Lehet!ségek gombabetegségeknek ellenálló GM búza el!állítására Jenes Barnabás, Várallyay Éva, Tóth Gábor, Ivanics Milán, Giczey Gábor, Balogh Andrea, Oreifig S. Aid, Burgyán József Mez!gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Növényi Sejtbiológia Csoport Növény Virológiai Csoport Gödöll!
Búza rozsda - levélrozsda (Puccinia recondita f. sp. tritici) és a szárrozsda (Puccinia graminis f. sp. tritici)
Búza lisztharmat. – Blumeria (Erysiphe) graminis f. sp. tritici
STRATÉGIA ! G ombagátló hatással rendelkez! fehérje génjét rekombináns DNS technikák segítségével beépíteni búza genomba ! A szelekciós gének ko-transzformációban történ! alkalmazása kés!bbi nemesít!i munka megkönnyítése érdekében ! T richoderma hamatum gombából származó ThamChigén egy 42 Kda méret" kitináz aktivitással renelkez! fehérjét kódol ! C o n i o t h y r i u m m i n i t a n s b ó l 1,3endoglükanáz gén 82,3KDa méret", glükanáz aktivitással rendelkez! fehérjét kódol ! A gént és enzimet az MBK Mikológia csoportjában izolálták és írták le el!ször
Stratégia
vörös vagy levél rozsda Puccinia rubigo-vera fekete- vagy szárrozsda Puccinia graminis Búza PR (Pathogenezis-related) proteinek Glükanázok, kitinázok Coniothiryum minnitans endoparazita gomba !-1,3 exo-glükanáz (83,2 kD) CMG1 gén
Célkit!zéseink • Hatékonyan
szabályozni konstitutív promoterrel a gombából származó sejtfalbontó enzimek génjeit egyszik" specifikus génkonstrukcióban.
• Gombarezisztencia
létrehozása ezekkel a génekkel, els!sorban a levél és szárrozsda ellen.
• Amennyiben
a tesztelt enzimek hatékonyak rezsiztencia kiváltására, akkor szövetspecifikus vagy indukálható promoterrel szabályozni a m"ködésüket búzában.
Transzgénikus búzanövények el!állítása Cmg1 gén klónozása és konstrukció készítés
Géntranszfer
Plazmid tisztítás
Éretlen embriók, virágzatok izolálása és kalluszindukció A transzgénikus növények rozsdatesztje Élelmiszerbiztonsági vizsgálatok
Transzgénikus szövetek szelekciója
Fertilis növények regenerálása
PCR teszt, genomikus DNS hibridizálás Western blot
A pUbiCmg plazmid - Coniothyrium minitans gomba 83,2 kD méret" 1,3-endoglükanáz fehérjéjét kódoló szekvencia (Cmg1) - 5 -vég: kukorica Polyubiquitine1 gén promotere - 3 -vég: nopaline synthase gén (NOS) terminátor Dr. Giczey Gábor Dr. Oreifig Aid
Genetikai transzformáció közvetlen géntranszferrel ! Éretlen
virágzatból kalluszindukció.
! A
pUbiCmg/pUBIChi és a pAHC20(bar gén) plazmidok rögzítése mikrohordozók felületére a kotranszformáció érdekében
! A
plazmidok bejuttatása egymás után kétszeri bombázással. Nyomás:55-60 bar, vákuum:0.5-0.7 bar, sebesség: 350-400 m/s
Feltételezetten transzgénikus egyedek PCR vizsgálata ! Cmg-NOS,Cmg-NOSII.
primerpár alkalmazása. Várt amplikon mérete:241 bp, 565 bp régió: cmg1 gén 3 -vég utolsó 260 bázisa (NCBI Locus AF247649), gén és a terminátor régió közti kapcsoló rész(34bp), NOS terminator (NCBI Locus PBIN19TD)
! Amplifikált
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16
Zseb!
Minta!
1!
Cmg 97.9!
2!
Cmg 97.9!
4!
Cmg 97.10!
6!
Cmg 97.11!
8!
Cmg 97.12!
10!
H2O!
12!
Dogankent (kontrol)!
14!
pUbiCmg 0.0015 µg/µl!
16!
"X174 DNA/Hae III fragments (ladder)!
Fast Visual Assay for Chitinase Activity
Fluorometric Assay for Chitinase Activity
CMG-transzgénikus búza növények ellen!rzése dot-blot DNS hibridizálással
1 – pUBIcmg plazmid , 2 – CMG16 T0búza DNS kivonat, 3 – CMG21, 4 – CMG23, 5 – CMG76/16 T1 búza DNS kivonat, 6 – CMG76/17, 7 – CMG90, 8 – CMG97/1, 9 – CMG97/2, 10 – CMG97/4, 11 – CMG97/5, 12 – CMG97/7, 13 – CMG97/9, 14 – puffer, 15 – CY-45 búza (vad típus) DNS kivonat. Próba – CmgNosII, 565 bp hosszú, a Cmg1 kódoló szekvencia utolsó szakasza és a Nos terminátor. A próbát DIG jelöl!kittel készítettük (Roche).
Southern Hybridisation
1: Cmg97.1.2/3; 2:Cmg97.2.2/1; 3: Cmg97.2.2/7; 4: Dogankent (nem transzformált); 5: Cmg97.2.2/21; 6: Cmg97.2.2/32; 7: Cmg97.2.2/8; 8: Cmg97.2.2/31 9: #-Hind Eco Ladder
1.3-beta-endoglükonáz cmg1 géntermék expressziójának igazolása specifikus nyúl IgG ellenanyaggal 1
! A transzformált vonalakból izolált fehéje extraktum
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
83 kDa
!
SDS-PAGE (Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, Csertex) szeparálás
! blottolás PVDF membránra ! cmg1 peptidre kifejlesztett ellenanyaggal identifikálás (Invitrogen Western Breeze Chromogenic Detection Kit Csertex nyúl IgG szérummal)
1.cmg1-1 peptid; 2. Multimark Mt.standard.; 3. cmg 97.6. 14/3; 4. CY-45 kontrol; 5. cmg 97.2. 2/18; 6. cmg 97. 1. 7/12; 7. cmg 97. 6. 7/9; 8. cmg 97. 1. 7/14; 9. cmg 97. 6. 7/12; 10. cmg 97. 6. 14/5; 11. cmg 16.7/6; 12. cmg 17. 1. 7/17
19 CMG vonal biotesztje Fajta CY-45
Vonal CMg 16 CMg 82 CMg 86 CMg 87 CMg 88 CMg 90 CMg 101 CMg 104 Dagenkent CMg 29 CMg 51 CMg 95 CMg 97 CMg 105 CMg 107 CMg 108 Délibáb CMg 76 CMg 77 CMg 78 CMg 79
1 3 X 4 4 ;3 4 4 3 X 2+ 3 ;1-N ;1 ;1 2+ ;14 4 4
Levélrozsda rasszkeverék Tesztelt növények száma 2 3 4 X X X 3 3 3 4 4 e 4 4 4 ;3 2 4 4 4 ;1-3 4 4 4 4 4 4 34 4 4 4 3 4 4 4 ;1-N ;1-N ;1-N ; ;1-N ;2 3 3 ;1-N34 2+3 3 4 3+ 4 4 4 4 4 4 4 4 ;1-4 4 4
5 X 3 4 3 ;1-3 4 4 4 4 4 ;23 4 4 4 ;1-4 4 4
A Cmg1 transzgént expresszáló transzgénikus búzavonalak élelmiszer-biztonsági vizsgálata. • Csoportallergén specifikus IgE keresztaktivitás vizsgálata WGA-, amiláz/tripszin inhibitor gliadin és gombára specifikus szelektált hiperimmun szérumokkal • Jelentéktelen reaktivitás • A potenciális allergén fehérjék tápcsatorna rezisztenciáját reprezentáló in vitro pepszines emésztés • Az eddig elvégzett vizsgálatok alapján potenciális allergén aktivitás kockázatával nem kell számolnunk, mivel tápcsatornában maradéktalanul elbontható.
CMG eredmények ! Sikeresen transzformáltunk búzát a Cmg1 génnel kotranszformáció segítségével, ahol a szelekciós marker a pFF19K plazmid által hordozott nptII gén, vagy a pAHC20 plazmid bar génje volt. Összesen 179 putatív transzgénikus vonalat állítottunk el! szelektív körülmények között. ! Elvégeztük a szükséges molekuláris és a rozsda rezisztencia bioteszt vizsgálatokat a transzgénikus jelleg bizonyítására. A regenerált vonalakból 78-at vizsgálva 27 esetében találtuk meg a cmg1 gént, ezek közül 20 vonal mutatott több-kevesebb rezisztenciát a biotesztek során. ! A bizonyítottan transzgénikus vonalakon élelmiszer biztonsági vizsgálatokat végeztünk. ! A génexpressziós fehérje termékre fókuszált eddigi vizsgálatok alapján nem jelentenek élelmiszer-biztonsági kockázatot. ! Elkészítettük a zöldszövet-specifikus promoterrel irányított CMG konstrukciót és megszületett az els! 9 feltételezetten transzgénikus növény ezzel a konstrukcióval.
Szövetspecifikus transzgén szabályozás " Ribulóz-1,5-biszfoszfát karboxiláz/ oxigenáz enzim (RuBisCO) " Zöldszövet specifikus " Az idegen fehérje a takarmány és élelmiszeripari szempontból jelent!s szövetekben nincs jelen.
A transzformációs rendszer
Kalász primordium izolálás
Növénynevelés
T0 transzgenikus növény
Szövettenyésztés és Növényregenerálás
Géntranszfer kotranszformáció
Biotest. Bonitálás Stackmann alapján Sorszám
Név
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
3A/1/1 3A/1/2 3A/1/3 3A/1/4 3A/1/5 3A/1/6 3A/1/7 3A/1/8 3A/1/9 3A/1/10 3A/1/11 3A/1/12 3A/1/13 3A/1/14 3A/1/15 3A/1/16 3A/1/23 3A/1/24 3A/1/25 3A/1/26 3A/1/27 3A/1/28
Bonitálási érték 0;1-3 0;1 0;10;1-3 0;1 0; 0;1 0 0;1 0;1-2 0;1-2 0;2 0;1-3 0;2-3 0;1-2 0;1-2 0;1-2 0;1 2-3 0;10;1 2 0;1 0 0; 2-3 0 0;
Sorszám 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K1 K2 K3
Név 3A/1/29 3A/1/30 3A/1/31 3A/1/32 3A/1/33 3A/1/34 3A/1/35 3A/1/36 3A/1/37 3A/1/38 3A/1/39 3A/1/40 3A/1/41 3A/1/42 3A/1/43 3A/1/44 3A/1/45 3A/1/46 3A/1/47 CY-45 Délibáb Dogankent
Bonitálási érték 0; 0;2-3 0 0; 2-3 0 0;1 2-3 0 0;1 0 0;1 0 0;1 2 0 0;1-2 0 0;1-2 0 0;2 0;1 2-3 0 0;1-2 0;2-3 0 0; 1-2 0 0;-1 0;2-3 0 0;2-3 0 0;2-3 0 0;-1 0;2-3 4 (S) 0:X
PCR teszt
RuBisCO promoter-cmg1 gén Fragment: 356bp Hasadás
Minta
41 mintából 32db transzformáns a cmg1 génre 9db PCR alapján negatív 32 : 9 3:1
3A/1/2 3A/1/3 3A/1/5 3A/1/6 3A/1/7 3A/1/8 3A/1/24 3A/1/26 3A/1/28 3A/1/29 3A/1/33 3A/1/34 3A/1/43 3A/1/47 3A/1/9 3A/1/10 3A/1/11 3A/1/14 3A/1/15
Bioteszt
Minta
PCR
0;1 0;10;1 0; 0;1 0 0;1 0;10;1 0 0; 0; 0 0;1 0 0;1 0 0;-1
+
0 0;-1 0;0-2 0;1-2 0;2 0;1-2? 0;1-2?
+
+ + + + + + + + + + + + + + + + +
3A/1/16 3A/1/25 3A/1/27 3A/1/30 3A/1/31 3A/1/32 3A/1/35 3A/1/36 3A/1/37 3A/1/38 3A/1/40 3A/1/42 3A/1/45 3A/1/46 3A/1/1 3A/1/4 3A/1/12 3A/1/13 3A/1/23 3A/1/39 3A/1/41 3A/1/44
Bioteszt
0;1-2? 0;1 2 0 0; 2-3 0;2-3 0 0; 2-3 0 0;1 2-3 0 0;1-2 0 0;1 2 0 0;1-2 0 0;1-2 0 0;2 0 0;1-2 0 0; 2-3 0 0;2-3 0;1-3 0;1-3? 0;1 2-3? 0;2-3? 0;1 2-3 0;1 2-3 0;2-3 0;2-3
PCR + + + negativ + + + + + + + + + + negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ
Rt-PCR
!"#$%&'()*+,*-'./012.'34,' ' !"#$'56)7*',*78*9*:' -74;*7*33*<' ' =>>?-'@7A5;*),' '
Fehérjekimutatás I. • 20 aminosav hosszúságú oligopeptid • Ellenanyag el!állítása nyúlban – Poliklonáris IgG ellenanyag tisztítása dialízissel • Kalibrációs görbe beállítása kompetitív indirekt ELISA módszerre • Western-blot el!kísérlet kontroll mintákon
1,4
Abszorbancia (490/630 nm)
– Esetleges keresztaktivitás kimutatása
Cmg1-1 kalibrációs görbe 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,001
0,01
0,1
1
10
100
cmg1-1 koncentráció (µg/ml)
1000
B*C,*7)'?
L (745A;4M'NO%=P'Q'MRSTNO%=P'+"'' L /4C9U,IC' L V?W'XYZ'[C9,ACI5\'@*H67]*'
Fehérjekimutatás III. Szövetspecifitás bizonyítása Különböz" szöveti eredet# minták teljes fehérjeizolátuma Szövetek: Gyökér Szár Levél Éretlen mag (viaszérés) Érett mag (labortiszta liszt)
összegzés Minta
3A/1/2 3A/1/3 3A/1/5 3A/1/6 3A/1/7 3A/1/8 3A/1/24 3A/1/26 3A/1/28 3A/1/29 3A/1/33 3A/1/34 3A/1/43 3A/1/47 3A/1/9 3A/1/10 3A/1/11 3A/1/14 3A/1/15
Bioteszt
0;1 0;10;1 0; 0;1 0 0;1 0;10;1 0 0; 0; 0 0;1 0 0;1 0 0;-1 0 0;-1 0;0-2 0;1-2 0;2 0;1-2? 0;1-2?
PCR
Rt PCR Western blot
+
Rt +
1.+
+
Rt +
2. +
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
2. +
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
Rt +
1.+
+
2. +
+
2. +
+
2. +
+
2. +
+
Rt +
2. +
Minta
3A/1/16 3A/1/25 3A/1/27 3A/1/30 3A/1/31 3A/1/32 3A/1/35 3A/1/36 3A/1/37 3A/1/38 3A/1/40 3A/1/42 3A/1/45 3A/1/46 3A/1/1 3A/1/4 3A/1/12 3A/1/13 3A/1/23 3A/1/39 3A/1/41 3A/1/44
Bioteszt
0;1-2? 0;1 2 0 0; 2-3 0;2-3 0 0; 2-3 0 0;1 2-3 0 0;1-2 0 0;1 2 0 0;1-2 0 0;1-2 0 0;2 0 0;1-2 0 0; 2-3 0 0;2-3 0;1-3 0;1-3? 0;1 2-3? 0;2-3? 0;1 2-3 0;1 2-3 0;2-3 0;2-3
PCR +
Rt PCR Rt +
Western blot 2. +
+
2. +
+ negativ
2. + negativ
+
2. +
+
2. +
+
2. +
+
2. +
+
Rt +
2. +
+
2. +
+
2. +
+
2. +
+
2. +
+
2. +
negativ
negativ
negativ
Rt -
negativ
negativ
Rt -
negativ
negativ
Rt -
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
negativ
Eredmények összefoglalása • Transzformációs vektor RuBisCO kisalegység promóterrel • Kotranszformáns GM vonalak el"állítása közvetlen géntranszfer módszerrel • GM vonalak PCR analízis • Mesterséges fert"zési tesztek módosítása, optimalizálása
Hexaploid búza Szövetspecifikus szabályzás Jó eredmény provokációs tesztben
• Provokációs teszt kevertspórás levélrozsda patotípusokkal • Rt-PCR • !-1,3 exo-glükanáz specifikus nyúl IgG ellenanyag • “+” kontroll fehérje termeltetése, tisztítása • Western-blot
További célok QPCR Kópiaszám megállapítása Folyamatban: el!zetes eredmények – 4 vagy 8 detektálható a PCR pozitív növények mintáiban
Publikálás Folyamatban
USA Minneapolis: UG99
Lisztharmat rezisztencia kialakítása búzában
