Kuliah I: Pendahuluan

Kuliah I: Pendahuluan

Copyright Statement:

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya) bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun. Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.

Rekayasa Genetika • Nomor Kode/Beban SKS : PAE 412/ 3 (2-1)• Smester VII diusulkan menjadi semester VI • Prasyarat : Lulus minimal nilai “C” mata kuliah Pengantar Bioteknologi Pertanian (PAE311) dan Biologi Molekuler (AEP 312) • Pengasuh: 1. Prof. Dr. Sc. Agr. Ir. Jamsari, MP • 2. Dr. Yusniwati, SP. MP. • 3. Lily Syukriani, SP. MP.

Deskripsi Singkat • Mata kuliah ini memberikan pembekalan tentang pengertian rekayasa genetika dan prinsip-prinsip serta metode yang dipergunakan dalam menghasilkan organisme transgenik. Lebih detail mata kuliah ini memberikan informasi tentang metode isolasi gen target dan proses penyelipannya serta prinsip analisis integrasi gen tersebut kedalam organisme target. Disamping itu, juga diuraikan penggunaan beberapa teknologi analisis molekuler yang dapat dipergunakan untuk keperluan analisis genom. Pad bagian akhir juga diuraikan tentang potensi resiko dan upaya-upaya yang dilakukan untuk memperkecil potensi resiko yang selama ini menjadi kekuatiran masyarakat.

Tujuan Instruksional Umum • Setelah lulus mengikuti perkuliahan rekayasa genetika ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan pengertian dan potensi manfaatnya dalam perbaikan dan peningkatan kesejahteraan masyarakat. Lebih jauh mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan prinsip isolasi gen target, penyelipan dan prosedur analisisnya. Mahasiswa juga mampi menjelaskan kemungkinan potensi resikonya serta kemungkinan upaya-upaya yang dapat dipergunakan untuk menghindari resiko yang mungkin terjadi.

Strategi Perkuliahan • SCL : Student centerred learning • Ceramah, diskusi, pemecahan masalah, tugas terstruktur, pemberian hand out, praktikum, dan ujian

Materi Kuliah Minggu I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV

Materi Pengertian dan Kontribusi Rekayasa genetika dalam berbagai kehidupan manusia Vektor kloning untuk transformasi genetik: plasmid, Phagemid. Vektor kloning berkapasitas besar : BAC, YAC, Cosmid Transformasi genetik : heat shock, elektrophorasi, Agrobacterium mediated, Biolistik. Analisis Transforman : berbasis PCR, restriksi, hibridisasi. Isolasi gen target I: berbasis fungsi dan Penyusunan Peta Genetik. Isolasi Gen target II: Penyusunan Peta Fisik dan kloning berbasis PCR Analisis fungsional transforman UTS Pustaka cDNA dan EST (Expressed Sequence Tagged) Genome, Chromosome, Primer Walking untuk isolasi Gen. Rekayasa Genetik untuk Peningkatan produksi dan perbaikan kwalitas Hasil Pertanian Rekayasa Genetik untuk Produksi Ternak dan perbaikan kwalitas Ternak Sistem penanda molekuler untuk analisis genom I.-RAPD, isozym, RFLP, AFLP. Sistem penanda molekuler untuk analisis genom II.STS, CAPS, Mini/Mikrosatellit, SNP.

XV Stabilitas ekspresi genetik transgenik. XVI Keamanan produk-produk transgenik. UAS

Daftar Buku: • • • • • • • •

• •

Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula, Prinsip Dasar Teknik Analisis Molekuler. Unri-Press. 180 halaman. Jamsari, 2008. Pengantar Pemuliaan, Landasan Biologis, Genetis dan Molekuler. Unri Press. Lewin, B. 2000. Genes. Oxford-University Press. 990 pp. Watson, J.D., J. Tooze, D.T. Kurtz. 1983. Recombinant DNA, A short course. Scientific American Book. 260 pp. Marshall, G., D. Walters. 1994. Molecular Biology in Crop Protection. Chapmann & Hall. 283 pp. Suzuki, D.T., A.J.F. Griffith, J. H. Miller, R.C. Lewontin. 1989. An Introduction to Genetic Analysis. W.H. Freeman and Company. 768 pp. Kempken, F and R. Kempken. 2000. Gentechnik bei Pflanzen. Springer-Verlag. Berlin. 245 pp. Nevers, P. 1991. Pflanzenzüchtung aus der Nähe gesehen. Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung. 87 p Brown, T.A. 2007. Genomes 3. Garland Science Publishing. Clarck, D.P. 2005. Molecular Biology, Understanding the genetic revolution. Elsevier Academic Press. USA.

Kriteria Penilaian : Skoring penilain dilakukan sesuai dengan kriteria penilain yang berlaku ditingkat Fakultas sebagai berikut: Nilai dalam huruf A AB+ B BC+ C CD E

Point

Rentang skor

4,00 3,50 3,25 3,00 2,75 2,25 2,00 1,75 1,00 0,00

85-100 80-84 75-79 70-74 65-69 60-64 55-59 50-54 40-49 00-39

Komponen Penilaian: 1. Penguasaan Teori Parameter : 1. UTS = 25% 2. UAS = 25% 3. Kuis (I+II) = 10% 2. Penguasaan Praktek Nilai Praktikum (30%), terdiri dari a. UAP = 40% b. Aktifitas selama praktikum (bertanya, diskusi, inisiatif, kreatifitas)= 10% c. Laporan praktikum = 20% d. Seminar hasil praktikum = 20% e. Kehadiran praktikum = 10% Aturan dan ketentuan praktikum dibuat dalam ketentuan tersendiri. 3. Tugas mandiri : 10%

Disiplin: • Toleransi keterlambatan dalammengikuti perkuliahan maksimal 15 menit berlaku untuk Dosen dan mahasiswa yang disepakati pada hari pertama perkuliaahan. • Seluruh tugas yang diberikan dikumpulkan sebelum perkuliahan dimulai. Setelah kuliah dimulai, maka tidak akan diterima. • Segala bentuk kecurangan (ujian, tugas, plagiarisme, dll.) merupakan tindakan kriminal dan memiliki sanksi akademik dan hukum yang berlaku.

Kontrak Perkuliahan: • Kuliah berdasarkan tatap muka, dan diskusi. Bilamana terjadi pembatalan kuliah, maka akan diganti sesuai dengan jadwal yang disepakati. • Kuliah menerapkan sistem SCL (student centered learning) • Pakaian kuliah harus rapi, tidak boleh berambut gondrong, pakai kaos oblong dan sandal. • Mahasiswa hanya diperkenankan mengikuti perkuliahan jika terlambat ≤ 15 menit (besaran waktu ini ditentukan berdasarkan kesepakatan bersama pada hari pertama kuliah) • Kehadiran kuliah minimal 75 % atau 12 kali jika total kuliah 16 kali. Kehadiran praktikum 100 %. • Praktikum diatur sendiri oleh Penanggung jawab praktikum dengan asistennya. Demikian kontrak perkuliahan ini dibuat, agar disetujui dan ditaati oleh semua pihak. Dosen Penanggungjawab

Padang, .... Perwakilan/Komting Mahasiswa .

Prof. Dr. Sc.agr. Ir. Jamsari, MP.

..................................................

Materi I. Pengertian dan Kontribusi Rekayasa genetika dalam berbagai kehidupan manusia No

1.

Tujuan Instruksional Khusus Mahasiswa mampu menjelaskan pengertian rekayasa genetika dan manfaatnya bagi kehidupan manusia.

Pokok Bahasan

Pengertian dan Kontribusi Rekayasa genetika dalam berbagai kehidupan manusia

Sub Pokok Bahasan

1. Pengertian rekayasa genetika. 2. Sejarah perkembangan teknologi Rekayasa Genetika. 3. Potensi pemanfaatan teknologi rekayasa genetika dalam berbagai aspek kehidupan manusia. 4. Keahlian yang dibutuhkan dalam teknologi rekayasa genetika. 5. Potensi Resiko penggunaan produk rekayasa genetika terhadap kehidupan manusia.

Est. Waktu

20 menit 20 menit 20 menit 20 menit 20 menit

Kepustak aan 1, 6, 7

1. Pengertian Rekayasa Genetika.

1. Pengertian Rekayasa Genetika. • Scientific alteration of the structure of genetic material in a living organism. It involves the production and use of recombinant DNA and has been employed to create bacteria that synthesize insulin and other human proteins. • (Life Sciences & Allied Applications / Genetics) alteration of the DNA of a cell for purposes of research, as a means of manufacturing animal proteins, correcting genetic defects, or making improvements to plants and animals bred by man

1. Pengertian Rekayasa Genetika. • The science of altering and cloning genes to produce a new trait in an organism or to make a biological substance, such as a protein or hormone. Genetic engineering mainly involves the creation of recombinant DNA, which is then inserted into the genetic material of a cell or virus.

2. Sejarah Perkembangan Teknologi Rekayasa Genetika

Timeline Perkembangan rekayasa Genetika Tahun

Kejadian penting

1865

Gen dianggap sebagai faktor partikulat

1900

Penemuan kembali hukum Mendel (Correns, Tschermak, de Vries)

1903

Khromosome adalah unit keturunan

1910

Gen-gen terletak pada kromosom

1913

Kromosome mengandung gen-gen yang tersusun secara linear

1927

Mutasi adalah perubahan physik pada gen

1931

Rekombinasi disebabkan oleh pindah silang

1944

DNA adalah materi genetik

1945

Gen adalah pengkode protein

1953

DNA berbentuk double helix (Watson dan Crick)

1958

Replikasi DNA bersifat semikonservatif

1961

Kode genetik tersusun secara triplet

1972

Kloning DNA ke dalam plasmid vektor

1976

Kloning gen pengendali insulin

Timeline Perkembangan Bioteknologi Tahun 1972 1973 1975 1975 1977 1978 1981 1982 1983 1984 1985 1987 1988 1989 1992

Kejadian Dihasilkannya rekombinan DNA pertama dengan bantuan enzim Ligase, Dihasilkannya organisme transgenik pertama oleh Cohen, et al. Ditemukannya teknik elektrophoresis dengan Agarose Sekuensing dengan metode pemutusan berantai Metode hibridisasi DNA Didirikannya perusahaan yang bergerak dalam teknologi gen: Genentech Diperkenalkannya RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 579 gen manusia berhasil dipetakan diperkenalkannya Hibridisasi in-situ Genbank sekuens pertama didirikan Identifikasi pertama penyakit Huntington’s pada kromosom IV Diperkenalkannya Pulsefield Gel Elektroporesis (PFGE) Diperkenalkannya PCR (Polymerase Chain Reaction) Diperkenalkannya YAC (Yeast Artificial Chromosome) Didirikannya proyek pensekuenan genom manusia Peta lengkap pertama genome Hemophilius influenzae Peta tautan lengkap genome manusia pertama

Timeline Perkembangan Bioteknologi Tahun Kejadian 1993 Diperkenalkannya ESTs (Expressed Sequences Tags), Dipublikasikannya peta fisik pertama genome manusia 1995 Genom Haemophilus influenza dan Mycoplasma genitalium lengkap disekuens 1996 Genom Saccharomyces cereviceae (Eukaryot) lengkap disekuens, juga Eschericia coli , Methanococcus fannaschii (Archaeobacteria) lengkap disekuens, Diperkenalkannya teknologi chip 1997 Dipublikasikannya peta fisik genom manusia yang lengkap 1998 Genom C. elegans selesai disekuens 1999 Genom Drosophila melanogaster selesai disekuens 2000 Genom Arabidopsis thaliana selesai disekuens 2000 Genome manusia H.sapiens selesai disekuens 2000 Genom Oriza sativa selesai disekuens 2002 Genom nyamuk Anopheles gambiae dan Plasmodium palcifarum selesai disekuens

3. Potensi pemanfaatan teknologi rekayasa genetika dalam berbagai aspek kehidupan manusia

Penciptaan Varietas Resisten • Resistensi terhadap Herbisida

Tanaman dengan resistensi terhadap herbisida adalah tanaman transgenik pertama yang diusahakan secara komersial, dengan alasan: 1.Relatif mudah untuk menghasilkannya

2.Gulma dapat menyebabkan 10-15% pengurangan hasil 3.Penggunaan herbisida yang tidak saja mahal, akan tetapi juga tidak ramah lingkungan.

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Herbisida Total X Herbisida Selektif •Meracun terhadap semua jenis tumbuhan •Cepat terurari di tanah •(Phosphinothricin, Basta=(WP) PPT/10 hari), Glyphosat (Round up (WP)/3-60 hari)

•Aktif pada dosis tertentu terhadap tumbuhan tertentu dengan karakter morfologi dan fisiologi tertentu •Persistensi lama di tanah dan air. •Atrazin, Bromoxynil, 2.4-D


Penciptaan Tanaman Resistensi terhadap Herbisida Herbisida Basta ® Sumber gen Resisten: gen bar- dan gen pat- diisolasi dari Bakteri tanah Streptomyces hygroscopicus dan S. viridochromogenes Mutan Lucerne (Medicago sativa) gen toleran terhadap Basta Produk: Phosphinothricin-acetyltransferase Fungsi: detoksifikasi melalui proses acetilasi Promotor: 35S-Promotor dari CaMV Tanaman: lucerne, tomat, jagung, padi, gandum dan kedelai


Glyphosat Enzym Oxidoreduktase (bakteri) dan EPSP-Shynthase (35S-Promotor) dari A. tumifaciens strain CP4 (mutant) Tanaman transgenik yang dihasilkan:

Kapas, kentang, Jagung, kedelai, tembakau dan gandum 1996-1997 (USA): Tanaman transgenik resisten herbisida menurunkan penggunaan herbisida 22-26%. Erosi tanah menurun 90%, peningkatan produksi 5%

Problem : kekuatiran tentang penyebaran gen herbisida resisten, dicoba penggunaan plastida sebagai target untuk pengintegrasian gen asing Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Resistensi terhadap herbisida


Resistensi terhadap Serangga Pertimbangan: Penggunaan insektisida yang jelas selain tidak ekonomis juga tidak ramah lingkungan

Menjadikan tanaman resisten terhadap serangga Sumber gen resisten: Bacillus thuringiensis, Bt-toxin , δ-Endotoxin Tanaman: Kapas, kentang, jagung, tomat

European corn borer

Keuntungan: Kapas: penghematan insektisida 3,6 juta liter, produksi 7% meningkat Jagung : 300.000 kg (10%) Western corn rootworm


Resistensi terhadap Serangga


Problem: Ada serangga yang resisten terhadap δ_endotoxin,

Strategi lain: Serin-Proteinase-inhibitor (menghambat enzim pencernaan)


Resistensi terhadap Virus Cross protection Coat protein gen ditransfer sebagai pelindung thdp. virus asing

Source: www.apsnet.org Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

R-Gene (-Resistent Gen) Resistensi terhadap Bakteri dan jamur 200 jenis bakteri bersifat pathogen (prokaryot) 8000 jenis jamur bersifat pathogen (Eukaryot) (100.000 jenis nonpathogen) Pathogen

Tanaman Inang

Gejala Penyakit

Bakteri

Agrobacterium tumifaciens

Tumbuhan dikotil

Erwinia amylovora

Apel, peer

Pseodomonas syringae pv. lachrymans

Timun

Bercak daun

Streptomyces scabies

Kentang

Bisul

Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Padi

Blast

Ophiostoma novo-ulmi

Ulm

Mati ulm

Phytoptora infestans

Kentang

Busuk umbi

Puccinia graminis

Gandum

Karat hitam

Pembentukan tumor

Jamur


Kerusakan akibat Jamur dan Bakteri: • Kerusakan morfologis, fisiologis • kontaminasi (mycotoksin) didalam bahan makanan dalam jangka panjang bersifat carcinogenic Kasus Phytoptora infestans Tanaman kentang di USA (1845), kelaparan terparah di dunia sehingga menyebabkan migrasi besar-besaran dari Irlandia ke USA

Strategi: - Chitinase untuk mencerna lapisan chitin dinding sel jamur (spesifik) - α-Thionin terhadap Pseudomonas syringae, dan Fusarium oxysporum Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Strategi - Gen Cholinoxygenase dari bakteri Arthrobacter globiformis menghasilkan Transgenik Arabidopsi thaliana toleran terhadap kadar garam tinggi (Glycinbetain) - Mannitol-Dehydrogenase (E. coli )menyebabkan akumulasi mannitol yang bisa meningkatkan toleransi terhadap kekeringan pada tanaman tembakau - Quicsilberreduktase (bakteri) pada tanaman Liriodendron tulipifera meningkatkan toleransi terhadap logam perak - Gen Metallothionin pada tanaman tembakau meningkatkan resistensi terhadap logam Cadmium


Toleran terhadap stress lingkungan (abiotic-stress) • Panas, • Dingin, • Kekeringan • Kadar Garam yang tinggi • Kekurangan mineral • Logam berat • Radiasi UV-B


Gene glutathione dari E. coli berperan dalam chelating untuk mengurangi keracunan pollutant.

Deteksi pollutant

Rumput lapangan golf

 Tahan herbisida  Tumbuh lambat mengurangi pemangkasan mengurangi polusi Bio Steel  Jaring laba-laba adalah protein terkuat  Protein penyusu jaring laba-laba diekspresikan di bulu domba  Hasilnya utuk membuat baju tahan peluru (Nexia)

Deteksi Ranjau Darat Dibutuhkan oleh Angkatan Darat, Tanpa upaya ini,anak-anak dan penduduk sipil terancam Bantuan Bioteknologi Tanaman (dikembangkan oleh Aresa Biodetection) • Gen yang peka terhadap logam dimasukkan ke dalam tanaman • Apabila akar tanaman menyentuh ranjau darat, Tanaman berubah warna dari hijau menjadi merah

Mendeteksi ranjau darat

Perubahan pada bahan makanan Negara berkembang: kekurangan pangan Negara Maju : Alergi, kualitas bahan makanan, transportasi

Strategi - Gen AGPase (ADP-Glucose-phsoporilase) dari E. coli digunakan untuk meningkatkan kandungan pati pada tanaman kentang Sebaliknya teknik ekspressi antisense Dihasilkan kentang yang menghasilkan amylopketin, tapi tanpa amylosa (penting untuk industri) - Gen Thioesterase dari Umbellularia californica dapat meningkatkan kandungan Laurat pada tanaman Raps, berguna dalam pembuatan margarin


Perubahan pada bahan makanan Kandungan Protein dan asam amino esensial, vitamin

- Pada tanaman padi dihasilkan tanaman transgenikj yang mampu menghasilkan kadar β-Carotin yang tinggi. Untuk itu empat macam gen pengkode empat macam enzim diintegrasikan: - Phyton-Synthase, Phytoen-Desaturase, ζ-Carotin-Desaturase dan Lycopen-ß-Cyclase.

- Golden Rice


Rasa dan Daya Simpan •

•

Polygalacturonase dengan teknik antisense dapat diinaktifkan dan daya simpan menjadi lama. Tomat dengan tanda Flavr Savr®.

Bahan baku industri •Poly (3HB) = PHB untuk menghasilkan materi bioplastik. Berhasil dicobakan pada plastida tanaman Arabidopsis thaliana dari gen Ralstonia eutropha

Source: Wikipedia E. coli

Produksi Metabolik Sekunder • Alkaloid : Morphin = Atropin (Papaver somniferum) Taxol untuk kanker dari Taxus brevifolia • Bahan untuk imunisasi: Gen spaA menghasilkan protein yang mampu mencegah karies gigi

proteins such as growth hormones, insulin, blood substitutes, and trypsin inhibitor Promega-3 fatty acid not from fish Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

PENGANTAR PEMULIAAN TANAMAN

Barnase-Barstar-System ON MALE STERILITY RNase dari Bacillus amyloliquefaciens >< Barstar Tumbuhan Steril (MS)

Tumbuhan Normal TA29

Barnase

TA29

Barnase

TA29

Barstar

Barnase

+

Barstar

Barnase Degradasi RNA di tapetum Tapetum mati Tapetum hidup Pollen tidak terbentuk

Pollen terbentuk normal

Dr. Jamsari-program study pemuliaan tanaman-BDP-FPUA

References: 1. Hayward, et al. (1993). Plant Breeding-principles and prospects. Chapman & Hall. 2. Fehr, W.R. (1987). Prnciples of cultivar development. Macmillan Publishing. Co. New York.


4. Keahlian yang dibutuhkan dalam teknologi rekayasa genetika.

Keahlian yang dibutuhkan Ilmu pendukung sesuai bidang kajian

Bidang Kajian Pertanian

Kedokteran Peternakan

Rekaya sa Genetik

Farmasi ?????????

Teknologi pangan Lingkungan Kehutanan

Industri Nanoteknologi

5. Potensi Resiko penggunaan produk rekayasa genetika terhadap kehidupan manusia.

Potential Risk of GMOs • Ecological aspects: - Biodiversity of plants, insects, spiders, and other animals.

- Crosspollination concerns, • Human health aspects: Allergens and toxins, gene transfer to microorganism within the body • Horizontal gene transfer: soil bacteria could be pesticide resistant

Strategies for Stopping the Spread of Foreign Genes Male sterility - Stopping pollen production “Termination gene”

Chloroplast transformation - Keeping pollen transgene-free

Keeping transgenic seeds from sprouting

Selesai

Bioteknologi Tanaman

Vektor Kloning Untuk Transformasi Genetik: Plasmid dan Phagemid.




Sub Pokok Bahasan 1. Pengertian vektor kloning untu transformasi genetik. 2. Pengertian dan karakteristik plasmid. 3. Kapasistas kloning plasmid. 4. Pengertian phagemid. 5. Kapasistas kloning phagemid

1. Pengertian vektor kloning untuk transformasi genetik.

Vektor Kloning

? VEKTOR: Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA


Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman

TRANSFORMASI GENETIK 1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens


adalah bakteri tanah penyebab tumor pada tanaman dikotiledon. Pertama ditemukan tahun 1907, dilanjutkan dengan penemuan plasmidnya yang berukuran 200-800 kb.



TRANSFORMASI GENETIK Plasmid mengandung gen penyebab tumor sehingga disebut dengan Tumour inducing-plasmid (Ti-Plasmid) tms

tmr nos

noc = katabolisme Nopalin

T-DNA LB

nos = sinthesis Nopalin

RB

tmr = sintesis Sitokinin noc

vir

T-DNA = DNA transfer

tms = sintesis Auxin vir = daerah virulen

Ti-Plasmid

ori = asal replikasi tra

LB = batas kiri RB = batas kanan

ori Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman Kromosom dalam inti sel tumbuhan Agrobacterium

Pelukaan Sel tumbuhan

Infeksi pada sel tumbuhan dan transfer T-DNA

Tumor T-DNA didalam kromosom inti sel

Agrobacterium di dalam tumor



Agrobacterium di dalam tumor Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Vektor Kloning Persyaratan Suatu Vektor: 1. Replikasi Autonom Dalam Inang 2. Berpenanda Untuk Seleksi 3. Berposisi Kloning Tunggal 4. Berberat Molekul Kecil 5. Memiliki Beberapa Kopi Pada Setiap Sel 6. Tidak Berkonjugasi Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Vektor Kloning Contoh Vektor: 1. Plasmid 2. Fag  (Fag M13) 3. Kosmid 4. P1- (PAC) (Plasmide Artificial Chrom.) 5. BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

6. YAC (Yeast Artificial Chromosome) Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

2. Pengertian dan Karakteristik Plasmid

PLASMID: Dna Ekstrakromosomal Berbentuk Sirkular Tertutup, Berpita Ganda..

KROMOSOMAL DNA

PLASMID

Sumber: Wikipedia Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Jenis-jenis Plasmid F-plasmid: F adalah singkatan dari fertility, Plasmid ini mengandung perangkat gen-gen tra. R-plasmid: R adalah singkatan dari resistance Col-plasmid, adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi senyawa bakteriosin Degradative plasmid, plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak umum seperti toluene atau asam salisilat. Virulence plasmid, adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid :Tumour inducing plasmide

Elemen-elemen penyusun faktor F : 1. Ori T (origin of transfer): sekuens yang berfungsi menandai titik awal selama transfer konjugatif. 2. Ori V (origin of replication): sekuen yang berfungsi dalam replikasi di dalam sel resipien. 3. Daerah tra (transfer genes): gen yang mengkode F-pilus dan pori-pori untuk transfer. 4. IS (elemen insersi): disebut juga dengan “gen egois” yang fragmen yang dapat mengintegrasikan dirinya sendiri pada lokasi yang berbeda-beda.

Jenis bakteri berdasarkan keberadaan faktor F 1. Bakteri Hfr: bakteri yang memiliki faktor F yang terintegrasi di dalam genom bakteri. 2. Bakteri F+: bakteri memiliki faktor F sebagai plasmid yang independen dari genom bakteri. Plasmidnya hanya mengandung sekuen dari faktor F dan tidak mengandung sekuen DNA dari genom bakteri. 3. Bakteri F’ (F-prime): bakteri yang memiliki plasmid F tetapi didalamnya juga terdapat sekuen DNA yang berasal dari genom bakteri. 4. Bakteri F-: bakteri yang tidak memiliki faktor F.

Kelengkapan Plasmid Promoter Marker (penanda) genetik Resistensi antibiotik Epitop Daerah MCS

Kendali Host terhadap Replikasi Plasmid

 Kontrol ketat (stringed control)

Kontrol longgar (relaxed control) (10-200 kopi)


Contoh Peta Plasmid


SISTEM VEKTOR - INANG Eco RI

Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III MCS = Multicloning Site

P O Z lac

Km®

pBin19 10 kb



SISTEM VEKTOR - INANG KLONING DALAM PLASMID Bam HI Eco RI

Bam HI

Bam HI

Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III MCS = Multicloning Site

DNA Asing P O Z lac

Km®

pBin19 10 kb


Ligasi fragmen dengan plasmid DNA Asing

Km®

DNA Ligase


Ligasi fragmen dengan plasmid

DNA Asing

Km®


Isolasi DNA Plasmid

+

CENTRIFUSE

Tris, Buffer EDTA NaOH dan SDS

PELLET

Km®

CENTRIFUSE

Km® Km®

Km®

Km®

Km®

Km®

Km®


Penampilan DNA plasmid stlh diisolasi

Isolasi DNA Plasmid M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Plasmid untuk Kloning Produk PCR

Produk PCR

Produk PCR yang dihasilkan oleh enzim DNA Polymerase non “Proofreading” biasanya menghasilkan ujung Adenyl (A)

Plasmid Kloning Produk PCR

Source: Promega, USA

Differential RAPD-Fingerprinting

AA

B B

C C

Cutting of specific fragments OPN15-Cg Before cutted

After cutted 1400 bp (A#1)

900 bp (A#2)

750 bp (A#3)

Cloning RAPD specific fragment

pGem-T Easy Vector, supplied by Promega-USA

Cloning RAPD specific fragment

E. coli, strain DH5α

Analisis DNA Plasmid dan insersi

Sumber: Jamsari


Analisis DNA Plasmid dan insersi dengan PCR

1000 bp 750 bp 500 bp

520 bp

250 bp 200 bp

Analisis DNA Plasmid dan insersi dengan PCR

1000 bp 750 bp 500 bp

520 bp 370 bp

250 bp

Visualisasi hasil restriksi insert menggunakan enzim BamHI

3. Kapasistas Kloning Plasmid.

Kapasitas Tampung Beberapa Vektor Vektor

Plasmid Plasmid Plasmid -Phage Cosmid

P1-(PAC) BAC YAC

Inang

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Bacillus subtilis Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

Kapasitas kloning

~ 5000 bp ~ 5000 bp ~ 5000 bp 9 – 23 kb 30 – 48 kb 85 – 110 kb 30 – 350 kb 50 kb – 2 Mb


Vektor Berkapasitas Besar

4. Pengertian Phagemid hibrida of the filamentous phage M13 dan plasmids untuk menghasilkan vektor yang dapat tumbuh sebagai plasmid dan juga dapat dimuat sebagai DNA pita tunggal dalam partikel virus.

Phagemid

Disamping memiliki ColEI ori plasmid tersebut juga memiliki f1ori. MCS diletakkan diantara gen Lac-Z. Vektor juga dilengkapi dengan gen resisten antibiotik ampicilin

5. Kapasistas kloning phagemid Vektor Plasmid Phagemid λ-Phage Cosmid

Kapasitas maks.(kb) 10-15 kb < 6 kb < 25 kb < 50 kb

YAC

20-2000 kb

P1-Phage BAC PAC

30-100 kb 100-300 kb 100-300 kb

Catatan

Sering ditemukan khimera


SELESAI


Kuliah III. Vektor kloning berkapasitas besar : Cosmid, BAC, YAC,



Sub Pokok Bahasan 1. Manfaat kloning berkapasistas besar. 2. Jenis-jenis vektor plasmid berkapasitas besar. 3. Pengertian dan karakteristik BAC, YAC dan Cosmid. 4. Kekurangan sistem BAC, YAC dan Cosmid

Manfaat kloning berkapasistas besar. Memperkecil jumlah klon pustaka DNA/genom yang harus dibuat. Memudahkan penanganan dan penyimpanannya. Memudahkan/mempercepat proses seleksi tranformant target.

Pustaka DNA Disebut juga bank klon (clone bank) atau gen bank, atau pustaka klon.

Sekumpulan klon (bakteri) transformant yang mengandung set potongan DNA (cDNA) dari sebagian atau keseluruhan set genom lengkap suatu organisme (bakteri, virus, tumbuhan, hewan, manusia).

Pustaka DNA

Library at Melk Abbey in Austria, Source: Wikipedia

Pustaka Klon/Pustaka DNA

PENYUSUNAN PUSTAKA DNA

1

Km®

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

A B C D E F G H Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Pustaka DNA

Simpan pada suhu -80oC atau -20oC

Memperkecil Jumlah Klon Pustaka

Ukuran Genom

125 Mb

125 Mb

Jumlah Klon Pustaka 125 Mb

EcoRI (6) = 46 = 4 kb = 125.000.000/4096 = 30.517 klon MSeI (4) = 44 = 4 kb = 125.000.000/256 = 488.281 klon

2. Jenis-jenis vektor plasmid berkapasitas besar. Vektor Plasmid Phagemid λ-Phage Cosmid

Kapasitas maks.(kb) 10-15 kb < 6 kb < 25 kb < 50 kb

YAC

20-2000 kb

P1-Phage BAC PAC

30-100 kb 100-300 kb 100-300 kb

Catatan

Sering ditemukan khimera

3. Pengertian dan Karakteristik Cosmid , BAC, dan YAC.

Cosmid • Kosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen Cos • Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa bereplikasi didalam E. coli. • Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan Hohn (1978).

Cosmid

Karakteristik • Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal. • Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri. • Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA dengan ukuran 37 sampai 57 kb, • Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb.

Transfeksi Cosmid sebagai Vektor Transformasi

YAC (Yeast Artificial Chromosome) • Butuh kloning dengan kapasitas besar: Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi (pembekuan) darah pada jenis hemopilia A, memiliki ukuran 190 kb sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb. • Dikembangkan oleh Burke et al (1987)

Karakteristik penting plasmid YAC • Dikembangkan dari plasmid pBR322 • Memiliki komponen gen yeast : SUP4, 7RP1, HIS3 dan URA3. • Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin) • Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast

Prinsip kloning dengan YAC

Kelemahan • Sering mengandung khimera. • Sebab: artefak ligasi atau disebut juga dengan kokloning, delesi serta bisa diakibatkan oleh adanya rekombinasi • Nagaraja et al (1994) 50% nya ;Olson et al (1987) =10%

BAC (Bacterial Artificial Chromosome) • Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F • Mengandung: oriS, repE – F: replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel inang. parA and parB: pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas insersi • Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb) • Dikembangkan oleh Kim, Shizuya, dll.

Beberapa Contoh Vektor BAC

BAC (Bacterial Artificial Chromosome) Spesies Sorghum BTX623 Kedelai (Forrest) Beet Gula Tomat (L. esculentum) Mogeor Gandum Chinese Spring Hewan Ayam White Leghorn (female) Kuda Tikus Serangga Anopeles gambiae PEST Semut api Nyamuk Ulat Sutera (Bombyx mori) P50 Mikroba Bakteri

insert (kb) 145 125 140

Jumlah Equivalensi klon genom 10,752 2.0X 35,328 4.8X 57,600 10.6X 4.8X

pBeloBAC11 pCLD04541 pCLD04541

Sisi kloning BamHI BamHI BamHI

BIBAC2

BamHI

pBeloBAC11

HindIII

Vektor

125

36,864

210

4,608

134 130 150

49,920 50,688 99,840

5.5X 2.2X 5.0X

pECBAC1 pECBAC1 pECBAC1

HindIII BamHI HindIII

133 140 180

30,720 23,040 50,688

14.0X 5.3X 8.2X

pECBAC1 pECBAC1 pECBAC1

HindIII HindIII EcoRI

165

21120

6.6X

pBeleoBAC11

Bam HI

65

3,840

pECBAC1

BamHI

4. Kekurangan sistem BAC, YAC dan Cosmid • • • •

Kelebihan Cosmid, YAC, BAC: kapasitas besar Kekurangan terutama YAC: Chimera Cosmid juga tidak stabil: 35% BAC lebih sedikit mengandung khimera dan efisiensi transformasi 100x dibanding YAC.

Kestabilan Pustaka Klon

Sumber: Ioannou, et al., (1994).

Selesai

Materi IVTRANSFORMASI GENETIK




TRANSFORMASI GENETIK

?


Beberapa Tanaman Budidaya Transgenik. Buah

Sayuran

Butiran

Tanaman lain

Bunga2an

Apel

Kol Bunga

Jagung

Kapas

Krisantemum

Pisang

Brokolli

Padi

Luzerne

Kalankoa

Peer

Chikori

Gandum

Raps

Pelargonia

Strawberry

Timun

Lada

Petunia

Kiwi

Kentang

Kol liar

Mawar

Melon

Wortel

Kedelai

Jeruk

Kol

Bg Matahari

Pepaya

Selada

Tembakau

Plum

Oliv

Tebu

Anggur

Asparagus

Beet gula

Ubi Jalar Tomat Zucchini Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI GENETIK METODE TRANSFORMASI 1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens 2. Transformasi dengan Biolistik 3. Transformasi dengan fusi protoplasma

4. Transformasi dengan mikroinjeksi 5. Transformasi dengan elektrophorasi (Electrophoration) 6. Transformasi dengan chemical (heat shock)



TRANSFORMASI GENETIK 1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens


adalah bakteri tanah penyebab tumor pada tanaman dikotiledon. Pertama ditemukan tahun 1907, dilanjutkan dengan penemuan plasmidnya yang berukuran 200-800 kb.



TRANSFORMASI GENETIK Plasmid mengandung gen penyebab tumor sehingga disebut dengan Tumour inducing-plasmid (Ti-Plasmid) tms

tmr nos

T-DNA = DNA transfer noc = katabolisme Nopalin

T-DNA

nos = sinthesis Nopalin

LB

tmr = sintesis Sitokinin

RB

tms = sintesis Auxin noc vir

Ti-Plasmid

vir = daerah virulen ori = asal replikasi LB = batas kiri

tra

RB = batas kanan

ori Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman Kromosom dalam inti sel tumbuhan Agrobacterium

Pelukaan Sel tumbuhan



Agrobacterium di dalam tumor



Agrobacterium di dalam tumor Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman LB

RB

1 T-DNA LB

RB

2 T-DNA

virD2 LB

RB

3 virD2

virE2

virD2 LB

RB

4

Komplek T-DNA-Protein Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI GENETIK LB

T2 Gen P2

T1 SMG P1 RB

T-DNA dimodifikasi

LB

vir

Ti-Plasmid tanpa T-DNA

A.t. ori

RB

E. coli - plasmid dengan T-DNA

E.c. ori

Kan®

SKEMA SISTEM VEKTOR BINER Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI GENETIK TRANSFORMASI BIOLISTIK = PARTIKEL BOMBARDEMEN = MIKROPROJEKTIL

KELEBIHAN: 1. TIDAK MEMERLUKAN PENGHILANGAN DINDING SEL 2. TEORITIS SETIAP SEL ATAU JARINGAN BISA DITRANSFORMASI 3. CARA TRANSFORMASI TIDAK SEKOMPLEKS A. TUMIFACIENS 4. VEKTOR YANG DIPERLUKAN UNTUK TRANSFORMASI SEDERHANA 5. DAPAT MENGAKOMODASI LEBIH DARI 10 GEN SEKALIGUS PADA PLASMID YANG BERBEDA 6. METODENYA DAPAT DITERAPKAN PADA SETIAP ORGANISME DAN GENOTIP Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


TRANSFORMASI BIOLISTIK Hind III Eco RI

Sma I

T

Plasmid untuk transformasi biolistik

P

Amp® = gen resistensi ampicilin Amp®

SMG

= Gen penanda untuk tumbuhan

P

= promotor

T

= terminator

SMG

E.c. ori



TRANSFORMASI BIOLISTIK

KAMAR TEKANAN

PEMEGANG MAKRO

DNA BERLAPIS PARTIKEL EMAS

CAWAN PETRI DGN JARINGAN TANAMAN

BIORAD

PRINSIP ALAT TRANSFORMASI BIOLISTIK Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Particle Bombardment


TRANSFORMASI BIOLISTIK

KELEMAHAN: 1. EFISIENSI RENDAH (0,05%) 2. TIDAK SETIAP DNA YG DITRANSF. STABIL TERINTEGRASI DIDALAM INTISEL 3. KEBANYAKAN HARUS MENGGUNAKAN JARINGAN MERISTEM



Transf. potongan daun dgn A. tumifaciens Potongan daun dengan A. tumifaciens dikokultivasi 1-2 hari Potongan daun dicuci Perlakuan antibiotik untuk mematikan Bakteri dan menseleksi sel-sel transformant 2-4 minggu Transfer potongan daun ke medium regenerasi dan seleksi (pembentukan kalus dan tunas) 6-10 minggu Potongan daun diletakkan pada medium tanpa phytohormon untuk pembentukan akar 4-6 minggu Regenerasi tanaman transgenik

Transformasi kalus dengan biolistik

Embrio/Kallus diinisiasi dan dikultivasi

8-12 minggu Transformasi biolistik

Pertumbuhan kallus tanpa seleksi 4 hari

Pertumbuhan kallus dengan media seleksi 8-12 minggu Regenerasi dan seleksi lanjutan 8-12 minggu Regenerasi tanaman transgenik


DNA MICROINJECTION • direct microinjection of a chosen gene construct • (a single gene or a combination of genes) from another member of the same species or from a different species • into the pronucleus of a fertilized ovum • one of the first methods that proved to be effective in mammals (Gordon and Ruddle, 1981) • the introduced DNA may lead to the over- or under-expression of certain genes

• The insertion of DNA is random process • high probability that the introduced gene will not insert itself into a site on the host DNA • manipulated fertilized ovum is transferred into the oviduct of a recipient female or foster mother • induced to act as a recipient by mating with a vasectomized male • Applicable to a wide variety of species.

Procedure for DNA microinjection • fertilized eggs to be inoculated by microinjection is increased by superovulation • female mice are given an initial injection of pregnant mare’s serum and another injection, about 48 hours later, of human chorionic gonadotropin. • the super- ovulated females are mated and killed • the fertilized eggs are flushed from their oviducts • microinjection of the fertilized eggs • the microinjected transgene construct is often in a linear form and free of prokaryotic vector DNA sequences

Peralatan Mikroinjeksi

Transgenic mice by DNA microinjection


3. Transformasi Dengan Fusi Protoplasma LANGKAH PERTAMA: MEMBEBASKAN PROTOPLASMA DARI DINDING SEL (ENZIMATIS) :

UTAMA PEKTINASE DAN CELLULASE PROTOPLASMA DIPELIHARA DALAM MEDIUM: ISO-OSMOSIS VEKTOR TRANSFORMASI = BIOLISTIK METODE : PEG (POLYETHYLENGLYKOL) ELECTROPHORATION

PROBLEM: REGENERASI TRANSFORMANT Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Fusi Protoplasma

Inter-specific and inter-generic fusion achievements Cross Oat Brassica sinensis Torrentia fourneri Brassica oleracea Datura innoxia Nicotiana tabacum Datura innoxia Arabidopsis thaliana Petunia hybrida

Crossed with Maize B. oleracea T. bailloni B. campestris Atropa belladonna N. glutinosa D. candida Brassica campestris Vicia faba

Electrophorasi

Electrophorasi


SISTEM SELEKSI DAN REPORTER NH2

1. SELEKSI DOMINAN:

CH2

ANTIBIOTIK KELAS AMINOGLYCOSID:

O

OH

Kanamycin dari Streptomyces kanamyceticus HO

HO

Gentamycin dari Micromonospora purpurea Neomycin dari Streptomyces fradiae

HO

O NH2

Streptomycin dari Streptomyces griseus CH2O O O

NH2

HO NH2 OH STRUKTUR FORMULA KANAMYCIN Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA


SELESAI


Materi VI. Isolasi gen Target I: Berbasis Fungsi dan Peta



Sub Pokok Bahasan 1. Prinsip dan tujuan isolasi gen target. 2. Pengertian isolasi gen target berbasis fungsi. 3. Pengertian isolasi gen target berbasis posisi/peta. 4. Pengertian dan prinsip penyusunan peta genetik.

1. Prinsip dan Tujuan Isolasi Gen Target.

Isolasi Gen TargeT

Isolasi gen target

PS

T Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA

Mengisolasi gen ≠ mengisolasi DNA genom

G

Gn

Gn = DNA genom

G = gen

Hubungan Gen-DNA/Protein ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC..........GCAGGGAGGCAAACAATGA Gen/DNA Reverse transkripsi

Transkripsi

AUGUUACGUCCUGUAGAAACCCC..........GCAGGGAGGCAAACAAUGA mRNA Sekuensing Asam amino

Translasi

MLRPVEUP..........QQGGKQ.

Asam amino/polipept ida/protein

Sekuens nukleotida gen GUS ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCG AAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGT TTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCG AAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATC AGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAG TGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAA AACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACC ACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACT GGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAG GCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGT CACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGA ACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAG GATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCAT TACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCG GCTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCA ACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTG GTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAA GCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCAT CAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAG AGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCG TGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATAT GTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGC AAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTC TGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGA

Sekuens Asama amino gen GUS MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAI AVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFD AVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVC VNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYT TPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDAD QQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIY PLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLM VHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAV GFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNH PSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVM FCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQ EKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVF DRVSAVVGEQVWNFADFATSQGILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAF LLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ.

2. Pengertian isolasi gen target berbasis fungsi dan Peta

ISOLASI GEN FuncTional cloning

Isolasi Gen TargeT

DikeTahui

PosiTional cloning

Produk

Tidak dikeTahui

biokimia

Analisis ProTein

Posisi (geneTis/fisik)

Analisis AA

Kloning/Isolasi

?

Sekuensing

DNA

PE

DNA

T Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA

Isolasi gen target berbasis fungsi

1. Kloning Berbasis Fungsi

Isolasi gen yang didasarkan atas informasi produk biokimia dari gen Target

PRASYARAT: ADA PRODUK BIOKIMIA DARI GEN TARGET DIUJI DENGAN METODE MUTANT KOMPLEMENTER DITRACE/TELUSURI DARI PROTEIN; ASAM AMINO; DAN LEVEL ASAM NUKLEOTID (DNA)

Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA


Seleksi karakTer

IdenTifikasi biokimiawi

Purifikasi proTein TargeT IdenTifikasi proTein TargeT Sekuensing proTein/DNA

ACGTCTTGAACCT

ACGTCTTGAACCT


Problem FuncTional Cloning Kebanyakan Produk Gen Tidak DikeTahui PhenoTyp Yang Bisa DiamaTi TnTukmengukur Produk Biokimia Gen TerbaTas Penggunaannya TerbaTas Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA

2D-elekTrophoresis

Sumber: ProTeomic of M. TrauncaTula, Nagaraj, eT al., (2007)

Maldi Toff

A

B

Profil respon Arabidopsis Thaliana Terhadap kondisi dingin menggunakan Gas chromaTography-mass specTromeTry (GC-MS)

3. Isolasi Gen Berbasis Peta

2. Kloning Berbasis Posisi

PERSYARATAN: 1.TERSEDIA PETA GENETIK YANG AKURAT MATERIAL DASAR UNTUK MELOKALISASI POSISI GEN TARGET SECARA GENETIS. 2.TERSEDIANYA PETA FISIK DISEKITAR GEN TARGET MATERIAL FISIK POSISI GEN TARGET SECARA AKTUAL




Prinsip Penyusunan Peta Genetik dan Fisik


PETA GENETIK:

POSISI TARGET GEN SECARA TEORITIS YANG DITENTTKAN BERDASARKAN HASIL ANALISIS GENETIS SEGREGASI ALELALEL TETUA DAN KETURUNANNYA.

LANGKAH PENYUSUNAN PETA GENETIK:

1. MENEMUKAN PENANDA ANTARA ALLEL DOMINANRESESIF 2. MELAKTKAN PERSILANGAN INDIVIDU YANG MENGANDUNG ALEL DOMINAN DAN RESESIF 3. MELAKUKAN ANALISIS PEDIGREE POLA PEWARISAN ALELALEL Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA


Langkah Penyusunan PeTa GeneTik: Menemukan Penanda AnTara Allel Dominan-resesif • Melakukan Skrining Marker (Bsa=bulked SegreganT Analysis) (SisTem Penanda: RFLP, AFLP, SSR, STS, SNP, Dll) UNTUK MEMPEROLEH MARKER POLYMORPHISME PADA ALEL TARGET • Menggunakan Marker Polymorphismus untuk Melakukan Analisis Pedigree Alel-alel Dari TeTua Kepada KeTurunannya • Analisis TauTan (Linkage Analysis) Marker Masing-masing Alel • MenenTukan Jarak GeneTis



Genotiping Karakter Penotif ♂

♀


Genotiping Karakter Penotif


BSA=Bulked SegreganT Analysis 48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

Bulked segreganT analysis



Single planT analysis F M M M M F F F F F M F F F M F F M F M F M M M M M F M M M M MM M M M M M M M M M M M



L5

Peta Genetik kromosm L5 terdiri dari 19 marker AFLP dan 5 marker STS, serta lokus sex (M)



Hibridisasi fragmen lokus marker AFLP secara In Situ

Hibridisasi Southern bloT

Fluorescence in situ hybridization (FISH)



2. PENYTSTNAN PETA FISIK PeTa fisik : peTa posisi suaTu lokus (gen) TerTenTu yang besarannya dinyaTakan dengan saTuan pasangan basa (pb) aTau basepair (bp) PeTa fisik disusun dari: 1. Hibridisasi in-siTu dengan menggunakan probe-probe spesifik yang posisinya secara geneTik sudah dikeTahui 2. Menggunakan sekuens DNA berukuran besar (HMW) yang dicerna dengan rarecuTTer dan dirunning dengan PFGE, dihibridisasi dengan probe yang posisi geneTiknya sudah dikeTahui

3. Penyusunan conTig dari klon-klon yang mengandung insersi dengan ukuran besar (PAC, Kosmid, BAC, YAC, dll.).



cM

PENYTSTNAN PETA FISIK

0.0

PM3159

7.8 15.4 18.2 24.7 25.6

PM3449 PM4461 PM4151 STS3660 EM3660

25.6 27.9 28.0 29.5

EM4447.2 EM4447.1 EM3950

30.0 30.0 33.8

EM3156 STS3156 SEX (M) STS4150.3 STS4150.2 STS4150.1 EM4150 EM3353 PM3551 EM3251

33.8

EM4654

36.8 36.8 40.1 42.1

PM4455 PM3648 PM3262 PM4050

55.3

PM 3148

29.6 29.7 29.8 29.8 29.9 30.0



Sumber: SMR-BüTTner



BioTeknologi TnTuk PerlinTan

2. PENYTSTNAN PETA FISIK 

Hibridisasi in-siTu :

Sumber: SMR-BüTTner Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA

HMW-DNA

HMW-DNA di resTriksi dengan enzim „RarecuTTer“

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 750 kb

SouThern

500 kb

Transfer; Hibridisasi dengan

350 kb

150 kb

spesific probe

50 kb

20 kb

5 kb

Sumber: SMR-BüTTner


PENYTSTNAN PETA FISIK DGN. KLON BERINSERSI BESAR . planT maTerial : YY male planTs • vecTor: pBeloBAC-kan, pBeloBAC11 • hosT: DH10B (E. coli)

• resTricTion cloning siTes : HindIII, BamHI BAC inserT size

kb

50

194.0

40

145.5

30

97.0 Frequency

20

48.5 23.1

10 200

175

150

125

75

50

100

9.4

0 25

no. of clones in a size class

BAC inserT size disTribuTion

VecTor

size (kb)


2. PENYUSUNAN PETA FISIK

M 1 2 3 E V P11

-

P19 RA

-

RH C1

-

C12 MT73-MT76 3 2 1 M

300 bp

PTSTAKA BAC * 200 bp

*

AFLP-BASED SCREENING 100 bp

* * M 1

2

3

E V

W

P91

A

B C

5

6

7

MT361-MT364

M

COLONY HYBRIDIZATION

434 bp

184 bp

165F12 124 bp

PCR-BASED SCREENING Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA


Kombinasi Primer untuk Skrining Klon-klon BAC



Assembling Contig A

1 2 3 4 5 6 7 8 A

12 kb 6 kb

77E 7

73F6

4 kb B

2 kb

54G 8

1 kb 364C 6

0.5 kb 55B 1

347D 2

C

B

1 2 3 4 5 6 7 8

C

1 2 3 4 5 6 7 8 45B 2

12 kb 6 kb

3E 11

D

4 kb

407A 8 10C 2

2 kb 1 kb

E

373B 5 = SP6-end = T7-end

0.5 kb 115G 11

100 k b

C


Perbandingan Peta Genetik dan Fisik ~ 106 kb/cM

~ 880 kb/cM 383B 6

385C3

77E7

364C6 381C5

407A8

73F6

4.34

0.47

0.44

0.86

46C7

0.20

0.07

115G11

10C2

EM3353

EM3156 STS3156 STS4150.1 EM4150 PM3551

M

EM4447.1

PM3159

EM3950

EM4447.2

55B1

373B 5

3E11

0.33

EM4654

151F5

347D2 45B2

54G8

3.27

cM

9.94 cM

555 kb (3-4 CW???)

EM4150

EM4447.1

M

1.06 cM = 932 kb

Prediksi Gap



Chromosome Walking !!! 1. Jika berTemu dengan daerah sekuens repeTiTive, maka proses walking Tidak bisa dilanjuTkan 2. MendapaTkan ujung klon yang bersifaT „single copy“ cukup suliT

3. Jika daerah TargeT merupakan daerah „cold spoT region“ maka korelasi jarak fisik dengan jarak geneTik bisa sangaT Tinggi, sehingga beberapa kali “walking” harus dilakukan


?

555 kb (3-4 CW???)

EM4150

M

1.06 cM = 932 kb EM4447.1


Chromosome Walking


Sekuens nukleotida gen GUS ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCG AAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGT TTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCG AAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATC AGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAG TGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAA AACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACC ACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACT GGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAG GCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGT CACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGA ACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAG GATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCAT TACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCG GCTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCA ACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTG GTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAA GCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCAT CAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAG AGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCG TGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATAT GTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGC AAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTC TGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGA

SELESAI


Kuliah I: Pendahuluan

Recommend Documents