisan kami yang berjudul "MEKANISME PENGHAMBATAN VIRULENSI BAKTERI ENI'EROPATOGEN OLEH EKSTRAK RIMPANG J AHE (Ztngiber officinule Roscoe)" yang telah dipertanggunglawabkan pada ujian terbuka program doktor Pascasmjana LPB. Oleh karena itu sepantasnya kami rnengucapkan terima kasih atas kesediaan:
Bapak Prof. Dr. Ir. fl. Dedi Fardiaz, M. Sc, selaku ketua komisi pembimbing, Ibu Dr. Ir. Fransiska-Rungkat Zakaria, M.Sc. Bapak Dr. drh. H , ldwan Sudirman. dan lbu Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc. sebagai anggota komisi pembimbing. Diucapkan terimakasih kepada: I . Ibu Fransiska-Rungkat Zakaria, selaku peneliti u t m hTim URGE yang telah memberikan kesempatan untuk rnewarnai penelitimya sehingga kami juga turut menggunakan bantuan dana untuk membiayai penelitian karni dan memberikan jalan untuk melakukan penelitian di Perancis.. 2. AIamarhumah Ibu Prof Dr. Ir. Hj.Srikandi Fardiaz, M.Sc. atas bimbingan dan saran beliau kami dapat merangkai rencana penelitian dan juga bantuan bahan
penelitian yang telah diberikan pada kami. 3. Pemerintah Perancis atas bantuan yang telah diberikan kepada kami sehingga karni dapat melakukan penelitian yang bejudul "Effzct of ginger (Zit~gi her oflci~~ulc! Roscoe) dichlorornethane extract on toxi11 binding to receptor on hybridoma and Caco-2 cell. Pada kesempatan ini karni dibimbingan oleh Prof. P. NABET, P.F W C K , J. CAPIMOUNT, dan F. B. NABET. 4. Yayasan Orbit, Yayasan Toyota Astra dan Yayasan Aji Dharma Bakti yang telah menyurnbangkan dana untu k kelancaran penelitian tersebut. 5. Rektor Universitas Brawijaya dan Dekan Fakultas Petemakan yang telah mengijinkan untuk menambah pengetahuan kami dm rnenerima kembali sebagai
kolega.
6 . lbunda Soekmopranoto atas do'a restunya ananda dapat belajar walau pedalanan yang ananda ternpuh hampir 66 purnama. Kepada suarni dan ananda tercinta Dedi dan Dian, mereka rela menahan kerinduan yans mendalam rnelepaskan ibunya dengan do'a untuk menjadi laksamana menggali dan menggali pengetahuan agar senantiasa berfikir dan berdikir dan mengantarkan pada 'Tholabul ngilmi alakulli faridhothun muslimina wal muslimat" dan terucap kami berlindung kepada Allah dengan segala hukumNya.
7. Ucapan terimaksih juga disampaikan kepada mbak Ary, mas Taufik, mbak Sri dan mas Nur staf laboratorium PAU Pangan dan Gizi TPB, Bapak Wawan staf laboratorium mikrobiologi BALITVET, Ibu Andrijar dan Bapak Taryono staf Balai Penelitian Rernpah dan Tanaman Obat BALITRO yang telah membatu mencarikan pustaka dan pengadaan sampel jahe. Atas jasa mereka juga, kami &pat rnelakukan penelitian ini dan semoga Allah yang membalaskan kebaikan mereka.
DAFTAR IS1
Halaman
Isi DAFTAR IS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAFTAR SJNGKATAN.............................................
xiv
DAFTAR TABEL ...................................................................................
xvi
DAFTAR GAMB AR ...........................................................................
DAFTAR LAMFIRAN ........................................................................... I.
xxi
PENDAHULUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . LATAR BELAKANG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I3. TUNAN ................................................................................... C. MANFAAT PENELITIAN ................................................ D. DAFTAR PUSTAKA .................................................................
I1 . TINJAUAN PUSTAKA........................................................ A . S E W A W A ANTIUIKROBA DARI BAHAN TANAMAN ....... 1. Golongan Fenolik ........................................................ .. 2 . Golongan Terpeno~a. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 10 10 11
B . MEKANlSME PENGHAMBATAN MIKROBA ...................... 1 . Kornponen Bioaktif Senyawa Antimikroba .......................... . . a. C ~ n c ~aromatik n ...................................................... b. Gugus alkil ............................................................ c . Senyawa tiosulfinat.................................................. 2 . Mekanisme Kerja Senyawa Antirnikroba............................. a. Gangguan pembentukan dinding sel ............................ b . Reaksi dengan seI mernbran. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c. Penghambat sintesis protein........................................ d. Gangguan fungsi material genetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e. Pengkelat logam ................................................................
C . ANALISIS PENGHAMBATAN MKROBA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
D . TANAMAN JAHE DAN M A N F M T N Y A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19 20 21
1. Nama dan Asal Tanaman Jahe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 . Manfaat Tanarnan Jahe ..........................................................
E KOMPOSISI KIMIA JAHE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I . Minyak Atsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21 2.3
2 . Oleoresin .............................................................................. 3 . Ekstraksi Oleoresin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a.Pelarut ekstraksi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b.Cara ekstraksi .......................................................... . . c . Frakstnas~. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
G . MIKROBA PATOGEN PADA BAHAN PANGAN................ 1 . Saltnotleila yphi ........................................................ 2 . E.scherichia coli 01 5 7: H 7 ........................................... 3 C;ihriochofercre 0 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H. FAKTOR VIRULENSI BAKTERI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . Struktur Bakteri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a. Kapsul dan lapisan lendir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b . Adesin ............................................................... 3 Toksin................................................................... a. Enterotoksin....................................................... b . Sitotoksin.......................................................... c. Endotoksin......................................................... .. d . Hemohwn .......................................................... 4 . Faktor Lingkungan..................................................... a. Antimikroba dan Fe (Besi) ........................................ b . Suhu .................................................................. .
I . RESEPTOR MEMBRAN................................................. I . Intmksi Toksin dengan Reseptor .................................... 2 . Mekanisme Transduksi Sinyal pada Reseptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
III . PENGHAMBATAN BAKTElU E. coli 0157.H7.S. typhi DAN ?I cholerat, 01 OLEH EKSTRAK JAHE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C . METODA PENELITIAhl... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Tempat dan Waktu Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2 . Bahan Penelltian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 . Ekstraksi Jahe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 . Fraksinasi Ekstrak Jahe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . Analisis Total Fenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 . Uji Aktivitas Antimikroba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
a Metoda d ~ h agar s ~ ....................................................... b . Metoda pengenceran pada nutrien broth ............................. c . Aktivitas antirnikroba sari jahe ........................................ -Menentukan kadar oleoresin sari jahe ............................... -Uji aktivitas antimikroba sari jahe .................................... .
D H A S I L PENELITIAN DAN PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . Rendemen Oleoresin Jahe pada Setiap Tahap Ekstraksi . . . . . . . . . . . . . 2 . Pengaruh Polaritas Ekstrak Jahe terhadap Aktivitas Antimi kroba a Ekstrak non poIar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b. Ekstrak semi polar .................................................... c . Ekstrak polar........................................................... 3 . -4ktivitas Antimikroba Ekstrak Diklorometan Jahe pada Metoda .
Pengenceran................................................................ 4 . Pengaruh Sari Jahe terhadap F. cholerae ..................................
5 . Aktivitas Antimikroba dari Fraksi Ekstrak Diklorornetan Jahe ...... a. Fraksinasi ekstrak diklorometanjahe .................................
b . Aktivitas antimikroba fraksi 1-4 dari ekstrak diklorometan jahe
F . DAFTAR PUSTAKA..................................................... IV . PENGARUH EKSTRAK DIKLOROMETAN DAN SARI JAKE TERHADAP E-~~DROFOBISIT AS BAKTERI E. coli 0157.H7.S. tyyhi D-AN 1: cholerue 01 .............................................................
C METODA PENELITIAN .................................................... 1 . Tempat dan Waktu Penelitian. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2 . Bahan Penelltian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 . Uji Hidrofobisitas Bakteri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
D . HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F DAFTAR PUSTAKA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C . METODA PENELITIAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. T e m p t dan Waktu Penelitian .......................................... .. 2 . Bahan Penelltian .......................................................... 3 . Ekstrak Diklorometan Jahe.............................................. 4 . Toksin Kolera Subunit B terkonjugasi-FITC .........................
5 . Kultur Sel Hibridoma dan Caw-2...................................... 6 . Penambahan Ekstrak Jahe pada Kultur Sel ............................ 7 . Aplikasi flow cyfometryuntuk Menentukan Viabilitas Sel . . . . . . . . . . 8 . Analisis Ikatan Toksin B-FITC pada Reseptor denganpow cyromefry................................................................... a. Penjenuhan dan ikatan spesifik toksin B-FITC pada sel hibridoma dan Caco-2.................................................
b. Analisis penghambatan ekstrak diklorornetanjahe terhadap pengikatan toksin B-FITC pada sel hibridoma dan Caco-2 ...... D. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN .......................... I . Pensaruh Ekstrak Diklorometam Jahe terhadap Pertumbuhan Sel Hibridorna dan Caco.2 ................................................... 2. Reseptor Kolera Toksin B-FFTC pada Hibridoma dan Caco-2 ..... 3 . Reseptor Spesifik Toksin B-FFTC pada Hibridoma dan Caco-2 ... 4 . Pengaruh Ekstrak Diklorometan Jahe terhadap Pengikatan Toksin B-FFTCpada Sel Hibridoma dan Cam-2 ..............................
VII . PEMBAHASAN LMUM ...............................................
VIII . KESIMPULAN DAN SARAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B . SARAN.....................................................................
DAFTAR SINGKATAN
ADP ATCC AMP ATP BATH BCC
BM BHA BSA CHO cfu CT CAMP cGMP
DMSO DNA
GDE
GM 1 Gas
EDTA EPS FLS FITC malton KCKT KK KLT LFLS L9OLS LT LPS Mdalton MBC MIC
MIF NA NAD
m, OD
: Adenosine diphosphate (adenosin difosfat)
: American Type Culture Collection : Adenosine
rnonophosphate (adenosin monofosfat)
: Adenosine triphosphate (adenosl trifosfat) : Bacterial Adesion To Hydrocarbon : Balitvet Culture CoIlection : Berat Molekul : Butylated hydroxyanisole
Serum Alburnine : Chinese Hamster Ovary : colony forming unit : Cholera Toxin (toksin koIera) : cyclic adenosil monophosfhate (denosin monofosfa siklik) : cyclic guanosine monophosphate Cguonosin monofosfat sikiik) : Dimethylsulfoxide : Deoxyibonucleic acid (Asam deoksiribonukleat) : Ginger Dichloromethane Extract : Monosialosil gangiiosida : Guainylnucleotide a subunit stimulating factor : Ethylenc diarnine tetra acetate ( etilen diamin tetra asetat) : Eksopolisakarida : Forward Light Scatter : Fluorecensce isothiocyanate : kilo Dalton : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi . : Kromatografi Kolom : kornatografi Lapis Tipis : Lovg Forward Light Scatter : Log 90" Light Scatter : Labile Toxin (toksin labil terhadap panas) : Lipopolisakarida : Mega Dalton : Minimum Bactericidal Concentration : Minimum Inhibitory Concentration : Mean of fluorescence Intensity : Nutrient Agar (nutrien agar) : Nicotinamide adenin dinucleotide : Nutrient Broth (nutrien broth) : Optical Density : Bovine
PBS Rl LT RNA RPM 1 Rr SDS-PAGE Toksin-B Toksin-A
ST VT 90LS
: Phosphate Buffer Saline (bufer salin fosfat) : Rabbit Ileal Loop Test
Ribonucleic acid (asam ribonukleat) : Roosevelt Park Medical Institute Retardation factor : Sodium dodesilsulfat poliakrilamid gel elektroforesis : Toksin subunit B : Toksin subunit A : Stable Toxin (toksin tahan terhadap panas) : Vero Toksin : 90" Light Scatter
DAFTAR TABEL
Tabel 1 . Komposisi hmia dari 100 g jahe.. .. . . . .. . . ..... . . . ........... . ..... . . . . . . . . .
2 . Mutu jahe dari berbagai daerah di Indonesia............ . . . .
..
. .. . . .
3 . Sifat fi siko kimia minyak atsiri jahe.. . ... . . . ... . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . 4. Kon~posisi komponen minyak atsiri dari rimpang jahe dan oleoresin...
5 . Jumlah toksin kolera yang terikat pada sel dari berbagai had pengamatan, data merupakan ekspresi inkubasi 1 pg sel dengan 1 ng toksin . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ... . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . .. . . .
. . . ..
. ..
.. .
.
6 . Rendemen oleoresin dan total fenol dari hasil ekstraksi bertahap berturut-tvrut dengan heksan, diklorometan dan etanol .. . . .. . ... . . . . . . . . . 7. Radius areal pengharnbatan (mm)dari 30 pl ekstrak jahe (konsentrasi
90 mg ekstraklml) . . .. . ... . . . . . . ... .... . . ... . . . ... ... . . . . . . . . .... . . . . . . ... ..... .
8. Pertumbuhan bakteri E. coli 0157:H7, S. Whi dan
b: ckolerae 01. pada media NB yang mengandung ekstrak diklorometan ... . . . . . . . . . .
9. Penghambatan F: cholerae 01 &lam media NE3, ditambah 0,5 persen NaCI, inkubasi pada suhu 37"C, 24 jam.. . . . . . . . ... .... . . . ... .. .. 10. Nilai Rf fraksi ekstrak diklorometan ........ . . . . . .... ..... . . . . . ......... . ...
I I . Radius areal pengharnbatan (mrn) dari 30pl ekstrak dan fiaksi ekstrak diklorometan jahe terhadap I: cholerae 0 1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 12. Kriteria hidrofobisitas bakteri...... . . . . . . . . . . ..... ... . . . . . . ...... . . . . . .
1 3 . Pengaruh ekstrak diklorometan dan sari jahe terhadap hidrofobisitas
bakteri pada penambahan 0,9 ml n-oktana.. . . . . . . . . ....
.. . .
. . . ... . . . . . . . . . .
14. Aktivitas hemolisin .'T cholerae 01, E. coIi 0157:H7, S. typhi dan S. lrlrrezt.c pada media asar darah. . .. ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . .. . . . . . . . . .
1 5 . Pengaruh ekstrak diklorometan jahe terhadap aktivitas 5 uglml ekstrak hernolisin I : cho/erm 01 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16. Total ikatan, ikatan non spesifik dan spesifik toksin B-FITC pada 10" sel/ml hibridoma , pada konsentrasi 40 uglml toksin B-tanpa-FITC
dengan berbasai konsentrasi toksin B-FITC. .............................. 17. Total ikataq ikatan non spesifik dan spesifik toksin B-FITC pada lo5 seVd Caco-2, pada konsentrasi 40 ugml toksin B-tanpa-FITC dengan berbagai konsentrasi toksin B-FITC. .............................
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1. Rumus bangun zingiberen (Guenther, 1952).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. Reaksi dehidrasi dan degradasi ginger01 menjadi zingeron dan shogaol (Pursqlove ~ lI98, I ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
Struktur gangliosida GMt teidiri dari (1) galaktosa, (2) Nasetiigaktosarnin, ( 3 ) glukosa, (4) asam asetilmuraminik- (5) seramida (N-asil spingosin) (Gill, 1978). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. Kemungkinan model mekanisme ikatan dan translokasi toksin kolera pada membran sel eukariot ; menggambarkan toksin subunit B berikatan dengan GMI dari mernbran sel eukariot dm memfasilitasi reaksi enzimatik yanz mengakibatkan toksirl subunit A dzpat mencapai bagian hidrofobik membran (Cau dan Seite, 1999).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . hmp-
jahe gajah (Zitlg'berofficittale Roscoe).. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6. Skema prom ekstraksi jahe............................................... 7. Penshambatan (mrn) dari 30 yl ekstrak diklorometan jahe (konsentrasi 9i, mg ekstrawml) terhadap S. fyphi, V. cholerae 01
danE. coli 0157:H7 ......................................................... 8. Subkultur I: cholerae 0 1 pada media NA, setelah diinkubasi pada media NB yang masing-masing media mengandung sari jahe setara dengan 11)0,(2)6, (3)9dan(4) 12 mgbubukfml .................... 9. Fraksinasi ekstrak diklorometan jahe pada silica G60 F 245 dengan larutan pengembang heksan :dietil eter (3:7 ) . Hasil menunjukkan F](Rf: 0.1 5), F2 (Rf: 0,19), F3 (Rc 0,30) dan F4 (Rf0.42) FS (Rf: 0.50), F g (& 0,611, F,(Rr: 0,75) clan Fs(Rr: 0,89). . . . . . . . . . . . . . . . . . 10. Fraksinasi ekstrak diklorometan jahe
pada silica Ga F245 dengan larutan pengembang heksan :dieti1 eter (3:7). Pada proses pengembansan lebih lanjut Hasil menunjukkan FI(Rr: 0,15), Fz (Rf 0.19). F3 ~ R F0,301 : dan F4 (Rc0.42) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....
12
1 1 . Penghambatan E< cholerae 01 dari anak panah berserak searah jarum jam adalah ekstrak diklorometan jahe (30 pl dari 90 rng ekstraklml), kontrol pelarut dan F,, FZ, F3, F4 (30 p1 dari 15 mg
fiaksilml). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12. Pengaruh sari jahe dan ekstrak diklorometan terhadap hidrofobisitas E. .coli 0 1 57:H7 pada hidrokarbon n-oktana.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13. Pengaruh sari jahe dan ekstrak diklorometan terhadap hidrofobisitas S. 9phi pada hidrokarbon n-oktana.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I4 Pengaruh sari jahe dan ekstrak diklorometan terhdap hidrofobisitas sel I,: cholerae 01 pada hidrokarbon n-oktana... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
1 5 . Aktivitas hemolisis S. rypki , E. coli 01 5 7: H7 S. atlretis dan k: cholrrae 0 l pada agar darah (kontrol), areal bening menunjukkan ..
adanya hemol~s~s .......................................................... 16. Aktivitas hemolisis t - cholerae 01, E coli 0157:H7, S iyphi dan S. atlretcs pada agar darah dengan penggunaan 10 mg/ml sari jahe sebagai pelarut media agar darah dan ekstrak dikJoromztan konsentrasi 8, 15, 20 dan 20 p g / d agar darah berturut-tumt pada C.: cholerae 01, E. coli 01 S7:H7 dan S. yphi dan S. atrretis ............... 17. Profil BM protein pada SDS-PAGE: protein supernatan kultur b: cholerae 01 (2,3,4, 5 dan 7)dan standar B M protein (1 dan 6 ) ...... 18. Aktivitas 2:5 dan 5 pgml ekstrak hemolisin k-: cholerae 01
terhadap sel eritrosit pada berbagai lama inkubasi
............
19. Sitogram flow cytomev, Log intensitas sinar difrhksi (LFLS) meningkat menunjukkan populasi sel hidup (H)dan log intensitas
sinar refraksi (90LS) meningkat dengan LFLS menurun menunjukkan populasi sel mati (G); populasi (a) sel hibridoma dan (b) sel Caco-2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20. Histogram fluoresens dari toksin B-FITC; (a) populasi sel tanpa toksin B-FITC tidak berfluoresens, (b) populasi sel berfluoresens
dengan toxin B-FITC yang terikat pada reseptor, pada penambahan 40 pglml toksin-FITC pada hibridorna 1 o6 seVml... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 1. Pertumbuhan 10' seYml Caw-2 pada media RPMI 1640, yang mengandung 12,5,25 dan 5OCtglml ekstrak diklorometan jahe. ....
124
22. Pertumbuhan lo5 sel/rnl hibridorna pada media RPMI 1640, yang mengandung 12,5, 25 dm 50pglml ekstrak diklorornetan jahe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
125
23. Kurva penjenuhan reseptor oleh toksin B-FITC pada hibridoma (a) dan Cam-2 (b). .......................................................
127
24. Pengaruh ekstrak diklorometan jahe 25 dan 50 pglml terhadap ikatan toksin-FITC pada 1o5 seYml hibridorna; (a) intensitas fluoresensi dan (b) persen penghambatan intensitas fluoresens.....
129
2 5 . Pengaruh ekstrak diklorometan jahe 25 dan 50 &ml terhadap ikatan toksin-FITC pada I o5 seYml Caco-2; (a) intensitas fluoresens dan (b) persen penghambtan intensitas fluoresens......
I30
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran I
Halaman
Rendemen oleoresin dan total fenol hasil ekstraksi bertahap secara berurutan dengan pelarut heksan, diklorometan dan etanol... .. ...... . .
142
2 . Radius areal penghambatan (mm)dari 30p1(90 mg ekstrakdrnl) ekstrak jahe pada uji difusi agar.... .. . .. . .. . ........... ......... .. ...... . ..
143
3. Hidrofobisitas E. coli 0157:H7pada n-oktana... ........ . . . . ..... .. . . ..
144
Hidrofobisitas S vphi pada n-oktana.. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . ... . . . . . . . ..
145
5 . Hidrofobisitas K choferae01 pada n-oktana.. .... ............ . .. . . . . . .
146
4.
6 . Pengaruh 1Omglml sari jahe terhadap hidrofobisitas E. coli
01 57:H7pada n-oktana......... . . .... .. .... .. . .. . . .. ....... .. . . . . ....... . ...
147
7. Pengaruh 1Omglml sari jahe segar terhadap hidrofobisitas S. gphi
pada hidrokarbon n-ohm... . ................. . .. . . . .. . . .. . ........ . .
.
148
8. Pengaruh IOmglml sari jahe segar terhadap hidrofobisitas K cholerae 01 pada hidrokarbon n-oktana. . . . .. . ................ . ....... . .
149
9. Pensaruh 15 m g l d ekstrak diklorometan jahe terhadap hidrofobisitas E. coli 0157:H7pada hidrokarbon n-oktana.. ...... . . ...
150
. ..
10. Pengaruh 20 rngd ekstrak diklorometanjahe terhadap hidrofobisitas S. vphi pada hidrokarbon n-oktana... ... ....
Pengamh 8 mglrnl ekstrak diiorometan jahe terhadap hidrofobisitas L .' choferae 0l pada hidrokarbon n-oktana. .. ... .. . . . . . . . . ...... . . . . . .. ..
152
12. Hasil analisis b r a t molekul protein supernatan kultur K cholerae 01 pada elektroforesis (SDS-PAGE) . . .... . . . . . . ... . .. ..... .. . . . . . .. .. . . ..
153
13. Aktivitas hemolisin 2,5pg proteidrnl pada berbagai suhu inkubasi
154
14. Aktivitas hemolisin 5 pg proteinlrnl pada berbagai suhu inkubasi
155
1I
.
ssi
15. Pengaruh ekstrak diklorometanjahe tefiadap aktivitas ekstrak hemolisin 25.40%. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. .. . . . .. . . . . . . . . . . - . ,,, ,
156
1 6. Proliferasi sel hibridoma pada media RPMI 1640 mengandung 0, 1 2 , 5 , 2 5 dan 50 pdml ekstrak diklorometanjahe, jurnlah sel (x 10'
seU ~nl). . . . .
...... ...
. . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . ... . . . .. . . . . . . . . . . ,
157
17. Proliferasi sel hibridoma pada media RPMl 1640 mengandung 0, 12.5,25 dan 50 pg/rnI ekstrak diklorometanjahe, jurnlah sel (x lo4
seVml)
. .. .. . . .. . . . . .. . . . ... . . . . . . ... ... ... ... . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . ....
18. Saturasi toksin B-FITC pada hibridoma dan Caco-2.. . . . . ... . . . . ... . . ..
157
158
19. Pengharnbat an ekstrak diklorometan jahe terhadap pengikatan
toksin B-FITC pada sel hibridoma... . . . . . . . .. .. . . . .... .. ... . .. .. . . . ..
.. . ..
158
20. Penghambatan ekstrak diklorometan jahe terhadap pengikatan toksin B-FITC pada sel Caco-2 ............ . . . ........... . .. . .. ... . . ... . . . . .
158
2 1. Potensi relatif total fenol hasil ekstraksi bertahap terhadap total fenol .. dalam sari jahe. . . . . . . . . ... . . . . . ................ . . ... . ............. .. ..... . . . ..
159
ssii
