L. acidophilus_(PSMM _ TIDE): 2010-04-06 Ivo Sedláček a Pavel Švec
Česká sbírka mikroorganismů Přírodovědecká fakulta MU Tvrdého 14, 602 00 Brno Projekt FI-IM5/205
„… problematika taxonomie“ Polyfázová taxonomie - taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami - obsahuje dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace - použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup – tzv. „polyphasic approach“
Fylogenetická klasifikace fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie
a o chemotaxonomické údaje popis mnoha nových taxonů X co identifikovat? identifikace taxonu X mobilní genetické elementy (bakteriofágy, ostrovy patogenity, chromozomové kazety, plazmidy), exoproteiny - genetický polymorfismus
„… problematika taxonomie“ DNA Celková DNA: % obsah G+C restriční profil (RFLP, PFGE) velikost genomu DNA reasociace
RNA RNA sekvencování analýza nízkomolekulárních RNA
Úseky DNA: PCR metody (rep-PCR, RAPD, AFLP) ribotypizace DNA sondy DNA sekvencování
Polyfázová taxonomie,
plazmidová DNA
fylogenetická příbuznost
Proteiny Chemotaxonomické znaky mastné kyseliny (FAME) mykolové kyseliny polární lipidy chinony
elektroforetický profil celobuněčných peoteinů enzymový profil (MLEE)
www.bacterio.cict.fr
Fenotyp morfologie biochemie a fyziologie (API, Biolog) sérologie
Lactobacillus acidophilus komplex
•
Lactobacillus = 130 taxonů
•
probiotická mikroflóra; ?patogenita?
•
L. acidophilus – ústa, trávicí trakt, vagina
•
L. acidophilus sensu stricto
•
L. acidophilus sensu lato (obligátně homofermentativní) velice rozsáhlá skupina bakterií: L. acidophilus sensu stricto,
L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii (Fujisava et al., 1992); L. jensenii (Gasser et al., 1970) fylogeneticky příbuzné x fenotypově podobné L. acidophilus sensu lato - vaginální sliznice?!
Lactobacillus acidophilus komplex
externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace
cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5°C) presumptivní identifikace založena na:
rep-PCR (GTG5)
spolehlivá identifikace LAB
Lactobacillus acidophilus komplex: rep-PCR
Shluk I
„in house“ databáze > 1600 LAB
Shluk II
Neprůkazné pro L. acidophilus komplex
Shluk IIIa
Lactobacillus acidophilus komplex
externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace
cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5°C) presumptivní identifikace založena na:
rep-PCR (GTG5)
24 izolátů L. acidophilus sensu lato (20 žen)
biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně)
ribotypizace (RiboPrinter)
MALDI-TOF MS
Lactobacillus acidophilus komplex: biotypizace API Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A
API 50CH ID L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus L. brevis L. crispatus L. acidophilus komplex L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus Lactobacillus sp. L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace
RiboPrinter MALDI-TOF MS
výborná, dobrá ID: 10 nejistá, nepřijatelná ID: 14
? růst při 45°C ? variabilní bioprofil
Finální ID
Lactobacillus acidophilus komplex: rozšířená biotypizace Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A
API 50CH ID L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus L. brevis L. crispatus L. acidophilus komplex L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus Lactobacillus sp. L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace L. acidophilus komplex L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus Lactobacillus sp. L. gasseri L. acidophilus komplex L. gasseri L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex komplex komplex Lactobacillus sp. L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex komplex
4% NaCl
RiboPrinter MALDI-TOF MS
Finální ID
Lactobacillus acidophilus komplex: dendrogram biotypizace 01A 06A 28A 04A 18C 32A 11B 21A 29B 35A 19A 10A 30B 17A 33A 03A 22A 14C/2 15B 11A 19C 34A 30C 10E/1 0%
10%
20% Linkage Distance
30%
Lactobacillus acidophilus komplex: RiboPrinter
profil 1.
pheS sekvencování (a)
profil 2.a
L. gasseri profil 2.b
Lactobacillus acidophilus komplex: RiboPrinter Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A
API 50CH ID L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus L. brevis L. crispatus L. acidophilus komplex L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus Lactobacillus sp. L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace L. acidophilus komplex L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus Lactobacillus sp. L. gasseri L. acidophilus komplex L. gasseri L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex komplex NI NI L. acidophilus komplex NI L. acidophilus komplex komplex NI komplex NI Lactobacillus sp. L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI komplex NI
RiboPrinter MALDI-TOF MS NI L. gasseri NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI
Finální ID
Lactobacillus acidophilus komplex
externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace
cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5°C) presumptivní identifikace založena na:
rep-PCR (GTG5)
24 izolátů L. acidophilus sensu lato (20 žen)
biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně) ribotypizace (RiboPrinter) MALDI-TOF MS
7 izolátů L. acidophilus sensu lato
sekvencování pheS genu
Lactobacillus acidophilus komplex: ribotypizace
pheS sekvencování (a)
Lactobacillus acidophilus komplex: MALDI-TOF MS
Lactobacillus mucosae: MALDI-TOF MS x104
4706
isolate 10E/1
] u s.[a te In
1.0 0.8 0.6 4491
0.4 0.2
2352
2742
5135
3145 3421
0.0 x104
6312
5304
3996
6842
4706
7989
9403
7450
L. mucosae CCDM 690T
] u s.[a te In
1.5
1.0
0.5
2350
4492
3144 2739
5136 5304
3687 3994
6313
6844
7453
9406
7990
0.0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Fig. 2: Comparison between MALDI-TOF mass spectra of isolate 10E/1 identified as L. mucosae and the corresponding reference strain L. mucosae CCDM 690T.
m/z
Lactobacillus acidophilus komplex: MALDI-TOF MS Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A
API 50CH ID L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus L. brevis L. crispatus L. acidophilus komplex L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus Lactobacillus sp. L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace L. acidophilus komplex L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus Lactobacillus sp. L. gasseri L. acidophilus komplex L. gasseri L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex komplex NI NI L. acidophilus komplex NI L. acidophilus komplex komplex NI komplex NI Lactobacillus sp. L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI komplex NI
RiboPrinter NI L. gasseri NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI L. crispatus L. jensenii NI L. jensenii NI L. crispatus(a) L. crispatus(a) NI NI NI L. jensenii L. crispatus(a)
MALDI-TOF MS L. crispatus(a) L. gasseri L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. mucosae L. jensenii L. crispatus L. jensenii L. jensenii L. crispatus L. crispatus(a)
Finální ID
L. crispatus(a) L. crispatus L. frumenti L. crispatus(a) L. crispatus(a)
(a)
profil podobný L. ultunensis
Lactobacillus acidophilus komplex: finální identifikace Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A
API 50CH ID L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus L. brevis L. crispatus L. acidophilus komplex L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus L. acidophilus Lactobacillus sp. L. acidophilus L. acidophilus komplex L. acidophilus L. gasseri L. acidophilus L. acidophilus
Fenotypizace L. acidophilus komplex L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex L. acidophilus Lactobacillus sp. L. gasseri L. acidophilus komplex L. gasseri L. gasseri L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex komplex NI NI L. acidophilus komplex NI L. acidophilus komplex komplex NI komplex NI Lactobacillus sp. L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI komplex NI
RiboPrinter NI L. gasseri NI NI NI NI NI NI NI NI NI NI L. crispatus L. jensenii NI L. jensenii NI L. crispatus(a) L. crispatus(a) NI NI NI L. jensenii L. crispatus(a)
MALDI-TOF MS L. crispatus(a) L. gasseri L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. mucosae L. jensenii L. crispatus L. jensenii L. jensenii L. crispatus L. crispatus(a) L. crispatus L. jensenii L. crispatus(a) L. jensenii (b) L. crispatus L. crispatus L. crispatus L. frumenti L. crispatus(a) L. crispatus(a) L. jensenii L. crispatus profil podobný L. ultunensis (a)
Finální ID = fenotypizace + shluková analýza ribotypizace + MALDI-TOF MS
Finální ID L. crispatus L. gasseri L. crispatus (b) L. crispatus L. crispatus L. mucosae L. jensenii (b) L. crispatus L. jensenii L. jensenii L. crispatus (b) L. crispatus (b) L. crispatus
(b)
L. crispatus L. vaginalis (b) L. crispatus L. crispatus
sekvencování pheS (b)
Lactobacillus acidophilus komplex 24 studovaných izolátů z cervixu: L. crispatus (63%) L. jensenii (25%) L. gasseri, L. mucosae, L. vaginalis L. acidophilus sensu stricto
MALDI-TOF MS
ribotypizace
biotypizace
?databáze?
Děkuji za pozornost
