Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997
OPTIMASI ANALISIS VITAMIN A, D DAN E DALAM DAGING AYAM DENGAN KROMATOGRAFI CAIR PRESTASI TINGGI Jernih Rosida Balai Penelitian Ternak Ciawi, P .O . Box 221, Bogor 16002 PENDAHULUAN Vitamin merupakan komponen penting yang diperlukan oleh manusia untuk tumbuh optimal . Kekurangan vitamin dapat mengakibatkan terganggunya penglihatan, mineralisasi tulang dan reproduksi . Begitu pula sebaliknya apabila dikonsumsi secara berlebihan dapat menyebabkan gangguan kulit dan dan hiperkalsemia . Vitamin dibedakan menurut kelarutannya di dalam lemak atau pelarut lemak yaitu vitamin A (C 20 H 300), vitamin D2 (C 28H 44 0), vitamin D 3 (C 27 H 44 0), vitamin E (C 29 H 500) dan vitamin yang larut dalam air yaitu vitamin B, (C 12 H 17 N 4 0S), vitamin B2 (C 17 H 180 5 N 4 ), vitamin B 6 (C 7 H 10 0 3 N), vitamin B 12 (C63H88O14NPCo) dan vitamin C (C 6 H 8 0 6) . Ternak unggas dan babi membutuhkan kedua jenis vitamin tersebut tetapi ruminan hanya memerlukan vitamin yang larut dalam lemak atau pelarut lemak karena mikroba rumen dapat mensintesa vitamin yang larut dalam air. Sedangkan manusia mutlak memerlukan kedua jenis vitamin tersebut sebab keduanya tidak dapat disintesis oleh tubuh . Daging merupakan sumber protein, lemak, mineral dan vitamin yang larut dalam pelarut lemak bagi manusia . Penentuan vitamin tersebut mulai dilakukan secara individual . Vitamin A dilakukan secara spektrofotometri berdasarkan reaksi CARR - PIERCE, vitamin D berdasarkan reaksi antimon (Ill) chlorida dan vitamin E dengan kalorimetri EMMERSE-ENGEL berdasarkan reaksi ion ferro menjadi ferri . Sedangkan teknik Kromatografi Cair Prestasi Tinggi (HPLC) dapat memisahkan vitamin yang larut dalam lemak secara serentak dan waktu analisis yang singkat . Pada penentuan dengan HPLC selain jenis kolom pemisahan vitamin yang larut dalam lemak dipengaruhi oleh konsentrasi dan kecepatan alir fasa gerak . Makalah ini melaporkan hasil analisis vitamin A, D dan E pada kolom C8 dan C18, serta penentuan konsentrasi dan kecepatan aiir fasa gerak yang optimal . BAHAN DAN METODE Bahan Daging unggas (ayam) yang diperoleh dari kandang percobaan Balai Penelitian Ternak Ciawi . Standar vitamin A, D2, D3 dan E dad Sigma 187
Lokakarya Fungsional Non Penelid 1997
chemical . Kloroform, dietileter, etanol absolut, kalium hidroksida dari MERCK pelarut metanol khusus HPLC, vitamin C, disodium-hidrogenfosfat, asam sitrat dari AJAX chemical . Alat digunakan penguap hampa udara (BUCHI ROTAVAPOR), pengering dingin (DYNAVAC), pemanas listrik yang dilengkapi dengan pengaduk magnit (HEIDOLP), pengocok ultra sonik (SANOPON), blender dan penyaring FGWP 0,22 .Lm dari MILLIPORE . HPLC Hewlett Packard model 1084 B yang digunakan dilengkapi dengan injektor automatik, detektor variabel ultra violet, 2 wadah fasa gerak dan integrator pengolah . Rever data kolom yang digunakan C18 Reverse phase LICHROSORB dengan ukuran (10 4m, 25 cm x 4,6 nm i .d .) dan C8 Reverse phase LICHROSORB dengan ukuran (10 µm, 25 cm x 4,6 nm i .d .) dan C8 dengan ukuran (10 µm, 25 cm x 46 mm) . PERSIAPAN CONTOH DAN EKSTRAKSI VITAMIN Contoh daging diiris-iris dan dikeringkan dengan kering beku selama 3 hari lalu digiling halus berukuran 1 mm mengunakan blender dan disimpan pada suhu 4 ° C sampai siap dianalisis . Vitamin yang larut dalam lemak bersifat peka terhadap cahaya, maka selama analisis cahaya Iangsung dihindarkan dengan menggunakan wadah yang dilapisi kertas karbon atau aluminium . Contoh tersebut ditimbang 3 - 5 gr lalu diekstrak 3 kali dengan 30 ml campuran chloroform : etanol (2 : 1) dengan blender selama masing-masing 3 menit . Larutan disaring dengan corong Buchner menggunakan kertas saring Whatman 41, kemudian hasil saringan diuapkan dengan vakum . Residu dicuci atau dilarutkan dengan 50 ml etanol absolut dan dipindahkan ke dalam erlenmeyer bertutup teflon . Larutan residu dalam etanol ditambahkan 1,5 ml kalium hidroksida 15% (w/v) dan 0,5 gr vitamin C sambil dialiri gas N2 lalu ditutup dengan cepat . Campuran tersebut dikocok di dalam ultra sonik selama 30 menit, kemudian didiamkan semalam pada suhu kamar lalu dikocok kembali selama 30 menit dengan ultra sonik . Campuran tersebut diekstrak dengan 2 x 75 ml dietileter, lalu lapisan eter dicuci 2 kali dengan 40 ml larutan dapar fosfat pH 7,4 dan akhirnya dengan air suling hingga bebas basa (uji kertas pH) . Lapisan eter dipisahkan dan diuapkan dengan vakum dan residunya dilarutkan kembali dengan 3 ml metanol HPLC grade . Larutan disaring dengan kertas saring FGWP 0,22 µm . Larutan contoh 10 µl disuntikkan pada HPLC dan dielusi dengan larutan metanol 90% dan 95% . Begitu pula kecepatan alir fasa gerak yaitu 1,5 ml dan 2,0 ml/menit pada 2 jenis kolom C18 dan C8 .
1 88
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan perlakuan optimal untuk analisis HPLC dilihat pada waktu retensi yang cepat dan dapat memisahkan setiap komponen vitamin . Data waktu retensi analisis vitamin A, D2, D3 dan E disajikan dalam Tabel 1 . Pada konsentrasi metanol 90% waktu retensi yang diperlukan untuk vitamin A, D2, D3 dan E lebih lama dibandingkan konsentrasi metanol 95% . Begitupula pada kolom C18 dengan konsentrasi metanol 90% tampak lebih lama . Dengan kecepatan alir 1,5 mI/menit waktu retensi yang diperlukan lebih lama dibandingkan dengan kecepatan alir 2 ml/menit . Tabel 1 . Waktu retensi yang diperlukan pada berbagai kecepatan alir, kadar metanol dan jenis kolom A : Kadar metanol 90% Jenis kolom
Jenis Vitamin
C8 1,5 ml/menit
2,0 ml/menit
1,5 mI/menit
4,44 6,95 6,95 8,87
3,42 5,48 5,48 7,89
7,41 T .D . T .D . T .D .
A D 2 D 3 E
C18 2,0 ml/menit 5,78 T .D . T .D . T .D .
T .D . = tidak dilanjutkan
B : Kadar metanol 95% Jenis Vitamin
A D 2 D 3 E
Jenis C8 1,5 mI/menit
2,0 ml/menit
2,87 5,45 5,45 7,05
2,25 2,95 2,95 3,27
C18 1,5 ml/menit 2,0 ml/menit 4,41 7,83 8,34 9,50
3,28 5,96 6,39 7,37
Jenis kolom mempengaruhi kecepatan waktu retensi . Baik pada kecepatan alir 1,5/menit atau 2 mI/menit dan konsentrasi metanol 90% atau, kolom C8 memiliki waktu retensi yang lebih lambat dari kolom C18 . Oleh karena itu setelah mendapatkan puncak vitamin A pada kolom C18 konsentrasi metanol 90% tidak dilanjutkan kembali . Walaupun pemisahan pada kolom C8 menghasilkan waktu retensi yang cepat, puncak vitamin D2 dan D3 tidak terpisahkan . Vitamin D2 dan D3 keduanya mempunyai struktur molekul yang hampir sama . Pada kolom C18 vitamin D2 muncul lebih awal
1 89
Lokakarya Fungsionai Non Peneliti 1997
dari vitamin D3 karena adanya ikatan rangkap pada C22 - C23 dan gugusan methyl pada C24 . Sedangkan pemisahan kedua jenis vitamin tersebut kurang sempurna karena faktor pemisahan (resolution factor) lebih kecil dari 1 . Adapun pemisahan vitamin A, D2, D3 telah dilaporkan oleh Landen (1981) dengan menggunakan kolom ODS (Zorbax), fasa gerak asetonitril dan metilklorida (7 : 3) dan kecepatan alir 1 mI/menit . Waktu yang diperlukan untuk vitamin tersebut 14 menit . Sedangkan pada kolom C18 konsentrasi metanol 95% dan kecepatan alir 2 ml/menit waktu yang diperlukan untuk vitamin tersebut 7,5 menit . Oleh karena itu untuk analisis contoh daging dilakukan dengan kolom C18, konsentrasi metanol 95% dan kecepatan alir 2 ml/menit . Begitupula data ketelitian dan dapat ulang (recovery) dari standar vitamin yang larut dalam lemak dapat dilihat pada Tabel 2 . Hasil recovery untuk vitamin A tampak lebih tinggi yaitu 112 t 16% . Sedangkan untuk vitamin D2 menunjukan lebih rendah yaitu 92 ± 14%, demikian juga untuk vitamin D3 85 ± 15 % . Adapun recovery untuk vitamin E tampak memuaskan yaitu 104 ± 13 % . Tabel 2 . Hasil recovery campuran standar vitamin A, D2, D3 dan E Jenis Vitamin
Vitamin yang dianalisa (mg)
Vitamin yang didapat (mg)
A D 2 D 3 E A D 2 D 3 E A D 2 D 3 E A D 2 D 3 E
15,32 6,13 1,78 31,87 9,52 1,68 1,77 4,73 4,10 1,69 3,44 2,27 18,76 0,99 2,56 4,37
21,83 6,66 1,67 27,92 10,82 1,64 1,79 5,84 3,88 1,22 2,45 2,12 18,49 0,91 1,88 4,98
X Recover (%) :
Recovery (%) 142,52 108,65 94,86 87,63 113,70 97,62 101,13 123,47 94,67 72,19 71,22 93,39 98,56 91,92 73,44 113,96
A 112,36 + 16,74% ; D 2 92,60±14,28% ;D3 85,16±15,32% ; E 104,61 ± 13,99%
Hasil analisis vitamin A, D2, D3 dan E dari contoh tersebut dapat dilihat pada Tabel 3 . Dari hasil rata-rata tampak vitamin A lebih besar dari vitamin
1 90
Lokakarya Fungsional Non Peneli8 1997
D2 dan D3 . Sedangkan vitamin E tidak terdeteksi . Keadaan ini diakibatkan karena kandungan vitamin dalam daging terlalu kecil . Untuk melihat konsistensi analisis HPLC dilakukan perhitungan standar deviasi . Pada vitamin A didapat standar deviasi yang lebih tinggi dari vitamin D2 dan D3 . Tetapi koefesien keragaman untuk vitamin A lebih kecil dari vitamin D2 dan D3 . Hal ini mungkin disebabkan kadar vitamin D jauh lebih kecil dari vitamin A, sehingga perbedaan analisis yang kecil menyebabkan keragaman yang besar . Selain itu pengulangan contoh n = 3 juga mungkin mempengaruhi nilai keragaman . Walaupun nilai keragaman analisis vitamin lebih besar dari 10%, analisis HPLC tetap merupakan analisis cepat dan sensitif . Tabel 3 . :Hasil analisis vitamin A, D2, D3 dan E dalam daging ayam Ulangan Contoh
Vitamin (mg/100 gr) D3
A
D2
1 II III X mg/1 00gr
1,65 1,39 1,32 1,45
0,48 0,4 0,35 0,41
0,52 0,34 0,38 0,41
Std deviasi
±0,17
±0,07
±0,09
11,9
16,88
23,07
Keragaman (%)
E
tidakterdeteksi tidak terdeteksi tidak terdeteksi
KESIMPULAN Dari uraian di atas dapat disimpulkan bahwa vitamin yang larut dalam lemak dapat dipisahkan dengan HPLC, kolom C18, konsentrasi metanol 95% dan kecepatan alir 2 mI/menit secara serentak . DAFTAR BACAAN Antalick, J .D . 1981 . Determination of vitamin A, D and E by HPLC . Anal Abstracts, 40,3F15 . Bieri, J .G ., Tolliver T .J ., Catignani G .L . 1980 . Simultaneous determination ofalpha-tocopherol and retinol in plasma or red cells by HPLC . Anal Abstracts, 40,1 D208 . Capuano, A ., Daghette A . 1981 . Direct HPLC determination of vitamin A, E and B6 (retinol, alpha-tocopherol and pyri doxibne respectively) present in dietetic oils .Anal Ab stract 40, 2F72 . Deluca, H .F . 1978 . The fat soluble Hand Book of lipid research Vol 2 plenum . New York . 1 91
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997
Gertz,
C . dan Hermanu K . 1982, Determination Tocotrienol in food . Anal abstract 43, 5F13 .
of tocopherols
and
Muniz, J .F ., Wehr G .T ., Wehr H .M . 1983 . Reversed phase liquid chroma tography Determination of vitamin D2 and D3 in milk . Anal Abstracts,44,1 F36 . Okano, T ., Takeuchi A ., Kobayashi T . 1982 . Simplified assay of vitamin D2 in fortified dried milk by two stage HPLC .Anal Abstracts 43,5F28 . Pask-Hughes, R .A ., Calan D .H . 1982 . Determination of vitamin D3 in Cod liver oil by HPLC . J .Chrom 246, 95 -104 . Paul A .A ., Sautgahe D .A .T . 1978 . The composition of foods her mayesty's Stationaery office London 4 th . Zonta, F . dan Stancher B . 1982 . HPLC of fat soluble vitamin separa tion and indentification of vitamin D2 D3 and their iso mers in food samples in the presence of vitamin A .E and carotene . J . Chrom 246, 105 - 112 .
1 92
