LAMPIRAN
58
Lampiran 1. : Pengamatan karakteristik tanaman
1.
Jenis Pengamatan : visual (sifat kualitatif) atau pengukuran (sifat kuantitatif ) Metode pengamatan karakteristik yang dianjurkan dijelaskan pada kolom tiga (3) pada tabel karakter tanaman dengan kode berikut: MG :
Pengukuran dilakukan secara menyeluruh terhadap satu kelompok tanaman atau organ-organ tanaman Single measurement of a group of plants or parts of plants
MS
:
Pengukuran dilakukan secara satu per satu terhadap sejumlah individu tanaman atau organ tanaman Measurement of a number of individual plants or parts of plants
VG
:
Pemeriksaan visual dilakukan secara menyeluruh terhadap satu kelompok tanaman atau organ-organ tanaman Visual assessment by a single observation of a group of plants or parts of plants
VS
:
Pemeriksaan visual dilakukan secara satu per satu terhadap sejumlah individu tanaman atau organ tanaman Visual assessment by observation of individual plants or parts of plants
2. Pengamatan (untuk individu) dilakukan terhadap sampel pada tiap satuan percobaan 3. Jumlah sampel pengamatan untuk tiap satuan pengamatan 5 sample (diberi ajir) 4.
Stadia pengamatan (Lampiran 2.) •
Pengamatan varietas campuran : a. dilakuan tiga kali pengamatan : i. Fase vegetatif ii. Fase generatif iii. Fase generatif akhir (fase masak, ± 7 hari sebelum panen b. Varietas campuran (CVL : campuran varietas lain) yang ditemukan ditandai dalam lay out percobaan dan dibuang c. Bila terdapat individu tanaman yang meragukan (CVL atau bukan) dapat dilihat perkembangan tanaman selanjutnya, dan individu tanaman tersebut tidak dibuang tetapi ditandai terlebih dahulu.
59
Lampiran 2. Angka (kode) untuk stadia pertumbuhan General Description Deskripsi Umum
Stadia* (Kode)
Keterangan tambahan untuk Gandum, Barley, Rye, Oats dan Padi menembus Daun kedua terlihat (kurang dari 1 cm
10
Daun pertama koleoptil
39
Leher daun bendera daun bendera pertamakali terlihat
Pada padi : kebalikan dari stadia auricle Stadia sebelum booting
Booting 40
Tahap akhir fase bunting, menjelang berbunga
54
½ bunga keluar (muncul)
55
malai mulai keluar (½ - ¾ )
56
¾ malai keluar
60
Awal mekarnya bunga
Ukuran calon bunga mulai membesar Stadia awal bunting.
Awal mekarnya bunga 65
Berbunga 50 %
70
Awal perkembangan pengisian susu Masak susu Awal pengerasan biji
80
Pemasakan
90
Masak
Padi : spikelet utama masak
91
Kariopsis mengeras : susah untuk dipisahkan dengan menggunakan kuku.
Padi : 50 % biji pada malai masak
92
Malai sudah mengeras (sulit Padi : lebih dari 90% biji pada dibedakan antara kulit biji (testa) malai masak dengan kulit buah
Ket : *) menunjukan stadia pengamatan pada lampiran 3 dan 4, kolom (2)
60
Lampiran 3. Karakter kualitatif tanaman padi No urut (1) 1
2
3
4
5
6
7
Stadia Karakter tanaman pengamatan (2) (3) 10 Koleoptil : warna anthocyanin VS Tidak Berwarna Hijau Ungu 40 Daun Bagian Bawah : Warna Pelepah VS Hijau Hijau dengan garis ungu Ungu muda Ungu 40 Daun : Intensitas Warna Hijau VG Hijau muda Hijau Hijau tua 40 Daun : Warna Anthocyanin VG Tidak ada 40 VG
40 VG 40 VG
8
9
10
40 VS
40 VG 40 VS
Ada Daun : Distribusi Warna Anthocyanin Hanya pada bagian ujung daun Pada bagian pinggir Bercak-bercak Menyeluruh Pelepah Daun : Warna Anthocyanin Tidak ada Ada Pelepah Daun : Intensitas Warna Anthocyanin Sangat lemah Lemah Sedang Kuat Daun : Bulu pada permukaan daun Tidak ada atau sangat lemah Lemah Sedang Kuat Daun : Telinga Daun (Auricle) Tidak ada Ada Daun : Warna Anthocyanin pada telinga daun (Auricle) Tidak ada Ada
Varietas Contoh (4) IR64
Notasi (5)
BPI 76(NS)
1 3 5
IR64 BPI 76 (NS) PSBRC 50 Situ patenggang
1 2 3 4
IR64 BPI 76 (NS) Fatmawati
3 5 7
IR64 Situ patenggang
1 9
BPI 76 (NS)
1 2 3 4
IR64 Situ patenggang
1 9
C4-63-P6 K39-96-1-1-1-2
1 3 5 7
Ciherang Fatmawati
1 3 5 7
IR64
1 9
IR64 Way Rarem
1 9
61
No urut (1) 11
12
13
14
15
16
Stadia Karakter tanaman pengamatan (2) (3) 40 Daun : Leher daun (Collar)) Tidak ada VS Ada 40 VG 40 VS 40 VS 40 VS
60 VG
17
18
19
90 VG
70 VS
55 VG
20
60 VS/MS
Varietas Contoh (4)
IR64
Daun : warna anthosianin pada leher daun IR64 Hijau Way Rarem Ungu Daun : lidah daun (Ligula) Tidak ada Ada Ciherang Daun: Bentuk lidah daun (Ligula) Acute (runcing) Cleft (berlekuk) Ciherang Daun : Warna lidah daun (Ligula) Tidak berwarna Ciherang Hijau Hijau dengan garis ungu Maninjau Ungu muda Jatiluhur Ungu Situ patenggang Daun Bendera : Perilaku Helai Daun (pengamatan awal) Tegak Ciherang Agak tegak Cirata Horizontal Jatiluhur Melengkung Way Rarem Daun Bendera : Perilaku Helai Daun (pengamatan akhir) Tegak Ciherang Agak tegak Cirata Horizontal Jatiluhur Melengkung Way Rarem Batang : Perilaku Batang Tegak Digul Agak tegak Cisantana Terbuka Tukad Petanu Agak terbuka IR64 Menyebar Dodokan Umur Berbunga: 50 % tanaman telah berbunga Sangat genjah Dodokan Genjah Ciherang Sedang Cisadane Dalam (Lambat) Pandan Wangi Mandul Jantan Tidak Ada mandul jantan sebagian
Notasi (5) 1 9 1 2 1 9 1 2 1 2 3 4 5
1 3 5 7
1 3 5 7 1 3 5 7 9
1 3 5 7 1 2
62
No urut (1)
Stadia pengamatan (2)
21
65 VS
22
23
70 VS 70 VS
24
25
26
27
70 VS 90
60 VS 60 VS
28
29
70-80 VS
60-80
Karakter tanaman (3) mandul jantan Anak Bunga (Spikelet): Warna putik Putih Hijau muda Kuning Ungu Muda Ungu Batang : Warna anthocyanin pada buku Tidak ada Ada Batang : Intensitas warna anthocyanin pada buku Lemah Sedang Kuat Batang : Warna anthocyanin pada ruas Tidak ada Ada Lemma Steril : Warna Kuning Jerami Kuning Emas Merah Ungu Malai : Bulu ujung gabah (awns) Tidak ada Ada Malai : Warna bulu ujung gabah (pengamatan awal) Putih kekuning-kuningan Kekuning-kuningan Coklat Coklat kemerah-merahan Merah muda Merah Ungu muda Ungu Hitam Malai : Distribusi bulu ujung gabah Hanya diujung malai Hanya ¼ di bagian atas gabah Hanya pada bagian atas malai Hanya ¾ bagian gabah Sepanjang malai Anak bunga: kepadatan rambut pada lemma
Varietas Contoh (4)
Angke IR64 Dodokan
Notasi (5) 3
Way Rarem
1 2 3 4 5
Ciherang Cirata
1 9
Situ patenggang Citanduy
3 5 7
Ciherang Way Rarem
1 9
Fatmawati Situ patenggang Cirata
1 2 3 4
Angke Ciherang
1 9
Rojolele
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kewal nengsih Kewal arjuna
Ciherang Conde Tukad unda Rojolele
1 2 3 4 5
63
No urut (1)
Stadia pengamatan (2) VS
30
90 VS
31
32
33
34
35
36
90 VG
90 VS 90 VS
90 VS
90 VG
90 VG
Karakter tanaman
Varietas Contoh (4)
(3) Tidak ada atau sangat lemah Lemah Batang gadis Sedang Widas kuat Mekongga Sangat kuat Fatmawati Anak bunga : warna bulu (pengamatan akhir) kuning jerami keemasan coklat coklat kemerahan merah cerah merah ungu muda ungu hitam Malai : karakternya terhadap batang upright semi-upright slightly drooping strongly drooping Malai: keberadaan cabang sekunder Ada Tidak ada Ciherang Malai : tipe cabang sekunder Type 1 Lemah Dodokan Type 2 Kuat Ciherang Type 3 Mengelompok Batu tegi Malai : perilaku dari cabang malai Erect Tegak Semi-erect Agak tegak Spreading Menyebar Malai : eksersi (pemunculan malai dari leher malai) Tertutup (tidak muncul) Sebagian Muncul Muncul Muncul sampai muncul sempurna Muncul sempurna Umur Matang Sangat genjah Genjah Sedang Lambat (Dalam) Sangat lambat (Sangat dalam)
Notasi (5) 1 3 5 7 9 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 1 9 1 2 3
Cigeulis Mekongga
1 3 5
Cilamaya Muncul Fatmawati Cisadane IR64 Batang Piaman
1 3 5 7 9
Dodokan IR64 Cisadane Pandan Wangi
1 3 5 7 9
64
No urut (1) 37
38
39
40
41
43
44
45
Stadia Karakter tanaman pengamatan (2) (3) 92 Daun : Gejala penuaan (senesens) VG Cepat Sedang Lambat 92 Lemma : Warna VS Straw (kuning jerami) Gold (kuning emas) Brown (coklat) Reddish to light purple Purple (ungu) Black (hitam) 92 Lemma: warna antosianin pada keel (pengamatan akhir) VS tidak ada lemah sedang kuat 92 Lemma: pewarnaan antosianin pada VS daerah dibawah apex (pengamatan akhir) tidak ada lemah sedang kuat sangat kuat 92 Lemma: warna antosianin pada apex VS (pengamatan akhir) tidak ada lemah sedang kuat sangat kuat Gabah : bentuk round (bulat) ovum oval long (panjang) 92 Lemma: rekasi terhadap phenol VG Tidak ada Ada 92 Lemma: intensitas pewarnaan phenol VG cerah/ringan sedang gelap
Varietas Contoh (4)
Notasi (5)
Batang gadis Ciherang Fatmawati
3 5 7
IR64 Fatmawati
1 2 3 4 5 6
Cirata Situ patenggang Setail
1 3 5 7
1 3 5 7 9
1 3 5 7 9
1 9 3 5 7
65
Lampiran 4 Karakter kuantitatif tanaman No urut 1
Stadia Pengamatan 40 MS
Daun : Panjang lidah daun
2
40 MS
Daun : Panjang helai daun
3
40 MS
Daun : Lebar helai daun
4
70 VS
Batang: Ketebalan
5
70 VS
Batang: Panjang (tidak termasuk malai, tidak termasuk padi air dalam)
6
72-90
MS
7
70 MS
8
70-80 VS
Karakter
Malai: Panjang ”cabang utama” Malai: Jumlah malai per rumpun Malai : Panjang dari bulu ujung gabah terpanjang
9
Jumlah anakan
10
Tinggi Tanaman
11
Jumlah anakan produktif
12
92 MS
Gabah : Bobot 1000 biji bernas
13
92 MS
Panjang lemma steril
14
92 MS
Gabah : Panjang gabah
15
92 MS
Gabah: Lebar gabah
16
92 MS
Gabah : rasio panjang lebar gabah
66
Lampiran 5 Deskripsi varietas Hipa 6 Jete Nomor seleksi Asal persilangan Golongan Umur tanaman Bentuk tanaman Tinggi tanaman Anakan produktif Gabah isi per malai Warna kaki Warna batang Warna telinga daun Warna lidah daun Warna daun Permukaan daun Posisi daun Posisi daun bendera Leher malai Bentuk gabah Warna gabah Kerontokan mudah Kerebahan Tekstur nasi Kadar amilosa Bobot 1000 butir Rata-rata hasil Potensi hasil Ketahanan terhadap hama Ketahanan terhadap penyakit
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Anjuran tanam Pemulia
: :
Peneliti
:
Teknisi
:
Dilepas tahun
:
H36 A2/R17 Cere 101-128 hari Tegak 90,20-119,93 cm 7-14 91 – 266 butir Hijau Hijau Tidak berwarna Tidak berwarna Hijau tua Kasar Tegak Tegak Tertutup (tidak berleher) Ramping Kuning jerami Mudah Tahan Pulen 21,7% 22,18-26,67 gr 7,36 t/ha 10,60 t/ha Rentan terhadap wereng coklat biotipe 2 Agak rentan terhadap hawar daun bakteri patotipe IV dan VIII Rentan terhadap virus tungro Tidak ditanam pada daerah endemik OPT Satoto, Murdani D.,Yudistira Nugraha, dan Sudibyo TWU E. Lubis, Indrastuti A. Rumanti, Yuni Widiastuti, Suwarno, Agus Guswara, I.N. Widiarta, Triny S. Kadir, Alidawati, Neni Ernawati, Suwarto, Untung Sumarno, dan Himawan Munada, Warsono, Warsidi, Suwarto, Ajat Sudrajat, A Abdul Somad, Cecep Suparman, dan Sukirman. 2007
67
Lampiran 6 Deskripsi varietas Hipa 7 Nomor seleksi Asal persilangan Golongan Umur tanaman Bentuk tanaman Tinggi tanaman Anakan produktif Warna kaki Warna batang Warna telinga daun Warna lidah daun Warna daun Permukaan daun Posisi daun Posisi daun bendera Leher malai Bentuk gabah Warna gabah Kerontokan mudah Kerebahan Tekstur nasi Kadar amylosa Indeks glikemik Bobot 1000 butir Jumlah gabah bernas permalai Rata-rata hasil Potensi hasil Ketahanan terhadap hama Ketahanan terhadap penyakit
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Anjuran tanam
:
Pemulia Peneliti
: :
Teknisi
:
Alasan utama dilepas
:
Dilepas tahun
:
H25 A1/R14 Cere indica 112 hari Tegak 106 cm 16 batang Hijau Hijau Hijau Tidak berwarna Hijau Kasar Tegak Sedang Kuning Sedang Agak tahan Pulen 22,0% 49 29,8 gr 115-131 butir 7,6 t/ha 11,4 t/ha Rentan terhadap wereng coklat biotipe 3 Agak rentan terhadap hawar daun bakteri patotipe IV dan VIII Tahan terhadap virus tungro Baik ditanam pada sawah irigasi dan sawah tadah hujan Satoto, Sudibyo TWU dan Murdani D Yudistira N, Yuni Widiastuti, Agus Guswara, dan Entis Sutisna Warsidi, Munada, Prima, Ujang Sarmadi, A Abdul Somad, Cecep Suparman, Suardi, Warsono, dan Sukirman. Potensi hasil 10% lebih tinggi dibanding Ciherang, tahan tungro dan adaptasi luas 2009
68
Lampiran 7 Deskripsi varietas Hipa 8 Nomor seleksi Asal persilangan Golongan Umur tanaman Bentuk tanaman Tinggi tanaman Anakan produktif Warna kaki Warna batang Warna telinga daun Warna lidah daun Warna daun Permukaan daun Posisi daun Posisi daun bendera Leher malai Bentuk gabah Warna gabah Kerontokan mudah Kerebahan Tekstur nasi Kadar amylosa Indeks glikemik Bobot 1000 butir Jumlah gabah bernas permalai Rata-rata hasil Potensi hasil Ketahanan terhadap hama Ketahanan terhadap penyakit
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Anjuran tanam
:
Pemulia Peneliti
: :
Teknisi
:
Alasan utama dilepas
:
Dilepas tahun
:
H51 A1/PK21 Cere 110-112 hari Tegak 120-130 cm 14-18 batang Hijau Hijau Hijau Tidak berwarna Hijau Kasar Tegak Tegak Sedang Kuning jerami Sedang Sedang Pulen 22,7% 73,5 27-29 gr 7,5 t/ha 10,4 t/ha Rentan terhadap wereng coklat biotipe 3 Agak tahan terhadap hawar daun bakteri patotipe VIII Agak rentan terhadap hawar daun bakteri patotipe IV Rentan terhadap virus tungro Baik ditanam pada daerah dataran rendah <450 m dpl Satoto, Sudibyo TWU dan Murdani D Yudistira N, Yuni Widiastuti, Agus Guswara, dan Entis Sutisna Warsidi, Sony Suharsono, Munada, Prima, Ujang Sarmadi, A Abdul Somad, Cecep Suparman, Suardi, Potensi hasil 10% lebih tinggi dibanding Ciherang, tahan hawar daun bakteri, adaptasi luas dan produksi benih lebih mudah dibandingkan hibrida lainnya 2009
69
Lampiran 8 Deskripsi varietas Hipa 9 Nomor seleksi Asal persilangan Golongan Umur tanaman Bentuk tanaman Tinggi tanaman Anakan produktif Jumlah malai/m2 Warna kaki Warna batang Warna telinga daun Warna lidah daun Warna daun Permukaan daun Posisi daun Posisi daun bendera Leher malai Bentuk gabah Warna gabah Kerontokan mudah Kerebahan Tekstur nasi Kadar amylosa Indeks glikemik Bobot 1000 butir Jumlah gabah bernas permalai Rata-rata hasil Potensi hasil Ketahanan terhadap hama Ketahanan terhadap penyakit
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Anjuran tanam
:
Pemulia Peneliti
: :
Teknisi
:
Alasan utama dilepas
:
Dilepas tahun
:
H30 A1/R12 Cere 115 hari Tegak 103 cm 14 batang 315 Hijau Hijau Tidak berwarna Tidak berwarna Hijau Kasar Tegak Tegak Terbuka Sedang Kuning Jerami Sedang Tahan Pulen 22,3% 73,5 27,3 gr 8,1 t/ha 10,4 t/ha Rentan terhadap wereng coklat biotipe 3 Agak tahan terhadap hawar daun bakteri patotipe III. Agak rentan terhadap hawar daun bakteri patotipe VIII Rentan terhadap virus tungro Baik ditanam pada daerah dataran rendah <450 m dpl Satoto, Sudibyo TWU dan Murdani D Yudistira N, Yuni Widiastuti, Baehaki SE, Triny SK, dan Indrastuti AR. Warsidi, Prima, Ujang Sarmadi, A Abdul Somad, Cecep Suparman, Suardi, Sukirman, suwarto, Soedirman dan Warsono. Produktivitas tinggi dan tahan hawar daun bakteri. 2010
70
Lampiran 9 Deskripsi varietas Hipa 10 Nomor seleksi Asal persilangan Golongan Umur tanaman Bentuk tanaman Tinggi tanaman Anakan produktif Warna kaki Warna batang Warna telinga daun Warna lidah daun Warna daun Permukaan daun Posisi daun Posisi daun bendera Leher malai Bentuk gabah Warna gabah Kerontokan Kerebahan Tekstur nasi Kadar amylosa Indeks glikemik Bobot 1000 butir Jumlah gabah bernas permalai Rata-rata hasil Potensi hasil Ketahanan terhadap hama Ketahanan terhadap penyakit
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Anjuran tanam
:
Pemulia
:
Peneliti
:
Teknisi
:
Alasan utama dilepas
:
Dilepas tahun
:
H47 A6/PK18 Cere 114 hari Tegak 97 cm 20 batang Hijau Hijau Putih Hijau Hijau Kasar Tegak Tegak Ramping Kuning Emas Sedang Pulen 19,7% 26,1 gr 8,1 t/ha 9,4 t/ha Rentan terhadap wereng coklat biotipe 3 Agak tahan terhadap hawar daun bakteri patotipe III Agak rentan terhadap hawar daun bakteri patotipe VIII Rentan terhadap virus tungro Baik ditanam pada daerah dataran rendah <450 m dpl Satoto, Sudibyo TWU , Murdani D, Yuni Widiastuti dan Indrastuti AR Trini SK, Agus Setyono, Prihadi W dan Baehaki SE.dan Endang S. Warsidi, Munada, Prima, Ujang Sarmadi, A Abdul Somad, Cecep Suparman, Suardi, Warsono, dan Sukirman. Produktivitas hasil lebih tinggi dan lebih tahan hawar daun bakteri. 2010
71
Lampiran 10 Nilai kemiripan genetik delapan galur tetua hibrida (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(1) IR62829A
1.00
(2) B8094F
0.56
1.00
(3) IR58025A
0.48
0.68
1.00
(4) IR40750
0.36
0.64
0.80
1.00
(5) BP51-1
0.44
0.56
0.88
0.78
1.00
(6) S4325A
0.44
0.64
0.72
0.84
0.68
1.00
(7) IR68897A
0.64
0.68
0.84
0.72
0.80
0.64
1.00
(8) Bio-9
0.56
0.76
0.76
0.56
0.64
0.64
0.76
(8)
1.00
72
Lampiran 11 Gam mbar bebera apa karakter kualitatif pada Hipa 6 da an Hipa 7 No Karakter K 1
2
Koleoptil warna anthoccyanin
Hipa 6
H Hipa 7
Tidak berwarna b
Tidakk berwarna
Hijau
Hijau
A Ada. Cleft (b berlekuk) Tidak berwarna b
Ada Cleft (berlekuk) Tidakk berwarna
Daun a. a Leher daun (Collar) Warna anto osianin
b. b Lidah daun (Ligula) Bentuk, Wa arna
3
Anak A Bunga (Spikelet): ( Warna putik (stigma)
4
5
Putih
Putih
Warna W anthoc cyanin pada p buku Warna W anthoc cyanin pada p ruas
Tidak ada
Tidak ada a
Lemma L Steril : Warna
Kuning Jerami
Kuning Je erami
Batang B
73
No Karakter 6
Hipa 6
Hipa 7
Malai : a. Bulu ujung gabah Warn na (peng gamatan awa al) (peng gamatan akhir) Distribusi bulu ujung gabah
b. Anak k bunga: Kepa adatan rambut pada lemma Warn na
c. Karakkternya terhadap batan ng
d. Caba ang sekunder Perila aku dari caba ang malaii
Putih kekuning Kuning jerami Hanya a diujung malai
Putih kuningan Kuning jerami Ha anya diujung malai m
Kuat Kuning Jerami
Se edang Kuning Jerami
Agak terkulai
Agak terkulai
Ada, kkuat
Ada, kuat
Agak tegak
Agak tegak
74
No Karakter e. eksersi (pemunculan malai dari leher malai)
7
8
Hipa 6
Hipa 7
Muncul
Muncul sampai muncul sempurna
Lemma : Warna Bentuk
Kuning jerami Ramping panjang
Kuning jerami Ramping panjang
Lemma: Reaksi terhadap fenol Intensitas pewarnaan
Ada,
Ada
Gelap
Gelap
75
Lampiran 12 Prosedur baku pembuatan larutan kimia untuk ekstraksi DNA NaCl 5M (larutan stok, 100ml) (Sambrook et al.1989) Bahan kimia : •
NaCl (Natrium Choride)
•
Aquades streril
Prosedur •
Disiapkan 65 ml aquades steril kemudian ditimbang sebanyak 29,22 g NaCl
•
Secara bertahap dilarutkan NaCl dengan aquades ke dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer.
•
Pelarutan dilakukan sedikit demi sedikit karena NaCl pekat sukar larut dalam air
•
Setelah seluruh bahan benar-benar larut, volumen larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril.
EDTA 0,5M pH 8(larutan stok, 100ml) (Sambrook et al.1989) Bahan kimia : •
Na-EDTA
•
NaOH (Natrium Hydroxide)
•
Aquades streril
Prosedur •
Sebanyak 18,6 g Na-EDTA dan 2,0 gr NaOH dimasukan dalam beaker glass 250 ml
•
Bahan dilarutkan dengan menambahkan 80 ml aquades steril
•
Setelah semua bahan larut, pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter.
•
Pengaturan pH 8 dilakukan dengan manambahkan NaOH 2,5 M pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai.
•
Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril.
76
Tris-HCl 1 M pH 8 (larutan stok, 100ml) (Sambrook et al.1989) Bahan kimia : •
NaCl (Natrium Choride)
•
Aquades streril
Prosedur •
Disiapkan 65 ml aquades steril kemudian ditimbang sebanyak 29,22 g NaCl
•
Secara bertahap dilarutkan NaCl dengan aquades ke dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer.
•
Pelarutan dilakukan sedikit demi sedikit karena NaCl pekat sukar larut dalam air
•
Setelah seluruh bahan benar-benar larut, volumen larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril.
•
Larutan dimasukan pada botol kaca bening 100 ml, lalu disimpan pada suhu ruang.
Buffer ekstrak padi 250 ml Bahan kimia: •
NaCl 5M
•
Tris-HCl 1M pH 8,0
•
EDTA 0,5M
•
Aquades
•
SDS
Prosedur •
Sebanyak 25 ml NaCl 5 M dan 25 ml Tris-HCl 1M dan 25 ml EDTA 0,5M dimasukan dalam beaker glass, bahan dilarutkan dengan menambahkan Aquades
•
Tambahkan 1,2 gr SDS kemudian campur semua bahan dengan manggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer.
•
Tambahkan Aquades hingga volume 250 ml. dan aduk kembali.
•
Simpan buffer ekstrak pada botol kaca bening tertutup, simpan dalam suhu ruang
•
Sebelum digunakan buffer dapat dipanaskan pada suhu 60˚C selama 1-2 jam.
77
CISAM/KIAA (24:1) larutan kerja 100ml (Sambrook et al.1989) Bahan kimia: •
Chloroform
•
Isoamlilalkohol
•
Aquades steril
Prosedur •
Sebanyak 96 ml Chloroform dan 4 ml isoamil alcohol dimasikan dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
•
Pencampuran dilakukan dengan mengguncangkan botol, lalu larutan disimpan pada suhu ruang.
RNAase-A (larutan stok, 10 mg/ml) Bahan kimia: •
RNAase-A
•
Na-Asetat 3 M pH 5,2
•
Tris-HCl 1M
•
Aquades
Prosedur •
Sebanyak 10 mg RNAase-A, 3,3 µl Na-Asetat dan
996,7 µl aquades
dimasukan dalam tabung mikro 2 ml •
Pencampuran dilakukan dengan spin manual.
•
Suspensi yang terbentuk diinkubasi dalam waterbath pda suhu 100˚C selama 15 menit untuk menghilangkan DNAase yang masih terdapat dalam RNAase.
•
Suspensi dibiarkan dingin pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 100 µl larutan Tris-HCL 1M pH 7,4
TE (Tris-EDTA) Buffer 50x (Larutan stok) (Sambrook et al.1989) Bahan kimia : •
Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0
•
Larutan stok EDTA 0,5M pH 8,0
•
Aquades streril
•
Kertas saring
78
Prosedur •
Sebanyak 25 ml larutan stok Tris–HCL dan 5 ml larutan stok EDTA dimasukan dalam beaker glass 100 ml
•
Bahan dilarutkan dengan menambahkan 20 mal aquades steril. pengadukan menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer
•
Setelah semua bahan larut, kemudian disaring menggunakan kertas saring.
•
Larutan dimasukan dalam botol kaca bening tertutup dan disimpan pada suhu ruang.
TE Buffer 1X (larutan kerja, 100 ml) Bahan kimia: •
Larutan stok TE buffer 50X
•
Aquades steril
Prosedur •
Sebanyak 2ml larutan stok TE buffer 50X dan 98 ml aquades steril dimasukan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup
•
Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan pada suhu ruang.
79
Lampiran 13.
Prosedur baku pembuatan larutan kimia untuk elektroforesis horizontal
Buffer TAE 50X (larutan stok, 500 ml) (Sambrook et al 1989) Bahan kimia: •
Trizma base
•
Acetic acid glacical
•
Larutan stok EDTA 0,5M pH 8,0
•
Aquades steril
Alat •
Magnetik stirrer
•
Hot plate stirrer
Prosedur •
Sebanyak 121 gr trizma base, 28,55 ml Acetic acid glacial, 50 ml EDTA 0,5M pH 8,0 dan aquades dilarutkan dengan menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer
•
Setelah tercampur tambahkan aquades hingga mencapai volume 500 ml, aduk sebentar agar tercampur rata.
•
Larutan dimasukan dalam botol kaca bening 500 ml
Buffer TAE 1X (larutan kerja, 1000 ml) Bahan kimia: •
Larutan stok buffer TAE 50X
•
Aquades steril
Prosedur •
Sebanyak 50 ml buffer TAE 50X dimasukan dalam botol bening bertutup kemudian tambahkan 980 ml aquades steril.
•
Pencampuran dilakukan dengan mengguncangkan botol, taruh dalam suhi ruang.
Gel agarose 3 % Bahan kimia: •
Agarose
•
Larutan kerja buffer TAE 1X
80
Prosedur •
Masukan 3 gr agarose dan 100 ml buffer TAE dalam gelas erlemeyer 250 ml
•
Panaskan dalam microwave, pemanasan dilakukan 2-3 kali dengan lama pemanasan masing-masing 1-2 menit. Pemanasan dilakukan hingga larutan agarose tercampur rata dan berwarna bening.
•
Diamkan laruta agarose ± 10 menit hingga uap panasnya hilang sebelum dituangkan ke dalam cetakan.
•
Selanjutnya larutan agarose dituangkan ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir terlebih dahulu. Perhatikan dalam menuangkan gel agar jangan sampai terbentuk gelembung dan agar ketinggian permukaan gel merata.
•
Diamkan selama 30-60 menit hingga gel memadat.
•
Setelah gel padat angkat sisir dengan hati-hati. Gel beserta cetakan diletakkan ke dalam chamber elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TAE.
81
Lampiran 14.
Prosedur baku pembuatan larutan kimia untuk elektroforesis vertikal
Buffer TBE 10X (larutan stok, 1000 ml) Bahan kimia: •
Trizma base
•
Boric acid
•
EDTA
•
Aquades steril
Prosedur •
Masukan 500 ml Aquades dalam beaker glass 1000 ml
•
Masukan 108 gr trizma base, 9,2 gr EDTA dan 55,2 gr boric acid, campur menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer hingga semua bahan larut
•
Setelah semua larut tambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 1000ml, aduk kembali dengan stirrer.
•
Simpan dalam botol kaca bening bertutup 1000 ml taruh dalam suhu ruang.
Acrylamide 40% (larutan stok 1000 ml) Bahan kimia: •
Acrylamide
•
Bisacrylamide, N,N’Methylenebisacrylamide
•
Aquades steril
Prosedur •
Masukan 500 ml Aquades dalam beaker glass 1000 ml
•
Masukan 380 gr Acrylamide aduk dengan menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer hingga semua larut
•
Masukan
20
gr
Bisacrylamide,
N,N’Methylenebisacrylamide,
campur
menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer hingga semua bahan larut •
Setelah semua larut tambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 1000ml, aduk kembali dengan stirrer.
•
Simpan dalam botol kaca bening bertutup 1000 ml taruh dalam suhu ruang.
82
Acrylamide 8% (larutan kerja 1000 ml) Bahan kimia: •
Acrylamide 40 % (larutan stok)
•
Buffer TBE 10X
•
Aquades steril
Prosedur •
Masukan 200 ml Acrylamide 40 % , 50 ml TBE 10X dan 750 ml Aquades dalam beaker glass 1000 ml
•
Campur menggunakan magnetik stirrer pada hot plate stirrer hingga semua bahan larut
Ammonium persulfate solution (APS)10% (40 ml) Bahan kimia: •
Ammonium persulfate solution
•
Aquades steril (dH2O)
Prosedur •
Masukan 4 gr ammonium persulfate solution dan 40 ml aquades ke dalam tube 50 ml yang dibungkus alumunilum foil.
•
Kocok tube hingga seluruh bahan tercampur dan larut
•
Simpan bahan dalam freezer suhu 4˚C
