Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc.
Kryokonzervace bramboru (Solanum tuberosum, L.) METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2008
Metodika je výstupem řešení výzkumného záměru MZE0002700602 „Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agrobiodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství“. Metodika proběhla oponentním řízením. O uplatnění metodiky byla dne 16.12. 2008 uzavřena smlouva podle ustanovení §269 zákon č. 513/1991 Sb., obchodního zákoníku.
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2008 ISBN 978-80-87011-95-9
2
Autoři:
Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc.
Název:
Kryokonzervace bramboru (Solanum tuberosum, L.)
Vydal:
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 – Ruzyně
Redakce:
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 – Ruzyně
Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad:
40 výtisků
Vyšlo v roce 2008, první vydání Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory:
[email protected] [email protected]
Autor fotografií:
Miloš Faltus
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2008 ISBN 978-80-87011-95-9
3
KRYOKONZERVACE BRAMBORU (Solanum tuberosum, L.)
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008
4
Miloš Faltus, Jiří Zámečník
Kryokonzervace bramboru (Solanum tuberosum, L.) METODIKA PRO PRAXI
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008
5
Kryokonzervace bramboru (Solanum tuberosum, L.) Brambor patří mezi naše významné plodiny. Uchování genetických zdrojů bramboru je možné pouze ve vegetativním stavu, což zvyšuje riziko náhodné ztráty genotypu. Riziko ztráty genotypu lze omezit využitím metody kryokonzervace, při níž jsou rostlinné vzorky uloženy při ultranízké teplotě, která zastavuje všechny biochemické procesy. Kryokonzervované vzorky tak lze uchovávat bez změny po mnoho let. Tato metodika popisuje postup přípravy materiálu, postup předkultivace rostlin, jejich dehydrataci, kryokonzervaci a regeneraci. Jsou definovány zásady bezpečného uložení genotypů, které umožňují jejich úspěšnou regeneraci. Uživatelem metodiky je MZe, která ji uplatní v rámci „Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství“.
Potato cryoconservation (Solanum tuberosum, L.) Potato is important crop in the Czech Republic. Potato germplasm collection is maintained by vegetative plant parts and this fact increases risk of accidental lost of genotype. Cryoconservation decreases risks of genotype lost. Plant samples are stored at ultralow temperature that stopped all biochemical processes. The samples can be stored without any changes for many years. This methodology describes procedure of material preparation, explant preculture and dehydration, shoot tip cryopreservation and recovery. Principles of safe genotype storage and recovery are defined. The Ministry of Agriculture of the Czech Republic is the user of this methodology and it will utilize the potato cryoconservation method in the frame of “National Programme on Conservation and Utilization of Plant, Animal and Microbial Genetic Resources for Food and Agriculture”.
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008
6
Obsah: I. II.
Cíl metodiky................................................................................................................... 8 Vlastní popis metodiky................................................................................................... 8 a) Princip metody ........................................................................................................... 8 b) Materiál a metody....................................................................................................... 8 c) Postup kryokonzervace bramboru ............................................................................ 10 d) Evidence a uložení vzorků při kryokonzervaci ........................................................ 13 e) Kryoprotokol ............................................................................................................ 13 f) Stanovení minimálního rozsahu uložených vzorků.................................................. 13 III. Srovnání novosti postupů ......................................................................................... 15 IV. Popis uplatnění metodiky ......................................................................................... 15 V. Seznam použité literatury............................................................................................. 16 VI. Seznam publikací ..................................................................................................... 16 VII. Dedikace................................................................................................................... 17 VIII. Jména oponentů:....................................................................................................... 17
7
I. Cíl metodiky Cílem metodiky je stanovit postup pro dlouhodobé uchování vzrostných vrcholů bramboru v podmínkách teploty tekutého dusíku. II. Vlastní popis metodiky
a) Princip metody Podstatou metody kryokonzervace je uchování materiálu ve skelném stavu při ultranízké teplotě (bod varu tekutého dusíku, cca -196 °C). Skelný stav je amorfní pevné skupenství hmoty. Výhodou je, že látka při přechodu z kapalného do skelného stavu nemění uspořádání částic. Naproti tomu v procesu krystalizace dochází k vytvoření pravidelné struktury a tím k destrukci původního uspořádání hmoty. Zachování struktury rostlinného materiálu a jeho funkcí při přechodu do skelného stavu jsou podstatou jeho stabilního uchování při ultranízké teplotě. Problém, který řeší tato metodika je skutečnost, že rostliny druhu brambor obecný (Solanum tuberosum, L.) patří mezi plodiny, které netolerují zmrznutí. Zatímco samotné uchování rostlinného materiálu ve skelném stavu je velmi bezpečné a stabilní, problémem je způsob, jak do skelného stavu rostliny bezpečně převést a poté navrátit zpět do kultivačních podmínek při zachování životnosti rostlin. Tato metodika popisuje postup přípravy rostlinného materiálu a jeho zamrazení a odmrazení takovým způsobem, který umožňuje rostlinnému materiálu překonat působení nízké teploty.
b) Materiál a metody 1. Přístrojové vybavení Pro provedení metody kryokonzervace je třeba disponovat následujícím přístrojovým vybavením: Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační box, laminární box Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních medií: autokláv, horkovzdušný sterilizátor Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních medií: analytické váhy, přesné váhy, pH-metr, laboratorní míchačka, chladnička Vybavení pro stanovení sušiny vzorků: analytické váhy, laboratorní sušárna Uchování tekutého dusíku a kryokonzervovaných vzorků: Dewarova nádoba na tekutý dusík, Dewarova nádoba pro uložení vzorků v tekutém dusíku Záznamy, výpočty a tisk čárového kódu: PC, tiskárna čárového kódu, tiskárna
8
2. Chemikálie V následujícím seznamu jsou všechny chemikálie potřebné pro metodu kryokonzervace: Kultivační media: destilovaná voda soli – dusičnan amonný, dusičnan draselný, kyselina dihydrogen fosforečná, chlorid vápenatý, síran hořenatý, síran manganatý, síran zinečnatý, síran železnatý, jodid draselný, kyselina boritá, molybdenan disodný, chlorid kobaltnatý, síran měďnatý vitamíny – thiamin, pyridoxin, kyselina nikotinová, glycin fytohormony – kyselina indolyl octová, kinetin, kyselina giberelová sacharosa (P.A.) agar (Sigma Aldrich) Kryoprezervační roztok: sacharosa (P.A.), destilovaná voda Desikant: silikagel Chladící a skladovací medium: tekutý dusík 3. Drobné pomůcky Následující pomůcky jsou potřebné pro realizaci metody kryokonzervace bramboru: Příprava roztoků a medií: Erlenmeyerova baňka 500 ml odměrný válec 1000 ml Pasteurova pipeta 3 ml střička váženky Kultivace rostlin: kultivační zkumavky s hliníkovým uzávěrem 12 x 1,7 cm stojánek na zkumavky plastové kultivační nádoby 10 x 10 x 9 cm (Duchefa) plastové Petriho misky 6 cm skleněné Petriho misky 15 cm Předkultivace rostlin: Erlenmeyerova baňka 25 ml Izolace a dehydratace vzrostných vrcholů: injekční jehly 0,7 x 40 mm stříkačky 10 ml filtrační papír 11 cm skleněné Petriho misky 4, 12, 15 a 20 cm hliníkové plíšky 20 x 6 x 0,05 mm nádobky na silikagel 200 ml Kryokonzervace: stojánek na kryozkumavky kryozkumavky 1,8 ml (NUNC) polystyrénový džbán 1L Odtání vzorků: Erlenmeyerova baňka 100 ml nerezová miska parafilm
9
4. Rostlinný materiál a kultivační podmínky Výchozím materiálem pro kryokonzervaci bramboru jsou rostliny převedené do explantátových kultur v podmínkách in vitro. Rostliny in vitro bramboru se uchovávají obvykle ve zkumavkách (12x1,7 cm) s hliníkovým víčkem. Pro lepší ventilaci kultivačních zkumavek je vhodné víčko provrtat a do otvoru umístit molitanový hranolek o velikosti (1x1x2cm). Explantáty jsou pěstovány v kultivačním boxu při teplotě 22 ± 1 °C, hustotě světelného toku 80 µmol m-2 s-1 a fotoperiodě 16/8 h. Plastové krabičky o velikosti 10 x 10 x 9 cm urychlují postup multiplikace explantátů. 5. Kultivační media Pro kultivaci rostlin se používají dva typy agarových kultivačních medií. Jedno je tzv. multiplikační, které se používá pro namnožení explantátů bramboru do potřebného počtu a druhé medium je tzv. regenerační, které stimuluje regeneraci explantátů bramboru po jejich kryoprezervaci. Multiplikace in vitro rostlin probíhá na modifikovaném kultivačním mediu podle Grospietsche et al. (1999) bez kaseinu a myoinositolu a se sníženým obsahem dusíku (25 % původního obsahu NH4NO3 a 50 % původního obsahu KNO3 ve srovnání s mediem podle Murashige a Skooga, 1964), 30 g l-1 sacharosy a 7 g l-1 agaru. Regenerační medium má shodné složení jako množící medium, ale pro podporu regenerace rostlin navíc obsahuje směs fytohormonů (0,5 mg l-1 kyseliny indolyl octové, 0,5 mg l-1 kinetinu, 0,2 mg l-1 kyseliny giberelové). 6. Příprava sterilního silikagelu pro dehydrataci vzorků Dehydratace explantátů bramboru probíhá v suchém vzduchu nad sterilním silikagelem. Silikagel o hmotnosti 50 g se umístí do skleněné nádobky o objemu 200 ml se závitem a kovovým víčkem pro možnost sterilace horkým vzduchem. Vysoušení probíhá v horkovzdušném sterilizátoru s nucenou ventilací při teplotě 170 °C po dobu 2 dnů. Pak se nádoby se silikagelem uzavřou víčkem a ponechají ve sterilizátoru po dobu 10 hodin, tak aby po automatickém vypnutí přístroje došlo k ochlazení silikagelu na laboratorní teplotu do doby před započetím dehydratace.
c) Postup kryokonzervace bramboru Postup kryokonzervace explantátů bramboru lze rozdělit do pěti postupných kroků: • Namnožení explantátů • Předkultivace explantátů • Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou • Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem • Zamrazení a uložení v Dewarově nádobě • Hodnocení životnosti a regenerace Postup kryokonzervace bramboru je schématicky znázorněn na obr.1. 1) Namnožení explantátů Explantáty bramboru se uchovávají v kutivačních zkumavkách s 5 ml multiplikačního media. Pro namnožení explantátů do potřebného počtu 100 rostlin se provedou dvě multiplikace při subkultivačním intervalu 3-4 týdny. Matečné rostliny se nařežou na nodální segmenty a kultivují v krabičkách se 100 ml multiplikačního media. Při první multiplikaci se vysadí jedna krabička s třiceti nodálními segmenty a dalších dvacet explantátů se vysadí do deseti zkumavek pro uchování genotypu v in vitro podmínkách. Při druhé multiplikaci se z třiceti rostlin odvodí sto nodálních segmentů a vysadí se do třech krabiček. 10
1. multiplikace
2. multiplikace Odvození nodálních segmentů
Aplikace 2 M sacharosy
Umístění vrcholů na plíšky Sycení vrcholů 0,7 M sacharosou
Izolace vzrostných vrcholů
Dehydratace vrcholů nad silikagelem
Ponoření vrcholů do tekutého dusíku Odtátí vzorků ve vodní lázni
Vysázení na regenerační medium
Uložení vzorků do dewarovy nádoby
Hodnocení životnosti a regenerace
Obr. 1. Postup kryokonzervace explantátových kultur bramboru.
11
2) Předkultivace explantátů Po třech až čtyřech týdnech kultivace in vitro rostlin bramboru se z nich odvodí nodální segmenty. Ze sta explantátů se připraví tři sta nodálních segmentů a ty se vysadí po 100 kusech do třech krabiček s 50 ml multiplikačního media. Po čtyřech dnech kultivace se do každé krabičky s nodálními segmenty aplikuje 25 ml 2 M roztoku sacharosy. 3) Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou Po 5 až 6 dnech kultivace nodálních segmentů zalitých roztokem 2 M sacharosy se vyizolují vzrostné vrcholy vyrostlé z nodálních pupenů. Vrcholy se vyřežou z nodálních segmentů pomocí injekční jehly, která se použije jako mikroskalpel. Vrcholy se umístí do Petriho misky (12 cm) na sterilní filtrační papír nasycený 0,7 M roztokem sacharosy (14 ml) s fytohormony shodného složení jako v regeneračním mediu (0,5 mg l-1 kyseliny indolyl octové, 0,5 mg l-1 kinetinu, 0,2 mg l-1 kyseliny giberelové). Apikální vrcholy se sytí v roztoku sacharosy po dobu 20 hodin při 22 °C. 4) Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Po nasycení vzrostných vrcholů bramboru sacharosou se explantáty umístí na hliníkové plíšky po deseti kusech, vždy dva plíšky se umístí do jedné Petriho misky (4 cm). Plíšky a malé Petriho misky usnadňují manipulaci s explantáty. Spodní část petriho misky se spolu s plíšky a explantáty vloží pomocí sterilní pinzety do nádoby se silikagelem. Dehydratace vrcholů nad silikagelem probíhá ve sterilní místnosti v laminárním boxu, při teplotě 22-23 °C. Doba dehydratace explantátů je přibližně 1,5 – 2 hodiny v závislosti na velikosti explantátů a je ukončena při dosažení vlhkosti materiálu 0,4 g vody na 1 g sušiny. V případě použití jiných nádob či jiného množství silikagelu je nezbytné odzkoušet postup dehydratace explantátů a stanovit optimální dobu dehydratace. Kontrola míry dehydratace se provádí vážením na analytických vahách s přesností 0,01 mg. Nejprve se zváží Petriho misky (4 cm) s hliníkovými plíšky bez explantátů, pak s explantáty před dehydratací a po dehydrataci. Nakonec se kontrolní vzorky dosouší 72 hodin v sušárně při 105 °C pro získání hmotnosti sušiny. 5) Zamrazení a uložení v Dewarově nádobě Po vysušení jsou explantáty přilepeny k plíškům zaschlým přebytkem roztoku sacharosy. Díky tomu lze s plíšky manipulovat, aniž by došlo k náhodnému odpadnutí explantátu. Nejprve se připraví polystyrenová nádoba, která slouží jako stojánek pro kryozkumavky a zároveň jako nádoba na tekutý dusík. Tato nádoba se naplní tekutým dusíkem a pak se do ní umístí kryozkumavky a i ty se naplní tekutým dusíkem. Plíšky s explantáty se pomocí pinzety přenesou a co nejrychleji ponoří do tekutého dusíku v polystyrenové nádobě. Po ochlazení explantátů se plíšky umístí do kryozkumavky a uzavřou víčkem. Víčko kryozkumavky se nedotahuje, ale mohl tekutý dusík pronikat přes závit do kryozkumavky; čímž je zaručena stálá přítomnost tekutého dusíku v kryozkumavce při jejím umístění do Dewarovy nádoby. 6) Hodnocení životnosti a regenerace rostlin Vzorky pro kontrolu životnosti a regenerace rostlin bramboru po kryokonzervaci se připravují spolu se vzorky pro uložení do Dewarovy nádoby. Minimální doba pobytu vzorků v tekutém dusíku je 1 hodina. Samotné hodnocení se provádí po ohřevu kryoprezervovaných vzorků a po jejich vysazení na regenerační medium. Kryozkumavky se vzorky se umístí do stojánku s tekutým dusíkem. Po otevření víčka musí být kryozkumavky stále ponořeny v tekutém dusíku. Pinzetou se hliníkové plíšky rychle vytáhnou z kryozkumavek a i s vrcholy se ponoří do vodní lázně o laboratorní teplotě. Explantáty se po jejich odlepení od plíšků vyjmou
12
z vody a přenesou na regenerační medium s fytohormony (0,5 mg l-1 kyseliny indolyl octové, 0,5 mg l-1 kinetinu, 0,2 mg l-1 kyseliny giberelové). Hodnocení životnosti rostlin se provede po dvou týdnech a hodnocení regenerace po osmi týdnech od vysazení. Za živé se považují explantáty, u nichž je patrný růst a nedochází u nich ke ztrátě chlorofylu. Apikální růst spojený s tvorbou stonku je známkou regenerace rostliny.
d) Evidence a uložení vzorků při kryokonzervaci Každá kryozkumavka se označí specifickým čárovým kódem. Tento kód obsahuje pořadové číslo kryoprezervované položky, přesnou lokalizaci položky ve skladovacím systému a datum zamrazení položky. Označení každé zkumavky se spolu s informací o vzorku uloží do databáze zamrazených položek. Vzorky se umístí do Dewarových nádob naplněných tekutým dusíkem. Je nutné zabezpečit pravidelné doplňování těchto nádob z důvodu odparu tekutého dusíku.
e) Kryoprotokol Celý postup kryokonzervace se zaznamená v kryoprotokolu, který obsahuje základní identifikační údaje o kryokonzervovaných vzorcích a o metodě kryokonzervace a jejím výsledku. Tyto informace lze v případě potřeby doplnit dalšími údaji, které přesněji definují podmínky kryokonzervace a vlastnosti kryokonzervovaných vzorků. Základní údaje: Materiál: Množství: Označení: Kryo: Výsledek:
plodina, genotyp, identifikátor EVIGEZ, interní identifikátor počet kryoprezervovaných vzrostných vrcholů, počet kontrolních rostlin číslo kryoprezervované položky, pozice v kryoskladu, datum kryoprezervace metoda kryokonzervace životnost, regenerace
Doplňující údaje: Dehydratace: čerstvá hmotnost vzrostných vrcholů, počáteční obsah vody, konečný obsah vody, doba dehydratace, podíl krystalické fáze, přítomnost a charakteristika skelných přechodů (teplota skelného přechodu, změna tepelné kapacity) Poznámky: odchylky od standardního postupu
f) Stanovení minimálního rozsahu uložených vzorků Z hlediska konzervace genetických zdrojů rostlin, je velmi důležitá informace, zda počet vzorků uložených v tekutém dusíku umožňuje úspěšnou regeneraci daného genotypu. Pravděpodobnost regenerace rostlin je závislá na úspěšnosti regenerace a reprezentativnosti (počtu jedinců) kontrolního vzorku a na počtu vzorků uložených v tekutém dusíku. Na základě regenerace rostlin kontrolního vzorku lze stanovit minimální počet rostlin, které lze zregenerovat z rostlin uložených v tekutém dusíku (Dussert et al., 2003). V Tabulce 1 je uvedeno minimální procento regenerace kontrolních rostlin v závislosti na velikosti kontrolního souboru a na počtu uložených vzorků v Dewarově nádobě pro 95%-ní pravděpodobnost regenerace alespoň jedné rostliny. Doporučený počet vzrostných vrcholů uložených v tekutém dusíku od jednoho genotypu je 120 jedinců a velikost kontrolního vzorku je 40 jedinců. Pro 95 % pravděpodobnost, že z uložených vzorků zregeneruje alespoň jedna rostlina, je nutná desetiprocentní regenerace kontrolních rostlin, tedy čtyři rostliny ze čtyřiceti. V Tabulce 1 je uvedena minimální 13
regenerace kontrolního vzorku pro 95 % pravděpodobnost regenerace alespoň jedné rostliny při různém počtu uložených vzorků v kryobance a různé velikosti kontrolního vzorku. Tab. 1: Minimální procento regenerace kontrolního vzorku, která umožňuje regeneraci alespoň jedné rostliny s pravděpodobností 95 %, v závislosti na počtu kontrolních jedinců a počtu jedinců uložených v kryobance. Velikost uložené kolekce (počet uložených jedinců)
Velikost kontrolního vzorku (počet jedinců) 20
40
60
80
100
100
15
10
8,3
7,5
7
120
15
10
8,3
7,5
6
140
15
10
6,7
6,3
6
160
15
7,5
6,7
6,3
5
180
10
7,5
6,7
6,3
5
200
10
7,5
6,7
5
5
Pro dosažení jistoty uchování genotypu je nezbytná regenerace minimálně tří explantátů (obdobně v in vitro bance bramboru jsou použity tři zkumavky od genotypu) v kontrolním vzorku z celkového počtu uložených vzorků daného genotypu. Při 120-ti explantátech bramboru uložených v tekutém dusíku a 40-ti explantátech v kontrolním vzorku musí regenerace kontroly dosáhnout minimálně 15 %, aby s pravděpodobností minimálně 95 % došlo k regeneraci minimálně tří rostlin bramboru daného genotypu uloženého v kryobance (Tab. 2). Tab. 2: Minimální počet regenerujících rostlin z celkového počtu uložených explantátů (120 ks) v tekutém dusíku při 95 %-ní pravděpodobnosti v závislosti na procentu regenerace rostlin bramboru po kryokonzervaci v kontrolním vzorku o rozsahu 40 explantátů. Regenerace v kontrolním vzorku (%)
Minimální regenerace rostlin v kryobance (počet jedinců)
10
1
12,5
2
15
3
17,5
5
20
7
25
10
30
14
Doporučený počet 120 explantátů je uložen v 6-ti kryozkumavkách po 20-ti kusech. Při třech životaschopných explantátech v kryobance pak teoreticky po odtání dvou kryozkumavek 14
dojde k regeneraci jedné rostliny (obnova genotypu) a ve zbývajících čtyřech kryozkumavkách budou uloženy minimálně dva explantáty schopné regenerace do in vitro podmínek. V případě, že regenerace kontrolního vzorku je nízká, lze zvýšením rozsahu uložených vzorků (opakováním postupu kryokonzervace) docílit vyhovující pravděpodobnosti obnovení uloženého genotypu. Naopak v případě stabilně vysoké regenerace kontrolního vzorku lze omezit počet uložených vzorků, čímž lze snížit náklady na uložení genotypu. III. Srovnání novosti postupů V současné době je celá česká kolekce bramboru v rámci „Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství“ uchovávána v in vitro bance ve Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě. Postup kryokonzervace navazuje metodicky na metody pěstování explantátů v aseptických podmínkách, ale navíc umožňuje kryoprezervované explantáty uchovat po velice dlouhou dobu s minimálními provozními náklady. Dlouhodobě nízké provozní náklady na uskladnění explantátů při ultranízké teplotě a stabilita vzorků jsou hlavní výhodou metody kryokonzervace v porovnání se stávající metodou uchování bramboru. Na druhou stranu není ekonomicky efektivní využívat metodu kryokonzervace pro aktivní kolekci s častým odběrem uložených položek. Proto je metoda kryokonzervace vhodnou metodou, která doplňuje stávající metodu konzervace bramboru a zvyšuje bezpečnost skladovaných vzorků. Tato metodika vznikla úpravou metodiky kryokonzervace bramboru nazývané „kapková metoda“ (Shaefer-Menuhr et al., 1996). Tato původní metodika rovněž využívá hliníkové plíšky pro umístění vzrostných vrcholů a jejich zamrazení přímým ponořením do tekutého dusíku. Jako kryoprotektant využívá 10 % dimethylsulfoxid (DMSO), který se používá jednak pro dehydrataci izolovaných vzrostných vrcholů a pak ve formě malých kapek na hliníkové plíšky (proto „kapková metoda“), do nichž se vloží vzrostné vrcholy bramboru. Hlavní odlišností nové metodiky je předkultivace explantátů se sacharosou, která zvyšuje účinnost metody, dále využití sacharosy jako přirozeného kryoprotektantu a dehydratace vzrostných vrcholů v suchém vzduchu nad silikagelem. Odlišný je i výchozí materiál pro kryokonzervaci a složení regeneračního média. Zatímco původní metodika používala jako výchozí materiál apikální vrcholy z čtyřtýdenních rostlin a pro regeneraci rostlin po kryokonzervaci tekuté medium, nová metodika využívá axilární výhony vyrostlé z nodálních segmentů a pevné agarové regenerační medium, které je odlišné i fytohormonovým složením. Výhodou nové metodiky je i skutečnost, že nový postup vyloučil použití dimethylsulfoxidu jako kryoprotektantu, který není výhodný z hlediska genotoxicity, špatné skladovatelnosti a nemožnosti autoklávování, což postup přípravy poněkud komplikuje a také prodražuje při sterilizaci roztoků filtrací přes bakteriální filtry.
IV. Popis uplatnění metodiky Uživatelem metodiky kryokonzervace je MZe ČR a to prostřednictvím „Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství“. Využitím této metodiky kryokonzervace bramboru v „Národním programu“ dojde k vytvoření bezpečnostní zálohy nejcennějších vzorků bramboru a tím dojde k eliminaci rizik ztráty cenných genotypů. Aplikací této metodiky dojde k zachycení světového trendu uchování kolekcí bramboru jako je tomu u předních pracovišť ve světě, které se zabývají konzervací bramboru – CIP v Peru (Panta et al., 2006) a IPK v Německu (Keller et al., 2008). Úpravy postupů této metodiky jsou možné pouze v případech, že tyto úpravy povedou prokazatelně (na základě opakovaných pokusů) k statisticky významně vyšší regeneraci rostlin po kryokonzervaci nebo když změny metodiky povedou k úspoře 15
finančních prostředků pro kryokonzervaci jedné položky, aniž by byla negativně ovlivněna regenerace kryokonzervovaného genotypu.
V. Seznam použité literatury Dussert S, Engelmann F, Noirot M, 2003, Development of probabilistic tools to assist in the establishment and management of cryopreserved plant germplasm collections. CryoLetters 24, s. 339-350. Grospietsch M., Stodulková, E., Zámečník, J., 1999, Effect of osmotic stress on the dehydration tolerance of Solanum tuberosum shoot tips. CryoLetters 20, s. 339-346. Keller, ERJ, Kaczmarczyk, A, Senula, A, 2008, Cryopreservation for plant genebanks - A matter between high expectations and cautious reservation. CryoLetters 29, s. 53-62. Murashige T., Skoog F.A., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15, s. 473–497. Panta A, Panis B, Ynouye C, Criel B, Swennen R, Roca W, 2006, Improvement of potato cryopreservation for the long-term conservation of Andean landraces at CIP. In: Abstract Book of Cryo 2006. Hamburg Schaefer-Menuhr A, Mueller E, Wagner EM, 1996, Cryopreservation: an alternative for longterm storage of old potato varieties. Potato Res. 39, s. 507-513 VI. Seznam publikací Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2007, Cryoprotocols used for cryopreservation of vegetatively propagated plants in the Czech cryobank, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 247-250. Zámečník J., Bilavčík A., Faltus M., 2007, Metody dehydratace vzrostných vrcholů pro kryoprezervaci vegetativně množených plodin, ISBN 978-80-87011-00-3, In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha 21.3.2007, s. 573-576. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2006, Conservation of biodiversity of vegetative propagated crops by cryopreservation methods , In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 493-495. Faltus M., Zámečník J., Bilavčík A. , 2006, Tolerance of potato cultivars to osmotic stress and desiccation , In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 561-563. Faltus M., Zámečník J., Bilavčík A., 2006 , Osmotic stress pretreatment and cryopreservation of potato , In: Book of Abstracts "Cryo 2006", July 24-27, 2006, Hamburg, Germany, p. 151. Faltus M. , 2005, Effect of dehydration on potato cryopreservation (Solanum tuberosum, L.) , In: Book of Abstracts of the "International Symposium on the Environmental Physiology of Ectotherms and Plants", July 11-16, 2005, Roskilde, Denmark, p. 23 Faltus M., Zámečník J., Grospietsch M. , 2003, Comparison of encapsulation-dehydration and ultra-rapid freezing method for potatoes, In: Book of Abstracts of the Conference "CRYOBIOMOL 2003 - Low Temperature Biology", 14-18 September 2003, CoimbraPortugal, p. 119. Grospietsch M., Stodulková, E., Zámečník, J., 1999, Effect of osmotic stress on the dehydration tolerance of Solanum tuberosum shoot tips, CryoLetters 20, s. 339-346.
16
VII. Dedikace Metodika je výstupem řešení výzkumného záměru MZE0002700602 „Nové poznatky, metody a materiály pro genetické zlepšování biologického potenciálu plodin a využití agrobiodiversity pro setrvalý rozvoj zemědělství“.
VIII. Jména oponentů: Odborný oponent: Doc. Ing. Václav Hejnák, Ph.D.,
Katedra botaniky a fyziologie rostlin Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Česká zemědělská univerzita v Praze Oponent ze státní správy: Ing. Ivan Branžovský, CSc. Odbor zemědělských komodit, MZe
17
