Laboratorní cvičení č.5 Izolace RNA z rostlin a následná detekční a kvantitativní RT-PCR vybraných genů Teoretický úvod Reverzně přepisovaná PCR je metoda používaná pro amplifikaci cDNA (ssDNA komplementární ke specifické RNA). Pomocí RT-PCR se nejčastěji amplifikují a následně klonují 5´ a 3´ konce mRNA (tzv. EST klony, expressed sequence tag) nebo cDNA knihovny, využívané pro hledání nových genů. RT-PCR může být taky velmi snadno adaptována pro identifikace mutací a polymorfismu v přepisovaných genových sekvencích a nebo pro kvantifikaci exprese jednotlivých genů, když je množství izolované mRNA malé a nedostačující pro techniku Northern blotu. Prvním krokem RT-PCR je vždy enzymová konverze mRNA nebo celkové do jednovláknové cDNA kdy je deoxyribonukleotidový primer hybridizován s RNA a rětězec DNA následně prodloužen RNA-dependentní DNA polymerasou (EC 2.7.7.49, reverzní transkriptasa). Druhým krokem pak je klasická PCR se dvěma genově specifickými primery , pro kterou je jako templát využita RT reakcí vzniklá cDNA. Deoxyribonukleotidové primery použity pro přepis cDNA mohou být trojího typu: • oligo(dT) primer, který se specificky váže na polyA konec, který je přítomen v 98% procentech všech zralých eukaryotických mRNA a RT reakcí pak vzniká cDNA obsahující informací celé mRNA. • genově specifický primer, který hybridizuje pouze s jednou konkrétní mRNA nebo příbuznou skupinou mRNA. Genově specifické primery, jak negativní tak pozitivní, pro následující PCR pak samozřejmě musí ležet „upstream“ od použitého primeru pro RT. Pokud to lze, doporučuje se také navrhnout každý primer, jak negativní tak pozitivní, tak aby ležely každý na jiném exonu. Touto strategií lze pak velice jednoduše při vyhodnocení PCR rozlišit mezi správnou RT-PCR amplifikací a amplifikací, která vznikla na podkladě kontaminující genomové DNA, která se často v izolovaným RNA vzorcích nachází. • náhodné hexanukleotidové primery (random hexamers) jsou schopny se vázat a zahajovat syntézu cDNA na mnoha místech podél celého RNA templátu. Jedná se o směs krátkých šestinukleotidových fragmentů, ve kterých jsou vygenerovány všechny možnosti kombinací čtyř nukleotidů (A,G,C,T). Používá se především pokud je templát mRNA extrémně dlouhý (přes 3.000bp) nebo když má cílová mRNA komplikovanou sekundární strukturu. Ve většině případů je cílem vytvořit čím jak nejdelší cDNA a proto se pro navržení genově specifického primeru nejčastěji využívá nekódující sekvence 3´konce. Druhou nejlepší volbou je pak použití nespecifického oligo(dT) primeru. Pokud oba pokusy selžou přichází na řadu random hexamer primery. Nejrychlejším způsobem provedení RT-PCR je jednozkumavková reakce s genově specifickým primerem pro RT, kdy po proběhnutí RT reakce se pouze přidá druhý genově specifický primer a termostabilní polymerasa a nechá se proběhnout PCR. Nejčastějším problémem RT-PCR je izolace kvalitní RNA. Jednovláknová molekula RNA je daleko méně stabilnější než DNA a proto je i její životnost velice limitována. Navíc specifické RNA endonukleasy (RNasy) jsou velice aktivní enzymy, které pracují v široké škále pH a teplot bez přítomnosti kofaktoru a jsou přítomny téměř všude (např. na lidských dlaních). Během izolace a při následné RT reakci je proto nutno vzorek RNA před vlivem těchto enzymů chránit dodržováním specifických podmínek manipulace a používáním pouze speciálně ošetřeného skla a
plastiku, viz Laboratorní řád molekulárně-biologické laboratoře. Přesto často dochází k degradaci a fragmentaci mRNA populace a to hlavně od 5´konce, který není tak dobře chráněn a stabilizován polyA sekvencí jako 3´konec. A u některých genů je proto velice těžké získat a amplifikovat genetickou informaci jejich počátku.
Obrázek 12. Princip RT-PCR reakce s využitím genově specifického primeru, oligo(dT) primeru nebo random hexamer primerů. Klíčovým enzymem RT-PCR je reverzní transkriptasa, enzym objeven roku 1970 jako hlavní katalytická jednotka RNA virů, které s jeho pomocí přepisují svou genetickou informaci z RNA do DNA, která se pak začleňuje do genomu jejich hostitele. V současné době se v molekulární biologii využívají reverzní transkriptasy ze tři zdrojů: •
AMV RT enzym izolovaný z viru ptačí myeloblastosy (avian myeloblastosis virus), kromě RT aktivity, má ještě RNasa H aktivitu, která může rozštěpit delší fragmenty RNA templátů, optimální teplota enzymu je 42°C.
•
MoMLV RT enzym z Molonyho viru myší leukemie (Moloney strain of murine leukemia virus), jeho aktivita RNasy H je daleko slabší, jeho teplotní optimum je při 37°C, proto není moc vhodný pro templáty se složitou sekundární strukturou. Komerčně dostupné jsou i mutované verze obou enzymů, které mají inhibovanou RNasovou aktivitu a vyšší teplotní stabilitu (do 50°C), jsou proto vhodnější pro delší RNA templáty se složitou sekundární strukturou.
•
Termostabilní Tth DNA polymerasa vykazuje aktivitu reverzní transkriptasy v přítomnosti Mn2+ iontů a je proto využívaná hlavně tak kde je třeba provádět rutinní a rychlé RT-PCR, jelikož pro oba kroky stačí jediný enzym a obě reakce běží současně. Její nevýhoda je krátká délka syntetizovaných cDNA (do 2kb) a nemožnost využití oligo(dT) a random hexamer primerů, protože ty mají nízkou teplotu hybridizace a při optimální teplotě enzymu a PCR netvoří stabilní RNADNA hybrid.
Pokud chceme pomocí RT-PCR kvantifikovat míru exprese jednotlivých genů, tzn. zjistit množství molekul mRNA přepisovaných pro specifické geny zastoupených v populaci mRNA izolované z určitého ontogenetického stádia organismu či specifické tkáně či pletiva, je nutné společně se specifickou amplifikaci kvantifikovaného genu provést současně amplifikaci genu srovnávacího. Jako srovnávací geny se nejčastěji používají tzv. provozní (house-keeping) geny. Jsou to geny kódující proteiny které jsou v organismech esenciální a zastoupeny ve všech stádiích života organismu ve většině tkáních či pletivech. Tyto geny jsou vždy exprimovány pod konstitutivními promotory, tzn. že jejich exprese je za všech podmínek stejná a nebývá ničím ovlivňována. Nejčastěji používanými srovnávacími geny v rostlinné říši jsou geny kódující strukturní protein β-aktin, nebo klíčový enzym glykolýzy glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenasu (GAPDH). Pro kvantifikaci genové exprese se dříve používalo, vedle metody Northern blotu, semikvantitativní RT-PCR, kdy se na agarosovém gelu vizuálně porovnávaly intenzity amplifikovaných produktů vůči produktům provozního genu v jednotlivých vzorcích. V současnosti jsou tyto metody intenzivně nahrazovány PCR s odečtem produktu v reálném čase. Aby bylo možno kvantitativně odečítat signál DNA vznikajícího produktu, přidává se do PCR reakční směsi fluorescenční barvivo interkalující s dvouřetězcovou DNA. Druhým způsobem je detekce pomocí specifické fluorescenční sondy komplementární k amplionu (Obr. 13), ze které se uvolňuje fluorescence po rozštěpení 5´-3´exonukleasovou aktivitou termostabilní DNA polymerasy. Odečet uvolňované či kumulující se fluorescence umožňuje speciální typ termocykleru (real-time) do kterého jsou kromě standardního termobloku nainstalovány i exitační lampy a detekční zařízení (fotodiody nebo CCD kamera). Software termocykléru vyhodnocuje vznikající fluorescenci v jednotlivých zkumavkách v závislosti na počtu cyklů. U výsledných křivek se určují tak zvané Ct (treshold cycle) hodnoty, počet cyklů, kde křivka překročí limit detekce fluorescence. Vzájemným porovnáním Ct hodnot mezi sledovanými biologickými vzorky pro studovaný gen a gen provozní, lze získat po dostatečném počtu replikací, relativně přesný údaj o změně exprese genů ve studovaném vzorku vůči vzorku kontrolnímu. Nejjednodušším je vyhodnocení metodou delta delta Ct :
R=2 Kde ΔΔ Ct = Δ Ct
vzorek
- Δ Ct
kontrola
Δ Ct = Ct studovaný gen - Ct gen provozní
DETEKČNÍ RT-PCR
–ΔΔCt
Materiál a chemikálie •
RNA extrakční pufr (8 M guanidin/HCl, 20 mM MES, pH 7,0, 20 mM EDTA, 50 mM 2-merkaptoethanol, neautoklávovat – chaotropický roztok)
•
směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 4,8)
•
1 M octová kyselina (autoklávováno)
•
absolutní ethanol
•
3 M octan sodný, pH 5,2 (autoklávováno)
•
RNase free voda autoklavováno)
•
100 mM DTT (sterilizováno filtrem)
•
10 mM dNTP mix, 5x pufr pro M-MLV reverzní transkriptasu,10x PCR pufr
•
50 μM oligo(dT) primer, 10 μM genově specifické primery
•
M-MuLV reverzní transkriptasa, Taq polymerasa
•
10x TAE pufr (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0)
•
10x nanášecí pufr (50 % glycerol, 50 mM EDTA pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť)
•
10% Ethidium bromid, DNA marker 50 bp a 1kb GeneRuler, 2% agarosa v 1xTAE pufru
•
kapalný dusík
•
rostlinný materiál – huseníček (Arabidopsis), kukuřice, ječmen
•
nádoba na kapalný dusík, třecí miska s tloučkem, termocykler Biometra, termoblok na 37°C, UV spektrofotometr, laboratorní centrifuga a pikofuga, křemenná kyveta, mikropipety, mikrozkumavky 1,5-0,5-0,2 ml, špičky s filtrem, horizontální elektroforetická komůrka, zdroj nápětí, AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů
(deionizovaná
voda
s 0,1%
diethyl
pyrokarbonátem,
Tabulka 2. Genově specifické primery pro amplifikací několika genů z huseníčku a kukuřice. Úsek DNA
Název
Sekvence
Tm (°C)
Velikost cDNA (bp) Genomová kontaminace
Arabidopsis thaliana cytokinin oxidasa/ dehydrogenasa 1 cytokinin oxidasa/ dehydrogenasa 2 cytokinin oxidasa/ dehydrogenasa 4 cytokinin oxidasa/ dehydrogenasa 5 isopentenyl transferasa 4
AtCKX1fw AtCKX1rev AtCKX2fw AtCKX2rev AtCKX4fw AtCKX4rev AtCKX5fw AtCKX5rev IPTECORI_fw IPTXBAI_rev
5´-GAAGTCGTAACCTGTTCTGAGAAGCG-3´ 5´-AGAATCGCTAGAGGGTCGTAGGCTTG-3´ 5´-CGGATGCTCTACAGTGATTTCACAAC-3´ 5´-CGGTTTGTTGGATAGAGAAGAGCGAG-3´ 5´-TCTATGGAGTTTTAGGAGGTTTGG-3´ 5´-CATAAACCCTGGAGCGAAACCTAGAG-3´ 5´-GCACGAATCTCTCTCGAACCAGCTC-3´ 5´-CGCTGACGAAGAAGACGACGACG-3´ 5´-GAATTCGACAAAATGCAGTTCTACGATG-3´ 5´-CTAGAGTCCAAACTAGTTAAGACTTAAA-3´
65 66 63 65 59 65 66 66 57 61
919 1196 508 631 385 1128 893 2018 855 855
aktin
5´-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3´ ARAactfw 5´-GGTGGTGCAACGACCTTAAT-3´ ARAactrev 5´-GCGAACTGGTAAGAGTTGTAG-3´ transkripční faktor AtMYB2_fw MYB2 AtMYB2_rev 5´-AGCCCCAATCGTTGAACTC-3´ Cell wall invertasa 1 AtCWIN1_fw 5´-AGTGGCCGGTTAGGGAAGTT-3´ AtCWIN1_rev 5´-GCATGCTCTTCCCTTTCCAC-3´ Cell wall invertasa 3 AtCWIN3_fw 5´-AATTGGAAAAGGCGGATGTG-3´ AtCWIN3_rev 5´-CGCCATTGATTTGAGCAGAC-3´ Cell wall invertasa 6 AtCWIN6_fw 5´-AAAGGATGGGCTGGCCTTAT-3´ AtCWIN6_rev 5´-CAGTTTTTCCTCCTACTCCGTAGC-3´ Zea mays 5´-AGCAACTGGGATGACATGGAGAAAA-3´ aktin ACTfw 5´-CCTGTTCATAATCAAGGGCAACGTA-3´ ACTrev 5´-ATCCTGCAGGGCACCGACAT-3´ cytokinin oxidasa/ ZmCKX1fw 5´-CCGCGCCAGGTAGGTCTTGT-3´ dehydrogenasa 1 ZmCKX1r 5´-ACCAAGCTGTACCCGCTCA-3´ galactinol syntasa ZmGALS_fw 5´-AACTGGATGACCGCCCA-3´ ZmGALS_rev 5´-CCGCCGACTCCATCTTCAAC-3´ epoxy-karotenoid ZmVP14_fw 5´-CGTGGACGAAGGYGAGCACGT-3´ dioxygenasa ZmVP14_rev 5´-CGTCAGAGCTGGAGAAGCAC-3´ cytokininový regulátor ZmRR1_fw 5´-CCAGGCAGCGGGTGATAC-3´ odpověďi I ZmRR1_rev 5´-GAGCCCAACGTGAGCATG-3´ cytokininový regulátor ZmRR3_fw 5´-ACGGGCTTCAGCAGGAAAT-3´ odpověďi III ZmRR3_rev 5´-ATGGGACAGGGAGGAGAAGT-3´ cytokininový regulátor ZmRR7_fw 5´-AGCACGAACTTGAGGAGGAA-3´ odpověďi VII ZmRR7_rev 5´-ACCGCTACGACTGCTGCTT-3´ isopentenyl ZmIPT1_fw 5´-GTCGTCGGTTCGTAGGAAGG-3´ transferasa 1 ZmIPT1_rev 5´-TTGACAAAGCTGTTGARTGGA-3´ betain dehydrogenasa ZmBDH_fw 5´-CCAGCTAAACCATASTGWGTATCA-3´ ZmBDH_rev 5´-TCTCTGCCCCAAGCAAAGAT-3´ glyceraldehyd-3ZmGAPDH_fw fosfátdehydrogenasa ZmGAPDH_rev 5´-CTCGTAAGAGGCCCCCTTCT-3´
59 57 59 57 60 60 56 58 58 64
606 692 562 664 496 1014 497 736 322 1257
64 64 62 63 60 57 61 65 61 60 58 57 60 58 59 61 55 59 57 61
480 560 245 345 433 545 369 369 300 429 191 394 665 1731 470 470 445 600 407 587
Experimentální postupy 1.DEN
.
SE SMĚSÍ FENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!! a) Izolace RNA •
Pracujeme vždy v rukavicích pouze na vytyčeném místě, používáme pouze speciálně ošetřené sklo a plastik a špičky na automatické pipety s filtrem!
•
Ve třecí misce zhomogenizujeme na prach 0,5-1,0 g rostlinného materiálu (dodá vedoucí cvičení) pomocí kapalného dusíku.
•
Do sterilní mikrozkumavky přesně odvážíme 0,3 g zmrzlého rostlinného prachu a přidáme 650 μl RNA extrakčního pufru, vortexujeme a necháme 5 minut na ledu.
•
Centrifugujeme (14.000 g, 10 min., 4°C) a supernatant odpipetujeme do nové mikrozkumavky.
•
Přidáme 720 μl směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol, vortexujeme 15 sec a centrifugujeme (14.000 g, 10 min., 4°C).
•
Do nové mikrozkumavky opatrně odpipetujeme horní vodnou fázi a přidáme 120 μl 1 M kyseliny octové a 550 μl absolutního ethanolu.
•
Inkubujeme 30 minut v mrazícím boxu na -75°C .
•
Centrifugujeme (14.000 g, 15 min., 4°C) a supernatant odlejeme
•
Pelet promyjeme dvakrát 0,5 ml 3M octanem sodným, vždy stočíme a reprecipitujeme (14.000 g, 5 min., 4°C).
•
Nakonec promyjeme 70% vychlazeným ethanolem, stočíme (14.000 g, 5 min., 4°C), supernatant odlijeme, zbytky supernatantu krátce stočíme na pikofuze a opatrně odsajeme mikropipetou, pelet necháme 10 minut vyschnout ve flowboxu.
•
Pelet rozpustíme v 15 μl RNase-free vody a zamrazíme na -75°C, pokud budeme ihned pokračovat s RT reakcí necháme na ledu.
b) Spektrální stanovení RNA •
Odebereme 5 μl z celkové vyizolované RNA a vhodně naředíme do kyvety (100x), měříme absorbanci na 260 a 280 nm.
•
Pokud je RNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 2.1
•
Přibližnou koncentraci RNA určíme z jednoduché úměry, pokud je A260=1 pak je v kyvetě 40 μg/ml RNA.
c) Reverzní transkripce •
Do malé mikrozkumavky pipetujeme 1-2,5 μg celkové RNA (maximálně v objemu 5 μl) a přidáme 0,5 μl 50 μM oligo(dT) primeru, doplníme celkový objem vodou na 6,5 μl a špičkou pipety zamícháme, necháme inkubovat 5 minut v inkubátoru na 70°C.
•
Ochladíme na ledu a ke vzorku připipetujeme 2 μl 5x koncentrovaného pufru pro M-MVL reverzní transkriptasu, 1,0 μl dNTP mixu.
•
Mikrozkumavku krátce zvortexujeme a inkubujeme 5 minut v inkubátoru na 37°C.
•
Ke vzorku připipetujeme 0,5 μl M-MVL reverzní transkriptasy (100 jednotek), krátce zvortexujeme a krátce stočíme v pikofuze.
•
Inkubujeme 60-90 minut v inkubátoru na 37°C, probíhá reverzní transkripce do cDNA.
•
Vzniklou cDNA zamrazíme na -20°C, nebo uložíme na led a pokračujeme v RT-PCR.
d) RT-PCR
krátce
stočíme
v pikofuze,
•
Jako templáty pro PCR použijeme 1 μl RT reakce, kterou jsme předem dvakrát naředili ultra-čistou PCR vodu.
•
Pro každou dvojicí primerů dle tabulky si nastavíme 2 PCR reakce, vzorek a kontrolu, kde místo RT reakce použijeme jako templát izolovanou, nepřepsanou RNA (vhodně naředěnou tak aby množství v 1 μl odpovídalo množství RNA, které bylo původně v 1 μl RT reakce).
•
Do 0,2 ml PCR zkumavek uložených v chladicím stojánku pečlivě pipetujeme (v PCR boxu) reagencie v tomto pořadí: 16,75 2,50 1,25 0,50 1,00 1,00 1,00
μl μl μl μl μl μl μl
PCR vody 10x PCR pufru DMSO dNTP mix (každý 10 mM) pozitivního primeru, primery pipetujeme na stěnu zkumavky negativního primeru cDNA templátu
•
Reakci zahájíme přídavkem 1,00 μl Taq DNA polymerasy, zkumavku krátce zvortexujeme, dopravíme její obsah na dno mikrocentrifugací a okamžitě vložíme do vyhřátého termocykleru.
•
Pipetování si můžeme usnadnit přípravou tzv. premixu, kdy do 1,5 ml mikrozkumavky na ledu pipetujeme všechny komponenty PCR včetně Taq polymerasy v násobku počtu vzorků které budeme mít (plus jeden či dva navíc, kompenzace chyby pipetování), premix pak rozpipetujeme v chladícím stojánku po 22 μl a připipetujeme pouze konkrétní dvojici primeru (2 μl) a vhodný templát (1 μl).
•
Na termocykleru Biometra předem nastavíme PCR program: 1. 2. 3. 4. 4. 5. 6.
Počáteční denaturace 94oC, 3 min Denaturace 94oC, 30 sec Navázání primerů (annealing) x oC, 30 sec Růst řetězce (elongace) 72 oC, 2 min Kroky 2-4 opakovat 45x Koncová elongace 72oC, 10 min Chlazení 4oC
•
Pro odlišné teploty annelingu jednotlivých vzorků využijeme možnosti nastavení teplotního gradientu (poradí vedoucí cvičení).
•
Teplotu annelingu zvolíme podle Tm použitých primerů.
•
Provedeme tzv. „hot start“, který zabraňuje nespecifické navázání primeru na matrici během počátečního vyhřívání termocykleru. PCR zkumavky uchováváme v chladicím stojánku až do doby, kdy je termocykler vyhřán na počáteční 3 min denaturaci při 94oC, poté otevřeme víko a opatrně vložíme PCR zkumavky.
•
PCR Program necháme proběhnout a zatím si připravíme elektroforézu v 2% agarosovém gelu. Jako marker použijeme v jedné jamce 50 bp GeneRuler a v další 1kb GeneRuler.
d) Agarosová elektroforeza DNA •
Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky rozpustíme 2% agarosu (v 1x TAE) v mikrovlnné troubě a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do horizontální elektroforetické komůrky. Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou desku. Ihned přidáme 40 μl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel necháme ztuhnout asi 30 min.
•
Odstraníme hřeben a postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 200 ml elektrodového pufru 1 x TAE tak aby hladina splývala z agarosovým gelem.
•
Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: K PCR produktu (25 μl) pipetujeme 5 μl denaturačního barviva a inkubujeme v termobloku při 65oC po dobu 10 min.
•
Po inkubaci odstředíme vzorky na dno mikrozkumavek a pipetou opatrně naneseme jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforezy. Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu nanesených vzorků. Do jedné z jamek neopomeneme nanést DNA marker (λ DNA naštípaná restrikčním enzymem PstI).
•
POZOR: Vzorky kontroly a vzorku nanášíme vždy do sousedních jamek!!!
•
Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120 V po dobu 20-30 minut. Průběh elektroforezy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků.
•
Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení.
Vyhodnocení výsledků 1) Na základě pohyblivosti vzorku DNA a DNA standardů určete velikosti jednotlivých amplifikovaných fragmentů. 2) Expresi kterých genů se vám v daném rostlinném pletivu podařilo prokázat a které naopak exprimovány nebyly. 3) Proč se jako templát v kontrolní PCR použila nepřepsaná RNA? Výsledky této kontroly vyhodnoťte. 4) U všech genů, které se vám podařilo detekovat ve vzorku z kukuřice určete relativní míru exprese vzhledem ke srovnávacímu aktinovému genu. Využijte k tomu analysis tool programu AlphaDigiDoc (poradí vedoucí cvičení).
KVANTITATIVNÍ RT-PCR Materiál a chemikálie •
RNA extrakční reagencie TriReagent (Ambion)
•
absolutní ethanol
•
70% ethanol, 100% isopropanol
•
Chloroform
•
směs fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1, pH 4,8)
•
RNase free voda autoklavováno)
•
7.5 M Chlorid litný s 50 mM EDTA, pH 8.0
•
10 mM dNTP mix, 5x pufr pro M-MLV reverzní transkriptasu
•
50 μM oligo(dT) primer
•
1,2μM směsi reverse a forward genově specifických primerů
•
1,2μM směsi reverse a forward genově specifických primerů a 1,0μM tagman sondy
•
M-MuLV reverzní transkriptasa
•
2x SybrGreen qPCR směs: 1mL Immomixu (*); 0,05mL 25μM ROX (5-karboxyX-rhodamin, succinimidyl ester); 0,032mL SybrGreen I (10.000x ředěný); 0,918mL Dnase free voda
•
2x TagMan qPCR směs: 1mL Immomix; 0,05mL 25μM ROX (5-karboxy-Xrhodamin, succinimidyl ester); 0,950mL Dnase free voda
•
10μM N6-benzyladenin s přídavkem smáčedla Silwett77 (0,05%)
•
kapalný dusík
•
rostlinný materiál – semenáčky kukuřice (Zea mays)
•
rozprašovač, nádoba na kapalný dusík, třecí miska s tloučkem, termocyklér StepOnePlus Applied biosystem, standardní termocyklér nebo inkubátor na 42°C a 37°C, UV spektrofotometr, laboratorní centrifuga a pikofuga, křemenná kyveta, mikropipety, mikrozkumavky 1,5-0,5-0,2 ml, špičky s filtrem, PCR destička nebo PCR stripy
(deionizovaná
voda
s 0,1%
diethyl
pyrokarbonátem,
(*) Immomix je PCR reakční směs obsahující optimalizovanou koncentraci všech komponent kromě primerů a templátu, včetně DNA Polymerasy vhodné pro kvantitativní PCR. 1.DEN
.
a) Příprava biologického vzorku •
Ve skleníku si vybereme dva květináče se semenáčky kukuřice a označíme si je jako kontrolu a vzorek.
•
Na rostlinu označenou jako vzorek aplikujeme zhruba ze vzdálenosti 15 cm z rozprašovače 10 μM roztok cytokininu (N6-benzyladenin), rozprašování aplikujeme 3x po sobě ve 3-minutových intervalech.
•
Rostliny necháme ve skleníku do následujícího dne
2.DEN
.
S KAPALINOU TRI-REAGENT™ PRACUJ VŽDY V ZAPNUTÉ DIGESTOŘI!!! b) Izolace RNA •
Přibližně 2 gramy listů z obou rostlin rozetřeme ve třecí misce na prach za pomocí tekutého dusíku (homogenizovaný vzorek nesmí rozmrznout).
•
Do podchlazených mikrozkumavek přeneseme 100 mg homogenizovaného vzorku a okamžitě přidáme 10-násobek (w/v) Tri-Reagentu.
•
Intenzivně vortexujeme po dobu 5 minut při laboratorní teplotě.
•
Centrifugujeme 5 minut na maximální otáčky ve vychlazené centrifuze a supernatant kvantitativně přeneseme do nové 2mL mikrozkumavky.
•
Přidáme pětinu objemu chloroformu (0,2mL/1,0mL) a pořádně promícháme (vortex) a necháme inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě.
•
Centrifugujeme 10 minut na maximální otáčky ve vychlazené centrifuze a horní vodnou fázi opatrně přeneseme do nové mikrozkumavky.
•
Přidáme 0,5mL isopropanolu na 1mL výchozího množství Tri-reagentu, 10 sekund vortexujeme a necháme 10 minut stát při laboratorní teplotě.
•
Centrifugujeme 8 minut na maximální otáčky ve vychlazené centrifuze a supernatant opatrně odlijeme do odpadu. Před odlitím zkontrolujeme přítomnost peletu.
•
K peletě přidáme 1mL 75% etanolu, mikrozkumavku protřepeme a 5 minut centrifugujeme na 8.000 g.
•
Opatrně odlijeme etanol, stopy etanolu ze stěn mikrozkumavky stočíme na pikofuze a zbytky odebereme pipetou tak abychom neporušili pelet
•
Pelet necháme vyschnout ve flowboxu a rozpustíme v 0,045 mL RNase free vody.
•
Přidáme 5μL 10x DNase pufru a 2μL DNasy, promícháme a necháme inkubovat 30 minut při 37°C.
•
Ke vzorku přidáme 0,05 mL směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol, intenzivně vortexujeme a centrifugujeme na maximální otáčky 10 minut
•
Vodnou fázi přeneseme do nové mikrozkumavky a přidáme polovinu objemu 7,5M chloridu litného.
•
Na ½ hodiny uložíme do mrazicího boxu na -20°C, poté 30 minut centrifugujeme na maximální otáčky.
•
Supernatant opatrně přítomnost peletu.
odlijeme
do
odpadu.
Před
odlitím
zkontrolujeme
•
K peletě přidáme 1mL 75% etanolu, mikrozkumavku protřepeme a 5 minut centrifugujeme na 8.000 g.
•
Opatrně odlijeme etanol, stopy etanolu ze stěn mikrozkumavky stočíme na pikofuze a zbytky odebereme pipetou tak abychom neporušili pelet
•
Pelet necháme vyschnout ve flowboxu a rozpustíme ve 20μL RNase free vody.
c) Spektrální stanovení RNA •
Odebereme 5 μl z celkové vyizolované RNA a vhodně naředíme do kyvety (5100x), měříme absorbanci na 260 a 280 nm.
•
Pokud je RNA preparát čistý, poměr A260/A280 dosahuje hodnoty 2.1
•
Koncentraci RNA určíme z jednoduché úměry, pokud je A260=1 pak je v kyvetě 40 μg/ml RNA.
d) Reverzní transkripce •
Dbáme na to, aby ve všech připravovaných vzorcích pro kvantitativní RT-PCR bylo stejné výchozí množství RNA.
•
Pro každý vzorek současně připravíme kontrolu, kde všechny komponenty kromě vstupního množství RNA nahradíme Rase-free vodou, kontrolní vzorky držíme na ledu, nebo zamražené na -20°C až do nastavování kvantitativní PCR reakce.
•
Do malé mikrozkumavky pipetujeme 1-2,5 μg celkové RNA (maximálně v objemu 6 μl) a přidáme 0,5 μl 50 μM oligo(dT) primeru, doplníme celkový objem vodou na 6,5 μl a špičkou pipety zamícháme, necháme inkubovat 5 minut v inkubátoru na 70°C.
•
Ochladíme na ledu a ke vzorku připipetujeme 2 μl 5x koncentrovaného pufru pro M-MVL reverzní transkriptasu, 1,0 μl dNTP mixu.
•
Mikrozkumavku krátce zvortexujeme a inkubujeme 5 minut v inkubátoru na 37°C.
•
Ke vzorku připipetujeme 0,5 μl M-MVL reverzní transkriptasy (100 jednotek), krátce zvortexujeme a krátce stočíme v pikofuze.
•
Inkubujeme 60-90 minut v inkubátoru na 37°C, probíhá reverzní transkripce do cDNA.
•
Vzniklou cDNA zamrazíme na -20°C, nebo uložíme na led a pokračujeme v kvantitativním RT-PCR.
3.DEN
krátce
stočíme
v pikofuze,
.
e) Kvantitativní PCR •
Seznámíme se se softwarem StepOne v.2.0 na PC stanici připojené k realtime termocykléru StepOnePlus. S pomocí vyučujícího si vytvoříme nový
experiment pro vlastní vzorky a vybrané primerové sady a případně hybridizační sondy (Tabulka 3). Rozhodneme se zda provedeme experiment na principu Tagman nebo SybrGreen. Tabulka 2. Genově specifické primery a Tagman próby pro kvantifikaci několika genů metabolismu a percepce cytokininů u kukuřice. gen
Název
SYBR Green chemismus Cytokininový receptor ZmHK1rt_fw 1 ZmHK1rt_rev Regulátor cytokininové ZmRR1rt_fw odpovědi 1 ZmRR1rt_rev Regulátor cytokininové ZmRR7rt_fw odpovědi 7 ZmRR7rt_rev aktin ZmACTrt_fw ZmACTrt_rev Tagman chemismus Cytokinin ZmCKX1rt_fw dehydrogenasa 1 ZmCKX1rt_rev ZmCKX1 Cytokinin ZmCKX3rt_fw dehydrogenasa 3 ZmCKX3rt_rev ZmCKX3 Cytokinin syntetasa 5 ZmIPT5rt_fw ZmIPT5rt_rev ZmIPT5 Elongační faktor 1 ZmEF1rt_fw ZmEF1rt_rev ZmEF1
Sekvence
Teplota disociace produktu
5´-GGCTGCACTCAAGAAGTATGGT-3´ 5´-CCTCAAACCCGTCCATCTCT-3´ 5´-TGGATGGATTTGAAGCCACAA-3´ 5´-TCTCCACGTTCTATTTGCTCATTT-3´ 5´-CAGAGGATCAGCAGATGCCTAA-3´ 5´-CCTTGGTCTTGAGTGGCTTGA-3´ 5´-CGACAACCTGATGAAGATCCTTACT-3´ 5´-GCAACGTAGGCAAGTTTTTCCTT-3´ 5´-GGCCCGCTCATCGTCTA-3´ 5´-GCGTAGAACACGTCCTCAGA-3´ 5´-TCCCACATGGATTTGTTG-3´ 5´-GGGTCCTAGGCTTCAGGTCAAC-3´ 5´-CGTGTCGCCACCGTCTGTCGA-3´ 5´-CCGTGCTTGAGCGTCTCA-3´ 5´-CCACCACGACCAGATGCT-3´ 5´-CGAGGCGGGACGTGTT-3´ 5´-CCCTCCACGAGATCAA-3´ 5´-TGATACCCACCAAGCCTATGGT-3´ 5´-CATGTCGCGGACAGCAAAC-3´ 5´-AGACATTCTCCGCGTTTCCTCCCCT-3´
•
V experimentu si zadáme potřebný počet vzorků a počet genů (target), které chceme detekovat (4). Každou reakci provedeme ve dvou technických replikátech. Pro každý vzorek a každou kombinaci primerů (target) nastavíme negativní reakci s RNA nepřepsanou do cDNA. Pokud máme dva biologické vzorky nastavíme celkem 24 reakcí.
•
cDNA i kontrolní nepřepsanou RNA z předchozího kroku vhodně naředíme tak, aby nám její množství stačilo na všechny reakce.
•
Do stripů nebo PCR destičky nepipetujeme reakce v následujícím složení: TAGMAN:
SYBR GREEN: celkový objem
10,0 μl
celkový objem
10,0 μl
cDNA/RNA
2,5 μl
cDNA/RNA
2,5 μl
1,2 μM směs primerů
2,5 μl
1,2 μM směs primerů
2x SybrGreen qPCR směs
5,0 μl
a 1,0 μM Taqman próby
2,5 μl
2x Tagman qPCR směs
5,0 μl
•
Stripy nebo PCR destičku vhodně uzavřeme, obsah krátce centrifugujeme, umístíme do bloku real-time termocykléru a spustíme amplifikaci, průběh reakce sledujeme v analytickém okně softwaru a po skončení náležitě vyhodnotíme.
Vyhodnocení výsledků 1) V softwaru StepOne převeďte amplifikační křivky do logaritmické podoby a zkontrolujte proložení „treshhold“ přímek tak, že procházejí lineární oblastí všech amplikačních. 2) Odečtěte výsledné Ct hodnoty pro všechny vzorky a zapište si je. 3) Metodou delta delta Ct vypočítejte změnu exprese jednotlivých genů v rostlině na kterou byl aplikován cytokinin oproti rostlině kontrolní. 4) Pokud jste vzorky amplifikovali v chemismu SybrGreen, zkontrolujte denaturační křivky produktů a porovnejte získané denaturační teploty s teplotami v tabulce 3. 5) Zamyslete se a zhodnoťte fyziologický význam reakce rostliny (změny exprese sledovaných genů) na exogenní aplikaci hormonu. 6) Předpokládejte, že jste dostali u sledovaného genu hodnotu Ct vzorku přesně o tři jednotky vyšší než u kontroly. Kolikrát se změnila exprese genu ve vzorku oproti kontrole za předpokladu, že Ct hodnoty provozního genu vzorku i kontroly měly stejné Ct?
Literatura Sambrook, J. et al. (2001) „Molecular Cloning: A laboratory Manual“ Third Ed., Vol. 2, pp. 8.46 – 8.65. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Logemann, J. et al. (1987) „Improved Method for Isolation of RNA from Plant Tissues“. Anal Biochem 163, 16-20. Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Reagent Guide, manuál Applied Biosystems, 2008, http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generald ocuments/cms_046739.pdf TRI Reagent® Solution RNA/DNA/Protein Isolation Reagent, manuál Ambion, 2008, http://www.ambion.com/techlib/prot/bp_9738.pdf
Obrázek 13: Příklad navržení primerů a Tagman sondy pro kvantitativní PCR pro provozní gen kódující elongační faktor 1. Zobrazená je pouze 3´-terminální část ORF genu, tučně a dvojitě podtrženy jsou pozice forvard a reverse primerů, místo nasednutí Tagman próby je šedě zvýrazněno.
ZmEF1
970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| CCTGCCAAGG AGGCTGCCAG CTTCACGTCC CAGGTCATCA TCATGAACCA CCCTGGGCAG ATAGGCAATG GCTATGCCCC
ZmEF1
1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AGTGCTGGAC TGCCACACCT CCCACATCGC TGTCAAGTTT GCTGAGCTCA TTACCAAGAT CGACAGGCGC TCTGGCAAGG
ZmEF1
1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AGCTTGAGAA GGAGCCAAAG TTCCTGAAGG ACGGTGATGC TGGTATGGTG AAGATGATAC CCACCAAGCC TATGGTGGTG
ZmEF1
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| GAGACATTCT CCGCGTTTCC TCCCCTTGGT AGGTTTGCTG TCCGCGACAT GAGGCAGACA GTTGCTGTTG GAGTCATCAA
ZmEF1
1290 1300 1310 1320 1330 1340 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| .... GAGTGTGGAG AAGAAGGACC CGACCGGCGC CAAGGTGACC AAGGCGGCCG CCAAGAAGAA ATGA
