MAKALAH PEWARNAAN SEDERHANA, NEGATIF, KAPSUL dan GRAM Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Mikrobiologi yang Diampu Oleh Drs. Bambang Iskamto, M.Si
Disusun Oleh : RINA LESTARI 122100249
PROGRAM STUDI D3 KEBIDANAN SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN YOGYAKARTA YOGYAKARTA TAHUN AJARAN 2012/2013
Pewarnaan Bakteri
1
BAB I PENDDAHULUAN
A. Latar Belakang Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003) Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). B. Rumusan Masalah a. Apa yang dimaksud dengan pengecatan? b. Apa pengecatan sederhana itu? c. Bagaimana bentuk bakteri pada pengecatan sederhana? d. Apa pengecatan negatif itu? e. Bagaimana bentuk dan struktur bakteri pada pengecatan negatif?
Pewarnaan Bakteri
2
f. Apa pengecatan kapsul itu? g. Bagaimana bentuk dan struktur bakteri pada pengecatan kapsul? h. Apa pengecatan gram itu? i.
Bagaimana bentuk dan struktur bakteri pada pengecatan gram?
C. Tujuan a. Untuk mengetahui pengertian pengecatan bakteri b. Untuk mengetahui kerja pengecatan bakteri c. Untuk mengetahui bentuk dan struktur dari masing – masing pengecatan D. Manfaat a. Agar mahasiswa mampu mengetahui jenis – jenis pengecatan bakteri b. Agar mahasiswa mampu mengetahui bentuk dan struktur bakteri c. Agar mahasiswa mampu membedakan bentuk dan struktur bakteri
Pewarnaan Bakteri
3
BAB II PEMBAHASAN A. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin (lay ,1994). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaanpewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel Alat dan bahan yang di butuhkan pada saat pengecatan sederhana yaitu : Alat
Bahan
1. Gelas preparat
1. Bakteri Escherichia coli
2. Jarum ose
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Labeling
3. Aquades
4. Mikroskop
4. Methylen blue
5. Bunsen
5. Tissue
6. Pipet
6. Alkohol
Pewarnaan Bakteri
4
7. Tabung
7. Air mengalir
8. Rak tabung
Cara kerja : 1. Bersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian di fiksasi di atas bunsen 2. Beri label pada bagian bawah preparat glass 3. Pijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan teteskan 3 ose aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose 4. Pijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media dengan cara aseptik lalu diratakkan di atas preparat glass 5. Keringkan 6. Teteskan larutan zat warna methylen blue sebanyak 1 atau 2 tetes 7. Keringkan selama 1 menit 8. Cuci dengan air mengalir 9. Keringkan preparat dengan dianginkan, dan 10. Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri
Hasil pengamatan a. Bakteri Escherichia coli
Gambar di atas merupakan bakteri E. coli yang dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40x. Berwarna Ungu . Bentuk E. coli tampak seperti batang (basil) pendek yang membentuk koloni yang tersusun seperti rantai yang memanjang.
Pewarnaan Bakteri
5
b. Bakteri Bacillus Subtilis
B. Pewarnaan Negatif Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
Alat dan bahan Alat
Bahan
1. Gelas preparat
1. Bakteri Escherichia coli
2. Jarum ose
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Labeling
3. Aquades
4. Mikroskop
4. Nigrosin / tinta india
5. Bunsen
5. Tissue
Pewarnaan Bakteri
6
6. Pipet
6. Alkohol
7. Tabung 8. Rak tabung
Cara kerja : 1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol 2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah 3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi 4. Letakkan masing – masing bakteri (e coli dan bacillus) di atas nigrosin dengan cara aseptik 5. Buat apusan satu arah menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan 6. Keringkan dengan cara fiksasi 7. Amati menggunakan mikroskop
Hasil pengamatan a. Bacillus subtilis
Perbesaran 400 Berwarna Kuning Berbentuk coccus
b. E coli
Pewarnaan Bakteri
7
C. Pewarnaan Kapsul Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Teknik pewarnaan ini menggunakan tidak hanya satu jenis larutan zat warna, berbeda dengan teknik pewarnaan sederhana (pewarnaan tunggal) yang hanya menggunakan satu jenis zat warna saja. Pewarnaan diferensial banyak jenisnya, antara lain ialah pewarnaan gram, pewarnaan spora, pewarnaan tahan asam, pewarnaan giemsa, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagel. Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. fungsi kapsul pada sel bakteri : Sebagai makanan cadangan Mencegah kekeringan Mencegah fagositosis Menunjukkan virulensi Kapsul sulit diwarnai karena adaya afinitas( daya serap) terhadap cat sangat kecil
Alat dan bahan Alat
Bahan
1. Gelas preparat
1. Bakteri Escherichia coli
2. Jarum ose
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Labeling
3. Aquades
4. Mikroskop
4. Nigrosin / tinta india
5. Bunsen
5. Methylen blue
6. Pipet
6. Tissue
7. Tabung
7. Alkohol
8. Rak tabung
Cara Kerja : 1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol
Pewarnaan Bakteri
8
2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah 3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi 4. Letakkan masing – masing bakteri (e coli dan bacillus) di atas nigrosin dengan cara aseptik 5. Buat apusan satu arah menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan 6. Keringkan dengan cara fiksasi 7. Tetesi dengan methylen blue dan diamkan selama 1 menit (keringkan dengan fiksasi) 8. Amati dengan mikroskop
Hasil pengamatan :
Kapsul : bentuk kompak dan pasti Lendir : bentuk tidak beraturan Hasil bakteri seperti yang terdapat pada gambar ialah terdapat sel-sel bakteri yang bewarna dan kapsul tampak kosong disekitar tubuh bakteri (mengelilingi bakteri), dan sekitar kapsul berwarna gelap. Saat pengamatan bakteri ini relatif sukar karena apabila methylen blue terlalu pekat, maka akan mengganggu proses pengamatan bakteri. Kapsul dari berbagai spesies tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana atau pewarnaan Gram. Karena, kapsul dari berbagi spesies berbeda susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam pewarnaan yang sama. Misalnya, kapsul tidak memiliki afinitas yang besar terhadap bahan-bahan zat warna yang bersifat basa.
Pewarnaan Bakteri
9
D. Pewarnaan Gram Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. 2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam 3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
Pewarnaan Bakteri
10
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. 5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. 6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. 7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. 8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat 9. Peka terhadap streptomisin 10. Toksin yang dibentuk Endotoksin
b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. 2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. 3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. 4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. 6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. 7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut 8. Tidak peka terhadap streptomisin 9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-
Pewarnaan Bakteri
11
pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Alat dan bahan Alat
Bahan
1. Gelas preparat
1. Bakteri Escherichia coli
2. Jarum ose
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Labeling
3. Aquades
4. Mikroskop
4. Gram A : Larutan hucker cristal
5. Bunsen 6. Pipet
violet 5. Gram B : Larutan mordan Lugols iodin 6. Gram C : Larutan peluntur 7. Gram D : Larutan safranin 8. Tissue 9. Alkohol 10. Air mengalir
Cara Kerja : 1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol dan keringkan 2. Teteskan 3 ose aquades pada glass preparat 3. Letakkan bakteri diatas aquades tersebut secara aseptis 4. Keringkan dengan cara fiksasi 5. Tetesi gram A dan tunggu 1 menit 6. Setelah itu cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali 7. Setelah kering tetesi dengan gram B dan tunggu 1 menit 8. Cuci dengan air mengalir dan keringkan 9. Tetesi dengan gram C dan tunggu 30 detik 10. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
Pewarnaan Bakteri
12
11. Tetesi dengan gram D dan tunggu 2 menit 12. Cuci dengan air mengalir dan keringkan 13. Amati dengan mikroskop
Hasil pengamatan a. Gram positif
b. Gram negatif
Pewarnaan Bakteri
13
BAB III PENUTUP A. Kesimpulan Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan : 1. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup 2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna 3. Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya 4. Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan negatif,pewarnaan gram dan perwarnaan kapsul 5. Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : Methylen blue Nigrosin Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) / safranin Zat warna kedua / cat penutup (safranin) B. Saran Diharapkan kepda para praktikum untuk menjaga kebersihan lingkungan sekitar. Baik alat maupun benda yang kita gunakan untuk praktikum dan benda yang kita gunakan di tubuh kita.
Pewarnaan Bakteri
14
DAFTAR PUSTAKA http://apikdewefppundip2011.wordpress.com/2012/06/29/laporan-resmi-praktikummikrobiologi/ http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram http://arfiyahtrimeirina.blogspot.com/2012/01/laporan-praktikum-mikrobiologi_8802.html http://mikrolaborat.blogspot.com/2011/10/laporan-pewarnaan-bakteri.html http://ratihkuspriyadani.blogspot.com/2010/11/laporan-praktikum-mikrobiologiumum.html
http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html
http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/12/macam-macam-teknik-pewarnaanbakteri/
http://adesahy.blogspot.com/2011/09/pewarnaan-kapsul-burr-gins.html
Pewarnaan Bakteri
15
