Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
TEKNIK ISOLASI DNA DARI DARAH DOMBA ZULQOYAH LAYLA Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor
RINGKASAN Teknik molekuler digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi materi genetik pada individu . Penggunaan DNA sebagai bahan genetik dalam penelitian genetika molekuler dimanfaatkan untuk analisa keragaman genetik dari beberapa spesies ternak, identifikasi penyakit, pemetaan genom ternak, melihat kekerabatan ternak dan memetakan (mencari lokasi) gen-gen yang terkait dengan sifat produksi . Tujuan penulisan ini untuk menyampaikan teknik isolasi/ekstraksi, penentuan kualitas, penentuan kuantitas dan menghitung jumlah DNA genom yang dihasilkan . Pada percobaan ini darah yang dipakai berasal dari domba bangsa Ekor gemuk, Merino, Sumatera, Garut dan St Croix, masing-masing sebanyak 3 ekor . Dari 15 ekor sampel darah domba, semua DNA dapat diisolalsi dan kemurnian DNA yang dihasilkan berkisar antara 1,75 - 2,00 yang berarti sebagian besar sudah sesuai dengan standard kemurnian yang ditetapkan dengan konsentrasi berkisar antara 0,1375 - 1,4125 ug/ul .
PENDAHULUAN DNA merupakan bahan pembawa informasi genetik pada setiap organisme kecuali pada beberapa virus tertentu (Suwanto, 1992) . Akhir-akhir ini penelitian mengenai genetika molekuler sering menggunakan DNA sebagai bahan genetik, antara lain digunakan untuk analisa keragaman genetik dari beberapa bangsa ternak, untuk mengidentifikasi penyakit, untuk pemetaan genom ternak, untuk melihat kekerabatan ternak dan untuk mencari lokasi gen-gen yang terkait dengan sifat produksi (QTL = quantitative traits loci) . Salah satu bagian tubuh yang sering digunakan sebagai sumber DNA pada diagnosa agen infeksi atau pada analisa genetik, ialah darah . Pada ternak ruminansia, sumber DNA terbanyak terdapat pada inti sel darah putih . DNA yang berasal dari sel darah putih lebih bersih dibanding ekstrak DNA yang berasal dari darah total (whole blood) . (Keller, 1992) . Prosedur preparasi DNA pada umumnya dilakukan di dalam larutan . Panduan umum untuk mengisolasi DNA adalah pemecahan membran sel dengan menggunakan detergen dan senyawa pengkelat logam, biasanya EDTA, untuk menghilangkan sebagian komponen yang tidak diinginkan berupa RNA dan protein dengan menggunakan protease dan ribonuklcase, sedangkan protein-protein yang masih tersisa dihilangkan melalui ektraksi larutan DNA dengan pelarut organik (phenol dan campuran chloroform + isoamilalkohol) . Larutan DNA kemudian dipekatkan dan diendapkan dengan penambahan ethanol (Suwanto, 1993) .
116
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
Kualitas DNA dapat diketahui dengan proses elektrophoresis gel agarose, menggunakan pewarna Ethidium Bromida, sedangkan kemurnian DNA dapat diketahui berdasarkan hasil ba`gi nilai OD 260 terhadap nilai OD 280 yang terbaca pada UV spektrophotometer (Sambrook, 1989) . Pada tulisan ini akan diuraikan teknik isolasi, penentuan kualitas dan kuantitas DNA darah domba yang dilakukan di Laboratorium Genctika, Balai Penelitian Ternak Bogor .
BAHAN DAN CARA KERJA Materi Materi yang digunakan dalatn percobaan ini adalah darah domba sehat dari bangsa Ekor gemuk, Garut, Merino, Sumatera dan St Croix yang dikoleksi melalui vena jugularis dengan pemberian EDTA sebagai anti koagulan . Masing-masing bangsa domba yang digunakan sebanyak tiga ekor . Peralatan Alat-alat yang digunakan pada proses isolasi DNA harus dalam keadaan akurat sehingga tidak menyebabkan adanya kesalahan pengukuran . Pada alat-alat tertentu seperti tabung eppendorf ukuran 1500 ul, dan tips ukuran 0 - 2 ul ; 0 - 200 ul ; 0 - 1000 ul harus dalam kondisi baru dan steril, agar hasil pengamatan terhadap ekstraksi DNA dapat lebih akurat dan bebas dari kontaminasi . Peralatan yang digunakan adalah tabung vacutainer steril 10 cc berisi EDTA . Jarum venoject ukuran 22 G berikut holder, sentriluse, microsentrifuse, micropipet dengan ukuran 0 - 2 ul ; 0 - 200 ul ; 0 - 1000 ul tips den-an ukuran 0 - 2 ul 0 - 200 0 1000 ul, penangas air suhu 65° C, tabung eppendorf 1500 ul, vacum, cetakan gel + sisir, Elektrophorcsis horisontal, Uv transiluminator . spcktrophotometer, photographi film polaroid . Bahan-bahan Pada proses isolasi DNA dibutuhkan larutan I : larutan II ; nonidet P40 (BDH) distilled phenol ; chloroforn : isoamilalcohol 24 : I (chisam) ; ethanol absolut ; ethanol 70% ; Proteinase . K ; Tris Boric EDTA ; Ethidium lJromida ; NaOAc 3 M ; Agarose Blue juice (larutan pemberat) . Cara pembuatan larutan tersebut diatas disajikan pada Lampiran 1 . Metoda Metoda isolasi DNA yang digunakan adalah metoda dari John dkk (1991) yang telah dimodifikasi sebagai berikut : Sebanyak 5 ml
1 17
Lr-l:akarNa Fungsional Non Peneliti 1999
dipindahkan kedalam tabung eppendorf 1,5 ml dan kc d alatnnya ditambahkan 400 ul distilled phenol, diaduk sampai merata, disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit . Fase bagian alas dipindahkan ke dalam tabung, eppendorf baru, ditambahkan 200 ul distilled phenol dan 200 ul chisam, dicampur sampai merata dengan membolakbalik tabung . Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit . Fase bagian alas dipindahkan kedalam tabung eppendorf baru, ditambahkan 700 ul chisam, dicampur sampai merata dengan membolak- K lik tabung, disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama I menit . Fase bagian ata~ dipindahkan ke dalam tabung vacutainer steril, ditambahkan sebanvak 2 bagian alkohol absolut dingin . Bagian bawah tabung dijentik-jentik hingga tampak benang-benang DNA . Dengan menggunakan pasteurpipet yang ujungnya tertutup dan dibengkokkan, DNA yang terbentuk diangkat, dimasukkan kedalam tabung eppendorf yang berisi alkohol 70% sebanyak 1 ml, diaduk rata untuk mencuci DNA, selanjutnya disentrifugasi pad : kecepatan 12000 rpm selama 10 menit . Endapan DNA yang diperoleh, dilarutkan dalam larutan T .E . buffer steril sesuai dengan besar kecilnya endapan . DNA yang diperoleh, selanjutnya dimurnikan dengan menambahkan Natrium acetat 3 M sebanyak 1/10 volume larutan . Tabung dibolak-balik agar tercampur sempurna . Kedalam tabung ini ditambahkan ethanol absolut dingin sebanyak 2 x volume larutan, dibolak-balik perlahan-lahan, kemudian diinkubasi pada suhu -20o C selama 30 menit . Tabung disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit . Supernatan dibuang, kedalam endapan ditambahkan ethanol 709 sebanyak 500 ul, tabung dibolakbalik, alkohol dibuang, endapan dikeringkan dengan vacum . DNA yang terbentuk, dilarutkan kembali dalam 100 ul larutan TE buffer diinkubasikan pada suhu 65o C + 20' , kedalamnya ditambahkan 2,5 ul Proteinase K, inkubasi 37o C selama 2 jam, stop reaksi dengan perebusan selama 5 ` . Urutan cara kerja Iebih jelas terlihat pada skema berikut Penentuan kualitas Uji kualitas DNA dilakukan dengan proses elektrophoresis dalam larutan 0,5 x TBE . Larutan DNA hasil isolasi, diambil sebanyak 3 ul dan dicampur dengan 2 ul larutan blue juice, dimasukkan ke dalam sumuran gel, pada 0,8 % agarose . Separasi DNA pada gel ini dilakukan selama 1,5 jam pada legangan 90 volt dengan menggunakan alat pemisah elektrol'oresis horisontal . Listrik dialiri dari kutub negative ke kutub positive . Dalam kondisi netral dengan pH 7-8, DNA bermuatan negative (-), sehingga akan bergerak dari kutub negative ke kutub positive dalam larutan buffer ketika dialiri listrik . Setelah proses elektrophoresis selesai, gel direndam dalam larutan Ethidium Bromida dengan konsentrasi 0,5 ul/ml selama 5-10 menit . Proses ini dikenal dengan pewarnaan . Maksud daripada perendaman ini adalah agar Ethidium Bromida dapat Perlakuan terserap oleh DNA sehingga dapat dilihat dengan bantuan sinar UV . selanjutnya adalah perendaman gel dalam dH2O selama 5-10 menit, yang bertujuan untuk menghilangkan senyawa Ethidium Bromida yang terikat secara non spesifik pada bagian gel yang tidak ada DNA-nya .
118
L.okakarva Fungsional Non Peneliri 1999
Fragmen DNA dalam gel dilihat dengan bantuan sinar ultra violet pada alat transilluminator, setelah itu dilakukan penuttretan dengan kamera polaroid . Hasil pengujian kualitas DNA dapat dilihat dari gumpalan fragment DNA yang terbentuk pada kolom sumuran pada gel . Penentuan kuantitas Kuantitas DNA dapat dilihat dengan UV Spektrophotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm . Sebanyak 10 ul DNA dilarutkan dalam 2490 ul TE buffer, dicampur hingga merata, kemudian dibaca nilai optical dcnsitinya pada spektrophotometer dengan X 260 260 nm nm dan ~, 280 nm . Nilai kemurnian DNA diketahui dari pembacaan pada dibagi pembacaan pada'` 280 nm . Apabila didapat angka < 1,8 herarti masih terdapat protein yang mengotori DNA, maka sampel ditambah proteinase K dan apabila > 1,8 maka DNA sampel ditambah RNAsc untuk menghilangkan RNA yang masih ada . Selanjutnya dari hasil pengukuran tersehut dapat ditentukan konsentrasi DNA sampel dengan rumus ( 1 - 260 x 250 x 50) konsentrasi DNA = mc/ul 1000 dimana ~, 260 = nilai ahsorhensi yang dihaca pada spektrophotometer pada ', 260 . 250 = faktor pengencer DNA (10 ul DNA dalarn 2490 ul TE) . 50 = faktor konversi dan nilai ahsorhensi 260 = 1, sehingga konsentrasi DNA berarti 50 ug/mI . Data tentang konsentrasi DNA ini dapat digunakan untuk menentukan perhitungan dalam pengenceran DNA agar dapat dipergunakan untuk analisis RAPD . Ii AS IL a . Ekstraksi Dari sebanyak masin g- masing tiga nomor darah yang berasal dari domba Garut, St Croix, Merino, Sumatera dan Ekor Gcmuk, semua dapat diisolasi DNA-nya . b . Kualitas
Sumuran gel Gumpalan fragment DNA Keterangan Garut 3530 Garut 3179 Garut 6715
St Croix 20113 St Croix 603 519 St Croix
Mcnnu 1017 Mcrino 1025 Menono 1016
Sumatra Sumatra Sumatra
128 119 120
Ekor Gemuk S2 Ekor Gemuk S3 Ekor Gemuk ISA2
119
Lokakarva Fungsional Non Peneliti 1999
c . Kuantitas Hasil pembacaan Kuantitas Tabel 1 . Hasil pembacaan pada spcktrophotometer dengank 260 dan A 280 Spesmen
).
260
?.
280
Konsentrasi DNA ug/ul
k 260
Kemmrnian 280
Garut 3530 3179 6715 St .Croix 603 519 Merino 1025 1016
0,011 0,020 0 .015
0 .006 0 .011 0 .009
1,83 1,82 1,87
0,1375 0,25 0,1875
0,015 0,055 0,053
0,008 0 .029 0 .027
1,87 1,90 1,96
0,1875 0,6875 0,6625
0, 0 30 1,77 0,024 1,75 0 .016 2,0 standard Sambrook (1989)
0 .6625 0,525 0 .400
20113
1017
0 .053 0,042 0,032 eterangan : Nilai kernurnian 1 .75 - 2 .0, sesuai
Tabel 2 . Hasil Pembacaan Pada Spcktrophotometer dengank 260 dan A 280 Sebelum Pemurnian . ?,
Spesimen
?. 260
i_ 280
Konsentrasi DNA ug/ul
260
Kemurnian X 280
Ekor Gemuk
S2 0 .046 1 .44 . 0032 S3 0 .050 ~0 .035 .43 1 ISA2 0 .044 0 .030 1 .47 Sumatera 128 0 .052 0033 1 .58 119 0 .073 0 .045 1 .62 120 0 .039 0 .024 1 .63 Keterangan : Nilat ketnurnum 1 .43 - I .03 . dthawah standard Sambrook (1989) .
Nilai keniurnian pada Tahcl 2 herada dibawah dimurnikan . Hasil pemurnian dapat diiii :at ;)ada Tabel 3 .
standard,
0 .575 0 .625 0 .550 0 .650 0 .9125 0 .4875
maka perlu
Tabel 3 . Hasil Pemhacaan Pad, Spektrophotometer denganA 260 dan A 280 Setelah Pemurnian . ?,
Spesimen
?`
Ekor Gemuk S2
0.021 0 .023 0.013 0.080 0 .113 0 .062
260
- 3O
260
Keniurnian
Konsentrasi DNA ug/ul
280
Sumatera
1 20
S3 ISA2 128 119 120
O .()11 0 .013 0 .007 0 .0 .15 0 .0 0 3 0 016
1 .91 1 .77 1 .86 1 .78 1 .79 1 .72
0 .2625 0 .2875 0 .1625 1 .0 1 .4125 0 .775
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
Hasil Bagi nilai absorbensi 260 terhadap nilai absorbensi 280 pada DNA asal bangsa Garut, ST Croix dan Merino, berada antara 1,75 - 2,0 ini sesuai dengan standard yang ditetapkan (Sambrook, 1989), sehingga terhadap DNA dari kelompok tersebut tidak perlu dilakukan pernurnian . Sedangkan dari kelompok bangsa Ekor gemuk dan Sumatera, hasil bagi ~- 260 terhadap ~ 280 memperlihatkan nilai < 1,75, berarti DNA dari kelompok tersebut masih mengandung protein, sehingga DNA dari kelompok ekor gemuk dan Sumatera harus dimurnikan dengan penambahan proteinase K.
KESIMPULAN Dari 15 sampel darah yang berasal dari domba bangsa Ekor gemuk, Garut, Merino, Sumatera dan St Croix, telah diisolasi sebanyak 15 sampel DNA dengan konsentrasi berkisar antara 0 .1375 - 1,4125 ug/ul . Kemurnian DNA berkisar antara 1,72 - 2 .00, ini menunjukkan behwa basil isolasi darah domba yang telah dikerjakan tersebut sudah sesuai dengan standard yang ditetapkan .
DAFTAR BACAAN John S .W .M, G .Weitzner, R . Rozen and C .R . Scriver, 1991 . a Rapid Procedure for Extracty Genomic DNA from Lenkocytes . Nucleic Acid Research, 19(2) : 408 . Keller, G .H ., 1992 . DNA Probes . M . Stockton press . hal 36 - 37 Suwanto A ., 1993 . Biokimia DNA, . Kursus Singkat Biologi Molekuler PAU Bioteknologi IPB . Suwanto A ., 1993 ., Pulsed Field Gel Electrophoresis : Suatu Revolusi dalam Genetika Molekuler , Kursus Singkat Biologi Molekuler PAU (Pusat Antar University) Bioteknologi - IPB . Sambrook, J .E .F, Fritisch and T . Maniatis, 1989 . Molecular Cloning . A Laboratory manual 2nd Ed . Cold Spring Harbor Laboratory Press . Analysis and Cloning of Eukaryotic Genomic DNA, 9 .19 .
121
