Laboratorní medicína Minulost, přítomnost a budoucnost
Vzdálená minulost! První laboratorní testy Starověk •
•
Moč se rozlije na podlahu. Pokud moč obsahuje cukr, je přilákán hmyz (mravenci). Tento test byl používán ještě před 20 lety v některých částech Afriky. Hippocrates (300 př. n.l.) – první diagnostické protokoly – smyslové sledování – chuť a vzhled moči (sedimenty, bubliny), krve
Odběry krve ♦ Zavedeny až ve 20. století jako diagnostický nástroj ♦ Předtím byl odběr většího množství krve považován za léčivý pouštění žilou (16. století pijavice) George Washington – denní odběry krve – zemřel zřejmě na následky velkých ztrát krve Stále se používá – cyanotická kongenitální srdeční vada (tvoří se přemíra červ. Krvinek, pravidelně se odstraňují z krevního oběhu)
Vybavení v medicínské laboratoři: 1920 Moderní 200-300lůžková nemocnice by byla velmi dobře vybavená, kdyby měla: váhy mikroskop centrifuga Bunsenův hořák kolorimetr (předchůdce spetrofotometru)
Klinická biochemie v nemocniční laboratoři 1970 ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦
Váhy Spektrofotometr Plamenový fotometr (stanovení K, Na, Ca) Van Slykův aparát (měření plynů v krvi) Klettův kolorimeter (měření hemoglobinu) Centrifuga
V roce 1970 Nepoužívaly se počítače ani počítačky. Používaly se posuvné stupnice! Bez automatizace Bez propracované kontroly kvality Bez laboratorního informačního systému Informační technika – pouze telefon (ne FAX, email, internet)
Stav na počátku sedmdesátých let
Současnost Point-of-Care testování
Molekulární diagnostika Sofistikované přístroje, analyzátory (tandemová hmotnostní spektrometrie, mnohobarevná průtoková cytometrie) Testování mnoha parametrů na jediném analyzátoru (konsolidace testování) Konsolidace laboratoří
Lékařské vyšetření Lékař potřebuje výsledek Odběr vzorku Provedení testu Zadání výsledku do zprávy
Příjem a zpracování vzorku
Laboratorní informační systém
MIKROBIOLOGIE
Identifikace mikroorganismu (bakterie, plísně, viry, parazité), který způsobil infekci. Testování efektivních antibiotik.
Bakteriální kultury
MIKROBIOLOGIE Odpovědi na otázky typu:
•jsou zdravotní obtíže pacienta infekčního původu? Průkaz infekčního agens •Je přímá souvislost mezi výsledky z laboratorního vyšetření a určitými obtížemi pacienta? •Jaká bude terapie? •Jaký je epidemiologický význam získaných údajů? rizika infekce, hrozí nebezpečí šíření, jak zabránit šíření
VIROLOGIE
Přímý (antigen, nukl. kyselina) vs. nepřímý průkaz viru (protilátky) Monitoring průběhu onemocnění dle DNA viru dle protilátek v séru Běžné infekce
Akutní průjmy
Akutní respirační onemocnění
Hepatitidy, HIV
Klíšťová encefalitida
Herpesviry, cytomegalovirus, EBV
PARAZITOLOGIE
Jednobuněčné vs. složité mnohobuněčné organismy Gastrointestinální trakt, močové, pohlavní cesty a krev (vzorky stolice, moč, stěry sliznic) Přímý důkaz – identifikace patogenního agens (nukleové kys., mikroskopie, kultivace) Nepřímý důkaz – protilátky v séru (Borrelie, Toxoplazmy)
Trichomonas vaginalis
Trypanasoma
HEMATOLOGIE
Pracuje s čerstvou nesraženou krví Počet a charakterizace krevních buněk - krevní obraz a diferenciální rozpočet (analyzátor), krevní nátěr – mikroskop (barvení – morfologie buněk)
Diagnostika onemocnění (anemie) Detekce malignit (leukemie) Sledování stavu nemoci, efektivity léčby Rozlišení typů infekce
Testy srážlivosti krve
Srpkovítá anémie
LEUKEMIE
Abnormální nekontrolovatelný růst krevních buněk
Buňky nejsou schopny maturovat do konečných stádií
Následkem nádorového bujení se nedostatečne vyvíjejí i ostatní krevní řady (destičky, červené krvinky)
Diagnóza na základě vyšetření různých vzorků tkání na několika odděleních
Hematologie: krevní obraz Imunologie, Patologie: buněčné markery (krev, kostní dřeň) Cytogenetika: chromozomální přestavby
Transfúzní oddělení
Krev poskytovaná bezplatně dobrovolnými dárci Výroba krevních přípravků a derivátů
Testování krevních skupin
Provádí se zkoušky, kterými se určuje kompatibillita příjemce a dárce: Velká křížová zkouška – sérum příjemce se mísí s erytrocyty dárce
Testy na vyloučení infekčnosti darované krve – vyloučení přenosu infekčních onemocnění (AIDS, hepatitidy)
Transfuzní přípravky a deriváty
Transfuzní přípravky: připravované separací darované krve přímo na transfuzním oddělení Plná krev, erytrocytový koncentrát, krevní destičky, plazma
Výroba krevních derivátů farmaceutické firmy: obvykle mix od několika dárců lidský albumin, imunoglobiliny, faktory srážení
HISTOPATOLOGIE Testování tkání
Odběr vzorku (operace, biopsie)
Transport a zpracování
Řezy a barvení (značení)
Mikroskopické vyhodnocení
Diagnóza
Používání klasických technik, nutné získat zkušenost v přípravě i odečítání vzorků Automatizace nepostupuje tak rychle Čeká se dlouho na výsledek
Histologie – rozmanité techniky značení
Klasické barvení hematoxylin, eosin – struktura tkáně Enzymová histochemie (průkaz přítomnosti a aktivity enzymů ve tkáni) Imunohistochemie (detekce navázaných protilátek) Fluorescenční značení Zdokonalují se přístroje na přípravu řezů, elektronový mikroskop Automatizace nepostupuje tak rychle
Karcinom prsu – H/E barvení
Karcinom prsu – imunohisto barvení (tumor marker)
CYTOLOGIE
mikroskopické vyšetření jednotlivých buněk rozetřených na podložním skle - chybí kontinuita vyšetřované tkáně v histologickém řezu Metoda dle Papanicolaua (Pap screen): detekce časných stádií karcinomu děložního čípku. Příprava prepátu, značení, odečítání a vyhodnocení (% abnormálních buněk) Vyšetření výpotků,cytologie štítné žlázy, plicní cytologie (laváž), cytologie lymfatických uzlin
Pap screen pod mikroskopem
Klinická biochemie Zpracování sraženého krevního vzorku - sérum Stanovení množství specifických elementů přítomných v krevním oběhu
Proteiny, Cukry, Tuky
Meziprodukty metabolismu
Hormony
Toxiny
Onkologické markery
KLINICKÁ BiOCHEMIE
Vysoký stupeň automatizace: analyzátory Multidisciplinální
Buněčný metabolismus (buněčná biologie)
Hormonální interakce (endokrinologie)
Imunitní odpověď (imunologie)
anatomie
IMUNOLOGIE
Infekční imunita - bakteriální, virová, plísňová onemocnění Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie) Hypersensitivní reakce (alergie) Imunodeficity Autoimunitní onemocnění Onkologická hemagologická onemocnění Protinádorová imunita
Základní přístupy:
Automatizace: Analyzátory – protilátky, antigeny Sofistikované metody: průtoková cytometrie Funkční testy lymfocytů: laboratorní zkušenost, nelze automatizovat
TOXIKOLOGIE
Detekce a monitorování toxických látek (alkohol, drogy, jedy, léky): Studium rozdělení, příznaků a projevů, průběhu, klinických nálezů, možností prevence a léčby otrav (intoxikací) Diferenciální diagnostika intoxikace a její závažnosti ve vztahu ke zdravotnímu stavu a nebo chování pacienta Monitorování optimálního účinku a příp. možných interferencí látek při medikamentosní terapii Sledování dodržování léčebného režimu
Soudní (forezní) toxikologie
CHROMATOGRAFIE
Separační technika Nutná úprava vzorku, časově náročnější, odborně personálně náročnější
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Látky se dělí dle molekulové hmotnosti Nejúčinnější detekce: tandemová plynová chromatografie s hmotnostní detekcí GC-MS Screening neznámé noxy (jedu)
GENETIKA – DNA technologie
Dokončena kompletní sekvence lidského genomu Studium dědičných onemocnění Studium geneticky dané náchylnosti k onemocněním Techniky analýzy DNA prolínají do ostatních laboratorních oborů (patologie, mikrobiologie) PCR – polymerázová řetězová reakce Rozvíjející se obor: čipové technologie
Ochrana veřejného zdraví
Mikrobiologické zkoušky potravin, vody Fyzikální zkoušky pracovního prostředí normy pro osvětlení hluk proudění vzduchu Radiace
Konsolidace laboratoří + Automatizace Vzniknou centrální laboratoře – konsolidace mikrobiologie, imunologie a klinické chemie – nemocnice střední velikosti má asi 80 % testů automatizovaných – centrální laboratoře mohou přeřazovat pracovníky mezi různými technologiemi – vyšetření se provádí na poměrně malé ploše – centrální laboratoře mají silnou pozici při vyjednávání nízkých cen činidel
Výhody konsolidace laboratoří •
• • • • •
redukce možných zdrojů chyb redukce nákladů eliminace potřeby alikvotování zvýšení bezpečnosti maximální využití mikrovzorků technická dokonalost
Blízká budoucnost Snížení nároků na laboratorní síly Dramatický nárůst POCT a domácího testování Neinvazivní testování Zavádění složitých metod (tandemová hmotnostní spektrometrie) Molekulární diagnostika (Čipy a SNP), single cell analýzy Automatizace, robotika
Neinvazivní testování Bez nutnosti odebírání vzorků tkání Kontinuální testování hladiny glukózy bez nutnosti odběru krve detekce analytů v oku (změny koncentrace odpovídají změnám v detekci emitovaného IR záření)
GLUCOWATCH
Pokroky v zobrazovacích metodách vysoce citlivé ultrazvukové skenery s třírozměrným zobrazovacím softwarem zobrazovací zařízení vybraných oblastí srdce na principu resonanční spektroskopie
MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA
Význam molekulární diagnostiky Laboratorní výsledky určují ze 70%, jak jsou vynaloženy prostředky na léčbu
Nejrychleji rostoucí laboratorní obor 1953 – struktura DNA 1985 – objev PCR techniky
Molekulární diagnostika zpřesňuje diagnozu oněmocnění, umožňuje lépe léčit a předcházet onemocněním
Molekulární diagnostika: Lepší péče o pacienta Infekční onemocnění (kvantifikace virové nálože) & testování rezistence Revoluční zejména v oblasti onkologie: Zpřesnění diagnózy – výběr efektivní léčby Zpřesnění prognózy onemocnění Sledování průběhu onemocnění (citlivá detekce metastáz, relapsu onemocnění) Výběr vhodného dárce pro transplantaci kostní dřeně – HLA typizace Personalizovaná medicína – výběr léku na míru
Molekulární diagnostika: 3 základní přístupy Cytogenetika na úrovni chromozomů – chromozomální abnormality (abnormality v počtu, přestavby chromozomů – u onkologických onemocnění) Molekulární genetika na úrovni DNA, metoda polymerázové řetězové reakce = PCR, čipové technologie Průtoková cytometrie na úrovni buněk: detekce buněčných znaků
Cytogenetika metoda FISH (fluorescence in situ hybridization) Strukturální změny na chromozomech přestavby Genové přestavby (translokace) Pracuje se speciálními fluorescenčně značenými sondami
Dědičná onemocnění Onkologická onemocnění
Downův syndrom
Zdravý jedinec
Průtoková cytometrie Technika pro počítání, analýzu a třídění buněk suspendovaných v proudu tekutiny. Analýza znaků na buňkách
Detailní analýza krevních buněk onemocnění imunitního systému, Leukémie (diagnostika, sledování)
Molekulární genetika PCR = polymerázová řetězová reakce - umožňuje namnožit libovolný úsek DNA a tak ho zpřístupnit analýze Analýza mutací dědičná onemocnění, nádory Analýza polymorfismů – predikce onemocnění HLA typizace Otcovství Kriminalistika
Molekulární diagnostika: Single cell analysis = analýza z jedné buňky
Preimplantační genetická diagnostika Alternativní metoda k tradičním invazivním metodám prenatální diagnostiky (odebírání vzorků choriových klků nebo amniocentéza) Genetická analýza a selekce embrya před implantací při IVF (in vitro fertilizace) umožňuje vybrat embrya, která nenesou genetický materiál, způsobující onemocnění: Downův syndrom (trizomie 21. chromozomu) Cystická fibróza (mutace v genu pro chlor. Receptor)
Postup při preimplantační genetické diagnostice
Příprava embrya při klasickém IVF cyklu Růst embrya do velikosti cca 8 buněk (den 3) Biopsie (odstranění) embryonálních buněk (blastomer) pro testování Testování DNA (pro testy PCR) nebo celých jader (pro testy FISH)
Biopsie Embrya
Biopsie embrya
MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA: Čipové technologie Výhody
Î Î Î Î Î Úskalí
Î Î Î
Všechny potřebné testy (všech genů, co nás zajímají) jsou provedeny naráz Snížení ceny jednoho testu – cenově efektivní Laboratoř může vyhovět zvyšujícím se požadavkům Snížení času zpracování - časově efektivní Snížení nároků na počet laboratorních pracovníků a laboratorní prostor Nutná pečlivá optimalizace metod Někdy se produkuje příliš mnoho zbytečných výsledků Náročné počítačové zpracování výsledků
Farmakogenetika : ¾ Farmakogenetické testy mohou předpovědět, který lék bude u daného jedince efektivní a který způsobí nežádoucí účinky ¾ Použito u psychofarmak a léků při onemocnění srdce. ¾ Hledají se interindividuální rozdíly na úrovni DNA, které jsou spojeny s různou odpovídavostí na léčbu ¾ Bylo identifikováno přibližně 70 léčiv, které jsou katabolizovány enzymem cytochromem P450. Gen pro tento enzym se vyskytuje ve více než 50 variantách.
poor (PM), intermediate (IM), normal (EM) or rapid metabolizers (UM)
Pharmakogenetika příliš mnoho enzymu - lék je katabolizován příliš rychle a ztrácí účinnost. Málo enzymu - mohou se začít projevovat účinky předávkování. Např. 30% lidí afrického původu, 20% lidí z blízkého východu, ale pouze 2% Kavkazské populace nesou 3 nebo více kopií genu CYP2D6, což způsobuje Pomocí čipu lze určit příliš rychlý rozklad typ metabolismu léků některých léků
NUTRIGENOMIKA 9Vztah genotypu a zpracování živin 9Identifikace jedinců se sníženým
metabolismem folátů 9Gen pro 5,10-methylenehydrofolate reduktázu (MTHFR). 9Mutace v tomto genu: rizikový faktor pro vrozené vady (riziko u těhotných žen). Tělo není schopno dostatečně zpracovat kyselinu listovou.
Vzdálená budoucnost… 2 PERSONALIZOVANÁ MEDICÍNA 2 PREVENTIVNÍ MEDICÍNA Výrazně lepší výsledky léčby onemocnění v nižším stádiu (karcinom tl. střeva – 90 vs 8%) Stojí méně než léčba pokročilého onemocnění
UŽ NE “jedna velikost pastuje všem!“
