Gluténmentes termékek vizsgálata a cöliákia és a gabonaallergia szempontjából Takács Krisztina1, Kovács Erzsébet T.2, Gelencsér Éva1 1Központi Élelmiszer-tudományi 2Szegedi
Kutatóintézet
Tudományegyetem, Mérnöki Kar
Campden rendezvény, Budapest, 2011. március 25.
Élelmiszer okozta káros reakciók Toxikus Nem toxikus
Immunmediált
IgE-mediált
Nem-IgE-mediált
„Valódi” táplálék allergia
autoimmun betegség
Gabonaallergia
Cöliákia
Nem-immunmediált
Enzimatikus
Farmakológiai
Egyéb, nem ismert
1
Gabona allergia
=
cöliákia
- patomechhanizmus nem ismert
-- patomechanizmus ismert
-IV. típusú allergiás reakció
- I. típusú allergiás reakció
tünetek
(T-sejt- mediált)
- időleges (az élet folyamán elmúlhat)
- egy életre szól
- nem minden glutén tartalmú gabona tiltott
- életreszóló glutén-mentes diéta
- Prolamin szupercsalád 2S albumin tartalék fehérje család Nem-specifikus lipid transzfer fehérje család Gabona eredetű a-amiláz/tripszin inhibitor család Gabona eredetű prolamin család (pl. búza, rozs, árpa, zab glutén) (pl. kukorica glutén)
- búza, rozs, árpa, zab glutén
Gabonák közötti rokonsági fa Törzs
Zárvatermők
Osztály
Egyszíkűek
Kétszíkűek
Rend
Pázsitfűfélék
Szegfűfélék
Búza Rozs Árpa Tritikálé
Zab
Kukorica
Rizs
Hajdina
Amaránt
Keresztreakció!
2
Glutén fogalma Olyan fehérjefrakció, amely nem oldódik vízben és 0,5 M NaCl oldatban.
Gabona fehérjék
Albuminok (vízoldhatóak)
Globulinok (sóoldhatóak)
Glutén
Prolaminok (alkohol oldhatóak)
Gluteninek (sav/lúg oldhatóak)
Búza – gliadin; Rozs – secalin Árpa – hordein; Zab – avenin; Kukorica - zein
Diagnózis gabonaallergia
cöliákia Glutén + tTGA a-glutén és a-tTGA IgG, IgA
IgE
-vérvizsgálat (ellenanyag kimutatása)
Aktivált T-sejtek
-vérvizsgálat (ellenanyag kimutatása)
allergén-specifikus IgE (RAST)
IgA endomysium ellenanyag (EMA)
össz. IgE (ELISA)
IgA szöveti transzglutamináz ellenanyag Gliadin-specifikus IgA és IgG
-allergiás bőrteszt
-ismételt jejunális biopszia (3x-4x)
-ételprovokációs vizsgálat
3
40/2008 (IV.3.) FVM-EÜM-GKM Glutént tartalmazó gabonák: búza, rozs, árpa, zab, tönkölybúza, ezek hibrid változatai és Ezekből készült termékek JELÖLÉSKÖTELEZETT ALLERGÉNEK
ALINORM 08/31/26 Gluténmentes élelmiszer Búzából, egyéb Triticum fajokból (rozs, árpa), zabból, vagy ezek hibridjeiből 1 vagy több alkotót NEM tartalmazó élelmiszerek, amelyek glutén tartalma nem több, mint 20 mg/kg. Búzából, egyéb Triticum fajokból (rozs, árpa), zabból, vagy ezek hibridjeiből 1 vagy több alkotót tartalmazó élelmiszerek, melyekből a glutént kivonták, és így glutén tartalma nem több, mint 20 mg/kg. Csökkentett glutén tartalmú élelmiszer Búzából, egyéb Triticum fajokból (rozs, árpa), zabból, vagy ezek hibridjeiből 1 vagy több alkotót tartalmazó élelmiszerek, melyekben a glutén tartalom csökkentve lett, és glutén tartalmának 20-100 mg/kg közé kell esnie.
4
Gluténmentes termékek előállítása Előállításuk/fejlesztésük a technológusok számára nagy kihívás, de szükséges Állatmodellek hiánya Etika Jelenleg a piacon kapható választék csekély Néhány közülük alacsony minőségű Drága Cél: termék minőségének javítása cöliákiáért felelős fehérjék/peptidek detoxikálása
Gluténmentes termékek előállítása Alapanyagok Jó tápértékű (pszeudo)gabonák: amaránt, hajdina, köles, quiona, barna rizs, cirok Hüvelyesek: borsó, szója
Hidrokolloidok:
hidroxipropil-metil-cellulóz karboxi/metil-cellulóz guar gumi xantán pektinek
Fehérjék:
tejpor (laktóz intolerancia!) tojás (allergizálhat!)
Enzimek:
ciklodextrin glikozil transzferáz glükóz oxidáz transzglutamináz
Adalékanyagok
5
Gluténmentes termékek előállítása Transzgén technológia Tejsavbaktériummal és élesztővel történő fermentáció Epitópok maszkírozása enzimes keresztkötéssel
Száraztészta modellek előállítása, frakcionálása és jellemzése Liszt Víz TG
Keverés
Enzim hatás (30’, 60’, 150’)
Tészta formázása
Szárítás: -39oC, 24 óra, 89% -Szobahőm., 48 óra
Főzési és érzékszervi tulajdonságok vizsgálata
Őrlés
Szitálás (<250 µm)
Frakcionálás (Feillet et al. 1977): víz- és sóoldható f.: 0,5 M NaCl alkohol oldható f.: 68% etanol sav/lúgoldható f.: β-merkaptoetanol tart. borát-puffer (pH 10)
SZTE, Mérnöki Kar
6
Transzglutamináz enzim működése H2N—(CH2)4—CH—COOH NH2
lizin
+
O=C—CH2—CH2—CH—COOH NH2 NH2
TG
glutamin
a fehérje láncok közötti kovalens kötés kialakítása Cél: kiváló minőségű, hipoallergén termék előállítása
Tészták jellemzése Legjobb érzékszervi és főzési tulajdonságot együttesen biztosító optimális enzim-dózis: T. aestivum búzaliszt alapú: 60 mg TG/kg liszt T. durum búzaliszt alapú: 20 mg TG/kg liszt Sárgaborsóliszt alapú: 140 mg TG/kg liszt
7
Enzimhatás kimutatása - SDS-PAGE és immunblot 15%-os SDS-PAGE gél Fehérje elválasztás
PVDF membrán
Immunfestés
Enzim szubsztrátja konjugátum
humánszérum
Búza alapú tésztamodellek frakciói T. aestivumaestivum-alkohol frakció
T. durumdurum-alkohol frakció
Mw (kDa) 185 98
Mw (kDa) 185 98
52
52
31 19 17 11 6
31 19 17 11 6 3
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
T. aestivumaestivum-sav/lúg frakció
Mw (kDa) 185 98
52
52
31 19 17 11 6 3
31 19 17 11 6 3 2
3
4
5
6
7
8
9
3
4
5
6
7
8
9
T. durumdurum-sav/lúg frakció
Mw (kDa) 185 98
1
2
1
2
3
4
5
6
7
8
1. Natúr 2. 100 mg/kg TG, 30’ 3. 100 mg/kg TG, 60’ 4. 100 mg/kg TG, 150’ 5. 150 mg/kg TG, 60’ 6. 150 mg/kg TG, 150’ 7. 200 mg/kg TG, 30’ 8. 200 mg/kg TG, 60’ 9. 200 mg/kg TG, 150’
9
8
Glutén kimutatás (ALINORM 08/31/26) immunológiai módszer ellenanyagnak reagálnia kell a toxikus gabonafehérjékkel és nem keresztreagálhatnak más gabonafehérjékkel és egyéb élelmiszer, valamint élelmiszeralkotó komponensével módszer validálása, referencia standard detektálási határ 10 mg glutén/kg, vagy annál kevesebb R5-ELISA
Glutén kimutatása
Polikl.eag. alapú
Monokl. eag. (ω ω-gliadin)alapú
Monokl. eag. (R5 gliadin-epitóp) alapú
Kompetitív indirekt ELISA
direkt szendvics ELISA
immunkromatográfia elvén működő gyorsteszt (Félkvantitatív, kvalitatív)
Saját fejlesztés
Kereskedelmi forgalomban kaphatók
9
Kereskedelmi forgalomban lévő kitek Cég /Kit név
ImmunoLab GmbH Poliklonális Gluten ELISA Test KÉKI módszer R-Biopharm Ridascreen Gliadin R-Biopharm Ridascreen Fast Gliadin Monoklonális Tepnel GLuten Assay kit omega Tepnel Gluten Rapid Kit Diffchamb Transia Plate-Gluten Diffchamb Transia Plate-Prolamins Operon Monoklonális Stick Gluten R-Biopharm R5 Rida Quick Gliadin Ingenasa Ingezim Gluten (3.0.GLU.K.2) Neogen Alert for Gliadin Neogen Veratox for gliadin Biomedal Diagnostics G12 Glutentox ELISA (komp.)
Detektálás
4 ppm gliadin (8 ppm glutén)
1,5 ppm gliadin (3 ppm glutén) 5 ppm gliadin (10 ppm glutén) 1 ppm gliadin (2 ppm glutén) 100-200 ppm glutén
Méréshatár
4-400 ppm gliadin (8-800 ppm glutén) 1-1000ppm gliadin 5-80 ppb gliadin 10-80 ppb gliadin 10-200 ppm gliadin -
5 ppm gliadin 5-….. ppm gliadin (10 ppm glutén) (10-……ppm glutén) 1,5 ppm gliadin Certified Eureopean gliadin (3 ppm glutén) st. 1,5 ppm gliadin 2-2000ppm gliadin (3 ppm glutén) 2,5 ppm gliadin alatt a minta negatív 1,5 ppm gliadin (3 ppm glutén) 10 ppm gliadin (20 ppm glutén)
3 – 50 ppm glutén 2,5-25 ppm gliadin (5-50 ppm glutén) Glutentox standard 7,5-120 ng/ml gliadin
A glutén kimutatás nehézségei Glutén tartalom mérése gliadin meghatározáson alapszik Több specificitású és érzékenységű módszer létezik (Mit kell detektálnunk pontosan?) Kalibráció reproduktatív felvétele Gliadinok extrahálása Hőkezelés hatása Egyéb technológia kezelés hatása
10
Gluténmentes diétába illeszthető termékek?! T. aestivum
ppm
T. durum ppm
60000
60000
50000 50000
1. Natúr 2. 100 mg/kg TG, 30’ 3. 100 mg/kg TG, 60’ 4. 100 mg/kg TG, 150’ 5.150 mg/kg TG, 30’ 6. 150 mg/kg TG, 60’ 7. 150 mg/kg TG, 150’ 8. 200 mg/kg TG, 30’ 9. 200 mg/kg TG, 60’ 10. 200 mg/kg TG, 150’
40000 40000
30000
30000
20000
20000
10000
10000
0 1.
2. 3. 4.
5. 6. 7.
0
8. 9. 10.
Kompetitív indirekt ELISA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Szendvics ELISA (Tepnel)
8.
9.
10.
A TG enzimmel előállított búzaliszt alapú tésztát a cöliákiás betegek NEM FOGYASZTHATJÁK! A TG enzimmel előállított sárgaborsóliszt alapú tésztából cöliákiás betegek számára diétás élelmiszert lehetett előállítani!
ω-gliadin mérésen alapuló módszer (Skerrit és Hill,1991) AOAC ajánlása ω ω-gliadin frakció elleni ellenanyag >= 150 ppm glutén mérési határ Nyers és hőkezelt élelmiszerek kimutatására Előnye: ω-gliadin frakció nem denaturálódik 40%-os etanolos extrakció Hátránya: árpa prolaminokra fals negatív eredményt ad (alábecsül), hidrolizált glutént nem tud mérni, gluténtartalmat -40től +80%-ig alá/felébecsüli
11
R5-gliadin-epitóp mérésen alapuló módszer Codex Alimentarius Commission ajánlása
(Mendez et al., 2001)
Rozs szekalinok ellen termelt ellenanyag Felismeri a QQPFP pentapeptid szekvenciákat és a homológ szekvenciákat (QQQFP, LQPFP, QLPFP) főleg a γ és ω-típusúakban (Osmann et al, 2001) 5 ppm a mérési határ Nyers és hőkezelt élelmiszerek kimutatására Koktél (extrakciós összetevők mixe) előnye: QQPFP hőre rezisztens; felismeri a búza gliadinok-, árpa hordeinek-, és rozs szekalinok összes frakcióját
R5-gliadin-epitóp mérésen alapuló módszer (Mendez et al., 2001) Hátránya: árpa prolaminokra fals pozitív eredményt ad (felbecsül) PWG-gliadin standard használata esetén, hidrolizált glutént nem tud mérni PWG- referencia anyag használata standardként, így valójában csak a búza kontamináció kimutatására alkalmas Az őrlést követő 1 heti tárolás után a minták eltérő eredményt adtak (R5-ELISA) az őrlés után rögtön lemért mintákhoz képest! Szójaminta etanolos extrakció után 100 ppm-hez közeli gluténtartalmat mutatott, míg koktél-oldattal adott ugyan reakciót, de a kimutatási határ alatt volt.(?)
12
G12-ellenanyag alapú ELISA (Morón et al, 2008) Legújabb fejlesztés; kevés információ 33-mer felismerésére képes( toxikus gliadin fragment) A 33-mer egyik peptidrésze (QPQLPY) ellen termeltett ellenanyaggal dolgozik Hidrolizált, hőkezelt élelmiszerek mérésére alkalmas Szóját nem méri (kiküszöböli az R5 hibáját) Patogenitást okozó zab fajtákat képes kimutatni 6*104 –szer érzékenyebb mint az R5 ellenanyag
Következtetések Az élelmiszer antigének molekuláris szerkezete befolyásolja a patológiai immunválasz minőségét
Szükség van egy megbízhatóbb glutén detektálására szolgáló specifikus módszerre
A gluténmentes bővíthető
diétába
illeszthető
termékválaszték
13
Köszönöm a megtisztelő figyelmüket!
14
