Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian Kultur Isolat S. pneumoniae hasil seleksi pada Media BA 5% + Gentamisin
Uji Mikrobiologis
Ekstraksi DNA
(Uji sensitivitas antibiotik)
Duplex PCR
Gen erm(B)
Gen mef(A) & erm(B)
Analisis Data
Gen mef(A)
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan No. 1.
Nama Alat Erlenmeyer
Merek/Tipe Duran, 100 dan 500 mL LabServ
Kegunaan Tempat pembuatan media Tempat media agar
2.
Cawan petri plastik
3.
pH meter
Thermo Orion 2 Star pH Benchtop Barnstead Thermolyne Cimarec Precisa
Mengukur pH
4.
Heater dan pengaduk elektrik
5.
Timbangan digital
6.
Esco
7.
Laminar Air Flow Cabinet Mikropipet
8.
Tips
Thermo ; 0,5 µl1000 µl
9.
Autoklaf
Hirayama
10.
Refrigerator
Sanyo
11.
Biomedical Freezer o -86 C
Thermo Freezer
12.
Biomedical Freezer o -30 C
Sanyo
13.
Disposable cotton bud
Puritan
14.
Vortex mixer
VM-300 K
15.
Alat sentrifugasi
16.
Inkubator
Thermo Heraeus Centrifuge Forma Scientific
17.
Sarung tangan nitril
18.
Mengaduk suspensi media
Tempat Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Mengukur berat bahan pembuat media Tempat bekerja secara aseptis Meneteskan suatu larutan dengan akurasi tinggi Tempat meneteskan larutan pada mikropipet Tempat sterilisasi mekanik Tempat penyimpanan media Tempat penyimpanan isolat cair Tempat penyimpanan sampel DNA Mengulas suspensi antibiotik dan bakteri pada media Menghomogenkan suatu suspensi Mengsentrifugasi suatu suspensi Menginkubasi biakan murni mikoba
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Hand Seal
Melindungi tangan dari kontaminan
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Tabung vial
Eppendorf; 1,5 ml
Menyimpan sampel DNA
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
19.
Tabung cryotube
NUNC; 1,8 mL
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
20.
Multiblok heater
Thermo Scientific
Menyimpan media STGG/mikroba murni dalam bentuk cair Memanaskan sampel
Eppendorf; 0,5 µl1000 µl
25
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Washing Facility Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lembaga Eijkman Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
21.
Disposable ose
NUNC
Menginokulasi bakteri
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
22.
Mesin thermal cycler/ PCR
Applied BioSystems 9700
Ruang PCR Lembaga Eijkman
23.
Spektrofotometer
Nano Drop ND1000
Mengamplifikasi sekuens DNA tertentu Mengukur kuantifikasi DNA
24.
Apparatus elektroforesis
Bio-Rad
25.
Power Pac Basic
Bio-Rad
26.
Gel-Doc 1000
Bio-Rad
27.
Jarum ose
Menginokulasi isolat mikroba
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
28.
Pembakar bunsen
Menciptakan suasana aseptis
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
29.
Tabung reaksi
Duran
Menyimpan suspensi cair
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
30.
Water bath
Barnstead
Menjaga suhu media tetap hangat
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
31.
Alumunium foil
Klin-Pak
Menutup erlenmeyer
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
32.
Tissue
Multi
Membersihkan meja kerja
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
33.
PCR Cabinet
Scie-Plas
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
34.
Lilin
Memasukkan sampel DNA yang akan diamplifikasi Sumber panas
35.
Jar (toples kaca)
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
36.
Rak tabung reaksi
Menyimpan media berisi biakan kultur bakteri anaerob Menyimpan tabung reaksi
37.
Biological Safety Cabinet
Tempat bekerja secara aseptis
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya Sumber arus listrik untuk running elektroforesis Visualisasi hasil elektroforesis gel
Nuaire
26
Lab. Konversi Energi (Lab 1) Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman Ruang PCR Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
Lampiran 2. (lanjutan) No.
Nama Bahan
Spesifikasi
Kegunaan
1,5 mL
Isolat bakteri yang tidak peka terhadap Eritromisin
2.
Isolat murni Streptococcus pneumoniae tidak peka terhadap Eritromisin Darah domba
5%
3.
Gentamisin
50 mg/mL
4.
ddH2O
500 mL
Sebagai media tumbuh S. pneumoniae Untuk menghindari kontaminasi bakteri lain terutama Staphylococcus Sebagai pelarut
5.
Etanol
70%
Desinfektan
6.
Mueller-Hinton Broth
1 mL
7.
Mueller-Hinton Agar
500 g
8.
Gel agarosa
1%
9.
Go-Taq Green Master Mix
2x
Larutan nutrisi bakteri untuk uji sensitivitas antibiotik Media uji sensitivitas antibiotik Media untuk elektroforesis gel Buffer untuk reaksi PCR
10.
McFarland Standard
No. 0,5
Blangko untuk mengukur turbiditas suspensi pada uji sensitivitas antibiotik
11.
180.16 g/mol
Sumber karbohidrat pada media
12.
Glukosa (Glucose anhydrous Molecular Biology Grade) Gliserol
87%
Sumber lemak pada media
13.
Tryptone Soya Broth
500 g
14.
Tryptone Soya Agar
500 g
15.
Bubuk Skim-Milk
16.
Forward and reverse primer mef(A) Forward and reverse primer erm(B) DNA ladder
50 µM
Bahan untuk pembuatan media STGG Bahan untuk pembuatan media agar darah Bahan untuk pembuatan media agar darah dan STGG Primer untuk gen mef(A)
50 µM
Primer untuk gen erm(B)
100 bp
DNA Marker pada PCR
20 ng/µL
20.
DNA template S. pneumoniae TE Buffer
1x
DNA template yang digunakan untuk amplifikasi Buffer ekstraksi DNA
21.
Eritromisin disk
15 µg
Antibiotik jenis makrolida
22.
TBE Buffer
1x
Buffer elektroforesis gel
23.
SYBR Safe
400 µl
Pemberi warna yang menyisip pada fragmen basa pada proses elektroforesis gel
1.
17. 18. 19.
27
Lampiran 3. Komposisi Media Agar Darah Domba 5% + Gentamisin. Bahan Darah domba Tryptone Soya-Agar Gentamisin ddH2O
50 ml 40 g 50 µl 1000 ml
28
Komposisi
Lampiran 4. Komposisi Media STGG Bahan Skim milk Tryptone Soya-Broth Glukosa Gliserol ddH2O
2g 3g 0,5 g 10 ml 100 ml
29
Komposisi
Lampiran 5. Komposisi Media Agar Mueller-Hinton + Darah Domba 5% Bahan Mueller Hinton Agar Darah domba ddH2O
Komposisi 38 g 50 ml 1000 ml
30
Lampiran 6. Komposisi Go Taq Green 2x dATP dTTP dGTP dCTP MgCl2 Pewarna kuning Pewarna biru Taq Polymerase Buffer
Bahan
Konsentrasi / Kegunaan 400 μM 400 μM 400 μM 400 μM 3mM Pewarna dengan kecepatan migrasi lebih cepat dari fragmen DNA berukuran < 50 bp Pewarna dengan kecepatan migrasi yang sama dengan DNA berukuran 3-5 kb DNA Enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi Meningkatkan densitas sampel (Promega, 2012)
31
Lampiran 7. PCR Mix dan Kondisi untuk Duplex PCR PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x) erm(B) f-primer (50 µM) erm(B) r-primer (50 µM) mef(A) f-primer (50 µM) mef(A) r-primer (50 µM) DNA template ddH O
12,5 0,5 0,5 0,5 0,5 @2 8,5
1x 1 µM 1 µM 1 µM 1 µM 20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
94 C 0.30
o
72 C
1.30
o
72 C
5.00
o
50 C 0.30
o
25 C ∞
Ko dan Song (2004) 35 Siklus
32
Lampiran 8. PCR Mix dan Kondisi Singleplex PCR mef(A) PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x) mef(A) f-primer (50 µM) mef(A) r-primer (50 µM) DNA template ddH O
10 0,5 0,5 @2 12
1x 1 µM 1 µM 20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
93 C 3.00
o
93 C 1.00 o
72 C 5.00
o
72 C 1.00
o
52 C 1.00 o
25 C
∞
Sutcliffe et.al (1996), dengan sedikit modifikasi.
35 Siklus
33
Lampiran 9. PCR Mix dan Kondisi untuk Singleplex PCR erm(B) PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x) erm(B) f-primer (50 µM) erm(B) r-primer (50 µM) DNA template ddH O
10 0,5 0,5 @2 12
1x 1 µM 1 µM 20 ng/µl*
Total
25 µl
2
o
94 C 0.30
o
o
72 C
72 C
1.30
5.00
o
50 C 0.30
o
25 C ∞
Ko dan Song (2004) 35 Siklus
34
