.J
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
lsolasi dan Mekanisme Aksi Vasodilator dari Kulit Batang Alstonia iwahigensis secara in vitro
1. 2.
dr. Eva Rachmi, M.Kes., M.Pd.Ked. dr. Ahmad Wisnu Wardhana
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS MULAWARMAN SAMARINDA, 2011
HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN PENELITIAN RISET PEMBINAAN IPTEK KEDOKTERAN
1. Judul Penelitian
: Isolasi dan Mekanisme Aksi Vasodilator dari Kulit Batang Alstonia
iwahigensis secara in vitro
2. Peneliti Utama: a. Nama Lengkap b. Jenis Kelamin
dr. Eva Rachmi, M.Kes., M. Pd. Ked Perempuan
c. Keahlian
Dokter, Biornedik, Anatomi
d. Fakultas/Jurusan
Fakultas Kedokteran
e. Perguruan Tinggi
Universitas Mulawarman
3. Angota Tim Peneliti
1 (satu) orang
4. Anggota Peneliti 1: b. Jenis Kelamin
dr Ahmad Wisnu Wardhana Laki-laki
c. Keahlian
Dokter, Fisiologi
d. Fakultas/Jurusan
Fakultas Kedokteran
e. Perguruan Tinggi
Universitas Mulawarman
a. Nama Lengkap
5.
Jangka Waktu Penelitian dan Pendanaan: a. b.
Jangka waktu penelitian yang disetujui Biaya yang disetujui
: 1 (Satu) tahun Rp. 111.085.000,-
Samarinda, 30 November 2011 Ketua Peneliti,
dr.
Ei�
i, M.Kes., M. Pd. Ked
NIP. 19691018 200212 2 001
A.
KETERANGAN UMUM
1.
Nama Peneliti
Nama: E va Rachmi
Gelar : dr., M.Kes., M.Pd.Ked.
Nama: Ahmad Wisnu Wardhana
Gelar : dr.
Nama 2.
:
Gelar: :
·-
__
Judul Penelitian
lsolasi dan Mekanisme Aksl Vasodilator dari Kulit Satang Alstonia iwahigensis secara in 3.
Fokus Penelitian lXI
4.
Gizi Masyarakat
o
Penyakit Menular
o
Penyakit Tidak Menular
o
llmu Pengetahuan Terapan
o
Teknologi Kesehatan
Jenis Pe ne lit ia n oo
5.
vitro
llmu Pengetahuan Dasar
Kata Kun ci
I Alstonia iwahigensis, vasodilatasi, mekanisme aksi, antihipertensi 6.
7.
Jangka Waktu Penelitian dan Anggaran
Biaya
D 1 (satu) tahun
Tahun-1
Rp. 120.000.000,-
[] 2 (dua) tahun
Tahun-2
Rp. 149.500.000,-
lmpllkasi Etik
D Eksperimentasi dengan subyek manusia
0 Eksperimentasi dengan hewan
8. lnstitusi Penanggung Jawab
Nama/Alamat Lengkap/Kode PosiT elepon/F aksimile/Email FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS MULAWARMAN "
JL. KRAYAN, KAMPUS GUNUNG KELUA, SAMARINDA- KALTIM-75119 Telp: 0541-748581
Fax: 0541- 748449; 748581
11
B. Lembar OATA PERSONIL PENELITI 1.
Peneliti Utama
Nama : Eva Rachmi Tempat lahir: Malang
Gelar: dr., M.Kes., M.Pd.Ked. Tanggal lahir:
Kelamin:
30 No ember 1976
Perem uan
Jabatan : Staf Pengajar
•
Golongan: Ill B
Bagian/Divisi: Laboratorium Anatomi- Histologi lnstitusi asal: Fakultas Kedokteran Universitas Mul'awarman Telepon: 0541-748581
Faksimile: 0541-748449
Alamat Korespondeni Pos: Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman Jl. Kerayan, Kampus Gunung Kelua Samarinda- 75119 Alamat E-mail:
[email protected] Telepon Genggam (HP)
Telepon Rumah: ---
:
0813 4664 0256 Kualifikasi Akademik
Universitas
Gelar: dr.
Tahun: 2001
lnstitusi : FK Brawi'a a
Tahun: 2004
lnstitusi Pasca Sarjana Universitas Brawi'a a
Gelar: M.Kes
Tahun: 2007
lnstitusi FK Indonesia
Gelar: M.Pd.Ked.
Universitas
111
2. Peneliti 1
Nama : Ahmad Wisnu Wardhana
Gelar: dr
Tempat lahir:
Tanggal lahir:
Kelamin:
Samarinda
05 Mei 1983
Pria
Jabatan: Staf Pengajar
Golongan: 111 8
Bagian/Divisi: Laboratorium Fisiologi lnstitusi asal : Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman Telepon: 0541-748581
Faksimile: 0541-748449
Alamat Korespondeni Pos: Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman Jl. Kerayan, Kampus Gunung Kelua Samarinda- 75119 Alamat E- mail :
[email protected] Telepon Genggam (HP):
Telepon Rumah :
0812 2719 5566 Kualifikasi Akademik Tahun: 2009
lnstitusi: FK
Gelar: dr
Universitas Gadjah Mada Tahun: ---
lnstitusi : ---
Gelar: - - -
Tahun: ---
lnstitusi : --
Gelar: ---
-
•
IV
�
3. Kesekretariatan/Administrasi
Nama: Junaidi Sidik
Gelar : ---
Nip. 1980 0622 200910 1 001 Jabatan : Staf Keuangan
Golongan
:
II A
Bagian/Divisi: Tata Usaha Telepon: 0541-748581
Faksimile: 0541-748449
Alamat Korespondeni Pos: Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarrnan Jl. Kerayan, Kampus Gunung Kelua Samarinda - 75119 Alamat E- mail:
[email protected] Telepon Rumah:
--
Telepon Genggam (HP): 0812 5471 666
v
4.
Konsultan/Supervisor
Nama: Wahyono
Gelar: Prof., Dr., SU, Apt.
Tempat lahir :
Tanggal lahir:
Kelamin:
Klaten
06 Juni 1950
Pria
Jabatan: Guru Besar
Golongan : IV D
Bagian/Divisi: Biologi Farmasi lnstitusi asal: Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada Jl. Sekip Utara, Yogyakarta Faksimile : 0274 543120
Telepon: 0274 543120 Alamat Korespondeni Pos: Bag ian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada Jl. Sekip Utara, Yogyakarta. Alamat E-mail:
[email protected] Telepon Rumah: 0274 797247
-
Telepon Genggam (HP): 0856 2895 306
Kualifikasi Akademik
Tahun: 1976
lnstitusi : Fakultas Farmasi UGM
Gelar: Drs., Apt
Tahun: 1987
lnstitusi: F-MIPA UGM
Gelar : Sarjana Utama
Tahun : 2005
lnstitusi: UGM-Vrije
Gelar:
Unv. Amsterdam
Doktor
VI
KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur penulis ke hadirat Tuhan yang Maha Kuasa yang telah memberikan berkat, anugerah dan karunia yang melimpah, sehingga tim peneliti dapat menyelesaikan penelitian tahun pertama yang dibiayai oleh RISBIN IPTEKDOK tahun 2011 ini. Penelitian tentang "'lsolasi dan Mekanisme Aksi Vasodilator dari Kulit Batang Alstonia iwahigensis secara in vitro" bertujuan akhir untuk mendapatkan senyawa aktif dengan aktivitas- vasodilatasi dari kulit batang Alstonia iwahigensis melalui bioasay-guided isolation dan mengetahui mekanisme aksinya. Penelitian dilakukan sebagai respon terhadap makin meningkatnya prevalensi penderita hiertensi di dunia, khususnya Indonesia. Laporan akhir tahun pertama ini memuat hasil-hasil analisis tentang aktivitas vasodilatasi ekstrak dan fraksi kulit batang Alstonia iwahigensis dan kandungan metabolit sekundernya. Tahap pertama penelitian ini telah mengkonfirmasi dugaan tim peneliti tentang potensi antihipertensi kulit batang Alstonia iwahigensis. Terima kasih dan penghargaan disampaikan kepada pihak-pihak yang turut mendukung terselanggaranya kajian dan pelaporan ini. Semoga bermanfaat bagi pihak-pihak yang b erkepentinga n.
Samarinda, November 2011
Tim Peneliti
Vll
RINGKASAN EKSEKUTIF
Hipertensi merupakan masalah kesehatan dunia dan Indonesia untuk masa kini dan akan datang. Prevalensi hipertensi di dunia dan Indonesia terus meningkat seiring dengan peningkatan jumlah lanjut usia dan perubahan pola hidup di masyarakat. Jumlah lanjut usia (lansia) di dunia 7,8% pada tahun 2009 , sedangkan di Indonesia mencapai 5% pada tahun 2005 dan diperkirakan mencapai 8,5% pada tahun 2025, sehingga jumlah lansia yang terus meningkat akan meningkatkan penderita hipertensi. Masalah penanganan hipertensi menjadi lebih kompleks akibat kecenderungan terapi obat antihipertensi jangka panjang, sehingga menimbulkan resiko efek samping yang merugikan, peningkatan biaya pengobatan, dan ketergantungan bahan baku impor obat antihipertensi yang tinggi. Untuk itu perlu terus dicari obat alternatif yang lebih aman dengan harga terjangkau, serta bahan baku tersedia d i Indonesia. Salah satu tumbuhan yang potensial untuk diteliti lebih lanjut untuk pengembangan obat antihipertensi adalah kulit batang Alstonia iwahigensis (A. iwahigensis) dari suku Apocynaceae. Pada penelitian pendahuluan ekstrak etanol A. iwahigensis diketahui memiliki aktivitas vasodilatasi pada organ terpisah aorta tikus yang diprekontraksi dengan fenilefrine, tetapi senyawa aktif dan mekanisme aksi vasodilatasi melalui perantara endotel dan atau tanpa endotel pembuluh darah masih belum diketahui. Penelitian antihipertensi ini dilaku kan secara eksperimental post-test only control group design with control group secara in vitro dengan model organ terpisah aorta tikus Wistar. Aorta
digunakan karena ukuran lebih besar dibandingkan dengan arteri sehingga lebih mudah dipreparasi, selain itu basal tonus aorta lebih stabil dibandingkan arteri. Untuk isolasi dapat dilakukan dengan cara bioassay-guided isolation, diawali dengan pengujian ekstrak untuk diketahui aktivitas vasodilatasi, dilanjutkan proses pemisahan senyawa-senyawa tersebut dan diuji lagi aktivitasnya, pemisahan lebih lanjut hanya dilakukan pada fraksi aktif sedangkan fraksi yang kurang aktif tidak dilakukan, proses pemisahan dan uji aktivitas dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh senyawa murni yang aktif. Pada penelitian ini pengujian dilakukan baru sampai tingkat fraksi,
Vlll
sebagai tahap awal
untuk mendapatkan isolat yang berpotensi vasodilator pada penelitian
selanjutnya.
Uji kandungan metabolit sekunder pada ekstraksi bertingkat
Berbagai metabolit sekunder ditemukan pada ekstrak dikorometan dan eta no I. Pad a ekstrak .
diklorometan terkandung polifenol, flavoonoid, alkaloid, dan terpenoid. Pada ekstrak etanol didapatkan dua jenis alkaloid dan flavonoid. Sedangkan pada ekstrak heksan hanya didapatkan terpenoid.
Uji aktivitas vasodi/atasi pada ekstrak
Ekstrak diklorometan dan etanol menunjukkan efek vasodilatasi yang berbeda bermakna bila dibanding dengan kontrol negatif. Ekstrak diklorometan memiliki efek vasodilatasi yang lebih baik dari etanol, walaupun dalam uji ANOVA tidak berbeda bermakna. Sedangkan ekstrak heksan tidak memiliki kemampuan vasodiatasi.
Uji vasodilatasi fraksi gabungan
Ekstrak diklorometan yang telah menunjukkan kemampuan vasodilatasi yang oaling baik diuji pada tingkat fraksi. Sebagai pembanding turut diuji juga kontrol negatif (DMSO-etanol %}, ekstrak diklorometan, dan verapamil (bloker kana! kalsium tipe L). Fraksinasi dilakukan dengan Vacuum liquid chromatography (VLC) dan dilanjutkan ldentifikasi dengan KLT. Fraksi gabungan ke 3
(FIll), yang didapat melalui KLT dengan pelarut diklorometan/etanol 80/20, memiliki kemampuan vasodilatasi paling kuat. Bila diukur berdasar efek vasodilatasinya, berturut - turut mulai dari yang paling kuat adalah fraksi ke-3, fraksi ke-2, fraksi diklorometan, fraksi ke-4, dan fraksi ke-1. Tetapi kemampuan vasodilatasi fraksi ke-3 lebih lemah dari kemampuan verapamil. Pada dosis terbesar •
yang digunakan dalam penelitian ini ( 640 ug/dl} kemampuan vasodilatasi fraksi ke-3 dibanding verapamil masih berbeda bermakna (p
lX
/
KESIMPULAN Penelitian ini menunjukkan kemampuan vasodilatasi dari ekstrak diklorometan kulit batang Alstonia iwahigensis yang sebagai yang terbaik jka dibanding dengan ekstrak heksan dan etanol. Pada pengujian fraksi gabungan dari ekstrak diklorometan didapatkan hasil fraksinasi dengan pelarut diklorometan/ etanol 80/20 mempunyai aktivitas vasodilatasi paling baik dibanding fraksi lain. Kemampuan fraksi ini adalah
69% dibandingkan
dengan verapamil.
X
ABSTRACT
The prevalence of hypertension, especially in elderly people in the world is predicted to increase
60% by 2025. Increased risk of cardiovascular and cerebrovascular and long-term therapy
caused by hypertension encourages the search for effective and safe medicines from ethnobotany sources. Alstonia iwahigensis bark as indigenous plant in East Kalimantan has potention as an antihypertensive, but its mechanism of action and content of active substances which have the vasodilatation ability are not known yet. This research is an experimental post-test only control group design with control group, to isolate and test vasodilator mechanism of action of the bark of A. iwahigensis in vitro, which carried out within two years of research. Vasodilating ability was tested on a separate aorta preparations of Wistar rats that have been precontracted with phenylephrine. Vasodilator activity bioassays performed on extracts of hexane, dichloromethane, and ethanol, then to the fractions of
the
strongest vasodilator extract, and continued to the isolates from the fraction with the strongest vasodiltation capabilities. The mechanism of vasodilating action tested in aortic with and without endothel. TLC profiles made to screen the content of secondary metabolites. Alkaloid
was
detected in
dichloromethane
and
ethanol
extracts,
polyphenols
in
dichloromethane extract, sterols I terpenoids in hexane and dichloromethane extracts, and flavonoids in dichloromethane and ethanol extracts. Dichloromethane extract which demonstrated the
best
vasodilation
dichloromethane: ethanol
ability
(80: 20)
was
fractionated
by
VLC.
Fraction
obtained
has the strongest vasodilating effects, up to
by
solvent
69% of the
ability of
verapamil. The antihypertensive potention of Alstonia iwahigensis bark are promising thus it is necessary
to be contunied by vasodilation bioassay of isolates and its mechanism of action in
second year.
XI
ABSTRAK
Prevalensi penderita hipertensi terutama pada penduduk lanjut usia di dunia diprediksi meningkat hingga 60% pada tahun 2025. Dampak hipertensi
terhadap peningkatan resiko
kardiovaskular dan serebrovaskular serta terapinya yang jangka panjang mendorong pencarian obat yang efektif dan aman dari sumber-sumber etnobotani. Kulit batang Alstonia iwahigensis sebagai tanaman indigenous Kalimantan Timur berpotensi sebagai antihipertensi, tetapi perlu belum diketahui mekanisme kerjanya dan kandungan zat aktif yang mempunyai kemampuan vasodilatasi. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental post-test only control group design with control group untuk isolasi dan meguji mekanisme aksi vasodilator dari kulit batang A. iwahigensis
secara in vitro yang dilakukan dalam 2 tahun penelitian. Kemampuan vasodilatasi diujikan pada sediaan aorta terpisah tikus Wistar yang sudah diprekontraksi dengan fenilefrin. Bioassay aktivitas vasodilatasi dilakukan pada ekstrak heksan, diklorometan, dan etanol, kemudian pada hasil fraksinasi dari ekstrak yang kemampuan vasodilatasinya paling kuat, dan dilanjutkan pada isolat dari fraksi dengan kemampuan vasodiltasi terkuat. Mekanisme aksi vasodilatasi dari isolat diuji pada aorta yang berendotel dan yang tanpa endotel. Profil KLT dibuat untuk skrining kandungan metabolit sekunder. Metabolit sekunder alkaloid terdeteksi pada ekstrak diklorometan dan etanol, polifenol pada ekstrak diklorometan, sterol/terpenoid pada heksan dan diklorometan, serta flavonoid pada diklorometan dan etanol. Ekstrak diklorometan menunjukkan kemampuan vasodilatasi yang paling kuat, sehi ngga kemudian difraksinasi dengan
VLC.
Fraksi gabungan yang didapat dengan pelarut
d iklorometan : etanol (80 : 20) mempunyai efek vasodilatasi terkuat, hingga 69% dari kemampuan verapamil. Kemampuan antihipertensi kulit batang Alstonia iwahigensis yang menjanjikan ini, akan dilanjutkan dengan bioassay vasodilatasi isolat dan mekanisme kerjanya pada tahun ke-dua.
Xll
DAFTAR lSI Hal. Halaman Judul .............................................................................................................................................. i Keterangan Umum .......................................................................................................................... ii Lembar Data Personil Peneliti ......................................................................................................... iii Kata Pengantar ............................................................................................... :...........................................vii
Ringkasan Eksekutif .............................................. .......................................................................................viii Abstract
................................. ....................................................................................................................................
xi
Abstrak ......................................................................................................................................................... xii Daftar lsi ......................................................................................................................................................xiii Daftar Gambar ..............................................................................................................................................xv Daftar Lampiran ...........................................................................................................................................xvi Daftar Tabel ..................................................................................................................................................xvii BAB I Pendahuluan
.......
.
...........
.
................... ............................
.
BAB II Tujuan dan Manfaat Peneliti
2.1 Tujuan peneliti . ...
....
.
....
2.1.1 Tahap Satu ( Tujuan 2.1.2 Tahap
.
.
.......
...
Pertama )
..
..
..
..
.....
..
...
..
.
.........
.
...............
3.4 Tahap Penelitian ... . ..
3.4.1 Tahapan
...
... ..
...................
.
.
..
.
..
.
.
.. .
....
.
..... ....
.
....... ......
. .
..
.
.....
.. .
..
.
..
.....
.
..
.
...
.....
.......
.
.
..
..
....
.
.
..
.
.
......
.....
.
.
.....
...
.......
..
.
..
...
.........................................
1
5
.5
............. ................................ .
.........
.. .
........
.
.........
.
................
.
5
......
.
..
..
...
.
.
...
..
. .
..
..
....
.. . .. ...
...
....
. .. ...
.
...... ...............
........................
.
.................
.
...................
......
..........
.
.......
.. . . ..
.
...
.
.
.
..
......
..
.............
.
..........
.....
. .. ..
.
..
.
.
.
....................
.. .
.
.........
.
.....
.
....
.
.........
.
...
.
. .. ..
...
. .. . ...
....
..
. . ..
. .
. .
....... ...
......
.
....
.
..
..
..
...
. . ..
.... ...
...
..
..
...
.
..........
....
....
polar sampai polar
.................................
.........................
.
........
.
.
....
....
.
.......
.
.
.
.
....
....
........
. . ...
.. . ...
....
....
. .
.
.
...
...........
....
.
......
...........
........................
......................
.. . . . ..
.
.
.....
. . ...
. . ...
. .
.
................
..
.
..
.
...
.
..
........
.
.....
.......
..
.
7 8 8
9
11
. 11
.
..
...
.7
........
. .
........
....
.
. 11 . 11
. 12
........... ...
. .. .
. .
7
......
..
.. ..
.....
.
6
......
. .. ..
.........
..... .
.....
.......
........
........................................ ..
. . . .. .. . .. .. . .. .
..
.
.................................... .....................
.
...
..
.
..................................................................
.. . . ..
.
. . . .. . ... .. .. .. .
..
.............................................................. ...............
.. .
pembutan simplis
......
..
...
. ..
. ........... ...... ......
kedua
profil kromatografi
.. .
.
.............
3.5.2 Ekstraksi padat cair dengan pelarut yang non
3.5.4 lsolasi
.
.
........................
3.5.3 Pembuatan
.....
...........
.
................
penelitian tahun pertama
3.5.1 Pengambilan dan
...
.......................................... ...............
3.4.2 Tahapan penelitian tahun 3.5 Cara Kerja
..
.
dan Jumlah Ulangan
....
..
................. ...................................
) ....................................................................................................5
Peralatan Penelitian
3.3.1 Bahan . .
..
..
....
............................ .................................. ....
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
3.3 Bahan dan
...
. . . ..
.....................................................................
3.2 Hewan Coba
...
. .. . . . .. .. .
. . . .. ..
......... ..
Dua ( Tahun Kedua
2.2 Manfaat Penelitian BAB Ill Metode
......... ......
. . .
.............
.....
. . ..
........
12
. 13 Xlll
3.5.5 Karakteristik lsolat dan Elusidasi struktur
.. . ....
3.5.6 Eksplorasi kandungan metabolism sekunder
....................
... .. ... .. ... .......... ... ........ . . . . . . . . . ..............
.
......... . ............................. ............ .. ... ................... ..
3.5.7 Bioassay aktivitas vasodilatasi organ terpisah aorta
............................ . . . .
13 14 14
..
. .................................
3.5.8 ldentifikasi mekanisme aksi dengan bioassay aorta tanpa endotel dan berendote1
3.5.9 Analisis Data BAB IV Hasil
. ............
:.......................................... 16
.
....... ... ...... . . . . . ....... ... . .......
4.2 Uji Kandungan Metabolisme sekunder
. . .. .
.
...... . .. .. .. ......
4.4 Fraksinasi dengan VLC
Ucapan terima kasih Referensi
.
.
......
.
17 17
........................................... . . .. . . . . .
18
.. .................. .... ...................... . ...................... .........
19
........ ..................... ............................................ ................. .. .... ...
4.6 Uji vasodilatasi fraksi gabungan
21
................. .
22
... ......... ............ ............................ . ............. ................. . ..... .............
23
.
........................................................
................
.
.
...... ... . . . . . . . .
.....................................
BAB VI Kesimpulan dan Saran
.
............................................... ...........
. . . . . ...... .. ........................
4.5 ldentifikasi fraksi gabungan dengan KLT
.
.
......... .. . . . . . ......................................... .... ........... ... . .. . .
4.3 Uji Aktivitas vasodilatasi pada ekstrak optimal
.....
15
.. . . ............. .... ... ............. . ..
........................................ ..............................................
4.1 Ekstraksi simplisa kulit batang A. lwahigensis
BAB V Pembahasan
. .
......... ............ . .......... ...
.............
.. . . . . . . . . . .. ....... .......... .......... ..... ....... .
.......................... ..................
.
...............
.
.
.
... ... ................. .. .. .........
.
..... ... ..........
25
.. . . . . . .............
29
..
.............. ................................................... ....... ........... . ...... .................. .......... . . . . . . .
....
.
...............
.............................................................................................................. ........................... .............
30 31
XlV
Daftar Gambar
Gambar
4.1 Hasil screening metabolit sekunder golongan alkaloid, polifenol, terpenoid/steroid, dan flavonoid pada ekstrak kulit batang Alstonia iwahigensis
Gambar
19
. . . . . . . . . . . . . ......................................................... . . . . . . . . . . .
21
4.2 Prosentase vasodilatasi esktrak berdasar pertambaha konsentrasi ekstrak dan kontrol negatif
Gam bar 4.5 Hasil Gambar
. . . . . . . . . . . . . . . . . ...... .......................
KLT dilihat dibawah sinar UV 365 nm
..............................................................................
22
4.6 Prosentase vasodilatasi fraksi gabungan berdasar pertambahan konsentrasi ekstrak dan kontrol negatif
................................................... .......... . . . . . . . . .............
24
•
XV
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1
Uji a nova ekstrak kulit batang alstonia iwahigensis
Lampiran 2 Uji a nova fraksi kulit batang alstonia iwahigensis Lampiran 3 SK Penelitian
34
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .......
39
.......................................................
45
. . . . . . . . . . . . . . . .............................. .................................... . . . . . . . . . . . . . . .................
Lampiran 4 Dokumen Perjanjian Kerjasama
49
.......................................................... .........................
•
XVI
Oaftar label
Tabel 4.1 Rendemen berdasar jenis pelarut ekstrak heksan, diklorometan, dan etanol. ............. 17 Tabel 4.3 Prosentase vasodilatasi aorta setelah diberi paparan bahan uji
.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .....
Tabel4.4 Be rat fraksi (setelah kering) berdasar kombinasi pelarut vac�um liquid .. .. .. .
...
.............
20
21
Tabel4.6 Prosentase vasodilatasi aorta setelah diberi paparan bahan uji ................................... 23
•
xvii
BABl PENDAHULUAN
Hipertensi merupakan masalah kesehatan dunia dan Indonesia untuk masa kini dan akan datang. Prevalensi hipertensi di dunia dan lndonesiCI terus meningkat seiring dengan peningkatan jumlah lanjut usia dan perubahan pola hidup di masyarakat. Jumlah lanjut usia (lansia) di dunia 7,8% pada tahun 2009 (US Census Beaurau, 2009}, sedangkan di Indonesia mencapai 5% pada tahun 2005 dan diperkirakan mencapai 8,5% pada tahun 2025 (Data statistik Indonesia, 2010). Dari hasil penelitian di Amerika
Serikat diketahui prevalensi hipertensi meningkat >60% pada orang yang berumur >65 tahun (Chobanian et a/, 2003) dan tiga dari empat orang lansia diatas 70 tahun diketahui menderita hipertensi (Burth et a/., 1995), sehingga jumlah lansia yang terus meningkat akan meningkatkan penderita hipertensi. Pada tahun 2000, prevalensi hipertensi di dunia diperkirakan mencapai 26,4% (berkisar 972 juta orang), dan tahun 2025 diperkirakan meningkat 60% (berkisar 1,56 miliar orang) (WHO, 2002; Kearney et a/., 2005). Berdasar survey di Amerika Serikat terdapat juga tren peningkatan prevalensi hipertensi, dari
51% (tahun 1976-1980}
menjadi 70% (tahun 1999-2000) (Burth et a/., 1995; Chobanian et a/., 2003). Hasil Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) di Indonesia tahun 1995 menunjukkan prevalensi hipertensi sebesar 8,3 % (Depkes, 1999}, sedangkan hasil Riset Kesehatan Dasar tahun 2007 menunjukkan prevalensi hipertensi meningkat menjadi 29,8% (Depkes, 2008). Hipertensi jika tidak diobati akan berujung pada penyakit jantung dan •
serebrovaskuler, bila terkontrol dapat mengurangi mortalitas kardiovaskular dan serebrovaskuler. Hasil penelitian meta-analisis diketahui setiap kenaikan 2-mmHg tekanan darah diatas normal akan meningkatkan resiko kardiovaskular 5% dan resiko serebrovaskuler 7% (Lewi ngton et al, 2002). Prevalensi hipertensi yang besar dan resiko komplikasinya menjadikan hipertensi merupakan masalah besar dan membutuhkan perhatian khusus untuk mengatasinya untuk saat ini dan akan datang. 1
Masalah penanganan hipertensi menjadi lebih kompleks akibat kecenderungan terapi obat antihipertensi jangka panjang, sehingga menimbulkan resiko efek samping yang merugikan, peningkatan biaya pengobatan dan ketergantungan bahan baku impor obat antihipertensi yang tinggi. Untuk mengurangi dampak negatif pada pengobatan jangka panjang hipertensi dan ketergantungan bahan baku impor yang tinggi maka perlu terus dicari obat alternatif yang lebih aman dengan harga terjangkau, serta bahan baku tersedia di Indonesia. Obat seperti ini dapat diperoleh dengan penelitian etnobotani pada tumbuhan yang secara tradisional digunakan oleh suku tertentu untuk pengobatan hipertensi atau dari skrining antihipertensi secara bioassay karena tumbuhan merupakan sumber obat yang potensial (Babayi et a/., 2004). Skrining senyawa aktif tumbuhan obat khususnya untuk mekanisme aksi antihipertensi sangat sulit dilakukan karena secara umum tumbuhan atau tanaman obat mengandung banyak senyawa yang perlu dipisahkan. Selain itu patomekanisme dan mekanisme aksi antihipertensi juga sangat beragam, maka diperlukan berbagai model untuk uji coba aktivitasnya baik secara in vitro maupun in vivo. Jika semua ini dilakukan akan membutuhkan dana yang sangat besar, keterampilan khusus yang multidisip·l in, sarana dan prasarana yang memadai, serta waktu yang lama. Untuk obat antihipertensi, penelitian dapat d ifokuskan pada mekanisme aksi tertentu seperti aktivitas vasodilatasi pada pembuluh darah karena dapat dilakukan secara ;n vitro dan bekerja langsung di pembuluh darah, sebagai model dapat digunakan organ terpisah aorta. Aorta digunakan karena ukuran lebih besar dibandingkan dengan arteri sehingga lebih mudah dipreparasi, selain itu basal tonus aorta lebih stabil dibandingkan arteri (Furgchott, 1996). Untuk isolasi dapat dilakukan dengan cara bioassay-guided isolation, diawali dengan pengujian ekstrak untuk diketahui aktivitas vasodilatasi, dilanjutkan •
proses pemisahan senyawa-senyawa tersebut dan diuji lagi aktivitasnya, pemisahan lebih lanjut hanya dilakukan pada fraksi aktif sedangkan fraksi yang kurang aktif tidak dilakukan, proses pemisahan dan uji aktivitas dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh senyawa murni yang aktif (Rimando et a/., 2001).
2
-----
Salah
satu tumbuhan yang potensial untuk
diteliti lebih
lanjut untuk
pengembangan obat antihipertensi adalah kulit batang Alstonia iwahigensis (A. iwahigensis) dari suku Apocynaceae. Hasil skrining fitokimia pada ekstrak etanol kulit
batangnya mengandung metabolit sekunder alkaloid, terpenoid/steroid dan polifenol (Marliana
&
Ismail, 2008). Pada penelitian pendahuluan ekstrak etanol A. iwahigensis
diketahui memiliki aktivitas vasodilatasi pada organ terpisah aorta tikus yang di prekontraksi dengan fenilefrine (Rachmi et a!., 2010). Penelitian pendahuluan uji perbandingan aktivitas vasodilatasi pad a ekstrak eta no I kulit batang A. Scholaris dan A. iwahigensis yang banyak di Kaltim dengan menggunakan organ terpisah aorta tikus
diketahui aktivitas vasodilatasi A. iwahigensis lebih kuat dibandingkan A. scholaris (Rachmi et a/., 2010a), tetapi senyawa aktif dan mekanisme aksi vasodilatasi melalui perantara endotel dan atau tanpa endotel pembuluh darah masih belum diketahui. Dari berbagai penelitian yang banyak dilakukan pada A. scholaris
diketahui
bahwa: (1) pada ekstrak air kulit batang mempunyai efek sebagai angiotensin converting enzyme inhibitor dan menurunkan kontraktilitas aorta secara in vitro yang
lebih baik dibandingkan captopril (Yingsukpisarn, 2005), sedangkan pemberian ekstrak etanol daun secara intravena dapat menurunkan tekanan darah (Channa et a/., 2005), tetapi kedua penelitian tersebut belum diketahui senyawa aktifnya; (2) kandungan senyawa yang sudah diketahui pada A. Scholaris adalah: (a) echitaminic acid, (b) echitamidine N-oxide, (c) N(b)-demethy/a/stogustine N-oxide, (d) akuammicine N-oxide, (e) N(b)-demethylalstogustine (Salim et a/., 2004), tetapi belum ada data aktivitas
vasodilatasi pada pembuluh darah baik secara in vitro maupun in vivo. Penelitian kulit batang A. iwahigensis perlu dila kukan karena telah diketahui memiliki aktivitas vasodilatasi (Rachmi et a/., 2010) dan lebih kuat dibandingkan dengan A. scholaris •
(Rachmi, 2010a), serta belum diketahui senyawa aktif dan mekanisme aksinya. Vasodilatasi pada pembuluh darah dapat diperantarai oleh endotel pembuluh darah dan tanpa pengaruh endotel. Penelitian mekanisme aksi vasodilatasi ini penting dilakukan karena obat vasodilator untuk penderita disfungsi endotel tidak akan bermanfaat jika mekanisme aksi dipengaruhi oleh endotel. Penelitian mekanisme aksi 3
dapat dilakukan dengan menggunakan organ terpisah aorta dengan endotel dan tanpa endotel, diberikan suatu agonis dan antagonis, lalu respons aktivitas vasodilatasi dibandingkan .
•
4
BAB II TUJUAN DAN MANFAAAT PENELITIAN
2.1
TUJUAN PENELITIAN
2.1.1 TAHAP SATU (TAHUN PERTAMA)
A. Tujuan umum adalah mendapatkan fraksi gabungan dari kulit batang Alstonia iwahigensis yang memiliki aktivitas vasodilatasi melalui bioassay-guided isolation
B. Tujuan khusus adalah 1. Mengukur aktivitas vasodilatasi dari kulit batang Alstonia iwahigensis yang diekstraksi dengan polaritas pelarut semakin meningkat, yaitu heksan, diklorometan, dan etanol 2. Mengidentifikasi fraksi gabu ngan dari kulit batang Alstonia iwahgensis yang memiliki aktivitas vasodilatasi paling kuat 2.1.2 TAHAP DUA (TAHUN KEDUA)
A. Tujuan umum adalah mendapatkan senyawa aktif dengan aktivitas vasodilatasi dari kulit batang Alstonia iwahigensis melalui bioasay-guided isolation dan diketahui mekanisme aksinya. B. Tujuan khusus adalah 1.
Mendapatkan isolat aktif dari kulit batang Alstonia iwahigensis dengan aktivitas vasodilatasi melalui bioassay-guided isolation.
2. Mengidentifikasi mekanisme vasodilatasi senyawa aktif hasil isolasi dari kulit batang Alstonia iwahigensis diperantarai endotel dan atau tanpa en doteI.
5
2.2 MANFAAT PENELITIAN :
Penelitian ini penting dan mendesak untuk dilakukan karena memberikan manfaat sebagai berikut: 1. Untuk
diajukan sebagai paten metode isolasi dan senyawa aktif dengan aktivitas
vasodilatasi. 2. Landasan untuk pengujian in vivo untuk pengembangan obat vasodilator baru untuk antihipertensi yang berasal dari tumbuhan Indonesia. 3. Publikasi ilmiah di jurnal ilmiah nasional ataupun internasional. 4. Sebagai sarana untuk pembinaan peneliti muda lptekdok. 5. Memperkuat institusi FK-UNMUL dalam mengelola kegiatan lptekdok.
•
6
BABIII METODE
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental eksploratif untuk isolasi dan meguji mekanisme aksi vasodilator dari kulit batang A. iwahigensis secara in vitro.
Rancangan
penelitian menggunakan post-test only control group design with control group.
3.1
Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini direncanakan berlangsung dalam dua tahun anggaran. Setiap tahun anggaran berlangsung 6 bulan efektif. Semua kegiatan dapat dilaksanakan di FK-UNMUL. Kegiatan ekstraksi, fraksinasi dengan VLC, pembuatan profil kromatogram, deteksi kemampuan antioksidan, dan uji bioassay kemampuan vasodilatasi dilaksanakan di laboratorium Farmakologi.
3.2
Hewan coba dan jumlah ulangan
Hewan coba dalam penelitian ini adalah tikus wistar (Ratus Norwegicus Strain Wistar) jantan umur 3-4 bulan dengan berat 175-225 g dan sehat, yang ditandai dengan
bulu putih, fnata jernih dan tampak aktif,
dari laboratorium Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Mulawarman. Efek vasodilatasi diujikan pada sediaan organ terpisah aorta yang diambil dari tikus wistar. Tikus Wistar dipelihara dalam kondisi terkontrol dengan kriteria inklusi yaitu: berat badan tikus 100-200 gram, umur 3-6 bulan, tampak sehat dan bergerak aktif. MCJkanan dan minuman ad libitum, makanan tikus menggunakan pakan ayam NP 11 dan minum dengan air ledeng yang difiltrasi. Pencahayaan siang hari dengan sinar matahari dan malam gelap. Suhu ruangan dipertahankan 22-27 °C. •
Jumlah ulangan dihitung dengan rumus Federrer (t-1) (r-1) � 15
Dimana
:
t
=
jumlah perlakuan (pada penelitian ini ada 9 perlakuan)
r = jumlah ulangan tiap perlakuan 7
�=- =- ..: - � . ---
Jika dilakukan perhitungan, maka (9-1) (r-1);?: 15 r;:: 2,875, dan dibulatkan menjadi 3 ulangan
3.3
Bahan dan Peralatan Penelitian
3.3.1
Bahan
1. Peralatan untuk fraksinasi
kulit batang
Alstonia iwahigensis yaitu timbangan digital
(Sartorius), , Oven (Memmert), Blender dan saringan, Refrigerated incubator shacker {Lab-line), botol maserasi, botol ekstrak, fraksi, isolat
dan reagen,
dan Rotary
evaporator RV06-ML 1-8 {IKA)
2. Peralatan untuk preparasi cincin aorta meliputi seperangkat isolated organ bath dua chamber (Ugo Basile), Octal Brigde Amplifier dan pencatat digital Power Lab/16SP {AD Instruments), Transduser lsometrik (Ugo Basile), pipet mikro, cawan petri, pHmeter,
termometer, pin set, gunting jaringan, spuit 5 cc dan 20 cc. 3. Peralatan untuk elusidasi struktur yaitu Fisheer-John melting point. Penentuan struktur menggunakan spektroskopi ultraviolet-visible (UV-Vis), infrared (IR), massa (MS), nuclear magnetic resonance eH-NMR dan
3.3.2
13C-NMR)
Bahan Penelitian
3 .4 Bahan Penelitian 1.
Spesimen yang akan diambil adalah kulit batang
A. iwahigensis yang diambil dari
Kabupaten Kutai Katanegara. Determinasi akan dibantu oleh ahli taksonomi untuk memperoleh sertifikasi keabsahan bahan spesimen. Sebagian akan dibuat herbarium •
dan didokumentasikan . n.
Bahan untuk preparasi cincin aorta dan bioassay, terdiri dari aorta tikus wistar jantan, larutan Kreb's Henselheit, aquades,
nitrogliserin, indometasin
HCI, gas carbogen, Phenylephrine,
dan asetilkolin,
verapamil, L-NAME (NY-nitro-L-arginine methyl ester), EGTA,
dan ODQ (IH-[1,2,4]oxadiazolo-[4,3a]-quinoxaline-J-one).
8
. -=- --
. :E ·
iii.
Bahan untuk fraksinasi
:
n-heksane, dichlormethane, ethanol GR, methanol GR,
Kromatografi lapis tipis (KLT) Alumtmium Silica gel 60 F254, KLT preparatif 0.5
mm
Silica gel 60 F254, Silica gel 60 for CC, Sephadex, Vacuum liquid chromatography (VLC) iv.
.
Bahan untuk uji metabolit sekunder, terdiri dari DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil), pereaksi Dragendorf, Anisaldehid,
KOH,
FeCh, dan NEU (dipheny/boric acid-2-
aminoethyl ester)
3.4
Tahapan Penelitian Penelitian ini direncanakan dalam jangka waktu dua tahun anggaran, yaitu tahapan pada tahun pertama dan tahapan pada tahun kedua. Desain penelitian setiap tahun da pat dilihat pada gambar 3.1.
9
Simplisia Kulit Batang A. iwahigensis Maserasi n-Heksan
+I
�
I I
Ekstrak n-Heksan
I
Ampas
Maserasi CH2Cl2
I
Ekstrak CH2Cl2
Bioassa
-----I
FG 1
I
I
I
lsolat 1
I
Elusidasi Struktur
+
I •
I I
l
II
Maserasi Etanol
@]
I
I
Aorta Berendotel
�
Vasodilatasi (+)
�-
7"
Tambahkan ODQ
I
Ampas
I
I
I I , I � I I I l
•
(-) I
Tahun
1
I
-
lsolat dst
KLT
•..
Uji Mekanisme Aksi
lsolat Terpilih
\
l
FG dst
I
..
Is
I
lI
Ekstrak etanol
FG 4
F
?3 Bioassay
I
1
----. . ---I II
VLC
I Bioassa� I
Vasodilatasi
Vasodilatasi (+)
Ekstrak Terpilih
KLTP
I
Tambahkan L-NAME
Ampas
Fraksi Gabungan Terpilih
I
Spektroskopi UV-Vis, IR, MS, 1H-NMR, 13CNMR
lI l
I I KLT
FG 2
. � I
I
.
I
Bioassa'f
I II
w
r
Vasodilatasi (-)
Mekanisme Aksi via Endotel
7
7
,)
I
•
Aorta Tanpa 1Endotel
I
II
... Vasodilatasi (+)
1
•
l l >-�ahun II
Mekanisme Aksi Non Endotel
Vasodilatasi (-)
Gambar 3.1: Tahapan penelitian Risbin lptekdok
Keterangan: FG=Fraksi Gabungan; ODQ=1 H-[1 ,2,4]0xadiazolo[4,3-a]quinoxaline-1-one (antagonis sGC). L-NAME= NY-nitro-L-arginine methyl ester (antagonis eNOS).
10
3.4.1
Tahapan penelitian tahun pertama
Tahap satu/tahun pertama yaitu pembuatan simplisia, ekstraksi dan bioassay, fraksinasi dan bioassay, dengan urutan kerja sebagai berikut : 1.
Pembuatan simplisia kulit batang A. iwahigensis
2. Fraksinasi
kulit batang A. lwahigensis dengan n-heksao, diehloromethane, dan
ethanol 3.
Pengujian aktivitas vasodilatasi ketiga maeam fraksi kulit batang A. Jwahigensis melalui bioassay
4.
Pembuatan profil kromatografi fraksi kulit batang A. lwahigensis yang terpilih dan identifikasi kandungan metabolit sekunder
5.
3.4.2
ldentifikasi fraksi gabungan dengan aktivitas vasodilatasi terkuat melalui bioassay
Tahapan penelitian tahun kedua
Tahap dua/ tahun kedua yaitu isolasi fraksi gabungan terpilih, elusidasi struktur dan uji mekanisme aksi 1.
Pemisahan isolat dari fraksi gabungan terpilih .
2. ldentifikasi isolat dengan aktivitas vasodilatasi paling kuat melalui bioassay 3. Elusidasi struktur dan karakter isolat terpilih 4.
ldentifikasi mekanisme aksi isolat terpilih pada aorta yang berendotel dan tanpa en doteI
3.5 3.5.1 •
Cara kerja
Pengambilan dan pembuatan simplisia Proses ini dimulaii dengan peemilihan pohon A. iwahigensis yang memenuhi syarat (diameter batang utama Peneatatan data
>
20 em dan sehat), setelah diidentifikasi oleh ahli taksonomi.
karakter pohon yang dipilih yaitu lokasi dan jenis tanah. Pemanenan
dilakukan dengan pemangkasan batang eabang pertama. Batang yang telah dipanen dikumpulkan di tempat teduh, dibersihkan dari ranting kecil dan daun, lalu dipotong potong sepanjang 20 em untuk kemudian diambil kulit batangnya. Untuk penelitian ini 11
dibutuhkan kulit batang sebanyak 10 kg. Pengeringan dilakukan dengan oven bersuhu 50 - 60oC selama 1 minggu. Setelah pengeringan, kulit batang ditimbang, dikemas dalam
wadah bersih dan kedap udara, dan diberi label.
3.5.2 Ekstraksi padat cair dengan pelarut yang non polar sampai polar 1
Ekstraksi ini diperoleh dengan cara maserasi, yaitu merendam simplisia dengan pelarut. Awalnya simplisia dihaluskan hingga menjadi bubuk, selanjutnya direndam dengan pelarut non polar yaitu n-heksane selama
24
jam dan diu lang hingga 3 kali. Di akhir masing -
masing pengulangan dipisahkan antara ampas dan supernatannya. Ampas dari proses ini direndam dengan pelarut yang lebih polar yaitu dichloromethane, dengan cara yang sama seperti n-heksane. Ampasnya kemudian direndam lagi dengan pelarut yang lebih polar yaitu etanol PA.
Hasil akhir dari tahapan ini adalah fraksi dari 3 macam pelarut yaitu n
heksane, dichloromethane, dan ethanol PA. Masing-masing fraksi d i pekatkan dengan
rotary evaporator.
3.5.3 Pembuatan profil kromatografi Proses ini ditujukan untuk memperoleh beberapa fraksi gabungan. Tahapannya diawali dengan skrining fase gerak yang mempunyai daya pisah paling optimal dengan kromatografi lapis tipis (KLT), lalu dilanjutkan dengan vacum liquid chromatography (VLC), dan lalu dilakukan KLT kembali untuk pembuatan profil fraksi. Fase diam VLC
digunakan silika gel. Fase gerak digunakan
eluen
terbaik hasil skrining sebelumnya.
Sebelum vakum dijalankan, pelarut yang kepolarannya paling rendah dituangkan ke permukaan adsorben kemudian vakum dijalankan. Elusi diawali dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan (polaritas meningkat) •
� ==·-
dengan harapan bahwa komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan tingkat kepolarannya .. Pada VLC digunakan tekanan yang rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak. Kolom dihisap perlahan-lahan ke dalam wadah penampung fraksi sampai kering dengan cara memvaku mkannya.Setiap fraksi hasil VLC ditampung kemudian dipekatkan untuk selanjutnya dianalisis dengan menggunakan KLT. Fraksi12
fraksi yang didapat dipekatkan lalu dibuat profil KLT. Fraksi-fraksi dengan profil KLT mirip dijadikan satu menjadi fraksi gabungan.
3.5.4 lsolasi Fraksi gabungan yang diperoleh kemudian diisolasi dengan KLT preparatif menggunakan IOO mposisi fase gerak dengan daya pisah yang paling baik. Fase gerak dicari dengan mengubah-ubah kepolaran campuran pelarut melalui KLT biasa. Fase diam pada KLT preparatif adalah pelat kaca yang dilapisi silika gel F60 dengan ketebalan 0.5 mm yang sebelumnya pada daerah masing-masing diaktifkan dengan oven suhu
110°(
selama
1
jam. Bercak yang didapat diuji kemurniannya dengan diberi tiga macam fase gerak yang polaritasnya berbeda. Bila tidak ada pemisahan lebih lanjut dari bercak tersebut maka dianggap sebagai isolat murni. Selanjutnya isolat dikerok dan dilarutkan dengan fase geraknya untuk kemudian dipekatkan.
3.5.5 Karakterisasi isolat dan elusidasi struktur Satu isolat aktif terpilih dilakukan karakterisasi isolat dan
penentuan struktur.
Karakterisasi meliputi pemeriksaan organoleptik dan titik leleh. Pemeiksaan organoleptik meliputi warna dan bentuk kristal secara mikroskopik. Pemeriksaan titik leleh dengan Fisheer-John melting point. Penentuan struktur menggunakan spektroskopi ultraviolet visible (UV-Vis), infrared (IR), massa (MS), nuclear magnetic resonance (1H-NMR dan 13C NMR), dengan tujuan sebagai berikut •
Spektroskopi UV digunakan untuk menginformasikan keberadaan gugus kromofor (ikatan rangkap yang terkonjugasj).
• •
Spektroskopi IR digunakan untuk menentukan keberadaan gugus-gugus fungsional utama dalam suatu sampel yang diperoleh berdasarkan bilangan gelombang yang dibutuhkan untuk terjadinya vibrasi.
•
MS digunakan untuk menganalisis berat molekul dan pola-pola fragmentasi molekul dari suatu senyawa organik.
13
•
1 Spektroskopi H-NMR digunakan untuk mengetahui lingkungan kimia dari proton, jumlah relatif proton-proton yang ada, hubungan posisi antara inti-inti yang saling berinteraksi, jumlah dan jenis ikatan yang memisahkan inti-inti tersebut.
•
Spektroskopi
13
C-NMR digunakan untuk mengetahui nilai pergeseran kimia dan jenis 13 atom karbon C pada suatu senyawa. Disini juga akan dilakukan analisis NMR dua 1 13 dimensi yang merupakan gabungan analisis H-NMR dan C-NMR, menunjukkan kolerasi antara atom H dan atom C pada suatu senyawa (Pavia et a/., 2001; Wilson,
2005).
3.5.6 Eksplorasi kandungan metabolit sekunder Kandungan metabolit sekunder dideteksi dengan menyemprotkan pereaksi pada hasil KLT. Deteksi alkaloid pada KLT dengan pereaksi Dragendorf, hasil dinyatakan positif bila terbentuk warna coklat atau jingga tua. Terpenoid/steroid dideteksi dengan pereaksi anisaldehid dengan hasil positif bila berwarna ungu kekuningan, polifenol dengan FeCI3 dengan
hasil
positif bila
berwarna kehijauan, flavonoid
dengan
pereaksi NEU
(diphenylboric acid-2-aminoethy/ ester) dengan hasil positif bila berwarna kebiruan.
Aktivitas antioksidan dideteksi dengan menyemprotkan pereaksi radikal DPPH (2,2dipheny/-1-picrylhidrazy/). Bila fraksi pada KLT mampu meredam DPPH, ditunjukkan
dengan warna yang lebih pucat.
3.5.7 Bioassay aktivitas vasodilatasi organ terpisah aorta
Pada bioassay digunakan organ terpisah aorta tikus, prekontraksi digunakan fenilefrine Ki, 1996; Vercruysse et a/., 2008) dalam chamber yang berisi larutan ° Kreb's-Henselheit suhu 37 C pH 7.4 dan dialiri gas carbogen, lalu diberi fraksi/isolat atau KCI (Dong
•
&
dengan dosis kumu latif, kemudian diukur aktivitas vasodilatasinya. Parameter aktivitas vasodilatasi dinilai dengan nilai Emaks (nilai maksimum persen aktivitas vasodilatasi aorta yang dicapai setelah pemberian fraksi/isolat dengan dosis kumulatif ) dan EDSO vasodilatasi (logaritma konsentrasi fraksi/isolat yang menimbulkan 50% persen efek nilai Emaks). Sebagai pembanding kekuatan aktivitas vasodilator digunakan nitrogliserin (nitrit
14
oksid donor) dan verapamil (antagonis kalsium). Untuk kontrol negatif digunakan pelarut fraksi/isolat.
ldentifikasi mekanisme aksi dengan bioassay aorta tanpa endotel dan berendotel
3.5.8
Aorta dihilangkan endotelnya dengan cara mengosok bagian dalam dengan be nang silk 20 secara hati-hati untuk menghindari kerusakan pada sistem kontraktil otot polos. Aorta dinyatakan tanpa endotel bila penggujian prekontraksi dengan fenilefrine lalu diberi asetilkolin dengan dosis yang sama respons vasodilatasi <10%. Pengujian mekanisme aksi vasodila1:asi meliputi tiga hal, yaitu: 1. jika mekanisme aksi di endotel, maka pada: (a) bioassay aorta tanpa endotel setelah prekontraksi lalu diberi isolat aktif terpi lih tid a k akan terjad i aktivitas vasodilatasi, (b) bioassay aorta berendotel setelah prekontraksi lalu diberi isolat aktif terpilih maka akan terjadi aktivitas vasodilatasi; 2. jika mekanisme aksi tidak diperantarai oleh endotel, maka pada bioassay menggunakan aorta tanpa endotel dan berendotel setelah prekontraksi lalu diberi isolat aktif terpilih maka akan terjadi aktivitas vasodilatasi dengan kekuatan yang sama; 3. jika mekanisme aksi diperantarai oleh endotel dan tanpa endotel, maka pada bioassay aorta tanpa endotel dan berendotel setelah prekontraksi lalu diberi
isolat aktif terpilih maka akan terjadi aktivitas vasodilatasi dengan kekuatan yang berbeda.
Untuk lebih memastikan diperlukan langkah penelitian sebagai berikut: •
(1) aorta berendotel diberi L-NAME (Nr-nitro-L-arginine methyl ester), suatu antagonis eNOS yang selektif jika (a) mekanisme aksi diperantarai endotel maka respons vasodilatasi tidak akan terjadi atau menurun dibandingkan dengan tanpa pemberian L-NAME, (b) sedangkan mekanisme aksi vasodilatasi tidak diperantarai endotel maka tidak akan terjadi penurunan aktivitas vasodilatasi; 15
�----__.,___"""'
. ... ·,
.
..
(2) aorta berendotel diberi sGC antagonis (1H-[1,2,4]oxadiazolo-{4,3a}-quinoxaline1-one atau
ODQ), jika respons vasodilatasi tidak terjadi atau menurun
dibandingkan tanpa pemberian
ODQ maka mekanisme aksi vasodilatasi melalui
pembentukan NO oleh endotel. 3.5.9 Analisa data
Data aktivitas vasodilatasi dinyatakan dalam nilai Emaks vasodilatasi dan nilai EDSO yang disajikan dalam bentuk nilai mean
.±
SD. Untuk uji kekuatan aktivitas vasodilatasi
dibandingkan dengan standar obat yang menyebabkan vasodilatasi pada organ terpisah aorta tifus dan juga kontrol negatif (pelarut ekstrak/fraksi/isolat), lalu dilakukan uji normalitas dan variansi, dilakukan uji anova satu jalur jika syarat terpenuhi, berbeda bermakna jika p
16
BAB IV HASIL
4.1 Ekstraksi simplisa kulit batang A. lwahigensis Hasil ekstraksi
bertingkat dengan menggunakan pelarut non polar (heksanL semi polar
(diklorometan), dan polar (etanol) diperoleh dengan cara maserasi, yaitu merendam simplisia dengan pelarut, dengan setiap hari dishaker orbital dengan kecepatan Maserasi awal menggunakan heksan untuk merendam lwa�igensis, dengan hasil akhir didapatkan rendemen ....
300 gram serbuk kulit batang A.
4,39%. Maserasi selanjutnya dengan
diklorometan untuk merendam filtrat kering dari sisa maserasi heksan akhir rendemen
2 rpm selama 10 menit.
(234 gram), dengan hasil
1,25 %. Terakhir adalah maserasi dengan etanol PA untuk merendam filtrat
kering sisa maserasi diklorometan
(199,5 gram), dengan hasil akhir rendemen 3,77%. Pelarut
heksan memberikan rendemen terbesar, sedangkan diklorometan mempunyai rendemen terkecil.
Tabel 4.
1 Rendemen berdasar jenis pelarut ekstrak heksan, diklorometan, dan etanol. Pel a rut
Be rat Serbuk(g)
Berat Ekstrak (g)
Rendemen
Heksan
300
13.1623
4.39
Diklorometan
234
2.935
1.25
199.5
7.5227
3.77
Eta no I
17
4.2 Uji kandungan metabolit sekunder
Untuk mendapat informasi awal mengenai kandungan metabolit sekunder pada ekstrak .
kulit
batang
Alstonia
iwahigensis
yang
mungkin
berperan
dalaam
kemampuan
vasodiltasinya, dilakukan serangkaian uji pada hasil KLTnya.
F. DIKLORO: 0.80
F. ETANOL: 0.
F.DIKLORO: 0.92
71
F.HEKSAN: 0.85 F. DIKLORO: 0.95
•
18
Gambar 4.1 Hasil screening metabolit sekunder golongan alkaloid, polifenol, terpenoid/steroid, dan flavonoid pada ekstrak kulit batang Alstonia iwahigensis Satu noktah alkaloid teridentifikasi pada ekstrak diklorometan (Rf 0,80) dan dua noktah pada ekstrak etanol (Rf 0,24 dan 0,71 ) . Polifenol teridentifikasi pada ekstrak diklorometan (Rf 0,92), Polifenol golongan flavonoid terdapat pada ekstrak diklorometan, maupun etanol. Kelompok flavonoid paling banyak terdapat pada ekstrak etanol. Terpenoid teridentikasi pada ekstrak heksan (Rf 0,85) dan diklorometan (Rf 0,95) . •
4.3 Uji aktivitas vasodilatasi pada ekstrak optimal Masing - masing hasil maserasi heksan, diklorometan, dan etanol diuji kemampuan vasodilatasinya dengan dibandingkan kontrol negatif. Kontrol positif tidak diuji saat ini, tetapi nanti pada saat uji vasodilatasi fraksi gabungan.
19
Tabel 4.3 Prosentase vasodilatasi aorta setelah diberi paparan bahan uji Bahan Uji
0.04 mg/mL Mean
Kontrol
-0. 74
Heksan
0.00
Diklorometan
0.00
Etanol
0.00
+
+
+
+
+
0.08 mg/mL +
so
Mean
0.95
-1 .68
+
1 .9 4
-1.39
0.00
-0.78
+
1.56
-1 . 1 5
0.00
-6.40
+
0.00
-3.80
+
so
Konsentrasi Bahan 0.16 mg/mL Mean
1 . 59
-12.14
2.70
-8.07
+
+
+
+
+
so
Uji 0.32 mg/mL Mean
+
so
0.64 mg/mL + so Mean
2.82
-1.05
+
3.90
0.22
+
3.88
0.92
-1 .67
+
2.09
0.26
+
3.22
1 . 98
-21.03
+
5.30
-24.21
+
7.70
3.33
-12.89
4.44
-20.78
+
6.64
+
Pemberian kontrol negatif (DMSO-etanol 10%) menunjukkan vasodilatasi ..1-
.•
minimal pada konsentrasi rendah, yang mungkin disebabkan efek pengenceran, tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi kemudian kembali bervasokonstriksi. Pemberian ekstrak heksan pada dosis rendah tidak memberikan efek apapun, kemudian pada dosis 0,16 dan 0,32 mg/ml menyebabkan vasodilatasi ringan, dan pada dosis 0,64 mg/ml
kembali menyebabkan vasokonstriksi. Pada uji ANOVA, tidak ada perbedaan bermakna antara pemberian kontrol negatif dan ekstrak heksan. Ekstrak diklorometan dan etanol memberikan hasil vasodilatasi yang berbeda bermakna bila dibanding dengan kontrol negatif. Ekstrak diklorometan memi liki efek vasodilatasi yang lebih baik dari etanol, walaupun dalam uji ANOVA tidak berbeda bermakna. Oleh karena itu, pada tahap berikutnya yaitu fraksinasi digunakan kombinasi pelarut diklorometan dan etanol pada ekstrak diklorometan. Hasil ini lebih jelas terlihat pada gambar 4.1.
"
20
---- ---
10 .------.
0 'iii J!l � -10 '0 0 1/) C'G >
;
12 C1l a..
-20 ------ K -& HKS
-30
40
� CH2CI2 -0- EtOH
�-----.----r--.---_J 40
80
160
320
Konsentrasi (Jlg/mL)
Gambar 4.2
640
Prosentase vasodilatasi esktrak berdasar perta mbahan konsentrasi ekstrak dan kontrol negatif
4.4 Fraksinasi dengan VLC Ekstrak
diklorometan yang digunakan adalah seluruh hasil ekstraksi awal yang
tersisa. Ek strak tersebut dimasukkan ke dalam kolom kromatografi
untuk
kemudian
diali ri fase gerak kombinasi diklorometan dengan etanol. Komposisi fase gerak yang disiapkan 1 1 jenis (t abel 4 . 4) .
Tabel 4.4 Berat fraksi (setelah ke ring) berdasar kombinasi pelarut vacuum liquid chromatography Kombinasi pelarut (m l)
Diklorometan
Etanol
100 90 80 70 60
0 10 20 30 40
so
so
40 30 20
60 70 80
Berat fra ksi (%)
Kelompok Fraksi berdasar hasil KlT
•
16.96 48.9S 27.S9 1.82 0.73 0.48 0.46 0.27 0.06
II Ill
IV
21
90 100
10 0
0.43 2.26
Setelah masing-masing dikeringkan pada suhu 50 ° diidentifikasi melalui
C,
didapat
11
fraksi yang siap
KLT.
4Q l dent ifi kasi fraksi gabungan dengan KLT KLT
dapat memisahkan zat dalam masing-masing fraksi berdasar berat dan polaritasnya,
sehingga berdasarkan waktu retensinya dapat diidentifikasi senyawa yang mirip antar fraksi.
Ekstrak CH2CI2
Gambar 4.5
Hasil KLT dilihat dibawah sinar UV 365 nm
•
Gambar 4.5 Hasil KLT dilihat dibawah sinar UV 254 nm Hasil
KLT
menunjukkan ada 5 kelompok noktah yang memiliki waktu retensi berbeda {terutama
bila dilihat dengan sinar UV 365 nm). Noktah pertama adalah dari fraksi di klorometan
100.
22
Noktah kedua adalah dari fraksi diklorometan - etanol 90 : 10. Noktah ketiga adala h dari fraksi diklorometan - etanol 80 : 20. Kelompok noktah keempat adalah dari fraksi diklorometan etanol 70 : 30, 60 : 40, 50 : 50, 40 : 60, dan 30 : 70, 10 : 90 dan fraksi etanol 100. Dengan demikian ada 4 jenis kelompok fraksi yang akan diuji kemampuan vasodilatasinya (tabel 5.3).
4.6 Uji vasodilatasi fraksi gabungan Berdasar empat kelompok noktah yang teridentifikasi pada KLT, fraksi cair hasil
VLC
digabungkan sehingga didapatkan empat fraksi gabungan. Tiap fraksi gabungan diuji kemampuan vasodilatasi aorta secara invitro. Sebagai pembanding turut diuji juga kontrol negatif (DMSO-etanol %), fraksi diklorometan, dan verapamil (bloker kanal kalsium tipe L).
Tabel 4.6 Prosentase vasodilatasi aorta setelah diberi paparan bahan uji Konsentrasi Bahan Bahan
Uji
0.04 mg/mL Mean
+
0.08 mg/ml +
SO
-1.68
+
1 .94
o.oo
-6.40
+
1 . 52
1 .30
+
SO
Mean
Uji
0.16 mglml +
SO
-1.39
+
2.82
1 .59
-12.14
+
0.98
1.25
+
Mean
0.32 mg/mL
0.64 mglmL
+
SO
-1.05
+
3.90
0.22
+ +
1.98
-21.03
+
5.30
-24.21
+
7.70
1 .53
-0.01
+
0.95
-1.16
+
2.84
+
Mean
Mean
SO
-0.74
+
Diklorometan
0.00
+
Fl F ll F Ill
1.01
+
1.73
-5.61
+
2.30
-13.26
+
3.99
-22.86
+
3.48
-31.07
-5.50
2.03
-17.57
+
-31.87
+
4.61
-45.01
+
4.74
-57.49
F IV
-1.91
+
1.47
-5.37
+
3.61 1.48
-9.68
-13.66
+
4.44
-17.09
+
5.73
-55.93
+
6.03
-69.25
+ +
1.56
5.47
4.26
-77.88
+
4.30
-84.36
+
2.61
Kontrol
-1.14
Verapamil
-17.93
+
+
+
0.95
Kontrol dan Diklorometan dengan n = 3 kali pengulangan; F dengan n=6 kali pengulangan, F Ill dengan 11 kali pengulangan
I, II, IV
+
3.88
2.31 4.53
dan verapamil
Fraksi gabungan ke 3 (F Ill) memiliki kemampuan vasodilatasi paling kuat, baik dibandingkan dengan ekstrak diklorometan dan ketiga faksi gabungan lainnya. Bila diukur berdasar efek vasodilatasinya, berturut - turut mulai dari yang paling kuat adalah fraksi ke•
3, fraksi ke-2, fraksi diklorometan, fraksi ke-4, dan fraksi ke-1. Kekuatan vasodilatasi fraksi-3 berbeda bermakna dibanding fraksi gabungan lainnya dan fraksi diklorometan sejak dosis 80 .,
ug/ml, dengan seluruhnya p < 0,001. Tetapi kemampuan vasodilatasi
fraksi ke-3 lebih
lemah dari kemampuan verapamil.
23
20
0 'ii)
J!l � :c 0 UJ
�
-20
-40
s:: Cll
�
Cll
0..
-60
-80
_.._ -a-+----v--'*-+---
K CH2CL2 Fl F II F Ill FN VER
-100 40
80
160
320
640
Konsentrasi (JJQfml)
Gambar 4.6 Prosentase vasodilatasi fraksi gabungan berdasar pertambahan konsentrasi ekstrak dan kontrol negatif
Pada
dosis terbesar yang digunakan dalam penelitian ini ( 640 ug/dl) kemampuan
vasodilatasi fraksi ke-3 dibanding verapamil masih berbeda bermakna (p
•
24
BAB Y PEMBAHASAN
Pada penelitian ini dilak:ukan ekstrak:si selektif yang berurutan dengan pelarut yang polaritasnya meningkat. Pelarut yang digtmakan adalah
pelarut heksan (indeks polaritas
0.00), diklorometan (indeks polaritas (3.1), dan etanol (indeks polaritas 5.2) yang berturut t urut bersifat non polar, semi polar, dan polar. Walaupun tergolong polar, tetapi etanol
sebenarnya tidak sepolar air (indeks polaritas 9.0), hanya saja air jarang digunakan dalam proses ekstraksi awal
(Sarker, Latif & Gray, 2006). Kelompok metabolit sekunder dari
tanaman memiliki polaritas yang berbeda, sehingga metode ekstraksi selektif bermanfaat sebagai awal pemisahan metabolit yang terkandung dalam kulit batang Alstonia iwahigensis sehingga memudahkan isolasi lebih lanjut. Kebanyakan alkaloid terekstrak dengan pelarut yang lebih polar (metanol, etanol, dan bahkan air panas) ( Hanson, 2003), karena itu pada penelitian ini didapatkan 2 jenis alkaloid pada fraksi etanol yang polar dan sebagai tambahan ditemui jenis alkaloid yang semi polar (terlarut dalam diklorometan).
Sedangkan sterol dan terpenoid yang bersifat lipofilik lebih
cenderung terekstrak pada pelarut non polar (Sarker, Latif & Gray, 2006), sebagaimana dikonfrrmasi pada hasil KLT ekstrak: heksan dan diklorometan kulit batang Alstonia
iwahigensis. Polifenol pada ekstrak kulit batang Alstonia iwahigensis bersifat semipolar (teridentifikasi pada ekstrak diklorometan). Pada identifikasi flavonoid, penyemprotan NEU ke lempeng
KLT menghasilkan spot
kekuningan pada ekstrak: diklorometan, yang bila dilihat di bawah sinar UV 254 nm menghasilkan pendar berwarna gelap. Pengamatan dengan UV 365 nm menunjukkan beberapa spot yang berpendar biru pada ekstrak diklorometan dan ekstrak etanol. Walaupun •
kebanyakan flavonoid memmjukkan bercak kekuningan, tetapi pada sinar UV 365
nm,
flavonoid dapat berpendar hijau atau biru tergantung pada strukturnya. Bila mengandung asam karbosilik fenol atau coumarin, flavonoid akan berpendar biru (Wagner, Bladt & Rickl,
200 1).
Karena itu pada ekstrak kulit batang Alstonia iwahigensis diduga mengandung
kelompok flavonoid yang bersifat semipolar (ekstrak diklorometan) dan sebagian besar polar (ekstrak etanol), yang dapat dikonfirmasi lebih lanjut saat melakukan isolasi.
25
Sebagaimana ekstrak etanol kulit batang Alstonia dan flavonoid, ekstrak metanol
iwahigensis yang mengandung alkaloid
(yang polaritasnya berdekatan dengan etanol) dari
kulit
batang Alstonia boonei juga mengandung indole alkaloid, terpenoid jenis saponin, dan polifenol jenis tanin serta keluarga flavonoid (Akinmoladun et al, 2007; Adebayo, Adebaye Ajaiyeoba, 2004). Penelitian lain pada kulit batang genus
&
kandungan alkaloid alkaloid dan
yang kaya, misalnya pada
Alstonia menunjukkan
Alstonia angustiloba
didapatkan 20 jenis
Alstonia spatulata 25 jenis alkaloid (Ku, Tan, Low, Kamiyama & Kam. 200 1 ;
\ Tan et al, 201 0). Selain itu genus Alstonia
menjadi sumber
berbagai jenis alkaloid baru,
pada
Alstonia angustifolia didapatkan 3 jenis alkaloid indole baru, Alstonia macrophylla 4
jenis,
Alstonia angustiloba 3 jenis, dan Alstonia scholaris 1 jenis (Tan et a/, 201 0; Hirasawa
et al, 2009; Ku et al, 2001; Cai , 2008). Penelitian ini menunjukkan ekstrak diklorometan dan etanol dari Alstonia iwahigensisi mampu menghambat kontraksi otot polos yang diinduksi fenilefrin, sebanding dengan peningkatan konsentrasi. Antara kedua ekstrak tersebut, ekstrak diklorometan merniliki kemampuan vasodilator lebih baik dari ekstrak etanol. Fenilefrin merupakan agen yang menginduksi kontraksi otot polos melalui reseptor adrenergik
a
yang menyebabkan aktivasi
fosfolipase C dan selanjutnya menyebabkan produksi inositol 1 , 4, 5
trifosfat (IP3) dan
diasilgliserol (DAG). Akibat rangkaian kejadian ini memobilisasi kalsium dari penyimpanan intraseluler dan influks ion kalsium (Ca2+) (Bolton, 1979). ekstrak
yang
membrane-depolarization dependent.
Adanya inhibisi kontraksi cincin aorta pada penelitian ini menunjukkan
Alstonia iwahigensis bersifat spasmolitik dan antagonis terhadap efek ionotropik
fenilefrin. Kemampuan vasodilatasi pada ekstrak diklorometan mungkin diperankan oleh golongan alkaloid, sterol/terpenoid, polifenol, dan flavonoid. Kemampuan vasodilatasi ekstrak etanol mungkin disebabkan oleh kandungan alkaloid atau flavonoidnya. Golongan alkaloid seperti rutecarpin (Chiou, Chou, Liao, Sham, Chen, 1994) dan cassiarin (Matsumoto et al, 2010) mempunyai kemampuan vasorelaksan yang
endotel-dependent. Terpenoid diosgenin mampu
menghambat vasokonstriksi melalui mekanisme yang
endotel-dependent (Dias et al, 2007).
Golongan metabolit sekunder polifenol terutama flavonoid coumarin yang terekstrak dengan diklorometan dapat menyebabkan vasodilatasi yang
endotel-dependent dan non
endotel
dependent (Dongmo et al, 2007). Adanya flavonoid dan alkaloid pada ekstrak diklorometan 26
dan etanol kulit batang Alstonia iwahigensis, menunjukkan metabolit sekunder ini terbagi dan terkonsentrasi pada fraksi yang berbeda. Penelitian ini mengindikasikan senyawa bioaktif pada kulit batang Alstonia iwahigensis yang terlibat pada aktivitas vaskuler bersifat semipolar dan polar. Dengan mempertimbangkan kemampuan vasodilatasi yang paling kuat dan banyaknya kandungan
metabolit sekunder pacta ekstrak diklorometan yang rimngkin mempunyai efek
v� sodilatasi, memang layak untuk dilakukan fraksinasi dengan VLC yang dapat lebih selektif .
memisahkan kandungan metabolit sekunder. Fraksinasi bertingkat menghasilkan 4 kelompok fraksi gabungan, sesuai dengan hasil KL T. Pengelompokan fraksi didasarkan pada waktu retensi yang sama, yang berarti bahwa berat molekul dan polaritasnya sama atau mendekati. Pengujian aktivitas vasodilatasi pada keempat fraksi gabungan menunjukkan aktivitas vasodilatasi aorta fraksi gabungan ke-3 yang paling efektif. Kemampuan fraksi gabungan ke3 melebihi fraksi gabungan yang lain dan fraksi diklorometan, dengan perbedaan yang bermakna mulai dari dosis 80 ug/ml
(untuk semua fraksi p
<
0,001). Tetapi bila
dibandingkan dengan bloker kanal kalsium (Ca blocker), kemampuan fraksi gabungan ke-3 mencapai 69% kemampuan vasodilatasi verapamil. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan bahan uj i. Pada fraksi gabungan kemtmgkinan besar terkandung beberapajenis zat aktifyang mungkin tidak: bekerja secara sinergis. Selain itu, pada konsentrasi yang sama antara fraksi gabungan dan verapamil, verapamil
karena
konsentrasi zat aktif yang berefek vasodilatasi lebih tinggi pada
verapamil
merupakan
dimethoxyphenylethyl )methylamino]-2
isolat
dengan
rumus
kimia
5-[N-(3, 4-
-(3, 4-dimethoxyphenyl)- 2-isopropylvaleronitrile
hydrochloride (Faridbod, 2009), sedangkan fraksi gabun.gan ke-3 mungkin merupakan gabungan beberapa isolat. Efek yang ditimbulkan isolat dapat lebih kuat daripada
fraksi
asalnya (Maruyama, Sumitou, Sakamoto, Araki & Hara, 2009). Tanaman lain yang terbukti memptmyai kemampuan vasodilatasi antara lain Zingiber
officianale, ekstrak etanol akar Morinda citrifolia melawan kontraksi aorta kelinci yang diinduksi fenilefrin (Gilani et al, 201 0), ekstrak air daun Caesalpina ferrea (Menezes, Moreira,. Carvalho, Antoniolli, & Santos, 2007), dan ekstrak methanol daun Croton
schiedeanus Sclecht dan Calea
glomerulata melawan kontraksi aorta yang diinduksi
fenilefrin (Querrero et al, 2002). Mekanisme vasorelaksasi yang terjadi pada tanaman tersebut mirip dengan obat antihipertensi yaitu menghambat reseptor adrenergik dan voltage 27
dependent calcium channels; dan menghambat kalsium dari peyimpanan intraseluler; dan pembukaan kanal K+ yang diaktivasi voltage, ATP, dan kalsium yang menyebabkan hiperpolarisasi membrane otot polos melalui penurunan resting membrane potential (Gilani
et a!, 2010; Menezes et a/, 2007; Querrero et al, 2002).
Sebagaimana tanaman-tanaman
tersebut, ekstrak Alstonia iwahigensis mampu merelaksasi aorta yang diinduksi
fenilefrin
secara concentration-dependent,
oleh
se
hingga kemungkinan besar ekstrak Alstonia
�wahigensis menggunakan satu atau lebih mekanisme tersebut, yang perlu dibuktikan lebih Ianjut. Kekurangan dari penelitian ini adalah aorta tidak dide-endoteliasi untuk mempelajari peran endotel dalam mempengaruhi tonus vascular melalui sek.resi vasorelaksan terutama nitric oksida yang tergantung pada aktivasi nitric oxide synthase (NOS) yang kalsium dependent (Ameer, Salman, Siddiqui, 201 0;
Gilani et al, 201 0)
Uji vasodilatasi hanya
menggunakan fenilefrim menyebabkan site of action vasodilatasi dari fraksi gabungan ke-3 belum dapat diketahui pada penelitian ini. Penggunaan aorta utuh (whole aorta) belum dapat digunakan untuk membedakan apakah mekanisme kerja vasodilatasi pada otot palos atau pada endotel aorta. Selain itu tidak menutup kemungkinan fraksi gabungan ke-3 bekerja pada otot palos dan endotel, karena kandtmgan zat aktifnya yang mempunyai kemampuan vasodilatasi mungkin lebih dari satu jenis. Untuk mendapatkan zat aktif dari fraksi gabungan ke-3 yang berpotensi sebagai vasodilator harus dilakukan tahap selanjutnya yaitu bioasay
guided isolation pada aorta berendotel dan tidak berendotel untuk diuj i mekanisme aksinya .
•
28
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 K.ESIMPULAN
Penelitian ini menunjukkan ekstrak diklorometan dan etanol dari Alstonia iwahigensisi •
mampu menghambat kontraksi otot poles yang diinduksi fenilefrin, sebanding dengan peningkatan konsentrasi. Antara kedua ekstrak tersebut, ekstrak diklorometan memiliki kemampuan vasodilator lebih baik dari ekstrak etanol. Pengujian aktivitas vasodilatasi pada keempat fraksi gabungan dari ekstrak diklorometan menunjukkan
aktivitas
vasodilatasi
aorta
fraksi
gabungan
ke-3
(fase
gerak
diklorometan/etanol 80/20) yang paling efektif. Kemampuan fraksi gabungan ke-3 melebihi fraksi gabungan yang lain dan fraksi diklorometan, dengan perbedaan yang bermakna mulai dari dosis 80 ug/ml (untuk semua fraksi p < 0,00 1).
7.2 SARAN 1.
Penelitian ini perlu dilanjutkan hingga dapat teridentifikasi zat aktif yang berperan sebagai antihipertensi
2.
Untuk dapat diuji secara klinis, perlu diteliti lebih lanjut mekanisme aksinya sehiingga dapat diprediksi efek samping yang harus diwaspadai
3.
Apabila digunakan dalam bentuk herbal terstandar perlu ada kajian mengenai pembudidayaan pohon Alstonia iwahigensis .
•
29
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini tidak akan dapat terlaksana dengan baik tanpa dukungan dari pihak-pihak yang terkait, untuk itu disarnpaikan terima kasih kepada
1
RISBIN IPTEKDOK Kemenkes RI tahun 201 1 atas pembiayaan penelitian ini
2
Prof. Dr. Wahyono SU, Apt yang telah membimbing dan meningkatkan wawasan peneliti
3 4
dr. Emil B. Moerad, Sp.P, dekan FK Urunul atas dukungan moralnya dr. Sjarieflsmail, M.Kes, dan Ytmie Safitri S.Si atas masukannya dalam pelaksanaan penelitian
30
Referensi
Adebayo, MA and Adebaye, TO and Ajaiyeoba, EO (2004) Preliminary phytochemical
investigation and diuretic studies of alstonia boonei stem bark in male Wister rats. Journal of Natural Remedies, 4 (2). pp. 179- 1 1 82. ISSN 0972-554 7 Akinmoladun AC, Ibukun EO, Afor E, Akinrinlola BL, Onibon TR, Akinboboye AO, Obuotor EM, Farombi EO. Chemical constituents and antioxidant activity- ofAlstonia
boonei.
African Journal of Biotechnology. 2007; 6 (10): 1 1 97-1201 Ameer OZ, Salman IM, Siddiqui MJA. Cardiovascular activity of the n-butanol fraction of the methanol extract of Loranthus ferrugineus Roxb. The Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2010; 43 ( 2):1 86-194 Babayi, H., Kolo, I., Okogun, J.I., Ij ah, U.J.J. 2004. The antimicrobial activity of methanolic extracts of
Eucalyptus camaldulensis and Terminalia catappa against some pathogenic Biochemistry, 16(2): 106- 1 1 .
microorganisms.
Bolton TB, Mechanisms of action of transmitters and other substances on smooth muscle, ·
Physiological Reviews, 1 979. 59(3):. 606-7 1 8
Burt, V.L., Whelton, P., Roccella, E.J., Brown, C., Cutler, J.A., Higgins, M. 1995. Prevalence of hypertension in the US adult population. Results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988-1991.
Hypertension, 25:305-13.
Cai XH, Tan QG, Liu YP, Feng T, Du ZZ, Li WQ, Luo XD.
A Cage-Monoterpene Indole
Alkaloid from Alstonia scholaris.
Org. Lett., 2008; 10 (4):577-580 Channa, S., Dar, A., Ahmed, S., Atta-Ur-Rahman. 2005. Evaluation of Alstonia scholaris leaves for broncho-vasodilatory activity . J Ethnopharmaco., 97:469-76. Chiou WF, Chou. CJ, Liao JF, Sham AY, Chen CF. The mechanism of the vasodilator effect of rutaecarpine, an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa. Eur J Pharmacol. 1994 12;257(12):59-66 Chobanian, A.V., Bakris, G.L., Black, H.L., Chusman, W.C., Green, L.A., Izzo, J.L., Jones, D.W., Materson, B.J., Oparil, S., Wright, J.T., Roccella, E.J. 2003. The seventh report of the joint national committee on prevention, detection, evaluation, and treatment of high blood pressure: the JNC 7 report. JAMA, 289:2560-72. Data Statistik Indonesia. 2005.
Proyeksi Penduduk 2000-2025. Pada alamat situs Internet:
http://www.datastatistik-indonesia.com/proyeksi/index.php?option=com_proyeksi&
task=show&Itemid=941 BPS - BAPENAS- UNFPA, Jakarta, 2005. Diakses tanggal 1 4 Juli 2010. Departemen Kesehatan Republik Indonesia (Depkes). 1999.
menuju •
Indonesia
sehat 2010.
Badan
Rencana pembangunan kesehatan
Penelitian
dan
Pengembangan
Kesehatan
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia (Depkes). 2008.
Laporan Riset Kesehatan Dasar
(Riskesdas) nasional tahun 2007. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Dias KL, Correia Nde A, Pereira KK, Barbosa-Filho JM, Cavalcante KV, Araujo IG, Silva DF, Guedes DN, Neto Mdos A, Bendhack LM, Medeiros IA. Mechanisms involved in the vasodilator effect induced by diosgenin in rat superior mesenteric artery. Eur J Pharmacol. 2007;574(2-3 ) : 1 72-8. 31
Dong, U.L., and Ki, C.C.
1996. Calcium channel blocking and a-adrenoceptor blocking action Arch. Pharm. Res.,
of coptis rhizorna extracts and their alkaloid components in rat aorta.
19(6):456-61. Dongrno AB, Azebaze AGB, Nguelefack TB, Ouahouo BM, Sontia B, Meyer M, Nkengfack AE, Karnanyi A, Vierling W. Vasodilator effect of the extracts and some coumarins from the stern bark of Mammea africana (Guttiferae). Journal of Ethnopharrnacology,
1 1 1(2); 2007:
329-334 Faridbod F, Ganj aliL MR,
Safaraliee, Riahi S, Hosseini M,
Norouzi P.
Veraparnil:
Potentiometric Membrane Sensor for Veraparnil Pharmaceutical Analysis. Computational Investigation. Int. J. Electrochem. Sci.,
2009; 4:14 19 - 1435
1996. Bioassay With Isolated Vascular Tissue for Endothelium Derived Methods in Nitrit Oxide Research, 39: 567 Gilani AH, Mandukhail SR, Iqbal J.Antispasmodic and vasodilator activities of Morinda citrifolia root extract are mediated through blockade of voltage dependent calcium channels. BMC Complementary and AlternativeMedicine. 201 0; 10 (2).
Furgchott, F.R.
Relaxing Factor, Nitrit Oxide and Nitrit Oxide Donors. In:
Guerrero MF, Puebla P, Carron R, Martm ML, Arteaga L, dan San Roman LR. Assessment of the antihypertensive and vasodilator effects of ethanolic extracts of some Colombian medicinal plants. Journal ofEthnopharmacology.
2002; 80 (1): 37-42.
Hanson JR. The classess of natural products and their isolation. In: secondary metabolites.
Natural products: the
2003:1-33. The royal society of chemistry. Cambridge. UK
Hirasawa Y, Arai H, Zaima K, Oktarina R, Rahman A, Ekasari W, Widyawaruyanti A, Indrayanto G, Zaini NC, Morita H. Alstiphyllanines A-D, Indole Alkaloids from Alstonia
macrophylla. J Nat. Prod. , 2009; 72 (2): 304-307 Kearney, P.M., Whelton, M., Reynold, K., Muntner, K., Whelton, P.K., Jiang, H. burden ofhypertension: analysis of worldwide data. Lancet,
2005. Global
365:217-23.
Ku WF, Tan SJ, Low YY, Komiyama K, Karn TS. Angustilobine and andranginine type indole alkaloids and an uleine-secovallesamine bisindole alkaloid from Phytochemistry.
Alstonia angustiloba.
2001; 72(17): 2212-2218
Lewington, S . , Clarke, R., Qizilbash, N., Peto, R., Collins, R.
2002. Age-spesific relevance of
usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one
61 prospective studies. Lancet, 360:1903-13. Marliana, E., dan Ismail, I. 2008. Studi kandungan kimia dan bioaktivitas ekstrak etanol kulit batang Alstonia iwahigensis. J Kimia Mulawarman, 6(1 ): 1-4. million adults in
Maruyama H, Sumiton Y, Sakamoto T, Araki Y,
Hara H.
Antihypertensive Effects of
Flavonoids Isolated from Brazilian Green Propolis in Spontaneously Hypertensive Rats. Biol. Pharm. Bull.
2009; 32(7): 1244-1250
Matsumoto T, Kobayashi T, Ishida K, Hirasawa Y, Morita H, Honda T, Kamata K. Vasodilator effect of Cassiarin A, a novel antiplasmodial alkaloid from Cassia siamea, in rat isolated mesenteric artery. Bioi Pharrn Bull. Menezes IAC,
2010; 33(5):844-8
Moreira IJA,Carvalho AA, Antoniolli AR, dan
Santos MRV.Cardiovascular
Caesalpinia ferrea: involvement of ATPsensitive Vascular Pharmacolog. 2007; 47(1): 41-47 Pavia, D.L., Lampman, G.M., and Kriz, G.S. 2001. Introduction to spectroscopy. Third Edition, effects of the aqueous extract from
potassium channels.
Thompson Learning Inc, United of States.
32
Rachmi, E., Wardhana, A. W., Ismail, S., Kosala K. 2010a. Uji perbandingan aktivitas vasodilatasi ekstrak etanol kulit batang Alstonia scholaris dan iwahigensis yang banyak di Kaltim secara in vitro. Penelitian pendahuluan (tidak dipublikasikan). Rachmi, E., Wardhana, A. W., Ismail, S., Kosala, K. 2010. Aktivitas vasodilatasi ekstrak etanol kulit batang Alstonia iwahigensis pada organ terpisah aorta tikus. Penelitian Pendahuluan
(tidak dipublikasikan). Rimando, A.M., Olofsdotter, M., Dayan, F.E., and Duke, S.O. 2001. Searching for rice allelochemicals: an example of bioassay-guided isolation. Agronomy J, 93 : 1 6-20. Salim, A. A., Garson, M. J., Craik, D. J. 2004. New indole alkaloids from the bark of Alstonia scholaris. J Nat. Prod., 67(9):1591-4. d Seidel V. Initial and Bulk reaction. In Natural products isolation 2n . SD Sarker . Latif Z, Gray AI. 2006: 27 - 46. Humana Press. Totowa, New Jersey. Tan SJ, Choo YM, Thomas NF, Robinson WT, Komiyama K, Kam TS. Unusual indole alkaloid pyrrole, -pyrone, and -carbamic acid adducts from Alstonia angustifolia. Tetrahedron. 2010; 66 (39): 7799-7806 Tan SJ, Low YY, Choo YM, Abdullah Z, Etoh T, Hayashi M, Komiyama K, Kam TS. Strychnan and Secoangustilobine A Type Alkaloids from Alstonia spatulata. Revision of the C-20 Configuration ofScholaricine. J Nat. Prod., 2010; 73 ( 1 1 ) : 1891-1 897 US Census Bureau. 2010. The United States Census Bureau, World Population by Age and Sex. Di situs internet: http://www.census.gov/ipc/www/idb/worldpopinfo.php. Last Modified: June 28, 2010.
Vercruysse, L., Morel N., Camp, J. V., Szust, J., and Smagghe, G. 2008. Antihypertensive mechanisme ofthe dipeptide Val-Tyr in rat aorta. Peptides, 29:261-7. d Wagner H, Bladt S, Rickl V. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas 2n ed. 2001 Springer-Verlag. Berlin Heidelberg Whatson, D.G. 2005. Pharmaceutical analysis, second edition, Elsevier Limited, Oxford, United Kongdom. Diterjemahkan oleh WR Syarief, tahun 2007 dengan judul: Analisis farmasi: buku ajar untuk mahasiswa farmasi dan praktisi kimia farmasi, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. World Health Organization (WHO) 2002. The Word Health Report 2002: Risk to Health 2002. Genewa, World Health Organization. Yingsukpisarn, S. 2005. Angiotensin converting enzym inhbition activity and antihypertensive
effect of Thai medicinal plant. A thesis submitted for the degree of master of science at faculty ofgaduate study at Mahidol University (unpublished) .
•
33
LAMPIRAN
1:
UJI ANOVA EKSTRAK KULIT BATANG ALSTO NIA IWAHIGENSIS
One Way Analysis of Variance Data source:
Sunday, October 23, 2011, 8:13:42 AM
Konsentrasi Ekstrak 40 ug/ml
Normality Test (Shapiro-Wilk)
Failed
(P < 0.050)
Test execution ended by user request, ANOVA on Ranks begun Kruskai-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks Data source:
Data 1 in AORTA EKSTRAK
Grou p
N
K 40 ug/ml HKS 40 ug/ml CH2CI2 40 ug/ml EtOH 40 ug/ml
3 3 3 3
H
=
Sunday, October 23, 2011, 8:13:42 AM
Missing
Median
0 0 0 0
3.000 with 3 degrees of freedom. (P
0.000 0.000 0.000 0.000 =
25%
75%
-1.987 0.000 0.000 0.000
0.000 0.000 0.000 0.000
0.392)
The differences in the median values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P 0.392) =
•
34
One Way Analysis of Variance
Sunday, October 23, 2011,
Konsentrasi Ekstrak 80 ug/mL Normality Test (Shapiro-Wilk) Passed (P
8:14:30 AM
Data source:
Eq ual Variance Test:
Passed (P
=
0.098)
=
0.508}
Group Name
N
Missing
Mean
Std Dev
SEM
K 80 ug/mL HKS 80 ug/mL CH2CI2 80 ug/mL EtOH 80 ug/mL
3
0
-1.104
1.912
1.104
3
0
0.000
0.000
0.000
3
0
-5.989
1.666
0.962
3
0
-4.517
2.799
1.616
Source of Variation
Between Groups Residual Total
ss
MS
F
p
71.368
23.789
6.671
0.014
8
28.530
3.566
11
99.898
OF
3
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected there is a statistically significant difference (P 0.014).
by
chance;
=
Power of performed test with alpha = 0.050: 0.780
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): Comparisons for factor: Comparison
HKS 80 ug/mL vs. CH2CI2 80 ug HKS 80 ug/ml vs. EtOH 80 ug/ml HKS 80 ug/ml vs. K SO ug/ml K 80 ug/ml vs. CH2CI2 80 ug/mL K 80 ug/ml vs. EtOH 80 ug/ml EtOH 80 ug/m vs. CH2CI2 80 ug
p
Diff of Means
p
5.989
4
q 5.493
0.020
4.517
4
4.143
0.074
1.104
4
1.012
0.888
4.885
4
4.480
0.053
3.413
4
3.130
0.199
1.472
4
1.350
0.778
P
Yes No Do Not Test No Do Not Test Do Not Test
•
35
One Way Analysis of Variance Data source:
Sunday, October 23, 2011, 8:15:30 AM
Konsentrasi Ekstrak 160 ug/mL
Normality Test (Shapiro-Wilk)
Passed
(P
=
0.624)
Equal Variance Test:
Passed {P
=
0.174)
Group Name
N
K 160 ug/mL H KS 160 ug/mL CH2CI2 160 ug/mL EtOH 160 ug/mL
3 3 3 3
Missing
0 0 0 0
Mean
Std Dev
SEM
-0.221 -0.796 -12.213 -9.129
0.382 0.978 4.130 2.199
0.221 0.564 2.385 1.270
Source of Variation
OF
ss
Between Groups Residual Total
3 8 11
324.628 45.998 370.626
MS
F
p
108.209 5.750
18.820
<0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P <0.001). =
Power of performed test with alpha
=
0.050: 0.999
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): Comparisons for factor: Com pa riso n . K 160 ug/ml vs. CH 2CI2 160 u K 160 ug/ml vs. EtOH 160 ug/ K 160 ug/ml vs. HKS 160 ug/mL HKS 160 ug/m vs. CH2CI2 160 u H KS 160 ug/m vs. EtOH 160 ug/ EtOH 160 ug/ vs. CH2CI2 160 u
Diff of Means
11.992 8.909 0.575 11.418 8.334 3.084
p
4 4 4 4 4 4
q
p
8.663 6.435 0.415 8.247 6.020 2.228
0.001 0.008 0.991 0.002 0.012 0.442
P
Yes Yes No Yes Yes No
36
One Way Analysis of Variance Data source:
Sunday, October 23, 2011, 9:06:50 AM
Konsentrasi Ekstrak 320 ug/mL
Normality Test (Shapiro-Wilk)
Passed (P
Equal Variance Test:
Passed (P = 0.1.79)
Group Name
N
K 320 ug/mL HKS 320 ug/ml CH2CI2 320 ug/mL EtOH 320 ug/mL
3 3 3 3
Missing
0 0 0 0
=
0.1L01)
Mean
Std Dev
SEM
1.283 1.456 8.012 2.661
0.741 0.841 4.626 1.536
0.741 0.290 -19.315 -13.915
Source of Variation
OF
ss
Between Groups Residual Total
3 8 11
924.390 150.080 1074.470
MS
308.130 18.760
F
p
16.425
<0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.997 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (T u key Test): Comparisons for factor: Comparison
K 320 ug/mL vs. CH2'CI2 320 u K 320 ug/mL vs. EtOH 320 ug/mL K 320 ug/mL vs. HKS 320 ug/mL HKS 320 ug/m vs. CH2CI2 320 u HKS 320 ug/m vs. EtOH 320 ug/ EtOH 320 ug/ vs. CH2CI2 320 u
Diff of Means
20.056 14.656 0.451 19.605 14.205 5.400
p
4 4 4 4 4 4
q
p
8.020 5.861 0.180 7.840 5.680 2.159
0.002 0.014 0.999 0.003 0.016 0.466
P
•
37
One Way Analysis of Variance Data source:
Sunday, October 23,
2011, 8:16:26 AM
Konsentrasi Ekstra k 640 ug/ml
Normality Test ( Shaplro Wi lk)
Passed (P
=
0.262)
Equal Variance Test:
Passed (P
=
0.668)
-
Group Name
N
K 640 ug/ml HKS 640 ug/ml CH2CI2 640 ug/ml EtOH 640 ug/ml
3 3 3 3
Source of Variation
Between Groups Residual Total
M i ssing
Mean 1.923 1.542 -26.265 -23.218
0 0 0 0 OF
ss
3 8 11
2116.721 182.232 2298.953
Std Dev
SEM
2.282 2.388 7.049 5.525
1.317 1.379 4.070 3.190
MS
705.574 22.779
F
p
30.975
<0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha
=
0.050: 1.000
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): Comparisons for factor: Comparison
K 640 ug/ml vs.
CH2CI2 640 u K 640 ug/ml vs. EtOH 640 ug/ml K 640 ug/ml vs. HKS 640 ug/ml HKS 640 ug/m vs. CH2CI2 640 u HKS 640 ug/m vs. EtOH 640 ug/ EtOH 640 ug/ vs. CH2CI2 640 u
Diff of Means
28.188 25.141 0.381 27.807 24.759 3.048
p
4 4 4 4 4 4
q
p
10.230 9.124 0.138 10.091 8.985 1.106
<0.001 0.001 1.000 <0.001 0.001 0.861
P
Yes Yes No Yes Yes No
•
38
I!..AMPIRAN 2: UJ I ANOVA FRAKSI KULJT BATANG ALSTONIA IWAHIGENSIS One Way Analysis of Variance Data source:
Sunday, October 23, 2011, 8:18:01 AM
Fraksi 40 ug/ml
Normality Test (Shapiro-Wilk)
Failed
(P < 0.050)
Test execution ended by user request, ANOVA on Ranks begun Kruskai-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks Data source:
Data 1 in AORTA EKSTRAK
Group
N
ug/ml CH2CI2 40 ug/ml F 1 40 ug/ml F 11 40 ug/ml F 111 40 ug/ml F IV 40 ug/ml Ver40 ug/ml
3 3 6 6 11 6 6
K 40
H
=
Sunday, October 23, 2011, 8:18:01 AM
Missing
0 0 0 0 0 0 0
Median
25%
0.000 0.000 0.230 -0.522 -5.093 -1.410 -19.329
75%
-1.987 0.000 0.000 -2.927 -6.979 -2.705 -22.384
0.000 0.000 2.333 0.168 -3.846 -0.945 -13.278
34.620 with 6 degrees of freedom. (P = <0.001)
The differences in the median values among the treatment groups are greater than would be expected by dlance; there is a statistically significant difference (P <0.001) =
To isolate the group or groups that differ from the others use a multiple comparison procedure.
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Dunn's Method) : Comparison
F I 40 ug/ml vs Ver 40 ug/ml F I 40 ug/ml vs F Ill 40 ug/ml F I 40 ug/ml vs F IV 40 ug/ml F I 40 ug/ml vs F II 40 ug/ml F I 40 ug/ml vs K 40 ug/ml F I 40 ug/ml vs CH2CI2 40 ug/ CH2CI2 40 ug/ vs Ver 40 ug/ml CH2CI2 40 ug/ vs F 111 40 ug/m CH2CI2 40 ug/ vs F IV 40 ug/ml CH2CI2 40 ug/ vs F II 40 ug/ml CH2CI2 40 ug/ml vs K 40 ug/ml K 40 ug/ml vs Ver 40 ug/ml K 40 ug/ml vs F Ill 40 ug/ml K 40 ug/ml vs F IV 40 ug/ml K 40 ug/ml vs F II 40 ug/ml F II 40 ug/ml vs Ver 40 ug/ml F II 40 ug/ml vs F Ill 40 ug/m F II 40 ug/ml vs F IV 40 ug/ml
Diff of Ranks
33.167 24.379 14.500 9.750 7.833 4.333 28.833 20.045 10.167 5.417 3.500 25.333 16.545 6.667 1.917 23.417 14.629 4.750
Q
4.796 4.010 2.097 1.410 0.925 0.512 3.404 2.569 1.200 0.639 0.358 2.991 2.121 0.787 0.226 3.386 2.406 0.687
P
Yes Yes No Do Not Test Do Not Test Do Not Test Yes No Do Not Test Do Not Test Do Not Test No Do Not Test Do Not Test Do Not Test Do Not Test Do Not Test Do Not Test 39
F IV 40 ug/ml vs Ver 40 ug/mL F IV 40 ug/mL vs F Ill 40 ug/m F 111 40 ug/ml vs Ver 40 ug/ml One Way Analysis of Variance
18.667 9.879 8.788
2.699 1.625 1.445
Do Not Test Do Not Test Do Not Test Sunday, October 23, 2011, 8:19:16 AM
Data source: Fraksi 80 ug/ml Normality Test (Shapiro-Wilk)
Passed (P
Equal Variance Test:
Passed (P
Group Name K 80 ug/ml CH2CI2 80 ug/ml F I 80 ug/ml F II 80 ug/ml F 111 80 ug/ml F IV 80 ug/ml Ver 80 ug/ml
Missing 0 0 0 0 0 0 0
Source of Variation Between Groups Residual Total
N 3 3 6 6 11 6 6
=
=
0.306)
0.061)
Mean -1.104 -5.989 1.298 -5.611 -17.567 -5.368 -55.931
OF
ss
6 34 40
13625.597 366.618 13992.214
Std Dev 1.912 1.666 0.977 2.300 3.606 1.483 6.025 MS 2270.933 10.783
SEM 1.104 0.962 0.399 0.939 1.087 0.605 2.460 F
p
210.606
<0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P <0.001). =
Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): Comparisons for factor: Comparison F I 80 ug/ml vs. Ver 80 ug/ml F I 80 ug/ml vs. F Ill 80 ug/ F I 80 ug/ml vs. CH2CI2 80 ug F I 80 ug/ml vs. F II 80 ug/ml F I 80 ug/ml vs. F IV 80 ug/ml F 1 80 ug/ml vs. K 80 ug/ml K 80 ug/ml vs. Ver 80 ug/ml K 80 ug/ml vs. F Ill 80 ug/ml K 80 ug/ml vs. CH2CI2 80 ug/ml K 80 ug/ml vs. F II 80 ug/ml K 80 ug/ml vs. F IV 80 ug/ml F IV 80 ug/ml vs. Ver 80 ug/ml F IV 80 ug/m vs. F Ill 80 ug/ F IV 80 ug/m vs. CH2CI2 80 ug F IV 80 ug/m vs. F II 80 ug/m F II 80 ug/ml vs. Ver 80 ug/ml F II 80 ug/m vs. F Ill 80 ug/ F II 80 ug/m vs. CH2CI2 80 ug
Diff of Means 57.229 18.865 7.287 6.909 6.666 2.402 54.827 16.463 4.885 4.508 4.265 50.563 12.199 0.620 0.243 50.320 11.956 0.377
p
7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
q 42.690 16.009 4.438 5.154 4.973 1.463 33.393 10.886 2.577 2.745 2.597 37.717 10.352 0.378 0.181 37.536 10.145 0.230
p
<0.001 <0.001 0.049 0.014 0.020 0.942 <0.001 <0.001 0.543 0.469 0.534 <0.001 <0.001 1.000 1.000 <0.001 <0.001 1.000
P
40
CH2CI2 80 ug vs. Ver 80 ug/ml CH2CI2 80 ug vs. F Ill 80 ug/ F 111 80 ug/ vs. Ver 80 ug/ml One Way Analysis of Variance
7 7 7
49.942 11.578 38.364
30.418 <0.001 Yes <0.001 7.656 Yes 32.555 <0.001 Yes Sunday, October 23, 2011, 8:20:56 AM
Data source: Fraksi 160 ug/ml Normality Test (Shapiro-Wilk)
Passed (P
Equal Variance Test: Group
Name 160 ug/ml CH2CI2 160 ug/ml F 1 160 ug/ml F II 160 ug/ml F 111 160 ug/ml F IV 160 ug/ml Ver 160 ug/ml K
Passed (P
N 3 3 6 6 11 6 6
Source of Va riation Between Groups Residual Total
M issing 0 0 0 0 0 0 0 OF 6 34 40
=
=
0.076)
0.163) Mean -0.221 -12.213 1.249 -13.257 -31.874 -9.678 -69.250
ss 20766.444 441.203 21207.648
Std Dev 0.382 4.130 1.526 3.995 4.609 1.561 4.260 MS 3461.074 12.977
SEM 0.221 2.385 0.623 1.631 1.390 0.637 1.739 F
p
266.717
<0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P <0.001). =
Power of performed test with alpha
=
0.050: 1.000
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): Comparisons for factor:
Compa rison
FI FI FI FI FI FI
160 ug/m vs. Ver 160 ug/m 160 ug/m vs. F 111 160 ug 160 ug/m vs. F II 160 ug/ 160 ug/m vs. CH2CI2 160 u 160 ug/m vs. F IV 160 ug/ 160 ug/ml vs. K 160 ug/ml K 160 ug/ml vs. Ver 160 ug/ml K 160 ug/ml vs. F 111 160 ug K 160 ug/ml vs. F II 160 ug/ K 160 ug/ml vs. CH2CI2 160 u K 160 ug/ml vs. F IV 160 ug/ F IV 160 ug/ vs. Ver 160 ug/m F I V 160 ug/ vs. F Ill 160 ug F IV 160 ug/ vs. F II 160 ug/ F IV 160 ug/ vs. CH2CI2 160 u CH2CI2 160 u vs. Ver 160 ug/m CH2CI2 160 u vs. F Ill 160 ug CH2CI2 160 u vs. F 11 160 ug/
Diff of Means 70.499 33.123 14.506 13.462 10.927 1.470 69.029 31.653 13.036 11.992 9.458 59.571 22.196 3.579 2.535 57.036 19.661 1.044
p 7 7 7 7
7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
q
p
47.938 25.622 9.864 7.474 7.430 0.816 38.325 19.079 7.238 5.766 5.251 40.507 17.169 2.433 1.407 31.667 11.850 0.580
<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.997 <0.001 <0.001 <0.001 0.004 0.012 <0.001 <0.001 0.608 0.952 <0.001 <0.001 1.000
P
41
F II 160 ug/ vs. Ver 160 ug/m F 11 160 ug/ vs. F 111 160 ug F Ill 160 ug vs. Ver 160 ug/m One Way Analysis of Variance
7 7 7
55.993 18.617 37.375
38.074 <0.001 Yes 14.401 <0.001 Yes 28.911 <0.001 Yes Sunday, October 23, 2011, 8:24:45 AM
Data source: Fraksi 160 ug/ml Normality Test (Shapiro-Wllk)
Passed (P
Equal Variance Test:
Failed
Group Name 320 ug/ml CH2CI2 320 ug/ml F I 320 ug/ml F I I 320 ug/ml F Ill 320 ug/ml F IV 320 ug/ml Ver 320 ug/ml K
Source of Variation Between Groups Residual Tota l
N 3 3 6 6 11 6 6
Missing 0 0 0 0 0 0 0
=
0.300)
{P < 0.050)
Mean 0.741 -19.315 -0.0133 -22.863 -45.006 -13.665 -77.881
OF
ss
6 34 40
26710.715 611.686 27322.401
Std Dev 1.283 8.012 0.945 3.476 4.738 4.436 4.296 MS 4451.786 17.991
SEM 0.741 4.626 0.386 1.419 1.429 1.811 1.754 F
p
247.448
<0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P <0.001). =
Power of performed test with alpha
=
0.050: 1.000
All Pairwise Multiple Comparison Procedures {Tu key Test): Comparisons for factor: Comparison K 320 ug/ml vs. Ver 320 ug/ml K 320 ug/mL vs. F I ll 320 ug K 320 ug/ml vs. F II 320 ug/ml K 320 ug/ml vs. CH2CI2 320 u K 320 ug/ml vs. F IV 320 ug/ml K 320 ug/ml vs. F I 320 ug/ml F I 320 ug/m vs. Ver 320 ug/m F I 320 ug/m vs. F Ill 320 ug F I 320 ug/m vs. F II 320 ug/ F I 320 ug/m vs. CH2CI2 320 u F I 320 ug/m vs. F IV 320 ug/ F I V 320 ug/ vs. Ver 320 ug/m F I V 320 ug/ vs. F Ill 320 ug F IV 320 ug/ vs. F II 320 ug/ F IV 320 ug/ vs. CH2CI2 320 u CH2CI2 320 u vs. Ver 320 ug/m CH2CI2 320 u vs. F Ill 320 ug CH2CI2 320 u vs. F II 320 ug/
Diff of Means 78.622 45.747 23.604 20.056 14.406 0.754 77.868 44.993 22.850 19.302 13.652 64.216 31.341 9.198 5.650 58.566 25.691 3.548
p 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
q 37.072 23.418
11.130 8.190 6.793 0.356 44.969 29.559 13.196 9.101 7.884 37.085 20.590 5.312 2.664 27.615 13.151 1.673
p <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 1.000 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.011 0.504 <0.001 <0.001 0.896
P
42
F I I 320 ug/ vs. Ver 320 ug/m F 11 320 ug/vs. F 111 320 ug F I l l 320 ug vs. Ver 320 ug/m One Way Analysis of Variance
55.018 22.143 32.875
7 7 7
<0.001 31.773 <0.001 14.547 <0.001 21.597 Sunday, October 23,
Yes Yes Yes 2011, 8:26:03 AM
Data source: Fraksi 640 ug/ml Normality Test (Shapiro-Wilk)
Passed (P
Equal Variance Test:
Failed
Group Name K 640 ug/ml CH2CI2 640 ug/ml F I 640 ug/ml F II 640 ug/ml F 111 640 ug/ml F IV 640 ug/ml Ver 640 ug/ml Source of Variation Between Groups Residual Total
N 3 3 6 6 11 6 6
Missing 0 0 0 0 0 0 0 OF 6 34 40
=
0.205)
(P < 0.050)
Mean 1.923 -26.265 -1.164 -31.067 -57.487 -17.091 -84.357
ss 33256.103 580.183 33836.286
Std Dev 2.282 7.049 2.835 2.315 4.527 5.733 2.614 MS 5542.684 17.064
SEM 1.317 4.070 1.157 0.945 1.365 2.341 1.067 F 324.813
p <0.001
The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P <0.001). =
Power of performed test with alpha .
=
0.050: 1.000
All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): Comparisons for factor: Comparison K 640 ug/ml vs. Ver 640 ug/ml K 640 ug/ml vs. F Ill 640 ug K 640 ug/mL vs. F II 640 ug/ml K 640 ug/ml vs. CH2CI2 640 u K 640 ug/ml vs. F IV 640 ug/ml K 640 ug/ml vs. F I 640 ug/ml F I 640 ug/m vs. Ver 640 ug/m F I 640 ug/m vs. F Ill 640 ug F I 640 ug/m vs. F II 640 ug/ F I 640 ug/m vs. CH2CI2 640 u F I 640 ug/m vs. F IV 640 ug/ F IV 640 ug/ vs. Ver 640 ug/m F IV 640 ug/ vs. F Ill 640 ug F IV 640 ug/ vs. F II 640 ug/ F IV 640 ug/ vs. CH2CI2 640 u CH2CI2 640 u vs. Ver 640 ug/m CH2CI2 640 u vs. F Ill 640 ug CH2CI2 640 u vs. F II 640 ug/ F II 640 ug/ vs. Ver 640 ug/m
Diff of Means 86.280 59.410 32.990 28.188 19.014 3.087 83.193 56.322 29.903 25.101 15.927 67.266 40.395 13.976 9.174 58.092 31.221 4.802 53.290
p 7 7
q 41.773 31.226
p <0.001 <0.001
7
15.972
<0.001
7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7
11.819 9.206 1.495 49.331 37.993 17.731 12.153 9.444 39.887 27.249 8.287 4.442 28.126 16.410 2.325 31.600
<0.001 <0.001 0.936 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.049 <0.001 <0.001 0.656 <0.001
P
43
F II 640 ug/ vs. F Ill 640 ug F Ill 640 ug vs. Ver 640 ug/m
26.420 26.871
7 7
17.822 18.126
<0.001 <0.001
Yes Yes
44
Lampiran 3: SK Penelitian . , ,..,. ....(..,
KEMENTERIAN KESEHATAN
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jalan Percetakan Negara No. 29 Jakarta I 0560 Kotak Pos 1226 Telepon: (021) 4261088 Faksimile: (021) 4243933 E-mail:
[email protected], Website: http://www.litbang.depkes.go.id
1
KEPUTUSAN
KEPALA BADAN PENELITlAN DAN PENGEMBANGAN l<ESEHATAN
�9:; /20 1 1
NOM OR : HK.03.05/ l / T8NTANG
PENETAPAN TIM PELAKSANA RISE:T PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI t<E:DOKTERAN TAHUN 20 1 1 KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN , Mcnimbang
:
a. bahwa untul< mcningkatl
dalam
poten si
rangka
pencliti
Pcmbinaan
pembinaan
muda
llmu
perlu
dan
menggali
dilakukan
Pcngctahuan
dan
Riset
Teknologi
Kedoktcran;
c.
bahwa
berdasarkan
dimaksud
pada
Keputusan
pertimbangan a
huruf
Kcpala
dan
b
Badan
sebagaimana
perlu
ditetapkan
Penelitian
dan
Pengetahuan
dan
Pengembangan Kcsehatan tcntang Pcmbentukan Tim
Pelaksana
Risct Pem binaan
Ilmu
Teknologi Kedokteran Tahun 20 1 1 ; Mengingat
·
I . Undang-Undang Sistem
Nomor
Nasional
Penerapan (Lembaran Nomor 84,
18
tahun
Pcnclitian ,
llmu
Pengctahuan
Negara
Republik
Tambahan
2002
tentang
Pengembangan dan
Indonesia
Lcmbaran
dan
Teknologi tahun
Negara
2002
Republik
Indonesia Nomor 4219); 2. Undang-Undang Kesehatan
Nomor
(Lembaran
36
Ncgara
tahun Tahun
2009
tentang
2009
Nomor
144, Tambahan Lembaran Ncgara Nomor 5063); 3. Peratura n Pemcrintah Nomor 39 Tahun I 995 ten tang Penclitian dan Pc:ngcmbangan Kcsehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia tahun Tambahan
Lcmbaran
Ncgara
1995
Rcpublik
Nomor 67, Indonesia
Nomor 3609);
45
KEMENTERIAN KESEHATAN BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jalan Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10560 Kotak Pos 1226 Telepon: (021) 4261088 Faksimile: (021) 4243933 E-mail: [email protected], Website: ht1p:J/www.litbang.depkes.go.id
4 . Keput-usan
Mcnteri
Penyclenggaraan
Nomor
Kesehatan
79 1 / Menkes /SK/VII/ 1999
tentang
Penelitian
dan
Koordinasi Pengembangan
Keschatan; 5. Peraturan
Menteri
Kesehatan
1575/ Mcnkcs/Per/XI/2005
16
tanggal
Nomor Nopember
2005 tentang Organi.sasi dan lata Kerja Departemen Kesehatan
RI
Peraturan
sebagaimana Menteri
telah
diubah
Kesehatan
dengan
Nomor
1 1 44/ Menkcs/Per/VIII/20 1 0 tentang Organi.sasi dan Tata Kerja Kemcnterian Kesehatan RI; MEMUTUSKAN : Menetapkan Kesatu
PENETAPAN TIM PELAKSANA RISE! PEMBINAAN ILMU DAN
PENGETAHUAN
TEKNOLOG I
KEDOKTERAN
TAHUN 20 1 1 ; Kedua
Tim Pelaksana
Riset Pembinaan Jlmu Pengetahuan dan
Teknologi Kedokteran Risbin
Tahun 20 1 1 (selanjutnya disebut
lptekdok 20 I I ) sebagaimana tercantum dalam
lampiran keputusan ini bertugas;
1 . Melaksanakan
penelitian sesuai kaidah ilmiah dan
etika dengan waktu yang telah ditetapkan; 2 . Mempertanggungjawabkan
penggunaan
anggaran
sesuai pcraluran yang bcrlaku; 3. Membuat dan mcnyampaikan laporan kcmajuan dan
'-·
laporan akhir penelitian; 4 . Mcmbuat
ringkasart
penelitian
sebagai
cksekutif
bahan
berdasarkan masukan
hasil
kepada
pengambilan kcputusan dan pengelola program yang terkait dengan hasil penelitian; Ketiga
Tim
Pelaksana
Risbin
Iptckdok
201 1
sebagaimana
dimaksud pada dictum kedua diberikan honor sesuai dengan ketentuan yang berlaku; Keempat
Dalam mclaksanakan tugasnya, Tim Pelaksana Risbin Iptekdok 20 1 1 berpedoman pada peraturan perundang undangan yang berlaku;
46
KEMENTERIAN KESEHATAN BADAN PENELfTIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN Jalan Percetakan Negara No. 29 Jakarta 10560 Kotak Pos 1226 Telcpon: (02 1 ) 4261088 Faksimilc: (02 1 ) 4243933
E-mail: [email protected], Websire: http://www.litbang.dcpkes.go.id
Kelima
Dalam mclaksanakan tugasnya, Tim Pelaksana fptekdok 20 1 1
Risbin
dapal berkonsultasi dan berkoordinasi
dengan Tim Panel Pakar dan Tim Pengelola Administrasi Risbin lptekdok; Keenam
Biaya kcgialan Risbin lptckdok 20 1 1 dibebankan pada DrPA SekrctariaL Badan Litbangkes Nomor : 0682/0241 1 . 1 .0 1 /00/20 I I ;
Ketujuh
Dengan
bcrlakunya Kcputusan ini, maka Keputusan
Kepala Badan Pcnclitian dan Pcngembangan Kesehatan Nomor : HK.03.05/ l / 1092/2010 tanggal 17 Maret 2010 tentang Pcnctapan Tim Pelaksana Riset Pembinaan llmu
"··
Pengetahuan
dan
Teknologi
Kedokteran
Tahun
2010
dinyatakan Lidak bcrlaku lagi; Kedelapan
Keputusan
ini
Desember 20 I
I
berlaku ,
sejak
ditetapkan
sampai
31
dengan ketentuan apabila dikemudian
hari ternyala Lerdapat kckeliruan dalam keputusan ini dapal dilakukan perubahan dan perbaikan sebagaimana mcstinya. Ditetapkan di Jakarta
�
Pada tanggal
\9
�
Januari 20 1 1
KEPALA BADAN PENEIJITIAN DAN PENG EMBANG
'
Dc dc
SEHATAN
�
�
So
NIP. 195402 1 4 1 98 0 1 2 1 0 0 1
Tembusan:
1. Menteri Kesehalan Republik Indonesia;
2. Sekretaris Jcndcral I<emcntcrian Keschatan; 3. lnspektur Jenderal Kementcrian Kcschatan; 4. Kcpala Kantor Pclayanan Perbendaharaan Negara Jakarta V; 5. Pejabat Pembuat Komitmen Risbin Iptekdok; 6. Bendahara Pengeluaran Badan Litbang Kesehatan.
47
•
LAMPIRAN KEPUTUSAN KEPALA BAOAN LITBANG KESEHATAN
19 JANUARI 2011
NOMOR : HK.OJ.OS/1/ �93. /2011 TANGGAL:
Agus YUWOIIO. dr, SpPO
39
Bambang Setiawan, S.Kod
SanFebniN
Efel< •·ma11gostin sebaQ"' llrl�apoptosis Endothelial Progen!Oe me!alui Patlw
1<1'1.76,.000
FK UNIVERSITAS MULAWARMAN, BANJARMASIN �0
Eva Rachrru dr. M.Kes, M,Pd.KM
Ahmad WtSnu Wardtlana. dr
4\
lka Fikriah, dr•. M.Kes
Eva Matliaoa. S.S i. M.S1
Nul\lf Hasanah. dr., M.Kes
YL!niati. dr. M Kes
42
3
Jvnaidi Sidik Sjarif Ismail, dr , M.Kes
Junaidi Sldilt
J:maldiSidi.X
lsoras� dart Me.k.anisme A.ks1Va1oc:hlator dari Kulit
Batang Alstonia iwa.h.gens11 tecara 1n vitro lsolast Senyawa Aktffoarl Macaranga Tanarius seb;sal Antiol<sidan dan Hepatopreventif t<&Jtan Ek$ttatsi Satang, OtacontOit'leCon dao dtsertat PengUJ1an P!eklln:ik Antlbt�ten. Antloksican dan
Sistem lrr.un seca�a .n VitrO dan m vivo FK UNIVERSITAS AL KHAIRAAT, PALU 43
Jull� S�ri, d<
Wijoyo �lim. dr
Mayma Abil
Znun Dumo. S l
Pe11$arufl Pemberion Pn>biolik pada Pen
ln!el<si Sa..... n PemiO�san AIM (ISPA) di PaJu
1<4.435.000 143.615 000
l34.980000
ll9.il4.000
FK UNIVERSITAS UOAYANA, OENPASAR HlJbungan Potim01fismo Gene Matrix
44
Ni Wayan Tlanlng,S,Si, M•os
Bagus Arl Pradnyana 0... S dr
Desak Md W1h.md.arti dr M Kes
PUSUTBANG BIOMEOIS DAN FARMASI. JAKARTA 45
� 00
Sunamo, S Kep. M.Si.Med
Kambang Sariadjl S.S.
Fltriana. d<
Yudi Harloyo, S.Kom
Metal09rotemase-.9{MMP·9) dangan RernodeiJng
Ventriket Kin yo�ng Oi\.lkur tfengen Stratn dan Slrai'l Rate Erc-okardiografi sMta _N1l&1 Prognostiknya pada l'enderila lnlad< MioOanl AI
124 992.000
106.700.000
lampiran
4: Dokumen
Perjanjian Kerjasama
tnL di'bw:lt bcrduirrluln rdlr,..,,,. )'"1'1ll .-rupobn ba.g;ian ya.rll tldak inp.a:ah.k.u1 dui pc�� lni� ,.hu 1 a_ Und.atllt"Oruf!ll1i �' \1 Tehun �OCY.I k"n� s� N'.-�Urlllll. IPI:rw:ICU.s, �\MwJ•n dan P.nc:rapan llmu P.npuhuan d.an T�tc:nokl!Ei (L.et.ltlN.Nn rc� 'H"'''Ube� 1� ul\un � Komor &4• T&mboh.m r.-bal e� • lll p uDi£11 bWkln'* - •1191: b. Uroiou>ol·IJndon& "'-"" � b l> wo � ......,. � ..... l'ondidiQm ,......, .. u..._ .......,. - 361'"""" 1009 - �C
111 Pr.rjAnjNa
....,A&I&M 101&1....... ........
aAIWI rur.aLI1'1AJr tMJI NlfCIIUO.UO.U K:M&:H.U.d IIGIOW'ni1UAJII oaaiATAII aJ .,....
J"AJWI.TM ��Aa iiOU.W..t.JUIAJI ........ ... . I:IU'I � D.11V f'DOt'tABV..ut .ftiOIOLOCI � ·--
P.\cS.il. l\4lt1 1fil !Utrd4TMM't �\l.h 8UIM MIU'"C. Tolhua Cui. Rbl � � YMII bn1�.111npn th .__..h inl: t. DT, *• T . ... : rUM .. � s-.li.O �1\CIJli.IM.\ dliltt. l"'l!"nC�tnl'*'\lfili\ 11(��(3.1\ �ll':«
:J.. IIk...Jia. ......_ .,., : IM ....... ,.�..,.,...,. � MUJd OodtMl Fillrultu � V � ..,.. •"" u"""'"" " W\U�n � r WtrU*')I) rdMatt 'lOit ..._ bialinl�� dan "tu RIIIIIM u"'""""• ..,�,. }'lttiC � ts.:nb.....,.
688/K17Jr:tr/30lS
w -- - -- d.an lloau � lla. I>OT.....
.. dM 4� � ...,... ....... 1902 � 21 &rpwc.IMT t962 � !5urat lta:ii'UtUIIll't. �n R'l N& f'.ii:t �� "Z3 ApliJ IQ6l.. �· � td�np �� l'lti.AS DDVA..
Homor 'C6112/0:U·I t.Ol/00/2011
(2l ""fotv "" "" """"'""" ....... _ _ _ _ __ _ ..,.._ ·- ._ -"""'""" -- ..... � ke..,..P'&If a..;,.,. ,.... .S. -.aKUA ikUI _.,.... ---·. - - fla" _ ... ,�� )'tltftl dlpnon'""""� d.ta.a Dktana nMt. -... � Mn» pene.a.,-l.o � pcmba.npnan � M•hat&n.
JIU(4I(: fCJMlVdan nKA1C JCa:IUA K�tya bdw.mil·liiiiMdildlu' fAIIA PDL\K,. ....... � W'''* � �i;ln �..,tlldl � f\Indlllli li dart 1'11tWfllbU� �.l..,tu� ..a.t1 Uli�u., li�• f.leref,fl �ICRt\lWI <11M llfiUIL\·!O',.....t. W!I.,...I I'Jorlo.'110
PA$Al. 2 AUUGUNGIIm' Ru..I.RJ i.�t.y,)._up p1)41\.1..1 H "' f puh pdlktoiil�n �11n paw.UM�. �- ;.a� ••i.;lu ,.,�,.�._"· tjll&.o f'IW• CJ�m�hrtOlflCI. h.dt dan ��'1�- t...oc.:.� b.l•a�·,.�. Ll(e'tr�,.. f\..:11:; ..� lo.Fb,�n m�u � . . I. Jiol'l:l\o;ln, knad;¥lr. "lm'Mk"',cWfl JWH)� prt'1dU..h..411
'HIJf: dQ·hf.m\�IUl fOIL. fllf'A !CNtll'hU\ol\ fbdwt �nd;ti. "Vl dNl �hllttf_..:t ., �h4�ll T\l_hur.; ,.lUt 1. t"lful.� .l �h.I'S\ifltm.n.a dlQIOJb\Jd C*!• :t'·.-1 (':') nc!tpu1• ,;,qp.V. pn'llt'.l'a_t;Qn�n \.llta dllit:lu.'\dL.'m dul..•n. J-ot.hl.-..-.•·•ltttl 'tt�t..n .,nr-a.nan r.eNI\ll:ak p.lpdt· ,.......,lt. �fUll.'"''"" d-t"' boll:• h..."• t...t� -.ru-. �tu,� bkb PIJIAK KI!D11A ...,.���·�'W"'l U.U:•uwn ,a�,.,lJ,or!.,ku.
�� 1\"'MI�Il
U'l"t"1U'tiUA\ th.b"t 1.mtJT!rt"J ltirl),f11L•I1 101 ridak �,._ntu1 rtlr'r�q-...IU•• �·r.htlf.)'ot.Mn k� PI'IJI" ia:in &rl::lm
t.('-�tlfi;\MI\
diprr"II<'J\lttd;;
���;u l�•.,..l�hli.ll �'1\.tl't Jonnl,.
IIJ �\_"f1._..."ju.�,, i�1ro11
J'l·n•h•·'� ••�•• llriil\1 1\''"l..teiJihu,)n
Willi
'rcr:l-..r.(lbgi �dDit:lc-roul
b.Jtito111. ptrbt.li�U1 �l'l�tf11.�� 111!ll·'l'�nl}wl1 �".t:••lltl�111o'IK fi'-�\llkll nwnu\:n !!t'rltt prn:-akit 'ldnk •tu..·"u�••t", 1Ci:k(1�i p,oo;�,C"htu..n IHIJCW••r·W"IIfl l;tioli.:ihlo:;�M Ulll\16., :.>.�!Ut19,.ki111UI k\'•,Whtt\IUl 1l•u. b.Jyi dMl
i21 l"'r(jlt..Jwl �ttei!IIXn )·UI�dihJi,n,li o\ll_•t. PIKA.K
����� lrbil lhl-u« d..1 :.nn tiell"k-.1 (.11-)tid
IUlUU& Ud..tl: d\f"''I'Ice""tn4!�n 'UiliUt.i t:ln',l()ti;J�, !M!l'\ji}\"'J\ f:tlf\Ufl\\11 tr41tlltlh k,i·�; lll.l�Cl
11!£111hUfothtlln�,Ut00 i l)
{1ilhn t"t'34:JUI Vlllill.l lltfi-4lRo, S."fu .rll\.OM '�ltll. WniiN'.m p::-).u1jlllt. Sr.J l.t.J)(
Ul'lm\1: d�Hio'\l.ul\tfl bhprt prntt'H.Ifwm PDIAK.IC.&IATV.
� ��� d.Jn •WU �o r : -f"VV u _... r . hill 1W:1ilt .1 . J W't�IUI \1111-...wud pt!dil Hl'"'' t�i t-w n"" 'h�Lil'l � tt::null• cm-,;:.n t'lld.l� lti •·Ocn ,-.."fk"!'"'�t ..Jt \l:"flumo. & �t _ n �u..t l ' -''" ' l� t 11 •k.b .. .rt,.n o��M.l�;:l\t'tilt.
l'l\nJ1� ft�.:nk'UJJ''�'' P1$Ait K)I:SATU,
p..>Ui.k'li.ltt:U:lll k•:Ki•U.IIIn \<�4'1H dllll·rol..otO •illleli ""� KttlATU kt""t:-tlt.flll PfRAK KI!DUA tkn�lln nnl'l�m ,.. l�•f."fllllll'ilt+. ��lah t•"1.t�rJUtlH� d.il/.l.fnl lo.�rJI"I>tnUI j)l'f'Wnlt.m 111.1 cklD mcn.lp-'II.UI'I b.'t(IAI\ \'Mil+t rldllk 1_..1-p/1ortl\�f•
121 Bl.t!..wll
l•l'� Hi.l),. jX"'I•th�j;flii.IJI t("it.i.)ftill �fl('lii.JtJr- �·bn,,t.um.J! a I dlrttllk�ud � .oyott IH �oebu;.u- Htl .'-'>'IM"' OC'A), t'f1_JU6 n•l\.1., ,kt.p.:.rt puluh .stmbthn u� m.; n ml.u,. otc'lrolpw11 p.:hll" t1�1ol1 r'l•tl"-1h) ��t. tnnu-5Uk Pl•.h. � P'�
t\LIII.l
p¢i"•i"h1'"'1"1
ln:n
ttAIAL a .IAN'OKA WAKTU IU Wl.o�11A�n �t:�U�I pl'tl•"il,l..ttl �b.\.:.."'ltn!Ul• dlok.�u � t �� 10 f""tHt'uhl hvl.n•
but dabm �..,,, ftll l.r�t� •�t"l\l'!�f\t !OCJ�k
t.oc"'
f"NN'"1ijip.,._.!'\ 1d.tL'i1F -....wul l)n;.,.)\J!tilll
rl\\p.t\ouo �n k'!'_...Loln l''"l" l'" l..tn lfl 1--'-"k..etr:gl; 4:1� "i:fi!U �
rdolh •1:,�phw1 ad�......,. tU!I.c:b-.:1 � a r-t lit. m::tkJl � cbtu11
rtl \. �llftal b: tr...ctl ,.�., ,AIAL
6
fAtA CAR,\ .at.AYAIIU..
P"AIAL4 II'&M'ItlAYAAN
\l.:u�
v � "L',I\In-.:m·� t..rt'mth.•lll du�•!'l• lunlWt1�!1 jl"'"fjAI\,'Iillfl 1n1 Jc,eflkdt� f)tbtllf
tcKliA..'TU nt..ctU(Jollk.i:'411 pt\JI.1�11I
&Tt Yro
d!p�-tkm.411�fl
10.1ttUU&K
f l l f't1lHdv.nm tlllmL .,Ji!;:h P'IHAK. KUA'TU kc(Mtb fttlAK Ka)tJA tfLl;tk.Wwf\ Pll'lo1 ul \1"'.-ilJtO� k\• tf'k1'1ntn1J fti'NT!l tu•\iiUIIi VARA P'lllAK ,·tutu� N.u... : Wni"YI.!I'!Ije.u1 Mubw.:att111'1n r Jn�o"Unt!lll N!U1�1t" �f:lkl'fl'll11(
l)"""
: l)l) lt\!,o1 ��h7 ; M'. ttNI U\'1"\W'IUi iUt.:
(JI Till<.� �'*'m pent..l.1.lr'Jtt th\lr:\ �t••"'luam 'IIC'ftt.tiJI rtr11�n «c·�•r-�lt.An )1H1tl berl..:lt.a.J d..n �1!':1.11� �\ltl�l)!-.uilltf Kf,lcoirt�'" u,.;tVn 1p!C"ttink Jd1 1 �11 J\ '1' \ oth .J1" ..1'1•1't'att -111;:'0-•t)tlf'lt:Hotl o1tm..oki!Ud. flNt1iJ J\o;,t (I' tld.:Lk bter41w un�..1k t••u,,,p _."'� .cbu b.th•n hoLu. t�oAk.u �"'"� aw:C..Sru� �llldftlli ll rN' • ; u it'".lr:rtl.A d&n.n..u Prjabiu Pc-opd.-.n o.sr.llf)�t..!D
49
11 �}odU04.D c\Jt''' foo(iC,:.� dim;,.Jt...,.Jd: p..tdia .,.... � J'dr,;.morl«. �)ediol b.lf•I'\C/J:'.M j!•t 1\'f>��f&K.";tt'l
d!ln•
jlt.neiL1ilU'J
h..:.�utl
kiUUA
ol•�•ull\uln
dt•'''-d\•IJidikc.U.�ud
meh
nN"li�Ut
)'!HAIC
. ....... .
DOADMJIIAIWOQ/ JA P .... lll l'n..._•:fto fl\'l1�..tum\ tlllr'.\t'lSI.\Itllft.t dJWJc-..uMk;m ul.t'h P•nit;..;ir P'.:j:.bltt J\. n."""UtLl1 u • 1 . tl mll...l J.tt;OJ \'AU� clhunjHk tJictt. PtHAK k.I;DUA 111 1'>1ml�o�/l'quf:tot lo\'11Wtriu..'l•t IJ.urluUr/.l�t..t
(llt'DLU< K!8.4TU . .......
' I "'l'l"'t'f�lffllm l.l;k-NI"' uktnr, rihS.TJHk t.J;�..,, "''"'1l pcln.k�tn""n fo<"'l'li'�lltlofl &:.ul PIKAK MBOVA r1rtl;o�m r;c,·,•u.l Hnuk't"PH' d.ltf .!',ftn..•py, JJ Mt. "ft�JX't\JIC'h
� u . .:� rftilm�n
lx:rk.;:a!t.m dctl1�,, �rlW1i(f:.lJt\ft�t"�'\."'lll 1(1!\lllng:n.tJ flnr1 rtlfAJ( MBDUA sd,1mlMt• 1�01������-\l�l •tl.:hlr l•�tl.:.:ln 'C!PCmh:�r N .!fH I, r.•h
\'.����
ll �"'ji::.m Mc!:rlor.o.k.l:. .: ,.. a -. . w . . li pc1d.n.£&."lll �I.Ul. pet\(".,,..,r, ICC'VIfd,J ptKAl( p: KI:DUA �IU4 n-ktn� f("oo� ·t1••t.JfU.: '"""UIII .Jc.nr;.,, w.U:..-1 )tu � IM.ihc!it�:O.t:nJ •>k'h PIHAK X.!.SATU fl.� KF.OUA a,
U.1k : MO!��ttlt\Ol pa"ltltl;o•.l•\11'1 ��'" ve1.,4..w.,.n "m k4'""'t.�a'1 �'i'IC'I•tta" 4rut P1RAX U'tl..llan \·nn,; tc:Wh d..:r.rdt�t\ Ch f1RAK KEDUA.
(111'-•n\,lt�nt IMput-.111 h�:tn� t'lnl..fl�ll ._ ... Wtl h .-.A l1al91\l Ku•v P'Dnduan . 1¥n)·tl-'W''�'\ 1'1\lf'ltlllwl a•r-ntt>)u.ll, 1\•nLI.u.m 11ro�t dltn l..t:�J'H?rnn '-klur n 1\:rto."l.,�•• tnuku merultt ;-'"-'� dtu·rbltk.o•••
tll PntAK KCOO'A •.!Jib Jfkn\buu' dtu� tllC'tt� t\\Ptlt."""-'' lflptiOI!n � .. PlJIAJI; IC:I&A'MI ... h tU\i 1ltd.u IIM.Ia. A(DIOIS 20111 pt"'k'kiM" ....,. -t.....-..,., .l r.i.,�P P1HAK k&DUA JU.f¢-t •'-"Q a·.tt•bli"1 4aD l':lt.•lltt.' ''-' hot" l..lpo_o"")lll ) 1\.·,.Joi.!...L.. lo"'llltr;ll�._ pcudltll\fl ""'��· PI� ki:IAT\1 ltttlll'l,a\1 '-odila tlil.l.Uft AC'Uttol• 2011) u-l)!u,yak ;t r.ti\&IUI), IJ) PJHAJC Kt:OtJA WHJih tm-tn�"'' C.lu n1rnya.:.'llk.oirt Wpt:omn �'khu· l>cnth1in..n k,lt..tclol ..,KAK k�T1J tccl.:lrnbcu tumbot.ny01 tniU-P,fi.U kl;.'(h..l�t bv:ht.n tAfol·niht:r .1011 !k!h.u1y.:�'ll J. r.utMk..tp.
KB$Af\J �"1'iU1ll tl.-t\Jii.l
h 1\nr.Jilboln U �bkub<1 fttftt(l-lollUJt.n pcnditi.\n dt tntottt\llftl,�·if JX"nrhti>tn.
dan
<"Uiuo.!G!
uurnul .:iltUio
Lt1>1t.,n ;okh1 1 f'll•tcUh••H •hill 11hrnr.��t" KF.!IA'TU tii'�Utll lif'nwmj;:.mgiU \hilctlt )'111\Ji dl� JX,d
l1 Mt:!I�'"''"PitfkM\
.Jl
U.totl:-'loll"j')Jn --�tf·•IJIIttllt'UP!''
!lit'bkon.l\..1.m
d�t.r. �n�nA J-'�·lb �null ��.��� h.\.ttl
w.ottl.s-1
kl'l?itd�l PJ.HAJC
P/I.IAL
(1)l. 1' "lf" tkflllt II" , -._J1 t�tj•kt•n !"J• •t.dl ,n.l\... J w ..t ..d,t.;..,�; 111 Ud 1\t't.i.�tt.l...o•t hl'lo'k'f..Hi.QI, �·Au"""� lq'Jwt �u:n.:t, !cmwrn L.."'lil1n'a TJtl1i; .I ll'' u·l�h "''tl"-•• hn�IJ JX"I•U.uw...n kf'�.,e:m �li1:onr. in� ci•n tnl!n,. , d� mtltk !A.I!II.Ir'l\.llptmtptWik
U) f)"!.trn
C4J.cUNh-4 \�1� bt'h.UWJ1$0U) t d•ttt�olA
t
..-, U�u�c&.�U.-• ,...rt: ... t•..t.A4n -.r:mun ltdlt.iok 1ltn.,�;yt....W" �� kt,...• .\ Plli:AJC KE&AY'U KJ.UJ�i k<'tt'ttt��n HJ�4. b.'!-b"-u
10
KBI'EMIUXAJO HAall. �l!U'I"IAJII
lial lcJOjft.di lunluUm U-ltl pll\.t� 1•-.in �otW po:l'�Ut'lihlt't I'IY;"\I.U 1\lll.l 1\Wi�
u:�n..-1•1\.:1
;wkt:rp..•�
C:..n .... A.
'' f h'U I U akil:tti 11tii1C'III'UI\ ltl;, I'IJIAK KJ;I)UA 11�1WO 1"6� bn'd;.t�,rk:m prfPfltt:J�n. '"' tkan ft'lef&btbi.l'\ PIHAX KEIIATU IUAilfto'lfl ft':+ku:n 'lhh»k foi!J'1 �tsrb\.1.1
PASAI. 13 KI!IWAAJI •Ot.\KIIA 4FORC.B MAJlfii/Uq
PAI.U. tl PllRTUI
�Ur41- bt."T1.ukn •hLIA 1\•n u�furn•ut�l •••cnA�o,\lf.l prlilk�&�m.:mn 1'\:.'i)CWjttttl Uti .Jttn �JUltla· tn• � hr:rr�v•� \ hll.u ll!d • • c m Htttu.k �t:pcniiJ•t»:.u }ollfi.JI 11C!1.1�'' dt·n1Q.111 ll'-tk.��olltJ • lh'lll hlju:t n. F\.rl�n1i;,�n f\•lnlc:Mn;t...tn A:-n..,iau..n ni
lu
.'Jt PAllA. PIHAX ;,.rp..� hdtul. #'IN� t't.h �o�iW.han �e>Jwuh d.lr" Un .. ,,....$� .,... M�na diln.l.k
�\,1(111 ',1ollt'llt P,."'nldUf.. 'o .; . m kJIU�I eM ..AJU. PfHAJl
f.:t•h:t1Mtl:\.�llll\ tV:I�k�n��nfpr•nyeolt'MI.t:U'I J�kf.t)IUHt )"tlt1tl d1tlkibt!lkt!.r. olt!h k�t.dtl.w4"1 m, n1Ukt;;o� t/otr"'· llltl_wllm:l l.l�p:Jt m�m�ll=l•l�n J'ilC.AK k8DDA Uttri rJ-.1Litm J11�1 l.1 'f\!rJo;li\;IQf'l ��m"'
P\'J.tl.-"\1""-•1 t\To\-lili.tnlltti
"f..t.,lo.-.:al�kn•�ll oa<�l�Y1jm-.nu. ,..,..,•tMu
(11 "\..W•It•ba�tlht-.1 �.,;._...,11 r1k·Nktrt.;t
"- AI.IIJII)•"
PAS.Al.. l2 8AO'K81
lforw� .ot.tll.llh
if, 1tr-nc,•!l.• .=aLun �""t'' IJumt •....n�h �� b,.t'IJHI fllt!n k«"iKban �� hWI,. Ltd�k n.ICJfl\.11'�11"kflt• p.'kt:t)a:�.n dllak•IU1A�n; �rftn�, J�um h..r11.
l't-"lttlJ�ntnti'llutn. i...cl.:ol('•ot,.i.6ltl. kdJU:tr.::tlt dur;�
''JntiiC'lm; ,.
tt;rJ•,=l•JO
W1n J'hlu..ot lu:kvui�11J.f'k.�·m.ilmpll.oln
m�I\U"'tu d;m kr:ja:dLnn
t•'rfof'bti1 doiP,,\(h�I�Un\.tldl,t:ttljUI aJ�h P!JiAX ICE8AT'U
IU l&i!ow.:t�'l>l PlllAK K£DVA cb!.t� p.:: Llknr•..�.m lc�um d�n pmNN·M!n1 t:.l.."-1 ri4olk lllt�wtt dc�r. S\-.u-.n �" ll.c:tt'nl\LII!\ ,.._, tc�um Ill.'" .._. pnja� im d.tn .\�U mdar� krtmnlil.n Pt-r.tt� Pcnmdanpn \illl'l• llt'tb"� P0t.UC KI&ATO �an wnac .. bC'NJll pcri=:fP,\d:1 ktlut� '""u� pcnn�lW1 t)tt1�I"'NN 'lt.:un;ui drni;,Oln pr'riUICOJto"'ln k1�:1:
.(.!1 At'\11�:.,,
(,tj l'ttt'.l"oe:'(l,,fl �111..'�1 .,._,ttwr,l+orlli"IO:.l �hlll;;�"-111Ud IJ.I(Io� tiHt ( \I dllhkUioi�•n 4j,......,,IL\
P)Ah,u• IJt'tt.llwt'.:tM�tMn l"iHAJ< M.EDUA. 1naU PtK..UC J(AATU d&i)t:tt U1c.mctujm ..,u\ll tnc�no;JI�k .. ""' "" ' " U;rtu.IW k�::.�� mttlt..a� 1lU dtllatu •-u.kht ,\ � .H ).o.,:t) �·Juk tt•r1kc:l ln�-.., pt"mbcnhlhlLUI �\•4\.<1... �1\ i\'tdcWmt f.:r,...ll\1\ d .ni PlllAM. JUDUA •
l'lH.AK fUCD\fA bN'dil.,.Hli�ll IUUill t.'"tt'oiiUAMJ 1iAn \'l'lifiktl�l md�kuk;l.n kt�P'lt fTI('fli:r..buJkAn kcf'ucp.:tn NC'g:uu.
U!rbukl) ma�Jpun
Ill .t.p;.� lii PIHAX KEDUAt-:d;tk "'.c.'nl;nl!o:thkn l"'NNrtt"f�t.n k"n�, d.Jr• FIHAK KFA.ATO •·';olfn<�ic. J UJt:'.i.IJ l<.tlt �\Ms:ll.lfl,•t ,:tfl t :trt 11\,.u.l vna. i�l'Ht I I). ,.,,tW.. b "t l..-t\o;U�n Mt\k� V'l�� P1MAK IWIWA PIH.A.K KQJA'TV t1PJI.tl 'hi 'Ul .. 1\."i\Lj) .... M
i-1) h\ ot d;�L\Ia Wbktu .l
a ;.tof JIIM � dil«imbtw• �tl'l:� PIRAX KEDV.A kt·�• P1JJAI( KBUTO '''n-:'"� �n tnerr-.....b.l �bu:l \Ut.:a\1: .ad. Jo�ha."l"'" am ptKAJ( Ku.&Al'\1. tn111k.oi ""AK KaA'fU di::tnm:;=ap {ll \ r.\'I: IUJUI ..tkl!'t� • lrl�lot(l lfl\;l kl'!U.bJal'l m.:m.4ii:..... 11�·1)�11,
Mf·twnk 1«'1111lul1 tlHt\ /ii\QH m<-n�('f\U I..••r. b••m��;oln dfl/fl\ d.rm{o\UU l'iU.'ofllinln kcmbrAI1 bltlnu,�r rtHhtl y�t1R ll"�h lil�lutkif\ $C:1t.Wii dc-�n F-I����Ji..Vt'lnu
b �lem.aldclu•n P1.lt.AK KL'lJUA w .t....t..m lttff:'�r 'loP'hli3J't teo� )"r-8 ud� II'W.n\C'n�hl tipr;n a.:�i pt'f'rt'� 1\ltUu.ul bN 16£bM'I I�tduk t•
tCf}-W. k.,.il�tl UIC'"I'Il.ldrsn. : . m.:a� f'I.HAJC Km)UA. . r : u u .· · l'll"t"ll ,. . . .,,ahul.a., §t:fitf• ,,...,,,,. � "HAK tu:aATU �'t-.tt· ;..MtUUH .......� . •"'1!1k\U 14 jc"::t\f"•l � ba-. IM."p.k \C'fj
&k'Up.�l PIH.A.K
KEOUA � � IMIJtf\�. U1� brnt'm"/rP
Ul"..Jt,:.C. Pfnltt' tl:\d.uc: l.m�u•
PA8AI. 1-. .P&JIVa:LaAlAN J'RRS�Ill.U
J.10'!ocl-".h-u1 lll't11U PARA PUt.A.X. m.1U J\Otdoi .�m.,d ·kfm4�"'<'it"u*an i!A'('Dtu rn.._-,....... ..1\
tl't l\��t¥J"'�' t•ftoltli
t.:) ANtl..t b �hdlit:n .,t·htW,.Jt:I)An... rti:::I\IJ:$.1.Ioi'l I 1-..MJt. 411"-.t (I) ��- d;:ipu.l "'1W'�U.1lk1li, d('t���� C1UI1 n.._.fi,��.t-.•fllmb, mnkn pc:tti:l(';l..-lhan l.r.'!"R"but .&�ka.r. •JI:k!k:llitlkflt\ U\tl
50
�J,tx·ml.lk P\J.ni'\u Pt:r.�i'�'e;i.m
��·h�tlJ.In v�tl\lt
t.:tdiri dnn 3 lt�J Clrt� n r ..
&.o..pna ...,._ � -·�l/�1 - : 10 -:>0lt
�·,-mu �
�1r.:.n� 'il')\ctl ! dMI PiBAl..: KI!S'-nJ,
b
�!(lr.'J111ol wakLI do:�oi
F'U·J,t..l\ KI O:: I)U/o,
� 11...." ...C'In"t�.l'J:R �·l\kil yom,:.dlh.wjut (31 A1�DUn
fht� c.h:ff!t\litJI uld1 1'1\ll/\ PillAI�
1\a!<.il ll('f'Lit���� {nh;J"'J) d. pcJm.•li�hun .-u.:..-�lltM.n� Lllm�k$ttd
"•·
Fi"'!.' ;a"·::.t r}'l iidt.lc thtctlfllMo okh l'.utA P1JtAK, rtmk1t. �h��k-..1�-.n n�.&•l.i.ll 'rtiiiL"Wi ,,'k,ln
ot!i�)r.�H.-�ln ilt1un.t
Pl "fii!IJI.ULLm Ncy-:i ,t,;Jk11tut Plt;S..'=I'-
ltukum dr"ng.:n'L dornh\111 1m...-o1lt
t i � ll.l'nlJiUJ
ll:i'd."'pi1l
rji'(UlmiBUl
tlkao r,JIIakUk\11\
1
tJ.l �·11;)ht',''';l :'tl-111 in,.
J,
"!Ill·I Vo .. U.. .S wcl4tt 11 1.� 000 l::lllit&uor�6A� &U.� � "'Jllidlal,.u ...,
'h'U;ut··-·-�r;;;u.... � W-bn1ht�u111
12-
ll:l)llm jX"I)oiUjh)ll Ull PARA PUIAtc..
l'I.!L'tli.J:II\:In la!idt:•l.:01tm.N �1:a�o k����-�tkb!lUI
111\,.
H•onmi, A lunM Wianu
4t
P.4.8At 1!5 PEtfO'rVP
... ... )! '""'..'dol!.,..,.,.. , Ak.ti
haeU�
1JAilii.MH1 nmltttl
flo; PIJaWI, ltv_. Martft\nA,
p.nt s bm.1J1
J
111trv
•
. .....- T3".i9eooro
El<•trok o.....;Dnloon..4ilt�i �.utlbitkoon. k\tiO.kflidili l �n 'OMU1.fltldnUJUtft
""lf.41 lknJ'l(•ll.�Jmldotl "'"'"'"""' I. QilDriU� �.ho,tRf Ao.dok� d"'n
1•3.!11M ) OO
JJ"pcwlP.N tt.ktC�r
llllf.\�� \tlbu•t d:llam r:Jn.,W.:;ap 5 fllC'fltpu'''111 kr.k\l.(:ltnn hukum ''U1'R
tJ) 1-'N}II t1JUlf'l 111\ c.lii.-11Ml=tlnnRant okh !)i\kJ\
iHm.,\j 1lan
lH·I"Itll'lh:�.;u
ctJj(up
!Jot'n�
�UIAI\ Pl:RTA>IA, Bllld!in t\lm.litllu;r du Pea:;rm.banpa
PlHAK KlC.DtJA? Uafnnftu MuJilwan:alla.
•ta•
51
