LAPORAN PENDAHULUAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI BIOPROSES IDENTITAS PRAKTIKAN
I. II.
Nama
: Lily Diana Novitasari
NIM
: 03121003073
Kelompok/Shift
: 6 (enam) / Jum’at Siang
NAMA PERCOBAAN
: Medium
TUJUAN PERCOBAAN 1)
Dapat membuat media untuk menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroba.
2)
Mengetahui pengaruh pembuatan media terhadap perkembangan mikroba.
3) III.
Mengetahui teknik sterilisasi dengan autoklaf.
DASAR TEORI 3.1.
Pengertian Medium Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai
untuk menumbuhkan bakteri. Selain untuk menumbuhkan bakteri, medium dapat digunakan pula untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologi, dan perhitungan mikroba. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi medium berupa molekul-molekul
kecil
yang
dirakit
untuk
menyusun
komponen
sel.
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut
medium.
Medium
yang
digunakan
untuk
menumbuhkan
dan
mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan
jenis-jenis
mikroorganisme
yang
bersangkutan.
Beberapa
mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien
1
2
dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. Dasar makanan yang paling baik bagi bakteri ialah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat. Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin). Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan seperti jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan. Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang lebih 43oC. Agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode bacteriaological. Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam
3
bentuk. Nutrien diambil dari lingkungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel, beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler. Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru. Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20 oC -40oC. PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan . Media tersusun dari protein, asam amino, energi dan vitamin, dapat berbentuk : a) Media alami, disusun oleh bahan alami, kentang, dagimg, susu, telur dan lainlain. b) Media sintetik, disusun dari senyawa kimia. c) Media semi sintetis, media yang disusun berdasarkan campuran bahan alami dan bahan sintetis. Tujuan penggunaan media yaitu untuk isolasi, seleksi, evaluasi dan diferemsiasi biakan yang didapat, artinya penggunaan zat tertentu yang
mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembang biakan. Setiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan maksudnya. Media yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium ialah kaldu cair dan kaldu agar. Medium ini tersusun daripada kaldu bubuk 3 gram, pepton 5 gram, air suling 1000 gram. Jika diperlukan medium padat, maka ditambahkan 15 gram agar. Media ini disebut media baku. Jika tidak ada kaldu bubuk, bahan itu dapat diganti dengan rebusan daging yang diperoleh sebagai berikut: ambil barang 0,5 kg daging yang tidak berlemak, rendam dalam 1.000 ml air suling semalam dalam almari es. Paginya, buanglah lemak vang mungkin terdapat mengapung di permukaan air. Kemudian saring suspensi lewat kain kasa yang halus. Tambahkan air suling kepada filtrat sehingga volume menjadi 1 liter lagi. Kepada medium ini ditambahkan 5 gram pepton dan lain-lainnya yang diperlukan, lalu panasi suspensi sampai 100°C selama 20 menit. Akhirnya tuangkanlah suspensi lewat kertas saring, dan tambahkan air suling lagi sehingga volume tetap 1 liter. Medium ini perlu disterilkan dahulu sebelum digunakan untuk memiara bakteri. juga 3.2.
keasaman
medium
perlu
diatur,
biasanya
pH
7.
Jenis-jenis Medium Adapun macam-macam media pertumbuhan antara lain :
1. Medium berdasarkan sifat fisik a) Medium padat, yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat. b) Medium setengah padat, yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Medium semi padat dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh medium tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. c) Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). 2. Medium berdasarkan komposisi a) Medium sintesis, yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya glucose agar dan mac conkey agar. b) Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa
5
dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. c) Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya tomato juice agar, brain heart infusion agar, pancreatic extract. 3. Medium berdasarkan tujuan a) Medium untuk isolasi, media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya nutrient broth, blood agar. b) Medium selektif/penghambat, media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. c) Medium diperkaya (enrichment), media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya blood tellurite agar, bile agar, serum agar, dll. d) Medium untuk peremajaan kultur adalah media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur. e) Medium untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik, media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah koser’s citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. f) Medium untuk karakterisasi bakteri, media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah nitrate broth, lactose broth dan arginine agar. g) Medium diferensial, media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. Meskipun telah dijabarkan berbagai macam jenis dari medium, perlu diiingat bahwa tidak ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan bagi kultivasi untuk semua bakteri di laboratorium. Bakteri amat beragam, baik dari persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa berapa bakteri memiliki persyaratan nutrient yang sederhana, sedang yang lain memiliki persyaratan yang rumit. Karena alasan ini kondisi harus disesuaikan sedemikian rupa sehingga bisa menguntungkan bagi kelompok bakteri yang sedang ditelaah. 3.2.1 Lactose Broth Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (preenrichment broth) untuk salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien essensial untuk melakukan metabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa. 3.2.2. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) Eosin Methylene Blue Agar mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan
keraguan.
Bagaimanapun
media
ini
sangat
baik
untuk
mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung.
7
EMB yang menggunakan eosin dan methylene blue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri coli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat). Tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air. 3.2.3. Nutrient Agar Nutrient agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. natrium merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan. 3.2.4. Nutrient Broth Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut: 1. Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/aquadest. 2. Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama. 3. Atur pH sampai 7,0. 4. Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml. 5. Sterilisasi dengan autoklaf. 3.2.5. MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)
MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. Agar MRSA mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung: 1. Protein dari kasein 10 g/L 2. Ekstrak daging 8,0 g/L 3. Ekstrak ragi 4,0 g/L 4. D (+) glukosa 20 g/L 5. Magnesium sulfat 0,2 g/L 6. Agar-agar 14 g/L 7. Dipotassium hidrogen phosphat 2 g/L 8. Tween 80 1,0 g/L 9. Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L 10. Natrium asetat 5 g/L 11. Mangan sulfat 0,04 g/L 3.2.6. Trypticase Soy Broth (TSB) TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. 3.2.7. Plate Count Agar (PCA) PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini
9
baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks. 3.2.8. APDA Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat. 3.2.9. Potato Dextrose Agar (PDA) PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 gram media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. Campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.
DAFTAR PUSTAKA
Andi,M.
2013.
Laporan
Medium
Bakteri.
[Online].
http://sukseszona.
blogspot.com/2013/12/laporan-medium-bakteri.html. (Diakses tanggal 18 Maret 2015) Setiawan,A. 2013. Laporan Lengkap Mikrobiologi Pembuatan Medium Agar (NA). [Online]. http://dewa-mikrobiologi.blogspot.com/2013/06/laporanlengkap-mikrobiologi-pembuatan.html. (Diakses tanggal 18 Maret 2015) Shikamaru,J. 2014. Laporan Praktikum Pembuatan Medium PDA Alami. [Online]. https://www.academia.edu/7236411/Laporan_Praktikum_pembuatan_medi um_PDA_Alami. (Diakses tanggal 18 Maret 2015) Warman,S. 2014. Bentuk, Susunan dan Sifat Media untuk Pertumbuhan Bakteri Ruang Lingkup Mikroorganisme. [Online]. http://www.sandywarman.com /2014/09/bentuk-susunan-dan-sifat-media-untuk.html. (Diakses tanggal 18 Maret 2015) Yuliani,O. 2013. Laporan Pendahuluan Medium. [Online]. https://www.scribd. com/doc/138317014/Laporan-Pendahuluan-Medium. (Diakses tanggal 18 Maret 2015)
