0272: M. Nurhalim Shahib dkk.
KO-30
INOVASI BARU PENGEMBANGAN OBAT KANKER ALAMI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER: MEMBANGUN PROTOTIPE FORMULA ANTI KANKER DARI EKSTRAK PANDANUS CONOIDEUS LAM, PHYLLANTUS NIRURI L. DAN VITIS VINIFERA DALAM BENTUK SERBUK ORAL M. Nurhalim Shahib∗ , Diah Dhianawaty, dan Ani Melani Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran Jl. Raya Bandung Sumedang KM 21, Jatinangor, Sumedang ∗
e-Mail:
[email protected], telp: (022) 7794560
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK Dalam penelitian ini telah dikembangkan obat kanker baru berdasarkan ekspresi gen sel HeLa dalam bentuk kombinasi ekstrak tanaman obat yang terdiri dari Phyllanthus niruri L. (Pn) Vitis vinifera (Vv). Kedua kombinasi ini efeknya menghambat ekspresi gen caspase-3, p53, siklin D1, siklin D2, siklin D3, bcl-2, Rock-1, Rip-1, BRCA-1, BRCa-2, GAPDH dan PARP-1, sedangkan terhadap gen Cox-2 meningkat ringan. Kedua kombinasi tersebut lebih kuat hambatannya dibandingkan kombinasi tiga herbal (dari Phyllanthus niruri L., Vitis vinifera dan Pandanus connoideus Lam), sehingga layak dilanjutkan ke tahap percobaan hewan. Pada percobaan hewan yang diinduksi dengan dextrose sodium sulphate (DSS) dan Aoxymethan (AOM) terjadi penurunan ekpsresi Muc-2 dan Ascl-2 (Mash-2). Kedua gen tersebut adalah marker untuk adanya perubahan sekresi dan proliferasi pada mukosa usus mencit, sehingga dapat dianggap sebagai petanda awal perkembangan kanker usus (colon). Kombinasi ekstrak Phyllanthus niruri dan Vitis vinifera ternyata dapat meningkatkan kembali ekspresi gen Muc-2, namun tidak sepenuhnya dapat mengembalikan ekspresi Ascl-2. Efek terhadap eskpresi gen yang lain seperti siklin D tidak berpengaruh tetapi menurunkan ekpresi gen bcl-2. Sebaliknya terhadap PARP-1 terjadi penguatan ekspresi. Data selanjutnya telah diketahui bahwa Cox-2 merupakan gen yang penting untuk proliferasi sel, tetapi tidak spesifik. Pada penelitian ini ekspresinya tidak berubah setelah ditambahkan kombinasi ekstrak Phyllanthus niruri dan Vitis vinifera. Ini berarti fenomena molekuler yang diperoleh pada penelitian ini masih berada pada tahap perkembangan awal suatu kanker. Keadaan ini dapat dianggap sebagai precancer dan masih diperlukan pemeriksaan gen-gen lain yang spesifik dan perlu dianalisis gen-gen yang spesifik. Berdasarkan data ekspresi gen tersebut di atas, kombinasi Phyllanthus niruri dan Vitis vinifera dapat dikembangkan menjadi obat kanker colon. Dalam penelitian ini pula telah dapat disajikan dalam bentuk serbuk sesuai dengan tujuan penelitian. Kata Kunci: kanker, herbal, ekspresi gen, Real-Time PCR, target molekuler
I.
PENDAHULUAN
Beberapa tahun belakangan ini pemerintah Indonesia melalui Departemen Kesehatan telah memberdayakan pemanfaatan obat generik untuk memenuhi kebutuhan masyarakat dalam bidang kesehatan. Tetapi hasilnya masih belum memuaskan. Berkaitan dengan hal itu diperlukan suatu upaya mempertajam sasaran dengan mengarahkan efeknya sampai ke tingkat molekuler atau seluler, sehingga dapat ditentukan target molekuler suatu herbal. Hal ini penting untuk mengimbangi superioritas penggunaan obat modern yang hanya melegalitaskan senyawa ak-
tif. Sejalan dengan program pemerintah yang sedang mengembangkan dan meningkatkan obat generik di Indonesia, pemberdayaan bahan alam berkhasiat obat sekarang saatnya dikembangkan sampai uji klinik agar dapat diproduksi secara nasional. Diharapkan pengembangan obat generik yang dieksplorasi secara ilmiah akan dapat memenuhi kebutuhan masyarakat Indonesia sehingga dapat menunjang kemandirian bangsa. Pada penelitian ini direncanakan pengembangan bahan alam herbal menjadi obat kanker (generik). Kanker atau neoplasma maligna adalah sekelompok penyakit yang etiologinya multifaktorial dan secara spesifik menye-
Prosiding InSINas 2012
0272: M. Nurhalim Shahib dkk. babkan kelainan proliferasi sel. Keadaan tersebut dapat terjadi karena gangguan siklus sel dan regulasinya yang semuanya diatur melalui protein-protein yang dikode oleh gen-gen spesifik.[1] Hingga kini upaya pengembangan obat kanker dari bahan alam di Indonesia masih belum berhasil baik, sehingga pengelolaan penyakit kanker masih sepenuhnya bergantung kepada obat impor. Alasan logis mengenai hal itu karena orientasi pengembangan obat kanker di Indonesia terlalu kaku, hanya mengikuti pola barat dengan mengandalkan khasiat senyawa aktif. Sedangkan kenyataannya keberhasilan kemoteurapeutik dengan senyawa akif tersebut masih belum memuaskan, bahkan boleh dikatakan belum menurunkan angka kematian penyakit kanker secara bermakna. Alasan ilmiah yang kedua, jalur kematian sel dan cell survival belum seluruhnya dipahami, sehingga belum dapat dijawab dengan tuntas mengapa sel kanker dapat mati semu (dorman), dapat rekuren, bahkan dapat pula resisten terhadap terapi. Hal ini menunjukkan bahwa jalur kematian sel bukan hanya merupakan satu jalur lurus, tetapi multi pathways.[2] Sehingga dengan mengandalkan aktivitas satu senyawa aktif saja sukar untuk membunuh sel kanker. Alasan lain bahwa spesifisitas masing-masing jaringan menggunakan jalur kematian pada waktu yang berbeda, sehingga umur sel organ yang satu berbeda dari organ yang lain. Ini menunjukkan pathway yang digunakan untuk mempertahankan cell survival juga berbeda. Sudut pandang pengembangan obat kanker (generik) ini berdasarkan patogenesis kanker yang multifaktorial yang berarti secara molekuler terapi kanker tidak dapat hanya menggantungkan kepada satu macam senyawa aktif saja. Beberapa tahun terakhir telah dilaporkan bahwa Amerika Serikat telah mengembangkan penelitian alternative dan complementary medicine (Cruzen J., 1998). Ternyata para ahli telah sepakat bahwa bahan terapi alternatif dapat mengurangi efek toksik dan ketidaknyamanan terapi (Colic M. dan Povelic K., 2000). Permasalahannya apakah sel kanker dapat dihambat pertumbuhannya oleh pemberian ekstrak herbal. Dapatkah profil ekspresi gen dijadikan indikator hambatan sel kanker oleh ekstrak herbal. Untuk memecahkan masalah tersebut peneliti bertekad untuk mengembangkan obat kanker dalam bentuk kombinasi ekstrak tanaman obat Indonesia yang telah dikenal mempunyai efek anti kanker tetapi belum diuji secara akademik. Bentuk kombinasi tersebut terdiri dari Pandanus conoideus Lam, Phyllantus niruri L. dan Vitis vinifera yang disajikan dalam bentuk ekstrak etanol. Kombinasi tersebut untuk meningkatkan daya bunuh terhadap sel kanker, menghindari kematian semu (dorman), menghindari rekurensi dan resistensi terhadap obat kanker serta mencegah kanker yang disebabkan virus. Untuk mendeteksi suatu sel masuk ke fase
KO-31 proliferasi perlu diselidiki ekspresi gen siklin D yang berperan pada awal siklus sel (fase G1). Selanjutnya untuk mengetahui suatu sel kanker mempertahankan kehidupannya (cell survival) atau beralih ke resisten perlu diperiksa ekspresi bcl-2, Atg-6 dan p53. Disamping itu gen-gen pengendali proliferasi sel yang lain, seperti Cox-2 juga penting diteliti. Pada penelitian ini juga tumor suppressor gen seperti BRCA-1/2 disamping p53 perlu diteliti profil ekspresinya. Inilah salah satu alasan diformulasikannya kombinasi senyawa-senyawa yang mempunyai efek anti kanker dalam bentuk satu formula kombinasi obat kanker. Dalam hal ini, diperlukan kombinasi herbal dan konsentrasi yang tepat, sehingga mencapai kematian sel maksimal dan spesifik. Sebagai pembanding digunakan doxorubicin dan cisplatin. Efek kedua obat kanker ini terhadap kematian sel kanker disetarakan dengan efek herbal maka formula kombinasi herbal akan dapat ditentukan. Untuk mengetahui tipe kematian sel yang terjadi akan dianalisis berdasarkan ekspresi gen. Profil ekspresi gen bcl-2, caspase-3 menunjukkan apoptosis, sedangkan ekspresi RIP-1 menunjukkan nekrosis dan Atg-6 untuk menunjukkan autofagi. Analisis kombinasi ketiga obat kanker yang terdiri dari Pandanus conoideus Lam, Phyllantus niruri L. dan Vitis vinifera diharapkan akan menghasilkan suatu anti kanker yang ideal bagi dunia kedokteran di Indonesia. Yang selanjutnya diharapkan kombinasi tersebut dapat dikembangkan menjadi obat kanker generik yang efektif, efek sampingnya rendah dan murah. Tujuan Penelitian 1. Pengembangan obat kanker baru dari bahan alam dalam bentuk serbuk herbal berstandar. 2. Menghasilkan target molekuler ekstrak etanol herbal terhadap sel kanker berupa 14 macam profil ekspresi gen yaitu bcl-2, caspase-3, p53, cyclin D1, cyclin D2, cyclin D3, Atg-6, RIP-1, BRCA-1/2, Cox2, GAPDH, dan PARP-1 3. Meningkatkan perolehan hak paten nasional. 4. Membuka peluang baru pemanfaatan tanaman asli Indonesia yang berarti membuka peluang baru bagi petani Indonesia. TABEL 1: Nilai IC50 Phyllanthus niruri, Pandanus conoideus dan Vitis vinivera terhadap sel HeLa
Prosiding InSINas 2012
0272: M. Nurhalim Shahib dkk.
KO-32
II.
METODOLOGI
1. Penyediaan bahan herbal didapat dari PT. Puspita Jelita. 2. Metode analisis kimia kuantitatif dan kualitatif ekstrak etanol terhadap Phyllanthus niruri, Pandanus connoideus Lam dan Vitis vinifera yang dilakukan oleh ahli kimia dan farmasi. 3. Kultur sel HeLa untuk menentukan ekspresi gen caspase 3, p53, Atg-6, CCND-1, CCND-2, CCND3, Bcl-2, Rock-1, RIPK-1, BRCA-1/2, Cox-2 dan GAPDH. 4. Menyetarakan efek herbal dibandingkan dengan obat kanker cisplatin dan doxorubicin 5. Menggunakan hewan uji mencit/tikus penderita kanker yang diinduksi dengan zat karsinogenik. 6. Isolasi jaringan kanker untuk memperoleh ekstrak RNA 7. Penentuan konsentrasi Real-Time PCR. Dari sini akan didapat profil masing-masing efek herbal terhadap kadar RNA. 8. Formula kombinasi herbal sebagai obat kanker dapat diproduksi dalam bentuk serbuk.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini merupakan sebagian dari tahap penelitian translasi (translational research) dalam bidang medis di Fakultas Kedokteran UNPAD meliputi bidang penelitian dasar sampai dengan terapan, namun pada tahap ini belum sampai ke uji klinis. Walaupun demikian melalui penelitian ini telah banyak informasi baru yang dapat diungkapkan, terutama dalam bidang biologi molekuler tentang kaitannya dengan penentuan IC50 (inhibition concentration 50) tiga macam ekstrak tanaman obat yang dikaitkan dengan ekpresi gen. Gengen tersebut meliputi siklin D (D1, D2 dan D3), p53, caspase-3, beclin-1, bcl-2, Cox-2, Rock-1, RIP-1, GAPDH dan PARP-1. Ke 12 gen tersebut mempunyai fungsi atau terkait dengan fungsi seluler sebagai berikut:
Tentu saja keempat peran tersebut tidak terlalu kaku terbatas itu saja, karena ada pula gen-gen yang berperan ganda bahkan berperan multiple seperti p53, GAPDH yang selain berperan dalam glikolisis juga berperan dalam apoptosis. Hasil penetuan IC50 (inhibition concentration 50) telah dilakukan terhadap 3 macam herbal; Phyllanthus niruri, Pandanus conoideus dan Vitis vinivera terhadap sel HeLa (TABEL 1) Dari TABEL 1 di atas dapat diketahui bahwa hambatan terhadap proliferasi sel HeLa yang paling kuat adalah ekstrak Pandanus conoideus dibandingkan dengan Phyllanthus niruri dan Vitis vinivera. Berdasarkan IC50 masing-masing herbal ditentukan variasi hambatan terhadap proliferasi sel HeLa seperti tertera pada TABEL 3. Berdasarkan TABEL 3 dapat diketahui bahwa semakin tinggi konsentrasi yang digunakan semakin rendah kemampuan proliferasi, sedangkan persentasi penghambatan proliferasi semakin tinggi. Hasil uji hambatan terhadap proliferasi sel HeLa tampak konsentrasi Phyllanthus niruri (Pn) yang bervariasi dari 1000 µg/ml sampai dengan 2000 µg/ml tidak mengalami peningkatan yang berarti. Berdasarkan reaksi substrat-enzim ataupun suatu senyawa kimia tertentu dengan protein tertentu, fenomena yang demikian memperlihatkan reaksi tingkat nol. Artinya penambahan substart tidak berpengaruh lagi terhadap laju reaksi. Berdasarkan hasil itu maka kadar efektif Pn adalah 1000 µg/ml. Hasil yang lebih menarik adalah bila kedua herbal tersebut dikombinasikan (Pn+Vv) timbul sinergivitas yang sangat tinggi. Tampaknya ada mekanisme lain dan pathway reaksi yang lain daripada yang ditunjukkan oleh konsentrasi tunggal.
TABEL 3: Konsentrasi Herbal yang Digunakan Beserta Persentasi Proliferasi dan Penghambatan Proliferasi (PP)
1. Peran siklus sel dan regulasinya yang melibatkan berbagai gen di antaranya yang penting adalah siklin D1, D2, D3 dan p53. 2. Peran dalam cell death pathway yang melibatkan juga banyak gen, termasuk caspase-3, bcl-2, beclin1, RIP-1 dan p53. 3. Peran dalam cell movement, termasuk cell detachment yang dalam penelitian ini oleh gen Rock-1. 4. Peran dalam DNA repair seperti PARP-1 dan GAPDH. Prosiding InSINas 2012
0272: M. Nurhalim Shahib dkk.
KO-33 TABEL 2: Ekspresi Gen
Pengaruh gabungan herbal terhadap kultur sel HeLa menghasilkan hambatan proliferasi yang bervariasi dari rendah sampai lebih dari 95% (TABEL 2). Pada (TABEL 2 tertera pengaruh kombinasi herbal terhadap sel HeLa dianalisis berdasarkan sel yang masih hidup dan sel yang sudah mati (sel yang telah mengalami pelepasan dari dasar atau disebut detachment cell). Sel yang bebas dari dasar flash (cell detachment) dianggap sel mati, sedangkan sel yang masih melekat pada dasar tabung dianggap masih hidup. Hasil penelitian dengan herbal terhadap kehidupan sel HeLa akan dibandingkan berdasarkan ekspresi gen. Setelah ditentukan nilai IC50 ternyata gabungan Pc dengan Vv (IC50=8,70 µg/ml) dapat menghambat proliferasi sel HeLa lebih kuat dibandingkan dengan Pn dan Vv dalam kondisi ekstrak tunggal. Kalau dibandingkan dengan IC50 masing-masing herbal, tampak Pn dan Vv tidak mempunyai efek toksik atau mempunyai efek toksik yang sangat lemah. Mekanisme reaksi biokimia saja belum cukup dapat menerangkan efek interaksi obat tersebut. Hal ini harus dikaitkan dengan perubahan yang terjadi pada tingkat molekuler. Penulis mencoba mengaitkan hambatan proliferasi tersebut dengan 14 macam ekspresi gen ((TABEL 2). Proliferasi sel sangat tergantung kepada siklus sel yang dikendalikan oleh gen Siklin D1 dan p53. Kedua ekspresi gen tersebut pada sel yang mati tampak negatif. Tetapi yang menarik pada sel mati masih terdapat ekspresi gen bcl-2, sedangkan yang lain negatif, kecuali Atg-6 dan RIP-1 yang terekspresi lemah. Mengenai BRCA-2 belum dapat ditarik kesimpulan. Bila dibandingkan dengan sel HeLa yang hidup ternyata p53 dan siklin D1 serta GAPDH terekspresi sangat kuat. Di samping itu pada sel yang hidup tampak caspase-3, Atg-6, siklin D3, bcl-2, RIP-1, semua positif. Tetapi gen siklin D2, Rock-1, Cox-2, PARP-1 Dan BRCA-1 tidak berbeda dengan sel mati. Untuk sementara dapat disimpulkan bahwa sel akan mati bila siklin D1 dan GAPDH tidak terekpresi. Kemungkinan kematian tersebut bukan karena apoptosis, tetapi mungkin sel sedang melakukan mekanisme kematian sel dengan autofagi. Berdasarkan pengujian bcl-2 dan adanya Atg-6 (Beclin-1) yang pernah positif pada sel hidup.
Dilakukan penetuan kosentrasi IC50 untuk gabungan herbal dengan hasil seperti yang tertera pada TABEL 2. Pada penelitian ini telah dapat ditetapkan bahwa kemampuan hambatan proliferasi masing-masing herbal terhadap pertumbuhan sel HeLa bervariasi dari yang kuat sampai yang rendah berdasarkan IC50 (TABEL 1). Seperti telah diketahui bahwa kematian sel terdiri dari tiga cara, apoptosis, autifagi dan nekrotik (Kroemer G. et al., 2009). Untuk pengembangan obat kanker pada penelitian ini ditujukan pada peningkatan kematian apoptosis dan autofagi. Oleh karena itu pengembangan selanjutnya adalah penentuan konsentrasi kombinasi yang dibandingkan dengan Doxorubicin dan Cisplatin yang dikaitkan dengan profil ekspresi. Pada percobaan in vitro yang menggunakan sel HeLa telah didapatkan suatu kombinasi herbal yang terdiri dari Phyllanthus niruri dan Vitis vinivera yang dapat menghambat proliferasi sel sebesar 95,65%. Berdasarkan data di atas kombinasi tersebut diuji pada hewan percobaan (mencit). Sebagaimana telah dilaporkan dan diperlihatkan pada hasil terdahulu bahwa gen Muc-2 terekspresi positif pada usus mencit sedangkan MASH-2 tidak terekspresi atau terekspresi lemah. Pada penelitian ini hasilnya menunjukkan bahwa kombinasi tersebut dapat meningkatkan ekspresi gen Muc-2 dan menurunkan bcl-2. Hal ini berarti kombinasu herbal tersebut dapat digunakan untuk mencegah terjadinya tahap awal proliferasi sel kanker usus.
IV.
KESIMPULAN
1. Efek kombinasi Phyllanthus niruri dan Vitis vinifera lebih potensial dalam menghambat proliferasi sel HeLa dibandingkan dengan dosis tunggal. 2. Kematian sel oleh kombinasi Phyllanthus niruri dan Vitis vinifera dapat menyebabkan kematian sel namun tidak spesifik. 3. Pada sel HeLa yang mati terdapat ekspresi bcl-2, belum dapat dijelaskan mekanismenya. 4. Ekspresi gen Muc-2 dan Ascl-2 dapat dijadikan petanda (marker) proliferasi sel mukosa usus, seProsiding InSINas 2012
KO-34
0272: M. Nurhalim Shahib dkk.
hingga kemungkinan dapat dikembangkan marker pada kanker usus. 5. Kombinasi Phyllanthus niruri dan Vitis vinifera dapat mengembalikan ekspresi gen Muc-2 kembali normal pada usus mencit. 6. Telah dapat dihasilkan crude extract Phyllanthus niruri dalam bentuk serbuk sebagaimana yang diharapkan.
SARAN Masih diperlukan efek spesifik dari kombinasi herbal dalam mengatur ekspresi gen dengan memeriksa micro-RNA dan metilasi DNA.
DAFTAR PUSTAKA [1] Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L, Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnel, J. 2000. Molecular Cell Biology, 4th ed. Freeman and Company, New York [2] Kroemer, G., Galluzzi, L., Vandenabeele, P., Abrams, J., Alnemri, E.S., Baehrecke, E.H., Blagosklonny, M.V., El-Deiry, W.S., Golstein P., Green, D.R., Hengartner, M., Knight, R.A., Kumar, S., Lipton, S.A., Malorni, W., Nunez, G., Peter, M.E., Tschopp, J., Yuan, J., Piacentini, M., Zhivotovsky, B., Melino, G. 2009. Classification of Cell Death. Cell Death Differ. 2009 January; 16(1): 3-11
Prosiding InSINas 2012
