E. Johannes dkk./ MANASIR vol. 1 no. 1 (2013), hal. 27-32 Aktivitas Antimitotik Β-Sitosterol Isolat Dari Hydroid Aglaophenia Cupressina Lamoureoux Terhadap Pembelahan Awal Sel Zigot Bulu Babi Tripneustes Gratilla Linn. Eva Johannes , Syafaraenan , Rosana Agus dan Muh. Ruslan Umar Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin, Makassar 90245 Antimitotic Activity Of Β-Sitosterol Isolated From Hydroid Aglaophenia Cupressina Lamoureoux Against Early Division Of Zygotic Cells Of Sea Urchin Tripneustes Gratilla Linn. Eva Johannes , Syafaraenan , Rosana Agus and Muh. Ruslan Umar Biology Dept. MIPA Universitas Hasanuddin, Makassar 90245 ABSTRAK. Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux adalah hewan invertebrata laut yang banyak mengandung senyawa bioaktif. Senyawa bioaktif tersebut digunakan sebagai bahan dasar obat antibiotik maupun antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan β-sitosterol hasil isolasi dari hydroid dalam menghambat perkembangan sel zigot bulu babi Tripneustes gratilla Linn. Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental, dengan tahapan perlakuan : isolasi β-sitosterol dari hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux, melalui maserasi dengan methanol, partisi dengan n-heksan, fraksinasi dengan kolom kromatografi, UV,IR dan NMR. Selanjut dilakukan uji aktivitas antimitotik, dengan konsentrasi β- sitosterol (0,1 µg/mL, 1µg/mL, dan 10 µg/mL) yang disuntikkan ke dalam bagian gonad jantan dan betina dari bulu babi Tripneustes gratilla Linn. Fertilisasi dilakukan dengan cara 1 ml sperma dan 5 ml sel telur difertilisasikan dalam gelas ukur yang berisi 60 ml air laut bebas protozoa, lalu diinkubasikan pada suhu kamar. Pengamatan sel yang membelah dilakukan setelah 2 jam inkubasi dengan menggunakan mikroskop yang dilengkapi kamera. Hasil penelitian diperoleh nilai penghambatan pada konsentrasi 0,1 µg/mL adalah 49,5% , dan pada konsentrasi 1µg/mL dan 10µg/mL dengan hasil 71,5% dan 86,5%. Hal ini menunjukkan bahwa β-sitosterol memiliki kemampuan untuk menghambat pembelahan sel zigot bulu babi T. gratilla Linn, dengan nilai IC50 = 1,033. Kata kunci: Antimitotik, β-sitosterol, isolat, Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux, zigot, Bulu babi Tripneustes gratilla Linn. ABSTRACT. Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux is an invertebrate sea animal which contain various bioactive compounds. These bioactive compounds are used as raw materials for antibiotics and anticancer drugs. This research was aimed to find out the ability of β-sitosterol isolated from hydroid in inhibiting the development of zygotic cells of sea urchin (Tripneustes gratilla Linn.). This study was an experimental study with the following treatment steps: isolation of β-sitosterol from hydroid Agalophenia cupressina Lamoureoux by maceration with methanol, partition with n-hexane, fractionation with column chromatography, UV, IR, and NMR. An antimitotic activity test was then performed with the concentration of 0.1µg/mL, 1 µg/mL, and 10 µg/mL injected into male and female gonad sections of sea urchin (Trupneustes gratilla Linn.). The fertilization procedures involved 1 mL of sperm and 5 mL of ovum fertilized in beaker glass containing 60 mL protozoan-free seawater, and then was incubated. The dividing cells were observed after 2 hours of incubation using a camera-equipped microscope. It was observed that the inhibition rate at 0.1 µg/mL was 49.5%, at 1 µg/mL was 71.5%, and at 10 µg/mL was 86.5%. These results indicated that β-sitosterol compound has the ability to inhibit the division of zygotic cells of sea urchin (T. gratilla Linn.), IC50 = 1,033 Keywords: Antimitotic, β-sitosterol, Isolate, Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux, zygote, Sea urchin, Tripneustes gratilla Linn.
rian senyawa antitumor dari bahan alam. Penelitian bahan obat antitumor dari alam umumnya difokuskan untuk mendapatkan senyawa aktif yang memiliki kemampuan menekan proliferasi sel tumor, memiliki efek sitotoksik antimitotik atau mempunyai kemampuan dalam menginduksi terjadinya proses apoptosis pada sel tumor [2]. Lebih dari 2000 spesies telah berhasil diisolasi dari organisme laut dan 8 phylum telah diuji di laboratorium kanker diberbagai negara maju. Hasil yang ditemukan
PENDAHULUAN Sel tumor adalah sel yang mengalami perubahan bentuk, sifat dan kinetiknya. Pertumbuhannya menjadi otonom, liar, tidak terkendali, lepas dari koordinasi pertumbuhan normal. Perubahan sel itu terjadi karena mutasi gen yang mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel yaitu proto-onkogen dan anti-onkogen [1]. Berbagai usaha telah dilaku-kan untuk menyembuhkan penyakit tersebut, yang saat ini intensif dilakukan adalah penca27
E. Johannes dkk./ MANASIR vol. 1 no. 1 (2013), hal. 27-32 diantaranya untuk golongan yang aktif kurang lebih 30% masuk ke dalam filum Coelenterata, yang juga mengandung senyawa sitotoksik [3]. Hydroid adalah invertebrata laut dari filum coelenterata yang hidup menempel pada spons, kaya akan senyawa kimia seperti: alkaloid, steroid, terpenoid, histamine yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat-obatan [4]. Menurut Joana at al., 2011 [5]. Hydroid memiliki senyawa bioaktif yang paling menjanjikan untuk diisolasi bagi kepentingan pengobatan penyakit manusia. Dari hasil isolasi dan karakterisasi metabolit sekunder hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux [6], menemukan salah satu senyawa bioaktif dari golongan steroid yaitu β-sitosterol, diduga senyawa tersebut memiliki aktivitas antimitotik. Namun bagaimana senyawa tersebut dapat menghambat pembelahan sel zigot bulu babi perlu diteliti lebih lanjut. Studi penghambatan pada perkembangan sel zigot bulu babi merupakan salah satu model yang digunakan untuk mendeteksi aktivitas sitotoksik, teratogenik, dan antineoplastik dari senyawa baru. Sel zigot bulu babi memiliki sensitivitas selektif terhadap obat dan mengalami tahapan pembelahan seperti halnya sel kanker, sehingga banyak digunakan dalam penelitian antikanker. Misalnya untuk melihat pengaruh suatu senyawa dalam menghambat laju pembelahan dan pertumbuhan sel yang disebut sebagai sifat antimitotik atau sitotoksik [3]. Pada penelitian ini ingin diketahui bioaktivitas β-sitosterol sebagai antimitotik terhadap pembelahan sel zigot bulu babi Tripneustes gratilla Linn. Dengan menggunakan Metode Grafik Probit Log-Konsentrasi.
monitor dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Selanjutnya dikromatografi kolom flash/tekan menggunakan eluen yang sesuai. Proses ini dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh isolate murni. Eludasi struktur Eludasi struktur senyawa dengan menggunakan metode spektroskopi, meliputi data UV, IR dan NMR. Penyiapan Sel Telur dan Sperma Bulu Babi Tripneustes gratilla LINN. Bulu babi Tripneustes gratilla Linn., jantan dan betina diinduksi dengan penyuntikan 1 ml KCl 10% ke dalam bagian gonad. Sperma yang berwarna putih susu dan sel telur yang berwarna kuning keemasan ditampung pada gelas kimia yang berbeda. Setelah itu dimasukkan pada lemari pendingin. Fertilisasi dilakukan dengan cara 1 ml sperma dan 5 ml sel telur difertilisasikan dalam gelas kimia yang berisi 50 ml air laut bebas protozoa. Persiapan Sampel Uji Ekstrak dan senyawa hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux ditimbang sebanyak 1 mg kemudian dilarutkan dengan DMSO sebanyak 100 µl, diencerkan dengan air laut bebas protozoa sehingga diperoleh konsentrasi 1000 µg/ml sebagai stok. Dari larutan stok ini dipipet menggunakan mikropipet ke dalam tabung eppendorf untuk mendapat konsentrasi 1, 10, 100 dan 1000 µg/ml. Kemudian dibuat kontrol positif dengan menggunakan air laut bebas protozoa. Pelaksanaan Uji Tabung eppendorf berisi β-sitosterol ditambahkan air laut sesuai perhitungan untuk mencukupkan volume akhir hingga 1 ml. Kemudian ditambahkan zigot sebanyak 100 µg/ml setelah 10 menit terjadi fertilisasi. Dilakukan pengulangan 3 kali untuk setiap sampel uji dan kontrol.Selanjutnya disimpan pada suhu 15 – 20oC dengan diselingi pengocokan. Pengamatan sel yang membelah dilakukan setelah 2 jam inkubasi dengan menggunakan mikroskop yang dilengkapi dengan kamera. Kemudian dilakukan perhitungan IC50 dengan menggunakan metode Grafik Probit Log-Konsentrasi [8].
BAHAN DAN METODA Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia organik Jurusan Kimia F. MIPA UNHAS dan Laboratorium Fitokimia F. Farmasi UNHAS pada bulan Agustus 2012 sampai Desember 2012, dengan menggunakan metode eksperimental. Sampel Hydroid dan Bulu Babi diambil di perairan pulau Lae-lae, Makassar, dengan kedalamam 1 – 3 meter dari permukaan laut. Ekstraksi, Partisi dan Isolasi [7] Sampel yang telah dikeringkan dihaluskan kemudian dimaserasi dengan metanol selama 1x24 jam pada suhu kamar. Ekstrak yang diperoleh diuapkan dengan rotafapor hingga diperoleh maserat kental, selanjutnya dipartisi cair-cair dengan menggunakan pelarut n-heksan. Hasil ekstrak kental n-heksan dianalisis dengan kromatografi lapis tipis. Hasil partisi difraksinasi menggunakan kolom kromatografi vakum menjadi beberapa fraksi kemudian di
HASIL DAN DISKUSI A. HASIL Analisis Fisikokimia Isolat Berbentuk Kristal putih (bening) sebanyak 23 mg, titik leleh 138˚C-139˚C. Karakter senyawa tidak berpendar dibawah UV, tampak dengan uji warna KLT, dengan 28
E. Johannes dkk./ MANASIR vol. 1 no. 1 (2013), hal. 27-32 noda berwarna biru kemudian memudar, menunjukkan noda tunggal dengan nilai Rf yang sama 0,35 cm. Selanjutnya dilakukan uji IR dan NMR.
Uji Aktivitas Antimitotik Uji aktivitas antimitotik β-sitosterol terhadap pembelahan sel zigot bulubabi Tripneustes gratilla Linn.. Dari pengujian tersebut diperoleh hasil, semuanya bersifat antimitotik (tabel 1). Tabel 2. Hasil Pengamatan Penghambatan Pembelahan Sel Zigot Bulu Babi (T. gratilla Linn) dengan β-sitosterol Konsentrasi (µg/mL)
0,1 1 10
Penghambatan Pembelahan Sel (%) untuk β-sitosterol 49,5 71,6 86,5
Data diolah secara analisis probit dan diperoleh hasil; βsitosterol memiliki IC50 (inhibitory concentration) = 1,033 µg/mL sedangkan untuk kontrol positip vinkristin memiliki IC50 = 0,102µg/mL ( Tabel 3).
Gambar (1) Spektrun IR β-sitosterol Tabel 1. Data spectrum 1H, 13C NMR, HMBC senyawa β=sitosterol
Tabel 3. Hasil Perhitungan IC50 menurut Metode Grafik Probit Log-Konsentrasi
β-sitosterol
B. Diskusi 1. Eludasi struktur Senyawa Isolat [9] Spektrum IR (KBr) menunjukkan serapan pada bilangan gelombang 3433 cm-1, indikasi terhadap adanya gugusan hidroksil didukung oleh adanya puncak serapan pada 1050 cm-1 menunjukkan adanya C-O. Serapan pada 2956, 2938, dan 2869 cm-1 berasal dari metil dan metilen, serapan pada 1634 cm-1 berasal dari uluran C=C menunjukkan adanya gugus Olefin, dan tekukkan C-H muncul pada 1465 cm-1.
Gambar 2. Struktur molekul β-sitosterol 29
E. Johannes dkk./ MANASIR vol. 1 no. 1 (2013), hal. 27-32 pada δC 50,2 (C-9) dan 71,9 (C-5), sinyal-sinyal proton pada δH 0,91 ppm (H-9) dengan sinyal karbon pada δC 36,2 (C-10), sinyal proton pada δH 2,28 (H-11) dengan sinyal karbon pada δC 32,0 (C-8), 39,8 (C-12) dan 50,2 ppm (C-9), sinyal proton pada δH 0,98 ppm (H-14) dengan sinyal sinyal karbon pada δC 32,0 (C-8) dan 42,4 ppm (C-13), sinyal proton pada δH 1,58 ppm (H15) dengan sinyal sinyal karbon pada δC 32,0 (C-8) dan 56,8 (C-14). Sinyal proton δH 0, 83ppm (H-27) dengan sinyal-sinyal karbon pada δC29,2 (C-25) dan 45,9 ppm (C-24), sinyal proton pada δH 0,82 ppm (H-28) dengan sinyal karbon pada δC 12,0 (C-29), 26,1 (C-23) dan 45,9 (C-24), ditunjuk pada Gambar 2. Dengan demikian dipastikan bahwa senyawa ini adalah β-sitosterol.
Spektrum 1H NMR senyawa 2 memperlihatkan adanya 2 gugus metal dengan multiplisitas singlet pada δH 0,67 (3H,s) dan 1,00 ppm (3H,s) dan 4 gugus metal dengan sinyal pada δH 0,80 ( 3H, d,J = 6,7) 0,82 (3H, d, J = 6,7), 0,83 (3H, t,J = 6,7) dan 0,91 ppm (3H, t,J = 6,1). Analisis spektrum COSY senyawa 2 menunjukkan korelasi 1H-1H tetangga antara sinyal proton pada δH 1,15 ppm (H-1) dengan sinyal proton pada δH 1,84 ppm (H2) dengan sinyal proton pada δH 3,51 ppm (H-3), sinyal proton pada δH 3,51 ppm (H-3) dengan sinyal proton pada δH 14,2 ppm (H-4), serta sinyal proton pada δH 5,34 ppm (H-6) dengan sinyal proton pada δH 1, 98 ppm (H-7), sinyal proton pada δH 1,98 ppm (H-7) dengan sinyal proton pada δH 1,49 ppm (H-8), sinyal proton pada δH 1,49 ppm (H-8) dengan sinyal proton pada δH 0,91 ppm (H-9), sinyal proton pada δH 1,48 (H-11) dengan sinyal proton pada δH 2,00 ppm (H-12), juga sinyal proton pada δH 1,49 ppm (H-8) dengan sinyal proton pada δH 0,98 (H-14), sinyal proton pada δH 1,58 ppm (H-15) dengan sinyal proton pada δH 1,82 ppm (H16) , sinyal proton pada δH 1,82 ppm (H-16) dengan sinyal proton pada δH 1,07 ppm (H-17) , sinyal proton pada δH 1,07 ppm (H-17) dengan sinyal proton pada δH 1,34 ppm (H-20). Analisis spectrum COSY juga menunjukkan korelasi 1H -1H tetangga antara sinyal proton pada δH 1,34 ppm (H-20) dengan sinyal proton pada δH 1,98 ppm (H-22), sinyal proton pada δH 1,98 ppm (H-22) dengan sinyal proton pada δH 1,14 ppm (H23), sinyal proton pada δH 1,14 ppm (H-23) dengan sinyal proton pada δH 0,89 ppm (H-24), sinyal proton pada δH 0,89 ppm (H-24) dengan sinyal proton pada δH 1,23ppm (H-28), sinyal proton pada δH 1,23 (H-28) dengan sinyal proton pada δH 0,83 ppm (H-29), sinyal proton pada δH 0,89 ppm (H-24) dengan sinyal proton pada δH 1,65 ppm (H-25) dengan sinyal proton pada δH 0,80 ppm (H-27) serta sinyal proton pada δH 1,65 ppm (H-25) dengan sinyal proton pada δH 0,82 ppm (H-26). Berdasarkan data spektroskopi diatas memberikan petunjuk bahwa senyawa ini merupakan β-sitosterol (Gambar 2). Struktur senyawa ini dapat dibuktikan dengan spectrum HMBC yang menunjukkan korelasi jarak jauh 1 H -13C antara sinyal proton pada δH 1,15 ppm (H-1) dengan sinyal sinyal karbon pada δC 19,1 (C-19), 36,2 (C-10), dan 71,9 (C-5), sinyal proton pada δH 1,84 ppm ( H-2) dengan sinyal sinyal karbon pada δC 37,3 (C-1), 42,4 (C-4), 140,8 (C-3), sinyal proton pada δH5,34 ppm (H-6) dengan sinyal sinyal karbon pada δC 32,0 (C-7), sinyal proton pada δH 1,98 ppm (H-7) dengan sinyal karbon pada δC 32,0 (C-8), 56,8 (C-14), sinyal proton pada δH1,49 ppm (H-8) dengan sinyal-sinyal karbon
Gambar 3. Korelasi COSY dan HMBC β-sitosterol Penghambatan β-sitosterol Nilai penghambatan pada konsentrasi 0,1 µg/mL adalah 49,5% ini berarti sebagian sel zigot bulu babi T. gratilla Linn masih dapat bertahan dan menyesuaikan diri pada konsentrasi tersebut. Tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi 1µg/mL dan 10µg/mL dengan nilai 71,5% dan 86,5% semakin kecil kemampuan sel bulu babi untuk melakukan pembelahan. Hal ini menunjukkan bahwa βsitosterol memiliki kemampuan untuk menghambat pembelahan sel zigot bulu babi T. gratilla Linn. Semakin tinggi konsentrasi senyawa yang digunakan, maka nilai penghambatan juga semakin besar. Hal ini sesuai dengan pendapat [10] bahwa β sitosterol merupakan suatu senyawa yang banyak digunakan untuk dijadikan bahan dasar obat .
30
E. Johannes dkk./ MANASIR vol. 1 no. 1 (2013), hal. 27-32 Hasil pengamatan menunjukkan β-sitosterol merupakan senyawa yang memiliki potensi sebagai zat antimitotik. Hasil uji memperlihatkan β-sitosterol memiliki IC50 =1,033µg/mL. Jika dibandingkan dengan vinkristin murni yang memiliki IC50 = 0,104 µg/mL maka βsitosterol memiliki kemampuan untuk digunakan sebagai bahan baku obat antikanker. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa: Senyawa kimia β-sitosterol dari hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker berdasarkan nilai IC50 =1,033 µg/mL lebih besar dari nilai IC50 vinkristin sebagai kontrol positip.
Gambar 4. Sel Bulu Babi dengan Konsentrasi 0.1 µg/ml
UCAPAN TERIMA KASIH Diucapkan terima kasih banyak kepada LP2M UNHAS yang membantu dalam pembiayaan sehingga penelitian ini dapat berlangsung. DAFTAR PUSTAKA
Gambar 5. Sel Bulu Babi dengan Konsentrasi 1 µg/ml
Gambar 6. Sel bulu babi dengan konsentrasi 10 µg/ml Inhibitory Concentration (IC50) Uji toksisitas dilakukan untuk mengetahui tingkat keamanan zat yang akan digunakan, oleh [8], uji toksisitas antikanker didasarkan adanya efek toksik pada sel. Salah satu uji efek sitotoksik dengan menggunakan metode antimitotik yaitu penghambatan pembelahan sel telur bulu babi setelah fertilisasi. Metode penghambatan pembelahan sel dihitung sebagai IC50.
1.
Sukardja I.D.G., 2000. Onkologi klinik. Edidi II. Erlangga University Press. Surabaya
2.
Berninghausen and Leippe, 1997. Necrosis Versus Apoptosis as the Mechanisms of Target Cell Death Induced by entamoeba hystolitica. Infaction and Imunity. 65(9); 3615-3620.
3.
Angka, S.L. dan Suhartono, M.T., 2000, Bioteknologi Hasil Laut , PKSPL-IPB, Bogor.
4.
Paradise, M.A. Grassi, G. Conti,F. Passareli and M.G. Curci Abu Erra (2006). Fire Coral Persistant Cutaneous Reaction (online), (http://jr.science.wep.muhio.edu/filecourse diakses 9 Desember 2009).
5.
R. Joana; Luisa Peixe; Newton C.M.Gomes; Ricardo Calado., 2011 . Cnidarians as a Sources of New Marine Bioactive Compound An Overview of the Last Decade and Future Steps for Bioprospecting. www.mdpi.com/journal/marinedrugs Review(diakses 20 Juli 2012) Marine Drugs. ISSN 1660-3397 Johannes, Eva, 2008, Isolasi, Karakterisasi dan Uji Bioaktivitas Metabolit Sekunder Dari Hydroid Aglaophenia cupressina
6.
31
E. Johannes dkk./ MANASIR vol. 1 no. 1 (2013), hal. 27-32 Lamoureoux Sebagai Bahan Dasar Antimikroba, Program Pascasarjana Unhas, Makassar. Hal. 10-14, 36-42. 7. Gisela, 1994. Screening of Marine Samples, in Natural Products Workshop work Book. Marine Science Intitute University of The Philiphines. Philiphine. 8. Thomson, W.J., Rahman, A., Ginoudhary, M.I., 2001. Bioassay Techniques For Drug Development, Harword academic Publisher, Australia. Page 39-41 9. Silverstein, Bassler and Morrill., 1986. Penyelidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Terjemahan Hartomo, Anny Victor Purba. Penerbit Erlangga. 10. Usman, 2012. Dasar-Dasar Kimia Organik Bahan Alam. Penerbit Dua satu Press.
32
