Laboratóriumi vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben: Új lehetőségek, régi dilemmák
Nagy Eszter ORFI, Immunológiai Laboratórium
Immunológiai betegségek laboratóriumi diagnosztikája Diagnózis alapja: Anamnézis, fizikális vizsgálat
30%
Rutin laboratóriumi vizsgálatok 20% vérkép, gyulladásos aktivitás (süllyedés, CRP), biokémiai és vizeletvizsgálat, stb. Képalkotó eljárások (röntgen, ultrahang, MR, CT, EKG stb.)
20%
Szövettani vizsgálatok
20%
Immunológiai vizsgálatok
10‐20%
Autoantitest vizsgálatok
Autoantitestek szerepe az autoimmun kórképek diagnózisában
Antitest szerepe
Diagnosztikus
Diagnózis megerősítése
Kórkép
Antitest
SLE
ANA, dsDNS, Sm, aPL (CL, β2‐GPI , LA)
MCTD
U1‐RNP
SjS
SSA, SSB
APS
aPL (CL, β2‐GPI , LA)
RA
CCP, RF
SSc
Centromer, Scl‐70, U3‐RNP
PM/DM
tRNS‐szintetáz (Jo‐1), PL‐7, SRP, PL‐12, Mi‐2
Vasculitis
MPO, PR3, GBM
Autoantitestek laboratóriumi kimutatása • Klasszikus módszerek: ‐ Immunfluoreszcencia (IFA) ‐ Immundiffúzió (ID) ‐ Counterimmunelektroforézis ‐ Radioimmunassay (RIA) ‐ Enzim immunassay (EIA)
• Új módszerek: ‐ Line immunoassay (LIA) ‐ Bead‐alapú assay‐k ‐ Antigén‐microarray‐k ‐ Fehérje chip‐ek Kritikus Pontok: Szenzitivitás / specificitás , klinikai interpretáció Irányelvek hiánya az új módszerek alkalmazására és interpretációjára Standardizáció : kalibráció, új referencia minták szükségessége Tesztek harmonizálása Nemzetközi bizottságok: IUS / WHO / CDC Committee for the Standardization of Autoantibodies in Rheumatic Diseases, ACR ANA bizottsága
Az ANA szűrés dilemmája: IFA, ELISA vagy Immunoblot? IFA: nukleáris és citoplazma mintázatok
‐ DNS ‐ Histon ‐ Nucleosoma
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
SSA SSB Sm ENA RNP Scl‐70 PM‐Scl Ku (PM) Mi‐2 (PM) Sp‐100
‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
AMA (PBC) Ribosoma (SLE) Jo‐1, SRP, PL‐7, PL‐12 (PM ) Midbody CENP‐F (tumorok) Golgi Lysosoma Proteasoma Mitótikus orsó F‐Actin (AIH) Vimentin
IFA előnye: ‐ Intakt Hep‐2 sejtek, az antigén natív formában (a minőség a fixálás függvénye) ‐ Magas szenzitivitás: SLE‐ben 95 % ‐ ANA + anamnézis + fizikális vizsgálat kombinációjában (De alacsony specificitás ! – 57% SLE‐ben)
IFA
Az ANA szűrés dilemmája: IFA, ELISA vagy Immunoblot?
Fontos tényező a hígítás: 1: 40 ‐ az egészséges populáció 31,7 %‐a 1: 80 ‐ az egészséges populáció 13,3 %‐a Pozitív 1:160 ‐ az egészséges populáció 5 %‐a (Tan EM et al., 1997) • Ajánlás az IFA optimális hígításának kiválasztására: egészséges kontrollok 95 percentilisének megfelelően ‐ DE a hígítás emelésével a szenzitivitás csökken!!! • Konszenzus hiánya: hígítás gyerekminták esetén (<16 év), 1:40?
ELISA / Immunoblot Fontos tényezők: ‐ antigén forrása és tisztasága ‐ antigén szerkezete, hordozóhoz való rögzítése ‐ szűrőtesztek esetén az antigén keverék összetétele ‐ mit szűrünk? ha csak néhány mag elleni at.‐et szűr ANA, csak annak része!!! (eredmény közlés ennek függvényében) A 2007‐ben alakult ACR ANA munkacsoport állásfoglalása az ANA irodalmának áttekintése alapján ‐ arany standard még mindig az IFA teszt: az IFA teszt helyettesítésére a szolid‐fázisú immunassay‐k még nem teljesen alkalmasak ‐ az SLE‐s betegek kb. 35%‐a elveszíthető!!! (Meroni et al., 2010)
IFA Automata rendszer egyik példája
ELISA tesztek eltérő szenzitivitása és specificitása az antigén tulajdonságaiból adódóan • dsDNS ELISA: ssDNS kontamináció miatt – álpozitivitás • Antigén szerkezete: konformációs / lineáris (konformációs antigének: PT , néhány β2‐GPI, SSA‐60) • Antigén szilárd fázishoz való rögzítése: releváns epitópok hozzáférhetősége ‐ PR3 ELISA: direkt, capture, anchor ‐ PT ELISA: foszfatidilszerin rögzítése, majd PT hozzáadása Ca2+ jelenlétében
Körkontroll vizsgálat összesített eredményei egy minta kapcsán
n=36
0 Negatív, 1 Határérték, 2 Gyengén pozitív, 3 Pozitív, 4 Erősen pozitív
ACPA antitest Körkontroll célja: új ACPA standard? Konszenzus: erősen pozitív EWRR ECS on autoantibodies (2014‐ 2015)
Körkontroll vizsgálat összesített eredményei egy minta kapcsán
His‐tRNS szintetáz (Jo1) Nincs konszenzus EWRR ECS on autoantibodies (2014‐2015)
n=36
50%
0 Negatív, 1 Határérték, 2 Gyengén pozitív, 3 Pozitív, 4 Erősen pozitív 12 ELISA 5 IB 1 CIE
7 ELISA 2 IB
2 ELISA 4 IB
2 IB
1 IB
Diagnosztikai algoritmus CTD‐ben ANA‐IFA NEGATÍV
POZITÍV Mintázat függvényében
STOP Centromer titrálás
Citoplazma
Nuclear Dots
AMA, RIB, Myositis sp.
Sp‐100
Más titrálás
PM, SjS klinikai gyanúja
ha ≥ 1:160 vagy erős a klinikai gyanú CTD‐re ENA szűrés + ENA profil
dsDNS POZ
NEG
Mennyiségi meghatározás és konfirmálás
Erős klinikai gyanú SLE‐re
Nucleosoma
RNP, Sm, SSA, SSB, Jo‐1, PCNA, Histon Wiik, 2004; Bizzaro et al., 2007
Vizsgálati algoritmus ‐ SLE SLE DIAGNÓZIS: Immunológiai vizsgálatok • Antinukleáris antitest (ANA) • dsDNA at., Nucleosoma (Kromatin) • ENA at. (SS‐A,SS‐B, Sm, RNP) • komplement (C3, C4, CH50) • aPL at. (CL, β2‐GPI (G/A/M), LA) • RF • Direkt Coombs Kémiai, hematológiai vizsgálatok • CRP • Vérkép • Vizelet Kiegészítő vizsgálatok • •
dsDNS
Sm
U1‐RNP
SSA
PRIB
PCNA
P Ribosoma at. (negatív dsDNS és Sm, neurológiai manifesztációk esetén) PCNA at. (ANA mintázat ‐ konfirmáció) Különböző ANA mintázatok Hep‐2 sejteken
SLE KÖVETÉS: Immunológiai vizsgálatok • C1q (elsősorban veseérintettség esetén) • dsDNA at., Nucleosoma (szintje az aktivitás, lupus nephritis jelzője) • komplement (C3, C4, CH50) Kémiai, hematológiai vizsgálatok • CRP • Vérkép • Vizelet
NEONATÁLIS LUPUS (NLE): •
SS‐A (Ro‐52, Ro‐60), U1sn‐RNP
GYÓGYSZER INDUKÁLT LUPUS (DLE): • Histon antitest (diagnosztikai kritérium)
Aktív SLE‐ben 3 ‐ 6 havonta
Vizsgálati algoritmus – Sjögren Szindróma (SjS) SjS DIAGNÓZIS: Immunológiai vizsgálatok • ANA • ENA antitestek: SSA, SSB, Sm, RNP • RF További kiegészítő vizsgálatok: •
Pajzsmirigy at. (TPO, TG)
•
Szervpscifikus at. (APA, AMA, SMA)
•
Komplement (C3, C4, CH50), Kryoglobulin (vasculitis miatt)
•
Szérum immunglobulin szintek (Ig G, IgA, IgM) / immunfixáció (M komponens miatt)
Kiegészítő kémiai, hematológiai vizsgálatok: •
TSH
•
Szérum elektroforézis (monoklonális gammopátia miatt)
•
Vérkép (esetleges leukopénia miatt)
Vizsgálati algoritmus ‐ RA RA Diagnózis: CRP, We, C3, C4 RA Követés / Biológiai terápia: CRP, RF, ANA / dsDNS, PL at. (CL)
ACPA (CCP / MCV)
pozitív
negatív
RF IgM
pozitív
pozitív
negatív
negatív
Differenciál diagnózis
RA‐33 RF IgA CarP at.? pozitív RA nagyon valószínű < 4 ACR kritérium esetén is
ANA ‐ IIF
SS‐A SS‐B
Sm dsDNS
ACA Scl‐70 Nucleoláris
Sec. Sjögren
SLE
Scleroderma
negatív RA nem valószínű
RA 4 ACR krit.
Vizsgálati algoritmus – Szisztémás Sclerosis (SS) ANA‐IFA
Pozitív (mintázat függvényében) – Konfirmálás: ENA‐ELISA / Immunoblot
Centromer
+ Scleroderma limitált forma (Crest sy.)
Nucleoláris RNS Polim. I Fibrillarin PM/Scl Th/To
+
Scleroderma vagy PM Scleroderma overlap sy
RNS Polim. III
+
Scl‐70
U1‐RNP
+
+
Sleroderma főként diffúz forma
Sleroderma izületi, izom manif. vagy MCTD
Vizsgálati algoritmus – PM / DM ANA ‐ IIF
Finom / diffúz szemcsés citoplazma pozitivitás
SRP
Polymyositis Anti‐SRP Szindróma
CITOPLAZMA negatív
CK, LDH, GPT, GOT Aldoláz
Granulált nucleáris / homogén nucleoláris pozitivitás
PL‐7 PL‐12 Jo‐1
Mi‐2
PM/Scl Ku
U1‐ RNP
Polymyositis Anti‐szintetáz Szindróma
Dermato myositis
Scleroderma / Myositis overlap
MCTD
Myositis antitestek konfirmációja Immunoblot vizsgálattal MYOSITIS SPECIFIKUS antitestek: • • • • • • • • • • •
Jo‐1* (ASS) PL‐7 (ASS) PL‐12 (ASS) EJ (ASS) OJ (ASS) SRP (Nekrotizáló Myositis) Mi‐2 (DM) TIF‐1g (p155/140) (DM, CDM) MDA‐5 (C‐ADM, ILD) SAE (DM, ILD) NXP2 (p140) (JDM, kalcinózis)
1. 2. 1.
?
2.
MYOSITIS ASSZOCIÁLT antitestek: •
PM‐Scl* (PM, DM, Scleroderma overlap)
•
Ku (Scleroderma overlap)
•
U1‐snRNP* (MCTD)
•
SSA (Ro‐52, Ro‐60)*
1. Minta IFA képe (Citoplazma neg!!!)
ASS: anti‐szintetáz szindróma, CDM: tumor asszociált DM, C‐ADM: amyopathiás DM, JDM: juvenilis DM *ELISA teszt is elérhető
?
Vizsgálati algoritmus – Szisztémás Vasculitis ANCA – IIF / ELISA pozitív További vizsgálatok: • ANA IIF • C3/C4 • RF • Kryoglobulin • CRP • We
Etanollal fixált granulocitákon
Formalinnal fixált granulocitákon
C‐ANCA PR3 Wegener gran. Mikroszk. Poliang. Churg‐Strauss sy.
Atípusos ANCA
P‐ANCA MPO Mikroszk. Poliang. Wegener gran. Churg‐Strauss sy.
Vizsgálati algoritmus – APS CL (G/M), Β2GPI (G/M), LA
CL gyengén +
mind negatív
CL (A) / Β2GPI (A) ?
CL (G/M), Β2GPI (G/M), LA ismétlés 3 hónap múlva
negatív
negatív
további PL at. ?
legalább 1 +
negatív Nem APS
legalább 1 +
gyengén +
pozitív
CL (A) / Β2GPI (A) további PL at. ? legalább 1 +
APS lehetséges ? Követés
APS
MCTD DIAGNÓZIS: Immunológiai vizsgálatok • Antinukleáris antitest (ANA) • ENA ‐ U1‐snRNP Kémiai, hematológiai vizsgálatok • Vérkép • Vizelet • CRP
JUVENILIS IDIOPÁTHIÁS ARTHRITIS (JIA) Immunológiai vizsgálatok • • •
Antinukleáris antitest (ANA), pozitivitás esetén ENA RF, CCP AST, TB szűrés (Quantiferon)
Kémiai, hematológiai vizsgálatok • CRP, We Genetikai vizsgálatok • HLA‐B27
TNF‐ gátló terápia laboratóriumi vonatkozásai ‐ látens TB szűrés Mycobacterium tuberculosis fertőzés kimutatása IGRA teszttel (IFN‐ release assay) – Quantiferon teszt bevezetése • Szenzitív: látens és aktív TB fertőzés kiszűrése • Specifikus: BCG oltás vagy más, nem tuberkulózis Mycobacterium‐al való fertőzés nem befolyásolja • Biztonságosabb interpretáció (pozitív / negatív kontroll) %
negatív
100
87
nem értékelhető
63
80
50,8
60
37
40 20
pozitív
11
2
46,7
Gyártó szerint: •
TBAg Cut‐Off: 0,35 IU / mL
•
Mitogén (PK) Cut‐Off: 0,5 IIU/mL
Saját tapasztalat alapján: •
IU / mL
2,5
0
•
0 RB
ED
TBAg szürke zóna: 0,300 – 0,800
H
Quantiferon eredmények %‐os megoszlása a reumatológiai betegek (RB), hajléktalanok (H), és az őket ellátó egészségügyi dolgozók (ED) csoportjában (saját adatok)
Mitogén (PK): 0,5 ‐ 2 IU / mL nem egyértelmű
TNF‐ gátló terápia laboratóriumi vonatkozásai ‐ Gyógyszer és ellenanyag szint meghatározása Ajánlott algoritmus primer vagy szekunder hatásvesztés esetén Terápiára nem reagálók
Gyógyszer és EA szint meghatározása
Optimális gyógyszerszint, Nincs EA
Optimális gyógyszerszint, Van EA
Szuboptimális gyógyszerszint, Nincs EA
Nem TNF‐ mediált gyulladásos folyamat? Más terápiás lehetőség mérlegelése
Álpozitív teszt , funkc. inaktív / kis avidit. EA? (Funkcionális, neutralizációs teszt)
Nem EA mediált farmakokinetikai foly. Nagyobb dózis / gyakoribb adagolás
Szuboptimális gyógyszerszint, Van EA
Gyógyszert neutralizáló specifikus EA TNF gátló váltás
Bendtzen, K., Discovery Medicine, , 2013, 15 (83), 201‐211
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
