Kwantitatieve PCR van potentieel toxische cyanobacteriën in oppervlaktewateren Edwin Kardinaal, Danielle van der Linde, Lonneke Hensen & Bart Wullings KWR Watercycle Research Institute, Nieuwegein
Inhoud
Q-PCR ontwerp • Wat doet Q-PCR • Gebruik fycocyaninegenen • Wat zijn de doelorganismen
Resultaten • • • •
Test van methodiek op veldsamples Q-PCR resultaten in vergelijk met microscopische tellingen Toepassing methodiek in huidig beleid Algemeen toepasbaar?
Conclusies © kwr 2010
2
© kwr 2010
3
Nederlandse regelgeving mbt toxische cyanobacteriën in recreatie- en zwemwater in 2010
Indien cyanobacteriën een relevant gevaar lijken te vormen: • Dagelijkse observatie van mogelijke drijflagen • Intensieve monitoring of tellen van cyanobacteriën (wekelijks of eens per twee weken) tijdens het zwemseizoen • Focus op potentieel toxische cyanobacteriën (Microcystis, Planktothrix, Anabaena, Aphanizomenon en Woronichinia)
<50.000 cellen/ml; tweewekelijkse monitoring >50.000 cellen/ml <300.000 cells/ml; waarschuwen >300.000 cellen/ml: negatief zwemadvies © kwr 2010
HOE?
4
Methoden om cyanobacteriën te monitoren in zwemwater Microscopische tellingen • Kwantificeren van cellen op basis van visuele waarnememingen
Fluorometrie • Detectie van cyanobacterie specifiek chlorofyl
Q-PCR? • Kwantificeren van specifiek DNA
© kwr 2010
5
Q-PCwattuh?
Elk organisme bevat DNA: uniek voor soort (of individu). DNA niks meer dan opeenvolging van stikstofbasen : Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) en Guanine (G)
ATGCGTGCAATGTTTACGCGTAAAGCGTGCACGTTAGAGTACGTGCAGT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| © kwr 2010 TACGCACGTTACAAATGCTCATTTCGCACGTGCAATCTCATGCACGTCA
6
Zo werkt dat! (1)
© kwr 2010
7
Zo werkt dat! (2)
© kwr 2010
8
Q-PCR of kwantitatieve real-time polymerase ketting reactie Techniek gebaseerd op het “real-time” meten van selectieve DNA-vermenigvuldiging in de PCR-reactie Isolatie van genetisch materiaal (DNA) Detectie op basis van verschillen in DNA-volgorde Kenmerken: • • • •
snel (<4 uur) selectief en gevoelig kwantitatief robuust (elk watertype)
Mogelijkheid om meerdere targets te detecteren • Microcystis, Planktothrix, etc • gecombineerd met een interne controle © kwr 2010
9
Q-PCR primer en probe design Fycocyanine operon (cpcBA) • Uniek voor cyanobacteriën • Grote collectie van “referentie” sequenties beschikbaar in databases (totaal 1000 cpcBA sequenties) • Één kopie van cpcBA operon op genoom Microcystis • Sequentie-informatie operon gebruikt voor fylogenetische studies
Q-PCR primers en probes (Taqman) ontworpen op basis van verschillen en overeenkomsten
© kwr 2010
10
Vissen in de soep……..
Microcystis
Planktothrix
© kwr 2010
Aphanizomenon
Anabaena
11
Dendrogram van Anabaena en Aphanizomenon cpcBA sequenties
A B
Anabaena bergii, Aphanizomenon ovalisporum Anabaena variabilis, Anabaena siamensis e.g. Anabaena flos-aquae, A. kisseleviana, A.bergii, A. sphaerica, Aphanizomenon aphanizomenoides,
C
e.g. Anabaena solitaria, A. planktonica, A. viguieri, A. spiorides, A. circinalis, A. smithii, A. ucrainica, A. affinis, A. elipsoides, and A. lemmermannii
D
e.g. Aphanizomenon glacile, A. flos-aquae, A. issatschenkoi, Anabaena lemmermannii, A. circinalis, A. flos-aquae
© kwr 2010
12
De onderzochte locaties 2010
24 locaties Ca. 8 monsternamemomenten Totaal 182 monsters
© kwr 2010
13
Relatie celtelling en qPCR (1)
© kwr 2010
14
Relatie celtelling en qPCR (2)
© kwr 2010
15
Connectie celdichtheden vs. DNA kopie aantallen
Bestaat er een relatie tussen celdichtheden en DNA kopie aantallen? Afhankelijk van: • groeifase (seizoen) • celtellingen • genus en/of soort Proef: Groei cyanobacteriën onder gecontroleerde omstandigheden, kwantificeer cellen en meet DNA kopie aantallen.
© kwr 2010
16
Relatie cyanobacteriecellen vs. DNA kopie aantallen
Groeiproef: •Celtellingen mbv (omkeer)microscoop •Celtellingen mbv flowcytometrie •DNA kopie aantallen mbv qPCR
© kwr 2010
17
Verhoudingen laboratorium proef
© kwr 2010
18
Omrekenfactoren
Ratio tussen de kwantitatieve resultaten van de qPCR van de cyanobacteriën in de groeiproef ten opzichte van de microscopische celtelling en flowcytometerbepalingen.
© kwr 2010
19
De onderzochte locaties 2011
35 locaties Ca. 7 monsternamemomenten Totaal 232 monsters
© kwr 2010
20
Correlaties het grote plaatje
Planktothrix Anabaena 86
R2 = 0,4096
loggenkopieën genkopieën (/mL) (/mL) log
R2 = 0,875 6
4 4
2 2
00 00
11
22
33
44
5 5
6 6
7 7
log logcellen cellen(/mL) (/mL) © kwr 2010
21
Match tussen celaantallen en DNA kopieën op locatie
Camping De Watermolen Kennemermeer AnabaenaCC Anabaena
AphanizomenonDD Aphanizomenon
Microcystis Microcystis
Planktotrix Planktotrix
Anabaenasp. sp. Anabaena
Aphanizomenon Aphanizomenon
Microcystissp. sp. Microcystis
Planktothrixsp. sp. Planktothrix
1000000 10000000 cellen cellen// DNA DNAkopie kopie aantallen per aantallen perml ml
1000000 100000 100000 10000 10000 1000 1000
100 100 10 10 1 125 25
© kwr 2010
27 27
29 29
31 31
33 33 Weeknummers Weeknummers
35 35
37
37
39
39
22
Correlaties per locatie
© kwr 2010
23
Verhoudingen op basis van lab en veld
velddata2011 2011 Veld 2010 Verhoudingen Veld 2011 Labstudie 3000
Anabaena
Aphanizomenon
Microcystis
Plaktothrix
2000 2500
DNA kopieën / cel
DNA kopiëen/cel
1800 1600 2000 1400 1200 1500 1000
1000 800 600
500 400 200 00
Anabaena Cultures De Dommel Aphanizomenon Delfland RWS IJG Microcystis Rijnland
© kwr 2010
RWS Plank oost tothrix WS Fryslan Zuiderzeeland nederland
24
Reproduceerbaarheid tussen laboratoria
Aphanizomenon I
Aphanizomenon II
Aphanizomenon III
DNA kopie aantallen
1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 M1
M2
© kwr 2010
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
M11 DNA contr.
25
Conclusies
•Goede relatie cellen en DNA kopie aantallen: zie de 2 veldstudies, meer dan 400 monsternamemomenten! •Na correctie resultaten van beide technieken in zelfde orde grootte •Vergelijkbare resultaten tussen laboratoria •qPCR gericht op fycocyaninegenen biedt goed alternatief voor microscopische tellingen: betere risicobeoordeling! Nog te doen: •Meer laboratoria, intercalibratie •Uitbreiden naar andere genera: i.i.g. Woronichinia / Phormidium
© kwr 2010
26
