Korszerű vizsgáló eljárások és terápiás lehetőségek Stargardt macula-dystrophiában

Korszerű vizsgáló eljárások és terápiás lehetőségek Stargardt macula-dystrophiában Doktori értekezés

Dr. Hargitai János Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Farkas Ágnes Hivatalos bírálók: Dr. Kőhidai László Dr. Kerényi Ágnes Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Szende Béla Dr. Radó Gábor Dr. Lukáts Ákos

Budapest 2008

Tartalom 1. Rövidítések jegyzéke

4

2. Bevezetés

5

3. Célkitűzések

15

4. Módszerek

16

4.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt

16

macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával 4.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt macula-dystrophiában scanning laser ophthalmoscop segítségével. 4.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás

17 18

betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával 4.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a

20

retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között 4.4.1. A vírusvektor létrehozása

20

4.4.2. Retina pigmenthám sejttenyészet

21

4.4.3. In vitro transzdukció

22

4.4.4. In vivo transzdukció

22

4.4.4.1. In vivo transzdukció immunszupprimálás nélkül

23

4.4.4.2. In vivo transzdukció immunszupprimálással

24

4.4.5. ELISA vizsgálat

24

4.4.6. A retina in vivo vizsgálata

25

4.4.7. Szövettani vizsgálatok

26

5. Eredmények

27

5.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt

27

macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával 5.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt

33

macula-dystrophiában scaning laser ophthalmoscop segítségével 5.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás

39

betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával 5.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a retina szöveteibe, in vitro és in vivo körülmények között

2

40

5.4.1. In vitro transzdukció

40

5.4.1. In vivo transzdukció

42

5.5. A GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására alkalmas

47

módszerek vizsgálata 6. Megbeszélés

53

6.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt

53

macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával 6.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt

55

macula-dystrophiában scanning laser ophthalmoscop segítslgével 6.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás

57

betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával 6.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a

59

retina szöveteibe, in vitro és in vivo körülmények között 6.5. A GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására alkalmas

61

módszerek vizsgálata 7. Új eredmények és klinikai jelentőségük

64

8. Köszönetnyilvánítás

65

9. Irodalomjegyzék

66

10. Összefoglalás

89

11. Summary

90

12. Publikációk jegyzéke

91

12.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények

91

12.2. Egyéb közlemények

91

12.3. Idézhető absztaktok az értekezés témájában

92

12.4. Az értekezés témájában elhangzott előadások

95

13. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai

3

95

1. Rövidítések jegyzéke ABCR: ATP-ase binding casette reporter AMD: időskori macula degeneráció ATP: adenozin trifoszfát A2E: N-retinilidin-N-retinil-etanolamin CMV promoter: cytomegalovírus promoter CRD: csap-pálcika dystrophia DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium EGPF: enhanced green fluorescent protein ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay EPON: szövettani beágyazó anyag ERG: elektroretinográfia FACS: fluorescent cell sorter FT: foveola vastagság (foveolar thickness) GFP: green fluoresceint protein HRP: torma-peroxidáz (horseradish-peroxidase) HSV: herpes siplex vírus MV: macula térfogat (macular volume) OCT: optikai koherencia tomográfia (optical coherence tomography) OCT-compound: alacsony hőmérsékleten haszálható szövettani beágyazó anyag (fagyasztott metszethez) PBS: phosphate buffered saline RAL-PE: retina foszatidil-entanolamin RmP: „rim” fehérje RP: retinitis pigmentosa SLO: scanning laser ophthalmoscop (scanning laser ophthalmoscope) STGD: Stargardt macula-dystrophia (Stargardt macular dystrophy) TBS: trishydroxymethylaminomethane buffer solution UV: ultraibolya

4

2. Bevezetés A leggyakrabban előforduló öröklött, fiatal korban tüneteket okozó macula-dystrophiát Karl Stargardt írta le 1907-ben (Stargardt 1909, 1918). A betegség jellegzetes tünete a centrális látás csökkenése, amely általában a huszadik életév előtt jelentkezik. A távoli látóélesség a betegség végállapotában általában 2-3 méter ujjolvasásás és 0,1 között stabilizálódik (Markham et al. 1998). Súlyosan károsodik az olvasóképesség, amelyet azonban nem kísér a színlátás zavara. A betegek Ganzfeld ERG válaszaiban jellemző a fotópikus funkció károsodásának dominanciája, de gyakori panasz a sötétadaptáció megnyúlása is. A korai stádiumban a szemfenéki kép nem mindig patognomikus, a klinikai diagnózis gyakran csak a betegség előrehaladtával állítható fel a jellegzetes sárgásfehér foltozottság „snail slime” vagy/és az atrófiás „beaten bronze” macula elváltozások alapján. (1. ábra)

1. ábra „Snail slime” és „beaten bronze” macula-dystrophiák (Hargitai et al. 2005) A betegség előforulását 1:10000–re becsülik; túlnyomóan autoszomális recesszív, ritkán autoszomális domináns módon öröklődik. (2.ábra) Előfordulás gyakorisága 1:10000 1:10000-1:15000 nincs adat 1:5000-1:25000

Stargardt macula-dystrophia Progresszív csap-dystrophia Best-féle vitelliform macula-dystophia X kromoszómához kötött retinoschisis

1. táblázat A leggyakrabban előforduló öröklött macula-dystrophiák

5

Allikmets és munkatársai 1997-ben találták meg azt a gént, amelynek hibája a betegség autoszomális

recesszív

módon

öröklődő

formájának

(STGD

vagy

arSTGD)

kialakulásához vezethet (Kaplan et al. 1993; Allikmets 1997 et al.). Az ABCR gén az 1. kromoszómán helyezkedik el és egy transzmembrán fehérje, a „rim” fehérje (RmP) kódolásáért felelős, amely az adenozin-trifoszfát (ATP)-kötő kazetta transzporter család egyik tagja (Azarian et al. 1997). Az RmP fehérjét először béka csap-sejtek külső tagjában írtak le (Papermaster et al. 1978). Ez a fehérje a fotoreceptorok

és

a

retina

pigmenthámja

között

zajló

energiaigényes

transzportfolyamatokban vesz részt (Weng et al. 1999).

2. ábra Az RmP fehérje működése (rho: rodopszin; ops: opszin; PE: foszfatidilenatolamin; atRAL: csupa-transz retinál; arROL: csupa-transz retinol; N-RPE: N-retinidil- foszfatidil-enatolamin; DM: lemezkék membránja; PM: plazma membrán) Weng et al. 1999. Fény hatására a rodopszinból csupa-transz retinál szabadul fel a külső tagok lemezkéiben. A csupa-transz-retinál a lemezkék membránjában található foszfatidiletanolaminhoz (PE) kapcsolodik. Az így keletkezett termék a N-retinilidin-PE (N-retPE). Az RmP egészséges működése estén az N-ret-PE-t kiüríti a lemezkékből, majd a csupa-transz retinal csupal-transz retinollá (atROL) alakul, amit a pigmenthám sejtek alakítanak ismét 11-cis-retinallá. (2. ábra) Amennyiben az RmP fehérje hiányzik vagy működése nem megfelelő, N-ret-PE halmozódik fel a lemezkék közötti térben. A felhalmozódás egyik következménye az lesz, hogy az opszint a lemezkékben lévő nagy mennyiségű felesleges csupa-transz retinál aktiválja, melynek során opszin-csupa-transz retinál (ops/atRAL) keletkezik. Ez 6

az aktiváció jelenlegi ismereteink szerint a „zajos” fotoreceptorok kialakulásához vezet, amely a sötétadaptáció megnyúlásában nyilvánul meg (Fishman et al. 1991). A kóros anyagcsere további következménye lehet az N-retinilidin-N-retinil-PE (A2PEH2) képződése, ami akkor alakul ki, ha az N-ret-PE-hez egy második csupa-transz retinál molekula kapcsolódik. A pigmenthám sejtekben - amelyek egészséges anyagcsere esetén a lemezék fagocitózisában vesznek részt – az A2PE-H2 molekula Nretinilidin-N-retinil-etanolaminná (A2E) hidrolizál. Az A2E lipofuszcin formájában halmozódik fel a pigmenthám sejtekben, és a macula lutea „túlterhelt” pigmenthám sejtjei a sejtmembrán károsodásának következtében elpusztulnak (Mata et al. 2001). Az ABCA4 gén hibája előfordul még csap-pálcika dystrophiában (CRD), retinitis pigmentosában (RP) és időskori macula degenerációban (AMD) is (Cremers et al. 1998; Martinez-Mir et al. 1998; Maugeri et al. 2000; Surya et al. 1995, Allikmets et al. 2000). A betegség súlyossága jelenlegi ismereteink alapján a megmaradt „rim” fehérje funkció függvénye (Martinez-Mir et al. 1998). Ha a beteg heterozigóta formában hordozza a hibás ABCA4 allélt, időskori macula degeneráció kialakulása valószínűsíthető. Amennyiben két enyhe vagy mérsékelt allélt hordoz, STGD kialakulása várható. Két súlyos allélt hordozó betegeken nagy a valószínűséggel CRD vagy RP fog kialakulni. A patogenezis fenti, részben egyszerűsített elmélete alól több kivétel is ismert (Birch et al. 2000). Kimutatták, hogy CRD és STGD is kialakulhat azonos genotípus mellett. Különböző munkacsoportok a klinikailag bizonyított esetek körülbelül 30-70 százalékában találtak kóros genetikai eltérését, és eddig több mint 500 betegség-okozó genetikai variánst fedeztek fel (Lewis et al. 1999; Papaionnau et al. 2000; Rivera et al. 2000; Simonelli et al. 2000; Heckenlively et al. 2001; Fukui et al. 2002). (Az ABCR gén hibája gyakran kimutatható heterozigóta formában időskori macula degeneráció esetén.) A Stargardt betegség autoszomális dominánsan öröklődő formájának kialakulásáért jelenlegi ismereteink szerint az ELOVA4 gén felelős, ami hosszúláncú zsírsavak anyagcseréjében játszik szerepet (Zhang et al. 2001). A szemészeti diagnosztika új módszerei a kórkép pontosabb morfológiai megértését tették lehetővé. Az 1990-es évek elején Huang és munkatársai számoltak be egy új vizsgálati módszerről, az alacsony koherenciájú interferometria elvén működő optikai koherencia tomográfiáról, mely a biológiai rendszerek nagy felbontású leképezését tette lehetővé. A berendezés egy szuperlumineszcens diódalézer segítségével speciális, 7

alacsony koherenciájú fénynyalábot generál, melynek hullámhossza az infravörös tartományban van. A szemgolyón keresztülhaladó fény a szem különböző struktúráiról, azok optikai denzitásának függvényében verődik vissza. Az optikai koherencia tomográfia (OCT) segítségével az ideghártyában lezajló változásokat sejtréteg – illetve a legújabb készülékek segítségével már - sejtszinten lehet vizsgálni, és így a betegség progressziójáról is pontosabb képet kaphatunk. Az OCT vizsgálat gyors és könnyen kivitelezhető, a leképezés időtartama hozzávetőleg 1 másodperc (Huang et al. 1991; Hee et al. 1995; Jaffe et al. 2004). A klinikai használatban alkalmazott berendezések közül az első és második generációs készülékek axiális és transzverzális felbontása 10-20 μm közötti, a harmadik generációs OCT felbontása 10 μm alatti. Egy másik vizsgáló eljárás, a scanning laser ophthalmoscopia (SLO), amely nagy felbontású tomográfiás felvételek készítésére alkalmas a szemfenékről, non-invazív módon. A készülék voltaképpen egy monokromatikus funduskamera, melyben azonban a képalkotás nem a hagyományos funduskamerához hasonló módon - ahol a képalkotás időtartama alatt a szemfenék egész felszíne egy időben van megvilágítva - hanem a fundusnak lézerfénnyel pontról-pontra való "letapogatásával" történik. A készülék vizsgáló fényének megválasztásával (infravörös: 780 nm, hélium-neon 630 nm, argon-kék és -zöld 514, illetve 488 nm) a retina rétegeinek és a látóidegfőnek a morfológiai vagy metabolikus változásait akár sejtszinten tudjuk vizsgálni (Németh et al. 1999; Seres et al. 1999). A macula lutea sárgás színéről először Buzzi írt 1782-ben (Buzzi et al. 1782). Wald 1945-ben megjelent munkájából ismerjük a macula területében található sárgás pigmentek abszorpciós spektrumát (430-490 nanométer) (Wald et al. 1945). Humán retinából kimutatta a xantofilleket, amelyek fényelnyelés maximuma 465 nanométer. A xantofillek a karotinoidok egy alcsoportját képezik, amelyek többek között a zöldségek, a gyümölcsök, a lazacok, a kanári madarak és a flamingók élénk színéért felelősek. A xantofillek az egyenes láncú szénhidrogén karotinoidok oxigenizált formái (Goodwin et al. 1980). Bone az 1980-as években írta le a luteint és annak szerkezeti izomerjét a zeaxantint, mint a retina specifikus xantofilljeit (Bone et al. 1980). A lutein és a zeaxatint csupán kettő a több mint 600 eddig ismert karotinoid közül. 8

Szerkezeti felépítése alapján a lutein az α-karotinoidok, míg a zeaxantin a βkarotinoidok közé tartozik. Mindkettő vegyjele azonos (C40H56O2), de eltérő szerkezetük miatt kötődnek eltérő módon, különböző membránokhoz (Bone et al. 1980). Táplakozásunkban a karotinoidok legfőbb forrásai a növényi táplálékok (hüvelyesek és a zöldpaprika) valamint a tojás sárgája, a tej és a baromfihús (Müller et al. 1996). A táplálékok felszívódását követően a vér karotinoid szintjét több tényező is befolyásolja: a szervezet zsírtartalma, a stressz, a nem, a táplálék zsírtartalma és több még nem ismert tényező (Erdman et al. 1993; Broekmans et al. 2002; Hammond et al. 1997; Zaripheh et al. 2002; Khachik et al. 1997). Az egyes karotinoidok eloszlása a szervezetben nagy különbséget mutat, amely alapján arra következtetnek, hogy az egyes molekuláknak más ás más szervspecifikus feladata lehet. A retinának van a legmagasabb xantofill tartalma – a szérumban mért érték 10000szerese – és szinte kizárólagosan csak luteint és zeaxantint tartalmaz (Bhosale et al. 2004). A magas koncentráció kialakításában nagy szerepe lehet az aktív transzport folyamatoknak és specifikus xantofill-kötő fehérjéknek, mint pl. a tubulin (Bernstein et al. 1997; Yemelyanov et al. 2001). A lutein és a zeaxantin koncentrációja a foveolában a legmagasabb és attól a periféria felé haladva egyre csökken (Bone et al. 1988, 1993, 1997). A retinában megtalálható még a zeaxantin királis izomerje az ún. mezozeaxantin, amely luteinből keletkezik és a vérben nem mutatható ki (Bone et al. 1993, 1997). A lutein és a zeaxantin a fovea területében a csapok axonjában helyezkednek el, amelyek a Henle köteget alkotják (Segal et al. 1950; Snodderly et al. 1984 A, B; Wolbarsht et al. 1976), de megtalálhatóak még a külső magvas rétegben (Rapp et al.) 2000 és a pálcikák külső tagjában is (Snodderly et al. 1984 A). Hasonlóan kimutatták a pigmentek jelenlétét a fovea Müller sejtjeiben is, amelyek hálózatot képeznek a csapok axonjaival, ezzel is biztosítva a fovea integritását (Gass et al. 1992,1999; Ezra et al. 2001). A macula lutein és zeaxantin tartalmának in vivo, nem invazív mérésére több módszert dolgoztak ki, amelyek közül a legismertebbek: a heterokromatikus flikker fotometria (Snodderly et al. 2004) és a Raman-spectroscopia (Bernstein et al. 1998). A macula xantofill tartalmának legfontosabb meghatározója a táplálkozás. Ha magas lutein és zeaxantin tartalmú táplálkozást folytatunk, több mint három hónapon keresztül, 9

akkor mind a vérben, mind a retinában megemelkedik a fentiek koncentrációja (Johnson et al. 2001; Koh et al. 2004). Bizonyítékok vannak arra, hogy a férfiak retinájában a lutein felhalmozódás gyorsabb, és a maculapigement mennyiség magasabb (Broekmans et al. 2002, Hammond et al. 1996 A). Az örökletes tényezők is meghatározói lehetnek a maculapigment mennyiségének: kékszürke szivárványhártya esetén alacsonyabb koncentrációkat mértek, mint sötét színű iris esetén (Hammond et al. 1996 B). A dohányzás szintén csökkentheti a maculapigment mennyiségét (Hammond et al. 2000). Az életkor előrehaladtával a xanthofillek csökkenését írták le, amely meghatározó lehet az időskori macula degeneráció kialakulásában (Beatty et al. 2001; Eye Disease CaseControl Study Group 1992). A maculapigement élettani funkciója még nem teljesen ismert. Feltételezhető funkcióit a már ismert biológiai, optikai és fotokémiai tulajdonságaiból vezették le. Szerepet játszhatnak a kék fény megszűrésében (Howarth et al. 1986), a káprázás csökkentésében (Sujak et al. 2000), a kontrasztérzékenységben (Wooten et al. 2002) és a reaktív oxigéngyökök semlegesítésében (Conn et al. 1991). A pigmentek megfelelő elrendeződésben -amelyet a membrán fehérjékhez történő kötődésük biztosít – a fotoreceptorok előtt elhelyezkedő fényszűrő rétegként működnek (Ezra et al. 2001; Naylor et al. 1954; Stanworth et al. 1950; Yemelyanov et al. 2001). Az éleslátás fenntartásában elengedhetetlen szerepe van a pigmentek jelenlétének és azok megfelelő elrendeződésének. Idős korban, albinismusban és retinitis pigmentosa esetén – amikor a maculapigment mennyisége csökkent – igen gyakori panasz a szemkáprázás (Hammond et al. 1998). A maculapigment zsírban oldódó antioxidánsok tagjaként, fontos szerepet játszik a szervezet

antioxidáns

rendszerében

az

enzimek

(kataláz,

glutation-peroxidáz,

szuperoxid-dizmutáz) és a vízoldékony antioxidánsok (glutation, C-vitamin) mellett (Conn et al. 1993, De La Paz et al. 1992). A retina kifejezetten érzékeny az oxidatív streszre, mert igen magas az oxigén koncentrációja és folyamatos nagy energiájú kék fény behatásának van kitéve. A reaktív oxigén gyökök keletkezésében kiemelt szerepe van az UV és a kék fényt nagyfokban elnyelő molekuláknak, mint pl. lipofuszcinnak. Ezek az oxigén gyökök a hosszúláncú telítetlen zsírsavak károsításán keresztül lipid-peroxidációt okoznak, amely 10

DNS

károsodáshoz,

fehérjék

és

transzmembrán

glikoproteinek

oxidációjához

vezethetnek (Winkler et al. 1999). A karotinoidok a szabad gyökök eltávolításában játszanak kiemelt szerepet (Stahl et al. 1997; Leibler et al. 1997; Sundelin et al. 2001). Lipidoldékonyságuknak köszönhetően sejtmembránokhoz kötődve, a fotoreceptorok külső tagjában lévő magas telítetlen zsírsav tartalmú membránok védelmének alappilléreit képezik (Winkler et al. 1999; De La Paz et al.1992; Leibler et al. 1997). A korral előrehaladó pigementhámsejt pusztulás, a maculapigment mennyiségének csökkenése, és lipofuszcin felhalmozódása a retina oxidatív károsodásához és következményes látóélesség csökkenéshez vezet (Boulton et al. 1991; Curcio et al. 1993). Kísérletes körülmények között, ha a pigmentsejt kultúrákat luteinnel és zeaxantinnal kezelték, csökkenthető volt a lipofuszcin képződés és a kék fény által előidézett apoptosis (Boulton et al. 1993). A lutein és zeaxantin tartalmú étrend-kiegészítők folyamatos szedése a vér, majd később a retina xantofill tartalmának emelkedéséhez vezet. Néhány tanulmányban kimutatták, hogy magasabb szérum xantofill koncentráció esetén alacsonyabb arányban alakul ki időskori macula-degeneráció (Seddon et al. 1995, Snellen et al. 2002; Gale et al. 2003). A

maculapigment

bevitel

optimális

mennyiségének

meghatározására

további

tanulmányok vannak folyamatban. Jelenleg a Stargardt betegség a többi macula-dystrophiával együtt a gyógyíthatatlan betegségek közé tartozik. Ezek a kórképek a betegre, családjára és a társadalom egészére komoly terheket rónak. A korai diagnózis elősegítheti azt, hogy az érintettek megfelelő pályaválasztással könnyebben tudjanak beilleszkedni a társadalomba, és teljes életet élhessenek. A mai napig az egyetlen javasolt terápia STGD esetén olyan multivitamin készítmények alkalmazása, amelyek megfelelő összetételben tartalmazzák a retina és a fotoreceptorok korai öregedését hátráltató vitaminokat, nyomelemeket, antioxidánsokat és fotopigmenteket. A leggyakrabban használt optikai rehabilitációs lehetőségeinket jelenleg az alábbi segédeszközök képezik: távcsőszemüveg, nagyító TV és színszűrős szemüveg (Fonda et al. 1985; Zrenner et al. 2002). A retina betegségek diagnosztikus lehetőségeinek kibővülésével párhuzamosan egyre több kísérlet kezdődött, amely a betegségek gyógyítását tűzte ki céljául (Rattner et al. 1999) Ezekben a kísérletekben a szövetátültetés, az őssejt beültetés és a retina 11

protézisek mellett egyre nagyobb számban jelentek meg olyan próbálkozások, amelyek a betegséget sejt és/vagy gén szinten próbálják kezelni. A génterápia az öröklött és szerzett betegségek gyógyításában ígéretes módszernek tűnik. A génterápiás vizsgálatok első lépcsőben egy nyomjelző fehérje termelődéséért felelős gén sejtekbe történő bejuttatásának lehetőségeit vizsgálták. Ezen kísérletek sikere lehetővé tette, hogy a további kutatások egy adott betegségben meghibásodott gén vagy génszakasz, és ezen keresztül a fehérjetermék korrigálásának irányában folytatódjanak (Naldini et al. 1996 A,B; Miyoshi et al. 1997; Bennett et al. 1999). Jelenleg a génterápiás kísérletek túlnyomó része valamely vírus-vektort használ a transzgén bejuttatásához (Relph et al. 2004). Több olyan vírus-vektort sikerült kifejleszteni, amely képes a terápiás transzgén hosszú távú és biztonságos expresszálódásának elindítására az adott célsejtekben. A génterápiának különös jelentősége van a központi idegrendszer betegségeiben, mivel az idegi eredetű sejtek nem osztódnak és kifejezett védelmi rendszer veszi őket körül. Az adenovírus-vektor képes –az elérhető magas vírus-koncentrációknak köszönhetően – a célsejtek széles spektrumának eredményes transzdukciójára, de alkalmazásakor kifejezett immunválasz várható (Cao et al. 2004; Volpers et al. 2004; Thomas et al. 2001; Schagen et al. 2004). A vektor toxicitására hívta fel a figyelmet az a fatális kimenetelű humán kísérlet, amelyben az ornitin-traszkarbamiláz hiányát próbálták kezelni első-generációs adenovírus-vektor segítségével (Lehrman et al. 1999).

A

továbbfejlesztett „gutless” (tehetetlen) adenovírus-vektorból kiiktatták az összes a transzdukcióhoz nélkülözhető vírus alkotórészt, de a vírus kapszid fehérje továbbra is immunválaszt vált ki (Sakhukja et al. 2003; Kochanek et al. 2001, McKelvey et al. 2004). Az adenovírus-vektor másik hátránya, hogy a transzgén episzomálisan integrálódik, így krónikus betegségek kezeléséhez szükséges folyamatos gén-expresszió nem érhető el, de a célsejt genomja nem módosul a terápia következtében. Az adeno-szatellita vírus (AAV) a célsejtek széles spektrumának kezelésére nyújt lehetőséget (Kaplitt et al. 1994; Lu et al. 2004). A „beültethető” transzgén mérete kicsi (4-5kb) és a vektor immunválaszt nem vált ki. Amennyiben nagyobb méretű transzgén bejuttatására van szükség, akkor eredmény csak a gént feldarabolásával, két AAV vektor egyidejű transzdukciójával érhető el (Nakai et al. 2000; Duan et al. 2000; Sun et al. 2000).

12

A vektor másik hibája, hogy több esetben elégtelennek bizonyult a transzgén expressziója, ami valószínűleg abból adódott, hogy a transzgén a célsejt nem kódoló régiójába integrálódott (Nakai et al. 2003). Jelenleg két klinikai kísérlet van folyamatban Parkinson betegség kezelésére AAV vektor alkalmazásával (During et al.2001; Luo et al. 2002). A herpes simplex vírus (HSV) alapú vektorok eredményesen képesek az idegi sejtek transzdukciójára, köszönhetően a vírus ismert neurotrofizmusának. A hordozható transzgén mérete itt jóval nagyobb lehet (akár 50kb), és az integráció ebben az esetben is episzómális (Glorioso et al. 2004). A HSV vektor esetén is kifejezett immunreakcióra számíthatunk, és az expresszió is csak átmeneti jellegű, ezért a vektort jelenleg csak a daganatok kezelésére irányuló kísérletekben használják (Post et al. 2004). Hosszú távú transzgén expresszió elérésére - jelenlegi ismereteink alapján – leginkább a retrovírus és lentivírus alapú vektorok alkalmasak. Ezekben az esetekben a transzgén stabilan integrálódik a célsejt genomjába (Naldini et al. 1996A). A lentivírus-vektor képes nem osztódó, idegi eredetű sejtek nagyobb méretű (8-10kb) transzgénnel történő transzdukciójára, immunreakció kiváltása nélkül (Lever et al. 2004; Martin-Rendon et al. 2001; Azzouz et al. 2004). A vektor egyedüli kockázata az, hogy a genomba történő beépülés mutációk kialakulásához, vitális gének sérüléséhez és nyugvó „promoter” vagy „enhancer” régiók aktiválásához vezethet. Ez a mellékhatás jelentkezett azokban a gyerekekben, akiket az X-kromoszómához kötött kombinált immundeficiencia (CID) miatt kezeltek lentivírust alkalmazva. Három betegen a kezelés mellékhatásaként leukémia alakult ki, ami részben LIM-only2 (LMO2) onkogén aktiválódására vezethető vissza (Hacein-BeyAbina et al. 2003). A lentivírus-vektorokat két nagy csoportba oszthatjuk: főemlős eredetű vektorok és nem főemlős eredetű vektorok. Az előbbibe a humán immundeficiencia vírus (HIV) és a majom immundeficiencia vírus (SIV) tartozik. Az utóbbiba a lófertőző vérszegénység vírus (EIAV), a macska immundeficiencia vírus (FIV) és a szarvasmarha immundeficiencia vírus (BIV) vektorok tartoznak. Az első generációs lentivírusokat olyan vektorok követték, amelyből eltávolítottak minden olyan vírusrészt, amely immunválaszt okozhat a célszövetben. A vírusok pszeudotipizálása lehetővé tette, hogy a vírus-vektor retrográd transzportját kihasználva

13

távoli vagy elzárt idegsejt csoportokat lehessen kezelni (Dull et al. 1998; Kim et al. 1998; Poeschala et al.1998; Rohll et al. 2002). A legújabb lentivírus-vektok képesek a transzgén expresszálódásának „ki és bekapcsolására” a Tet (tetracyclin) szabályozó rendszer segítségével (Pluta et al. 2005). Ez a tulajdonság kifejezetten fontos lehet abban az esetben, ha akut betegséget kívánunk kezelni. Jelenleg -többek között- a következő neurodegeneratív betegségekben történnek génterápiás kísérletek lentivírus-vektor alkalmazásával: Alzheimer betegség (Marr et al. 2003), Parkinson betegség (Kirik et al. 2004), Huntington betegség (Kells et al. 2004) és amyotrophiás lateralsclerosis (Kaspar et al. 2003). A szem több szempontból is ideális célszerve lehet a génterápiának: sebészileg könnyen megközelíthető és a terápia in vivo könnyen nyomon követhető. Több öröklött retina betegségben sikerült már állatkísérletes modellben részleges anatómia és funkcionális rehabilitációt elérni az utóbbi években (Leber-féle congenitális amaurosis, retinitis pigmetosa, Stargardt macula-dystrophia) (Takahashi et al. 1999; Acland et al. 2001; Bemelmans et al. 2006; Kong et al. 2007).

A Stargardt betegség kisérletes állatmodelje az abcr -/- „knock out” egér, amelyben az RmP fehérje génjét törölték. Ezekben az egerekben lipofuszcin felhalmozódást és a sötétadaptáció megnyúlását írták le (Weng et al. 1999). A abcr-/- egér vizsgálatai során kimutatták, hogy az A2E felhalmozódás csökkent, abban az esetben, ha az állatokat sötétben tartották (Weng et al. 1999). Ennek alapján javasolhatjuk a betegnek, hogy az erős fényt a lehető legnagyobb mértékben kerüljék. Kísérletek indultak olyan gyógyszerek kifejlesztésére, amelyek az A2E felhalmozódást gátolják a pigmenthám sejtekben. Az abcr-/- egérben izotretinoinnak ilyen hatását mutatták ki (Radu et al. 2003).

14

3. Célkitűzések

Kutatásunk

célja

a

Stargardt

betegség

klinikai

morfológiai

vizsgálata

és

progressziójának megítélése új szemészeti diagnosztikus eszközökkel, valamint a betegség genetikai hátterének feltérképezése, és egy nyomjelző fehérje génterápiás módszerrel történő bejutásának in vitro és in vivo vizsgálata volt. Vizsgálatainkban a következő kérdésekre kerestünk választ: 1.

Alkalmas módszer-e az OCT a retina morfológiai változásainak vizsgálatára Stargardt macula-dystrophiában?

2. Nyomonkövethető-e SLO segítségével a maculapigment mennyiségének változása Stargardt macula-dystrophiában? 3. Az ABCA4 gén melyik mutációi fordulnak leggyakrabban elő a magyar Stargardt macula-dystrophiás betegcsoportban, és azok hogyan befolyásolják a betegek fenotípusát? 4. Képes-e a lentivírus-vektor a GFP nyomjelző fehérje (green fluorescent protein) génjének a retina pigmenthámjába és egyéb rétegeibe történő bejuttatására in vitro és in vivo körülmények között? 5. Milyen módszer alkalmas a GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására?

15

4. Módszerek Stargardt macula-dystrophiásnak (STGD) diagnosztizált betegeken és hasonló korú kontroll személyeken a következő klinikai vizsgálatokat végeztük: 4.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában OCT segítségével A Semmelweis Egyetem II.sz. Szemészeti Klinikáján harmincöt 15-55 éves (átlag: 28,3±7,6 év) hagyományos klinikai módszerekkel STGD-ának ítélt beteg 70 szemét és 25 hasonló korú (14-51 év; átlag: 27,6±8,7 év) egészséges kontrollszemély 50 szemét vizsgáltuk. A vizsgálatok mindegyike az intézet szabályzatának és a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően történt. Az összes résztvevő személy a vizsgálatok részletes ismertetését követően beleegyező nyilatkozatot írt alá. A betegek beválogatása a korábban ismertetett kritériumok alapján történt (Allikmets et al. 1997; Lewis et al. 1999). A kontroll csoportban egyik személynek sem volt szemészeti betegsége. A betegek között 19 nő és 16 férfi, míg az egészségesek között 13 nő és 12 férfi szerepelt. A betegség jelentkezésének idejét és a betegség fennállást minden beteg esetén rögzítettünk. A betegség kezdetének vagy a látásromlás észlelésének az idejét vagy a diagnózis felállításának időpontját tekintettük. A páciensek rutin szemészeti ellenőrzése a következőket tartalmazta: távoli korrigált látóélesség (Snellen tábla), az elülső és hátsó szegmentum biomikroszkópos vizsgálata, szemfenéki fénykép készítése. Pupillatágítást követően optikai koherencia tomográfiát végeztünk második generációs OCT berendezéssel (OCT2, Hunphrey-Zeiss Instruments, San Leonardo, CA, USA). Minden szem vizsgálata során hat, a vizsgáló személy által manuálisan a foveára centrált, 6 mm-es letapogatást végeztünk. A manuális centrálásra a betegek rossz fixációs képessége miatt volt szükség. A foveoláris vastagságot (FT) és a macula térfogatot (MV) -3500μm átmérőnek megfelelően- a készülék beépített szoftverének segítségével határoztuk meg. Az így kapott eredményeket összehasonlítottuk a betegek legjobb korrigált távoli látóélességével.

16

A statisztikai feldolgozáshoz, lineáris regressziót alkalmazva a Statistica 6.0 szoftvert használtuk (Statsoft Inc. Tusla, USA), és szignifikancia szintjének a p< 0,05 értéket tekintettük.

4.2. A maculapigment változásának vizsgálta STGD-ában SLO segítségével A Columbia Egyetem (New York, NY, USA) Szemészet Tanszékén tizenhat (11-63 éves; 11 nő és 5 férfi) STGD-ás beteg 32 szemét vizsgáltuk. A maculapigment jelenlétét scanning laser ophthalmoscop (SLO; Rodenstock, Munich, Germany) segítségével állapítottuk meg. A SLO vizsgálat előtt, meghatároztuk az összes vizsgált szem legjobb korrigált látóélességét Snellen tábla segítségével. A vizsgálatokat az intézet etikai bizottságának előzetes jóváhagyásával, a Helsinki Nyilatkozat elveinek betartása mellett végeztük. Minden vizsgált személy belegyező nyilatozatot írt alá a vizsgálatokat megelőzően. Négy

különböző

hullámhosszú

fényforrást

használva

és

azok

eredményeit

összehasonlítva (kék argon-lézer: 488 nm; zöld neon-lézer: 514 nm; vörös hélium neonlézer: 633; infravörös dióda-lézer: 780nm) határoztuk meg a maculapigment jelenlétét vagy annak hiányát a foveában. A kapott eredményeket 3 csoportba osztottuk: 1. Normál mennyiségű pigment a foveában: ha egyenletes eloszlású, körkörös elrendezésű, a foveára centrált sötét pigment volt megfigyelhető, amely a kék fényt teljes mértékben, a zöld és vörös fényt csökkenő mértékben nyelte el, míg az infravörös fény számára teljesen áttetsző volt. (Ezt az eredményt kaptuk mind a huszonöt egészséges kontroll személy esetén.) 2. Csökkent mennyiségű pigment a foveában: ha a pigment mennyiségében vagy eloszlásában a normál állapothoz képest eltérést találtunk, a normál pigment mennyiség mellett leírt fényelnyelési tulajdonságokkal.

17

3. A maculapigment teljes hiánya a foveában: ha a kék fénnyel történő megvilágítás során sötét színű pigment nem volt látható, vagy ha a kék fény mellett észlelt sötét pigment hasonló képet mutatott az infravörös megvilágításnál is. A betegek maculapigment mennyiségét összehasonlítottuk a legjobb korrigált látóélességgel. A látóélesség és a pigmenttartalom összefüggését 3x3-as Chi-négyzet teszttel vizsgáltuk az alábbi csoportok szerint: 0,1- és annál rosszabb, 0,1-0,5 közötti, 0,5 és annál jobb látóélesség, valamint normál mennyiségű pigment, csökkent mennyiségű pigment és a maculapigment teljes hiánya. 15 beteg ABCA4 genotípusát viszgáltuk az ABCR 350 gén-chippel (Allikmets et al. 2001).

4.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával A Semmelweis Egyetem II.sz. Szemészeti Klinikájánának harmincöt 8-45 éves (átlag: 28 év) STGD-ás betegét vizsgáltunk a Columbia Egyetem Szemészeti Tanszékével együttműködésben (New York, NY, USA) a genetikai háttér feltérképezésének céljából. Minden betegtől előzetes beleegyezés után 6 ml friss vénás vért vettük, amelyből a DNS-t QAIGEN DNA Maxi Preparációs csomag (QIAGEN Inc., valencia, CA, USA) segítségével izoláltuk. A betegek genetikai hátterének feltérképezését ABCR400 microchip segítségével végeztük, majd az eredményeket szekvenálással ellenőriztük. Az ABCR400 microchip képes az összes ABCA4 variáns (jelenleg ismert több mint 450 génhiba) egyidejű vizsgálatára (Allikmets et al. 2001; Jaakson et al. 2003). A microchip az „arrayed primer extension” (APEX) elvét alkalmazza és az összes ismert ABCA4 allél szekvencia-specifikus oligonukleotidjának szintézisével, és azok felhasználásával működik. A minták (templátok) előállításához, az ABCA4 gén összes exonját PCR módszerrel sokszorosítjuk, a korábban ismertetett módszerrel (Kurg et al. 2000). Az amplifikációs oldatban a dTTP 20 százalékát dUTP-vel helyettesítettük. A sokszorosított mintákat koncentrálása és tisztítása tisztító oszlopon történt (MIPSpin 18

PCR kit; Genotein Inc., Szöul, Dél-Korea). A minták fragmentációjához hőkezelést követően hőlabilis uracil-N-glikozilázt használtunk (Epicentre Biothechnologies, Madison, WI, USA). Az APEX módszerrel végzet genotipizáláshoz az amplifikált minták egyharmadát használtuk a primer extenziós reakcióban. Az APEX reakció oldata minden esetben a következőket tartalmazta: a fragmentált és denaturált PCR mintát, 4 U DNS-polimerázt (ThermoSequenase; GE Healthcare, Amersham, Nagy-Britannia), egyszeres reakció puffert és 1,4 µM koncentrációban fluorescensen jelzett ddNTP-ket: Texas-vörös ddATP, fluoreszcein-ddGTP (GE Healthcare), Cy3-ddCTP és Cy5-ddUTP (NEN, Boston, MA, USA). A reakciós oldatot 58˚C-on 15 percen keresztül inkubáltuk a ABCR400 microchip felületén. Az inkubációt a tárgylemez 95˚C-os desztillált vízzel (Milli-Q; Millipore, Bedford, MA, USA) történő öblítésével állítottuk le. A tárgylemezeket Genorama QuattroImagerrel (Asper Biotech Ltd., Tartu, Észtország) vizsgáltuk, és az ABCA4 szekvencia-variánsokat a műszer szoftverének (Genorama Genotyping Software, Asper Biotech Ltd., Tartu, Észtország) segítségével azonosítottuk (Tonisson et al. 2002). Az azonosított variásokat direkt szekvenálással, (Taq Dyedeoxy Terminator cycle Sequencing; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) automata szekvenálón ellenőriztük. A genotípus-fenotípus összehasonlítás során a betegeket a funduskép alapján a Fischman által javasolt csoportokba (Fischman et al. 1999) : •

Fenotípus I: apró atrófiás terület a foveában, finom pigmentzavarral és perifoveális sárgás-fehér foltozottsággal.

•

Fenotípus II: számos sárgás-fehér folt a macula területében.

•

Fenotípus III: kifejezett atrófiás elváltozás a fovea területében.

A betegek genetika adatait a legjobb korrigált látóélességgel és az OCT vizsgálat eredményeivel hasonlítottuk össze lineáris regresszió módszerével. A statisztikai számításokat a Statistica 6.0 szoftverrel (Statsoft Inc. Tusla, USA) végeztük és szignifikáns eltérésnek a p< 0,05 értéket tekintettük. 19

Elemeztük egy adott genetikai hiba lehetséges hatását a betegség progressziójára a vizsgálati csoportban.

Alapkutatásainkat humán pigmenthám tenyészeteken és kísérleti nyulakon végeztük:

4.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között

4.4.1. A vírus-vektor létrehozása A vírusokat a humán vese eredetű 293T sejtvonal három plazmiddal történő egyidejű transzfekciójával nyertük, a kálcium-foszfát módszer alkalmazásával (Chen et al. 1987; Naldini et al. 1996A,B). Az első plazmid (pCMVΔR8.2) tartalmazza a cytomegalovírus promotert és az inzulin poladenilációs jelet, amely az összes vírusfehérje –a köpenyfehérje (envelope) és a Vpu kivételével- „transz” formában történő expresszálódásához szükséges. A második plazmid (pHR’-CMV-GFP) tartalmazza az összes „cisz” állapotban lévő fehérje kódolásáért felelős szekvenciát, amely a vírus sejtbe jutásához és génjeinek a célsejt genomjába történő integrációjához szükséges. Ebben a plazmidban az expressziós kazetta a Rev (vírus replikációját szabályozó fehérje) kötőhelyekkel és CMV promoterrel együttesen felelős az EGFP expresszálódásáért. A harmadik plazmid (pMD.G) a vesicularis stomatitis vírus köpeny-fehérjéjének termeléséért felelős, amely a vírus stabilitását és a lehetséges célsejtek számát határozza meg. 40 darab 10 cm átmérőjű petricsészébe egyenként 1,5x106 293T sejtet helyeztünk egy éjszakára, majd a tápoldatot a transzfekció előtt két órával friss médiumra cseréltük. A kálcium-foszfátos precipitációhoz 15μg pCMVΔR8., 20μg pHR’-CMV-GFP és 5 μg pMD.G DNS keverékét használtuk. A tápoldatot a transzfekciót követően 18 órával friss médumra cseréltük. Újabb 48 óra elteltével a vírust tartalmazó tápoldatot összegyűjtöttük a negyven 10 cm-es petricsészéből. A sejttörmeléket lassú centrifugálással távolítottuk el. Ezt követően az oldatot 0,45μm pórus-méretű filteren szűrtük keresztül, majd ultracentrifugálást végeztünk 50000g-n 90 percig. Az így kapott vírusmasszát feloldottuk 600 μl vírus inkubációs oldatban (50mM Tris-HCL, pH 7.8, 20

130mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCL2, 0,1 dezoxinukleotid-trifoszfát [dNTPs], 3mM spermin, 0,3mM spermidin), majd 37˚C-on 2 órán át inkubáltuk. Az oldatot ezt követően TBS-sel hígítottuk (50mM Tris-HCL, pH 7,8, 130mM NaCl, 1mM KCl, 5mM MgCl2), amelyet 50000g-n 90 percig tartó újabb ultracentrifugálás követett. A végső vírusmasszát 100μl 8μg/ml Polybrene (kationos polymer, mely a retrovírus fertőzés hatékonyságát emeli a sejtkulturában) tartalmú TBS-ben oldottunk fel újra. A lentivírus-vektor titerét a 293 sejtek infekciójával határoztuk meg. 1x105 sejtet helyeztünk el petricsészénként, majd a 4 μg/ml Polybrene tartalmú vírusoldat különböző hígításait helyeztük a tápoldatokba. Egy éjszakán át tartó inkubációt követően a tápoldatot frissre cseréltük, és a sejteket további 48 óráig inkubáltuk. A GFP fluoreszcenciát

áramlási

citométerrel

(FACS)

határoztuk

meg.

A

vírus-titer

meghatározásához azokat a sejttenyészeteket használtuk, amelyekben a GFP fluoreszcenciát mutató sejtek száma megközelítőleg 5% volt. A koncentrációt az aktuális sejt-floureszcencia százalék és a hígítás mértékének arányából számoltuk ki. Az így nyert vírusoldatok fertőző egység (IU) koncentrációja 106 – 1010 IU/ml között változott.

4.4.2. Retina pigmenthám sejttenyészet A humán pigmentepithel sejteket 18-22 hetes magzatok szeméből nyertük az Albert Einstein Orvosi Egyetemről (New York, NY, USA). A terhesség megszakítást megelőzően az anya minden esetben beleegyező nyilatkozatot írt alá a szerv felhasználásáról. A szerveket az Albert Einstein Orvosi Egyetem és a Columbia Egyetem (New York, USA) közötti megállapodás alapján használtuk fel. A szemeket először 70%-os alkoholban, majd PBS oldatban tisztítottuk meg. A pigmenthám eltávolítása a korábban már ismertetett módszerrel történt (Gouras et al. 1994). A pigmenthám darabokat 37˚C-on inkubáltuk 95% páratartalom és 5% CO2 koncentráció mellett. A 20% fötális bovin szérum tartalmú Dulbecco modifikált Eagle tápoldatot (DMEM) 3 naponta cseréltük a sejttenyészeten.

21

4.4.3. In vitro transzdukció Annak érdekében, hogy az osztódó és a nyugalomban lévő sejtek transzdukciójának arányát össze tudjuk hasonlítani, a vírusoldatot az elsődleges pigmenthám tenyészet tápoldatába juttattuk. Ezáltal megfigyelhettük mind az eredeti erősen pigmentált sejtcsoport, mind az ebből kirajzó, már csökkent pigmenttartalmú osztódó sejtek viselkedését. A transzdukció előtt a tápoldatot friss, 20% fötális bovin szérum tartalmú DMEM oldatra cseréltük, amely 4 μg/ml koncentrációban Polybrent és a vírusoldat különböző koncentrációit (107 – 109 IU/ml) tartalmazta. A sejteket 14 órán keresztül inkubáltuk a vírusoldatban, majd annak kimosását követően a közeget friss tápoldatra cseréltük. Mind a fluoreszkáló, mind a nem fluoreszkáló sejteket egy meghatározott (0,4 x 0,8 mm) területen összeszámoltuk a tenyésztőedény alábbi három részén: 1. az eredeti pigmenthám lemez közepének megfelelően 2. az eredeti lemez szélének megfelelően, ahol az osztódó sejtek vonala indult 3. a sejttenyészet széli részének megfelelően, ahol nagy mennyiségű osztódó sejt volt megfigyelhető. A fenti vizsgálatokat hetente, tizenöt különböző tenyésztőedényben végeztük el, három héten keresztül. Öt sejttenyészetben 6 hétig, míg egy tenyészetben három hónapig folytattuk a vizsgálatot. 4.4.4. In vivo transzdukció Kísérleteinkben holland öves nyulakat használtunk az ARVO irányelveinek megfelelően (ARVO 2002). A nyulakat intramuszkulársian 20mg/kg ketamin és 10mg/kg xylazin keverékével altattuk el. Az állat egyik pupilláját 2 %-os cyclopentolat és phenilephrin hydrochlorid keverékével kitágítottuk, és a kísérleteket a tágított pupillájú szemeken végeztük, fénymikroszkópos ellenőrzés mellett. (3. ábra)

22

3. ábra A szubretinális és az intravitreális injekció bejuttatásának módja (Ralph et. al 2006) A kötőhártya sebet és a sclerotomiás nyílást a limbus mögött 3 mm-rel készítettük. A vizsgálathoz a nyulak szemére kontaktlencsét helyeztünk hialuronsav (Healon, Santa Ana, CA, USA) segítségével. A scleraseben keresztül egy 50µm átmérőjű üveg mikropipettát juttattunk az üvegtesti térbe. A pipetta végét a retina felszínére óvatosan rányomva, a vírus oldatot a neuroretinán keresztül a szubretinális térbe juttattuk. Minden esetben arra törekedtünk, hogy kb. 1-2 mm átmérőjű, kerek neuroretina leválást képezzünk. Ezek után a pipettát eltávolítottuk,a sclera és kötőhártya sebeket 9-0 nylon varrattal zártuk.

4.4.4.1. In vivo transzdukció immunszupprimálás nélkül A kísérleteket 27 nyúl egyik szemén végeztük különböző vírusoldatokat juttatva a szubretinális térbe: •

A oldat: CMV promóterrel ellátott GFP gént tartalmazó lentivírus 106-109 IU/ml koncentrációjú oldatát használtuk 16 szemben

•

B oldat: CMV promótert tartalmazó lentivírust jutattunk be, amely nem tartalmazta a GFP génjét három szembe 23

•

C oldat: csak Polybrene oldatot injektálunk két szembe

•

D oldat: rodopszin promótert tartalmazó lentvírus-GFP-t jutattunk be két szembe

•

Az A oldatot használtuk, azt lehetőség szerint a neuroretina rétegei közé adtuk négy szemben.

4.4.4.2. In vivo transzdukció immunszupprimálással A kísérleteket 9 nyúl 12 szemén végeztük. Az előzőekben leírt A oldatot injektáltuk a nyulak szubretinális terébe. •

Négy nyúl a műtét napjától kezdődően a következő immunszuppressziós terápiában részesült: intramuszkuláris metylprednisolon sodium-succinat (SoluMedrol; 6,25mg/nap), azathioprin (8mg/nap) és orális cyclosporin (Neoral oldat 50mg/nap) egy hónapon keresztül. Az immunszuppressziót egy hónap elteltével leállítottuk.

•

Két immunszupprimált és két nem immunszupprimált nyúl fülvénájából három naponként vért vettünk az esetleges GFP ellenanyag ELISA módszerrel történő kimutatására.

•

Két immunszupprimált és egy nem immunszupprimált nyúl az első operáció után 6 hónappal újabb szubretinális vírusinjekciót kapott a másik szembe. Ezekben az esetekben újabb immunszuppressziót nem alkalmaztunk.

4.4.5. ELISA vizsgálat Maxicorp 96 osztatú tenyésztőedények alját (Nalge Nucl International, Rochester, NY, USA) 1μg rEGFP (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA USA) 100μl 50mM koncentrációjú nátriumkarbonát oldattal (pH 9,8) vontunk be. A fluoreszcencia blokkolására a tenyésztőedényt 0.05% Tween és 3% bovin szérum albumin tartalmú PBS oldattal kezeltük. A nyulak vérét a fenti oldattal hígítottuk és az oldatból lyukanként 100 μl-t helyeztünk el. Kilencven percig tartó 37˚C-os inkubáció után, a

24

lyukakat PBS-sel kimosva 100 μl másodlagos anti-nyúl immunglobulin G-t adtunk hozzá, amely 0,1μg/ml torma-peroxidáz (HRP) konjugátumot tartalmazott. A HRP kimutatására 3,3’, 3,5’ tetrametilbenzidin szubsztrátot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) használtunk, amelyet kolorimetriás analízis követett a Multiscan RC plate reader (Labsystemsm, Helsinki, Finnország) segítségével.

4.4.6. A retina in vivo vizsgálata A nyulak retináját hetente vizsgáltuk scanning laser ophthalmoscoppal (SLO), indirekt ophthalmoscoppal és réslámpával. A GFP gén expresszálódásának vizsgálatához 488 nm hullámhosszúságú argon lézer gerjesztő-fényt és olyan filtert használtunk, mely csak az 500 nm-t meghaladó hullámhosszú fényeket engedi át. A fluoreszcens módban használt SLO képek alapján a GFP gén expresszálódásának mértékét (relatív fluoreszcencia) 0-3-ig osztályoztuk az injektált területnek megjelenő különálló fluoreszkáló pontok száma szerint: •

Ha az SLO képen legalább 50 különálló fluoreszkáló pontot láttunk az injektált területen, akkor az expresszálódás mértéke: 3;

•

10-50 fluoreszkáló pontot esetén: 2;

•

10 pontnál kevesebb esetén: 1;

•

a fluoreszencia hiánya esetén a gén expesszió mértéke: 0.

Az ideghártyán az injektált területnek megfelelően kialakult károsodás (relatív retina pigmenthám károsodás) mértékét szintén a 488nm hullámhosszú fény használata mellett állapítottuk meg, az alábbiak szerint: •

IV fokozat: 10 vagy annál több pigmentált (sötét) pont és ezek körül több atrófiás terület;

•

III fokozat: 5-10 pigmentált pont és ezek körül néhány atrófiás terület;

•

II fokozat: 2-5 pigmentált pont;

•

I fokozat: 1 pigmentált pont;

•

0 fokozat: a szubretinális injekció helyén pigmentáció változás nem látható.

25

4.4.7. Szövettani vizsgálatok A nyulak szemének szövettani vizsgálatára a fluoreszcencia megszűnését követően a kilökődési reakció jeleinek megjelenése után került sor. Ennek időpontja a nem immunszupprimált esetekben az injekciót követő 1-8. hónapra esett. Az immunszupprimált nyulak szövettani feldolgozása 12 hónap után történt. A szemek nagy részét 3%-os glutáraldehidet tartalmazó PBS oldatban fixáltuk, úgy, hogy a bulbust a limbusnak megfelelően 3 nyíláson keresztül töltöttük fel. A szemeket 2 napon keresztül + 4˚C-on tartottuk a fixáló oldatban. A lencsét és az üvegtestet puffer-oldatos öblítés után eltávolítottuk. Ezt követően a kezelt területet fénymikroszkóp ellenőrzése mellett kivágtuk, majd újabb öblítést követően dehidráltuk, majd Epon-ba ágyaztuk és fénymikroszkópos metszeteket készítettünk. Azokban az esetekben, amikor fagyasztott metszeteket készítettünk, a szövetdarabokat 4%-os paraformaldehid tartalmú PBS oldatban fixáltuk, majd OCT-kompanddal feltöltve száraz jéggel fagyasztottuk meg. A Leica 1850 cryotommal (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország) készített metszeteket zselatinnal kezelt tárgylemezeken

rögzítettük

fluoromount-G

fedőanyagot

használva,

majd

a

fluoreszcenciát epifluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiovert S100; Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Németország) vizsgáltuk. Az excitációhoz 480 ± 20 nm hullámhosszú fényforrást használtunk, a barrier-filter csak az 535 ± 25 nm hullámhosszú fényeket engedte át. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz poliklonális GFP ellenanyag (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) 1:1000 hígítását alkalmaztuk. Negatív kontrollként lentivírus-GFP oldattal nem kezelt retina pigmenthám sejttenyészeteket használtunk.

26

5. Eredmények 5.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában OCT segítségével Az átlagos legjobb korrigált látóélesség a vizsgált Stargardt betegcsoportban 0,16 volt (0,08-0,63) míg az egészséges kontroll csoportban 1,0. Minden beteg elülső szegentuma ép volt. A szemfenéki elváltozások az alábbi megoszlást mutatták: •

Fischman I.: 3 beteg

•

Fischman II.: 21 beteg

•

Fischman III.: 11 beteg

Fischman III. csoportba tartozó betegek látóélessége volt a legrosszabb, hasonlóan a korábbi vizsgálatokhoz. A STGD-ás betegek foveolája nagyfokban elvékonyodott (71,86±32,85 μm) az egészséges személyekhez képest (161,26±15,90 μm; p<0,001). A macula térfogat szintén szignifikáns módon csökkent a betegcsoportban a kontrollokhoz viszonyítva (169±0,32 mm3 vs. 2.45±0,13 mm3; p< 0,001). Egy 25 éves egészséges kontroll személy macula OCT vizsgálatának eredményét mutatja a 4. ábra, amelyen látható, hogy sem a neuroretina sem a pigmenthám nem mutat kóros eltérést. A foveoláris vastagság 186 μm, a macula térfogat 2,66 mm3.

4. ábra 25 éves egészséges kontrollszemély macula luteájának OCT felvétele (Hargitai et al. 2005) 27

A 5. ábra egy szintén 25 éves, de STGD-beteg maculájának OCT képét mutatja. Látható, hogy a foveoláris behúzottság kiszélesedett. A legjobb korrigált látóélesség 0,63, foveoláris vastagság 81 μm, macula térfogat 1,94 mm3.

5. ábra 25 éves STGD-beteg bal macula luteájának OCT felvétele (21. beteg) A zöld nyíl a kiszélesedett foveoláris behúzottságra és az elvékonyodott neuroretinára mutat. (Hargitai et al. 2005) Egy 28 éves STGD-ában szenvedő beteg macula OCT lelete látható a 6. ábrán. Az érintett szem látóélessége 0,25. A fovea területének elvékonyodása és a behúzottság jelentős kiszélesedése ábrázolódik (zöld nyíl). A foveola vastagsága 49 μm, a macula térfogata 1,83 mm3 .

6. ábra 28 éves STGD-beteg jobb macula luteájának OCT képe (18. beteg) (Hargitai et al. 2005)

28

A 7. ábra egy 15 éves beteg OCT eredményét szemlélteti. A bemutatott szem legjobb korrigált látóélessége 0,1. Az előző beteghez képest a fovea további elvékonyodása és kimélyülése figyelhető meg (zöld nyíl). A foveola vastagsága 38 μm, a macula térfogat 1,3 mm3.

7. ábra 15 éves STGD-beteg jobb macula luteájának OCT képe (28. beteg). (Hargitai et al. 2005)

29

A betegcsoport vizsgálati eredményeit az II. táblázat foglalja össze.

Beteg 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Kor (év) 18 27 29 42 22 17 28 37 32 55 15 15 27 37 20 28 27 28 31 15 25 18 34 52 37 18 24 15 31 28 28 32 27 36 19

Nem M F F F F F M M M F F M M F F M M M F F F M F F M F F M M M F M F F F

Betegség fenállása (év) 10 15 8 14 5 2 13 15 7 17 3 6 2 9 5 14 5 12 11 5 2 9 9 14 22 11 7 7 14 6 11 15 4 8 6

Látóéleség Látóélesség Fenotípus (jobb szem) (bal szem) (Fischmann) 0.42 0.50 I 0.06 0.08 III 0.17 0.17 II 0.10 0.10 III 0.20 0.33 II 1.00 0.71 II 0.10 0.06 III 0.10 0.10 II 0.08 0.08 II 0.25 0.56 I 0.25 0.33 II 0.20 0.20 III 0.38 0.33 I 0.12 0.16 II 0.30 0.20 III 0.32 0.08 II 0.10 0.10 III 0.25 0.10 III 0.10 0.13 II 0.10 0.10 II 0.20 0.62 II 0.08 0.10 II 0.16 0.16 III 0.16 0.16 II 0.10 0.12 III 0.20 0.25 II 0.18 0.18 II 0.10 0.16 III 0.10 0.10 II 0.33 0.56 II 0.08 0.10 II 0.20 0.20 II 0.25 0.20 II 0.12 0.10 II 0.10 0.10 III

MV bal FT jobb FT bal szem MV jobb 3 3 szem (µm) (µm) szem (mm ) szem (mm ) 90.00 76.00 1,7 1,67 43.00 58.00 1,27 1,28 54.00 20.00 1,38 1,35 91.00 71.00 1,6 1,59 28.00 77.00 1,64 1,68 156.00 141.00 2,55 2,6 71.00 92.00 1,61 1,61 87.00 97.00 1,95 1,95 51.00 32.00 1,59 1,66 160.00 170.00 1,72 1,82 67.00 68.00 1,78 1,76 107.00 117.00 1,93 1,92 56.00 86.00 2,01 1,97 92.00 46.00 1,55 1,59 49.00 34.00 1,43 1,53 52.00 60.00 1,46 1,52 97.00 92.00 1,76 1,71 49.00 46.00 1,83 1,86 67.00 72.00 1,55 1,49 28.00 34.00 1,63 1,65 94.00 81.00 1,92 1,94 63.00 72.00 1,4 1,43 16.00 23.00 1,31 1,56 122.00 113.00 1,9 1,99 40.00 40.00 1,41 1,42 59.00 72.00 1,42 1,47 83.00 100.00 1,72 1,77 38.00 46.00 1,3 1,41 41.00 44.00 1,95 1,96 91.00 129.00 1,98 2,04 55.00 63.00 1,52 1,59 92.00 86.00 1,8 1,75 66.00 75.00 1,72 1,76 58.00 69.00 1,59 1,56 62.00 53.00 1,67 1,65

Allél 1 Allél 2 ND ND L541P/A1038V ND 5917delG 5917delG ND ND V2050L ND ND ND IVS40+5G>A ND L541P/A1038V G1961E 106delT G1961E ND ND L541P/A1038V G863A IVS40+5G>A 5917delG ND ND G1886E G1961E G1961E ND ND ND IVS40+5G>A 5917delG L541P/A1038V D1532N ND ND L541P L541P/A1038V L541P/A1038V G863A L541P/A1038V ND G1961E ND ND ND P68L L541P/A1038V ND ND L541P/A1038V G1961E IVS40+5G>A 5917delG R1108C R1108C G1961E ND ND ND L541P/A1038V G863A ND ND ND ND IVS40+5G>A IVS40+5G>A

II. táblázat F: nő; M: férfi; I,II, III: szemfenéki elváltozások értékelése Fischmann beosztása szerint; FT: foveola vastagság; MV: macula térfogat; ND: genetikai eltérést nem detektáltunk. (Hargitai 2005)

A legjobb korrigált látóélesség mind a foveoláris vastagsággal (8. ábra), mind a macula térfogattal (9. ábra) szignifikáns összefüggést (p< 0,05) mutatott a betegcsoportban (többszörös regresszió analízis). Az egyes fenotípus csoportokban a fenti értékek között hasonló összefüggést nem tudtunk kimutatni.

30

8. ábra A legjobb korrigált látóélesség és a foveoláris vastagság kapcsolata a STGD betegcsoportban. (Hargitai 2005)

9. ábra A legjobb korrigált látóélesség és a macula térfogat kapcsolata a STGD betegcsoportban. (Hargitai 2005)

31

Hasonlóan szignifikáns eltérést találtunk a vizsgált betegcsoportban a betegség fennállása és a legjobb korrigált látóélesség között (p=0,0019). A betegek életkora a tünetek észlelésekor és a legjobb korrigált látóélesség között nem volt szignifikáns összefüggés (p=0,884).

32

5.2. A maculapigment változásának vizsgálta STGD-ában SLO segítségével

Egy egészséges kontroll személy szemfenéki képét mutatja a 10. ábra.

10. ábra. Egészséges felnőtt maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D) kék fényben (A, C); infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002) A kék fénnyel készített SLO képen látható a fovea körül a koncentrikus szimmetriájú sötét terület, amely az infravörös felvételen nem figyelhető meg. A kék fényben végzett vizsgálat a fovea területét ábrázolja legsötétebben. A pigment fényelnyelésének következtében látható sötétség progresszív módon csökken, minél magasabb hullámhosszú vizsgálófényt használunk. A sötét területek az infravörös megvilágítás esetén teljesen eltűnnek. Ezek alapján arra következtetünk, hogy ezt a koncentrikusan elhelyezkedő sötét reflexet, amely legjobban kék fénnyel látható és az infravörös fény számára áttetsző, túlnyomóan a maculapigment okozza. Ez a pigment indirekt biomikroszkópiával a fehér megvilágítás mellett sárgának, míg kék megvilágítás mellett sötét színűnek tűnik.

33

54 éves STGD-ás nőbeteg szemfenéki képét mutatjuk a 11. ábra.

11.ábra. 54 éves Stargardt-beteg (3. beteg) normál mennyiségű pigmentet tartalmazó maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D); kék fényben (A, C); infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002)

A kék fénnyel végzett vizsgálat a jobb szemen az előbbiekben leírt normál viszonyokat találta, azonban a bal foveola körül világos foltokat mutatott. Az infravörös fénnyel történt vizsgálat mindkét szemen a fény nagyfokú elnyelődését mutatta, amely alapján a retina pigmenthámjának károsodása volt valószínűsíthető. Ennek az elnyelődésnek a maximuma a foveola körüli részekre esett, magát a foveolát nem érintette. Ezek alapján feltételezhető, hogy ezen betegen a maculapigment mennyisége a foveolában normális volt, amivel összhangban van a beteg látóélességének kisfokú csökkenése (Vod: 0,625; Vosin: 0,5).

34

Egy 47 éves STGD-ás férfibeteg szemfenéki képét mutatja a 12. ábra.

12. ábra. 47 éves Stargardt-beteg (7. beteg) csökkent mennyiségű pigmentet tartalmazó maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D); kék fényben (A, C); infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002)

A kék fénnyel történt vizsgálat több eltérést is mutat: a fovea területében nagy világos folt látható, amely a pigmenthám atrófiájának felel meg, míg paracentálisan sötét pigment figyelhető meg. Az infravörös ábrán a macula pigmenthámjának károsodása látható (sötét területek), de a fovea paracentrális területében a sötét pigment nem látható, amely alapján arra következtethetünk, hogy a kék fényben látott sötét pigment a macula normál pigmenttartalmának felelt meg a fovea területében. A látóélesség a jobb szemen 0,4 a bal szemen 0,5. Ebben az esetben a maculapigment mennyiségét csökkentnek ítéltük.

35

Egy 30 éves nőbeteg SLO eredményeit mutatja a 13. ábra.

13. ábra 30 éves Stargardt beteg (13. beteg) a maculapigment teljes hiányát mutató maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D); kék fényben (A, C); infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002) A pigment hiánya mutatható ki kék megvilágításban. A fovea területében továbbra is látható egy sötéten pigmentált rész, azonban ez hasonló képet ad az infravörös megvilágítás mellett is. Ezek alapján valószínűsíthető, hogy ez a struktúra nem a maculapigmentnek felel meg. Ebben az esetben a maculapigment teljes hiánya áll fenn, a beteg látóélessége mindkét szemen 0,1.

36

Végül egy 29 éves nőbeteg maculái láthatóak a 14. ábrán.

14. ábra 29 éves Stargardt-beteg (12. beteg) a maculapigment teljes hiányát mutató maculáinak SLO képei: jobb szem (A, B); bal szem (C, D); kék fényben (A, C); infravörös megvilágításban (B, D). (Zhang X. et al. 2002) Mindkét szemen mind a kék fénnyel, mind az infravörös fénnyel történő vizsgálat hasonlóan kifejezett eltéréseket mutat a fovea területében. A kék fény alkalmzásakor egyik szemen sem volt megfigyelhető a maculapigmentre jellemző kép, ami annak teljes hiányára utal.

37

A III. táblázat tartalmazza vizsgált betegcsoport eredményeit.

Beteg 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Kor (év) 33 36 54 11 33 12 47 53 29 43 32 29 30 63 36 41

Nem N N N F N N F F N F N N N N F N

Látóélesség Látóélesség Maculapigment (jobb szem) (bal szem) (jobb szem) 0.67 0.38 + 1 0.5 + 0.625 0.5 + 0.8 1 + 0.67 0.4 +0.5 0.2 +0.4 0.5 +0.1 1 +0.1 0.1 +0.005 0.005 0.1 0.1 0.005 0.005 0.1 0.1 0.1 0.1 0.07 0.1 0.005 0.005 -

Maculapigment (bal szem) + + + + + +++++-

Exon

42 20 30 17 14 26 17 19 23 5 42 13 12

Allél 1 ND ND G1961E NS V989A C1490Y G863A/R943Q W663X 3819insT G863A/R943Q N965S R1129H R152Q G1961E Q636H L514P/A1038V

Exon

42 40

45 42

Allél 2 ND ND G1061E NS ND GIVS+5A R2077W ND ND ND ND ND ND ND G1961E ND

III. táblázat N: nő; F: férfi; +: Normál mennyiségű pigment a foveában; +-: csökkent mennyiségű pigment a foveában; -: a maculapigment teljes hiánya a foveában; ND: eltérést nem detektáltunk; NS: vérminta nem állt rendelkezésre. (Zhang X. 2002) A 15. ábra a 16 vizsgált Stargardt macula-dystrophiás beteg 32 szemének látóélességét hasonlítja össze a fovea területében megfigyelhető maculapigment mennyiségével.

15. ábra Stargardt-betegség: látóélesség, életkor, maculapigment. (Zhang X. et al. 2002)

38

Azokban a szemekben, amelyekben normál mennyiségű maculapigment igazolódott, a látóélesség 0,5 vagy a fölött volt két szem kivételével. Azokban az esetekben, ahol a maculapigment teljes hiánya volt megfigyelhető, a látóélesség 0,1 vagy annál rosszabb volt. Csökkent mennyiségű maculapigment esetén a látóélesség a két előbbi csoport között helyezkedett el két szem kivételével (8. beteg). A látóélesség és a pigmenttartalom összefüggését vizsgálva a Chi-négyzet teszttel szignifikáns kapcsolatot mutattunk ki (p<0.001).

5.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával A betegség kialakulásához kapcsolt mutációt 23 betegen sikerült kimutatni (65,7%). 48,5 százalékban mindkét allél mutálódott, míg 17 százalékban csak az egyik allélban találtunk eltérést. A leggyakrabban talált ABCA4 mutáció a magyar Stargardtbetegcsoportban a L541P/A1038V komplex allél volt, amely az esetek 14,3 százalékában volt megfigyelhető (a vizsgált betegek 28%-ában fordult elő legalább az egyik allél esetén a hiba). Egyéb gyakori eltérések közé tartozott a G1961E mutáció (10%), az IVS40+5G→A „splice site variant” (10%) és az 5917del G nonszensz mutáció (7%). Több egymással rokoni kapcsolatban álló betegen az IVS40+5G→A és 5917delG compound heterozigóta mutáció volt kimutatható. Érdekessége ezeknek az eseteknek, hogy jelentős részük roma származású volt. A fenti mutáció és néhány egyéb allél magas előfordulási aránya valószínűsíti, hogy a mutáció közös felmenőtől öröklődött. Mind az öt betegen, akik vagy homozigóta vagy compound heterozigóta formában hordozták az IVS40+5G→A mutációt, a szemfenéki kép alapján a Fischman III. csoportba tartozott. Minden esetben kifejezett eltérések voltak a macula területében. A látóélesség a teljes STGD betegcsoport átlagértékéhez képest rosszabb (0,12 vs. 0,21) volt. Amennyiben ehhez a mutációhoz az 5917delG eltérés kapcsolódott, a fenotípus eltérése sokkal kifejezettebb volt. 39

Az L541P/A1038V komplex allélt hordozó betegek fenotípusukat tekintve két csoportba voltak sorolhatóak: 70% Fischman II. (7/10) és 30% Fischman III. (3/10). Ez a mérsékelt fokú fenotípus eltérés, valószínűsíthetően a csökkent, de nem teljesen kioltott ATP-áz aktivitásnak volt köszönhető (Sun et al. 2000). A három Fischman III. fenotípusú betegen, ez a súlyosabb eltérés nem volt összefüggésbe hozható sem egy társmutációval, sem a betegség korai kezdetével, vagy a betegség fennállásának idejével. A tíz beteg közül a Fischman III. csoportba tartozó betegek látóélessége, macula térfogata, foveoláris vastagsága kifejezettebben csökkent, mint a Fischman II. csoportba tartózóké. A L541P/A1038V és G863A compound heterozigóta genotípusú beteg alcsoportban a betegség fennállása és a látóélesség csökkenése között összefüggés volt megfigyelhető. A G1961E compound heterozygota betegek (n=7) a Fischman II. és Fischman III. csoportba voltak sorolhatóak.

L541P/A1038V

IVS40+5G→A

G1961E

5917delG

Fischman I.

0

0

0

0

Fischman II.

7

0

5

1

Fischmann III.

3

5

2

3

IV. táblázat. A legyakrabban előforduló mutációk és a fenotípus (Fishman) összefüggése.

5.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között

5.4.1. In vitro transzdukció A GFP fluoreszcencia a lentivírusnak a tápoldatba juttatását követően 36-60 órával volt megfigyelhető. Amennyiben az alkalmazott vírus koncentráció 109 IU/ml volt, a fluoreszkáló sejtek aránya elérte a száz százalékot. A fluoreszcencia erőssége nagy

40

különbségeket mutatott a sejtek között. Az 16.A ábra nyugalomban lévő pigmenthámsejteket mutat a szövetdarab közepén fehér fénnyel megvilágítva. A 16.B ábra ugyanezen sejtek fluoreszenciáját mutatja, ahol a sejtek nagy része expresszálja a GFP fehérjét. Az 16.C ábra egy másodlagos sejtkultúrát mutat, amelyben a sejtek már többszörös osztódáson mentek keresztül. A sejtek nagy része ebben az esetben is fluoreszkál, és a fénymikroszkópos morfológia alapján a GFP fehérje termelése a sejteket nem károsította. A pigmenthám tenyészeteket három hónapon keresztül fent lehetett tartani, látható károsodás nélkül. Ez idő alatt a fluoreszcencia mértékében változás nem volt megfigyelhető. Immunhisztokémiai vizsgálattal a GFP fehérje jelenléte kimutatható volt.

16. ábra A: az elsődleges humán fötális pigmenthám sejtkultúra fénymikroszkópos képe; B: az elsődleges humán fötális pigmenthám sejtkultúra fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálva, transzdukciót követően; C: másodlagos pigmenthám sejtkultúra fluoreszcens mikroszkópos képe. (Doi et al. 2002)

41

5.4.2. In vivo transzdukció A lentivírus-vektornak a szubretinális térbe történő juttatását követően három napon belül minden esetben megfigyelhető volt a GFP expresszálódása. Az 17.A ábran látható a szubretinális injekció helye négy nappal az injekciót követően, amely a környező retina területeknél nagyobb reflektivitású. Az injekció okozta ideghártya leválás széle jól látható. Ugyanennek a területnek a zöld filterrel történő vizsgálata során nagyfokú GFP fluoreszcencia figyelhető meg (17.B ábra). Az injekció beadása után két héttel a vizsgált terület jelentősen megváltozott. A leválás helyén nagy pigmentrögök és atrófiás területek váltják egymást, és a fluoreszcencia teljesen megszűnt. (17.C-D ábra)

17. ábra A nyúl-ideghártya kezelt részének SLO felvétele. A: kék fényben készült felvételen a leválásnak megfelelő körülbelül 1,5 milliméteres terület látható négy nappal az injekció adását követően; B: fluoreszcens módban láthatóak az önállóan fluoreszkáló pigmenthám sejtek és sejtcsoportok négy nappal az injekció adását követően; C: a pigmenthám károsodása látható kék fényben az injekciót követően 15 nappal; D: a fluoreszcencia megszűnik az injekciót követően 15 nappal. (Doi et al.2002)

42

Az 18. ábra egy másik példát mutat a GFP fluoreszcencia megjelenésére, majd eltűnésére.

18. ábra A: kék fényben látható az ideghártya leválásának halvány határa öt nappal az injekció beadását követően, a kép felső szélén láthatóak a myelinizált látóidegrostok; B: a fluoreszcens üzemmódban különálló fluoreszkáló sejtek láthatóak; C: kék fényben látható a pigmenthám torzulása 21 nappal az injekció beadását követően; D: a fluoreszcencia megszűnt 21 nap után. D/1: a nyúl ideghártyájának szövettani feldolgozása. A nyilak az egymásra rétegződött pigmenthámsejteket mutatják, amelyek az in vivo SLO felvételeken sötét pigmentrögökként jelennek meg. A két pigmentrög között csökkent pigmenttartalmú terület az SLO képen a halvány területtel azonos. (Doi et al. 2002) 43

Öt nappal az injekció beadását követően az ideghártya-leválás szélét egy halvány vonal jelzi, a retina szerkezete egyebekben épnek tűnik. Ebben az időpontban a pigmenthámsejtek méretével azonos nagyságú fluoreszkáló pontok figyelhetőek meg. Három héttel az injekció adását követően ugyanennek a területnek a kifejezett károsodása figyelhető meg, párhuzamosan a fluoreszcencia eltűnésével. Annak eldöntésére, hogy a vírus-vektor vagy a GFP fehérje felelős-e az ideghártya károsodásáért, olyan, magas koncentrációjú lentivírus (109 IU/ml) oldatot juttattunk a szubretinális térbe, amely nem tartalmazta a GFP gént. (19. ábra)

19. ábra Két nyúl kék fényben készült SLO retina képei láthatóak 5 nappal (A, C) és 21 nappal (B, D) a GFP gént nem tartalmazó lentivírus injekció adását követően. Pigmenthám károsodás nem figyelhető meg. (Doi et al. 2002)

Ebben az esetben ideghártya károsodás nem volt megfigyelhető sem az SLO vizsgálat, sem a későbbi szövettani feldolgozás során. Abban az esetben, ha a vírusvektor expesszálódását a CMV promoter helyett a rodopszin promoter irányította, csak gyenge fluoreszcencia alakult ki, azonban a kilökődési reakció elmaradt.

44

Amikor az eredeti vírusvektort az üvegtesti térbe juttattuk, fluoreszcencia nem alakult ki. Az ideghártyák szövettani feldolgozása során a kilökődési reakciót követően az érintett területeknek megfelelően monocyták beáramlása és a pigmenthám súlyos torzulása volt megfigyelhető, amely immunrejekcióra jellemző. A GFP fluoreszcencia mértékét az SLO kép alapján 3 csoportba osztottuk. Az 20.a ábra a bejuttatott vírus koncentrációjának és a fluoreszcencia mértéknek, valamint az utóbbi megjelenésének és megszűnésének összefüggését mutatja. A legmagasabb koncentrációjú vírusoldatok (109 IU/ml) gyorsan megjelenő, kifejezett, azonban három héten belül megszűnő fluoreszcenciát okoztak.

45

20. ábra (Doi et al. 2002) Alacsonyabb koncentrációjú oldatok (107-108 IU/ml) esetén a fluoreszcencia mértéke kisebb volt, ám a kilökődés is később jelentkezett. Két nyúlon a fluoreszkálás két hónapon keresztül követhető volt. Alacsonyabb

koncentrációjú

oldatok

alkalmazásakor

fluoreszcencia

nem volt

megfigyelhető. Hasonlóan vizsgáltuk az ideghártya károsodásának mértékét a víruskoncentráció függvényében. (20.b ábra)

46

Magasabb koncentráció esetén a vizsgált retinaterület kifejezett károsodása volt megfigyelhető. A legalacsonyabb koncentrációjú oldatok (106 IU/ml) nem okoztak ideghártya károsodást.

5.5. A GFP fehérje által okozott immunválasz áthidalására alkalmas módszerek vizsgálata Az 21. ábrán a vizsgált ideghártya terület kék fényű és fluoreszcens módú vizsgálata látszik az injekció adását követően különböző időpontokban.

21. ábra (Doi et al. 2004) 47

14 nappal az injekciót követően a behatolás helye a látóidegrostok alatt látható halvány foltként. (21.a) A GFP fluoreszcencia a terület felső harmadában és az ideghártya leválás széli részein figyelhető meg. (21.b) 17 nappal az injekciót követően a kezelt területnek megfelelően kifejezett ödéma látható, és a fluoreszcencia megszűnik. (21.c-d) 20 nappal a műtét után a pigmenthám dezorganizációja látható, amely a kilökődés karakterisztikus

jele.

A

sötét

foltok

az

egymásra

rétegződő,

migráló

pigmenthámsejteknek felelnek meg. (21.e-f) Mind az öt nyúl esetében, ahol immunszuppressziót nem alkalmaztunk, hasonló kép volt megfigyelhető két-három héttel az injekció adását követően. Az

immunszupresszióban

részesült

kísérleti

nyúlak

egyikén

sem

voltak

megfigyelhetőek a kilöködés jelei, és az EGFP gén folyamatos expresszálódása volt kimutatható. Az 22. ábrán az egyik ilyen immunszuppresszióban részesült nyúl kezelt retinája látható a 32., 53., 60. és a 73. napon. A kék fénnyel történt megvilágítás során közel normális morfológiájú ideghártya figyelhető meg, míg a fluoreszcens képeken látható, hogy az expesszió a vizsgálat végéig fennállt.

48

22. ábra (Doi et al. 2004)

49

Az 23. ábrán egy másik immunszupprimált nyúl retinájának részlete látható fluoreszcens üzemmódban egy (23.a), három (23.b), hat (23.c) és tizenkét (23.d) hónappal az injekció után.

23. ábra (Doi et al. 2004) Jól látható, hogy a fluoreszcencia változatlan maradt a vizsgált időszakban. A fluoreszkáló

pontok

nagysága

hasonló,

méretük

megegyezik

egy

átlagos

pigmenthámsejt méretével, a fluoreszcencia erőssége a génexpresszió mértékével arányos.

50

Az 24. ábrán a vizsgált immunszupprimált és ilyen kezelésben nem részesült nyulakon megfigyelhető fluoreszcencia átlagos mértéke látható az idő függvényében.

24. ábra (Doi et al. 2004) A realtív GFP fluoreszcencia mértéke (üres gyűrű: immunszuppresszióban részesült nyulak; tele gyűrű: immunszuppresszióban nem részesült nyulak). Látható, hogy a nem immunszupprimált nyulakon az első két hétben erős fluoreszcencia jelentkezik, amely ezt követően – a kilökődési reakcióval – párhuzamosan teljesen megszűnik. Mind a négy nyúlon, melyek egy hónapon keresztül immunszuppresszív kezelésben részesültek, több hónapon keresztül tartó nagy intenzitású fluoreszcencia volt megfigyelhető. Az egyik immunszupprimált nyúl két és fél hónappal az első vírusinjekciót követően újabb injekciót kapott a másik szemébe, ezúttal az immunrendszer modulálása nélkül. Az injekció után hasonlóan erős GFP expersszió volt megfigyelhető ezen a szemen is, azonban két hét elteltével a fluoreszcencia megszűnt mindkét szemen, amelyet a már ismertetett kilökődési reakció jelei kísértek.

51

Az 25. ábra a vérben kimutatható EGFP ellenanyag mennyiségét mutatja immunszupprimált és nem immunszupprimált nyulakon.

25. ábra (Doi et al. 2004) ELISA módszerrel meghatározott GFP-antitest mennyisége a vérben az injekció adását követően. Az üres gyűrűk mutatják a nem immunszupprimált nyúl antitest mennyiségét, a nyíl a második injekció beadásának időponját. Két immunszupprimált nyúl vérében talált antitest mennység alakulását mutatják a tele gyűrűk. Mindhárom nyúl a 0. napon kapta az első szubretinális vírusinjekciót.

A kezelt nyulak vérében az ellenanyag nem volt kimutatható. A kezeletlen nyúlon az ellenanyag az ötödik napon volt először kimutatható, majd mennyisége a tizenkettedik napon tetőzött, amely időpontban a kilökődési reakció jelei megjelentek. A kilökődést követően az ellenanyag mennyisége lecsökkent és csak a másik szembe beadott vírusinjekció után emelkedett meg ismét. A szemek szövettani feldolgozása során az előzőekben már leírt kilökődési reakció jelei voltak láthatóak. Az immunszuprimált nyulakon hasonló elváltozások nem alakultak ki.

52

6. Megbeszélés 6.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában OCT segítségével Tanulmányunkban a foveola vastagsága és a macula térfogata kivétel nélkül csökkent minden STGD-ás betegen a kontrollokhoz viszonyítva. Ezek alapján elmondható, hogy a szemfenéki képeket a retina elvékonyodása és térfogatának nagyfokú csökkenése jellemzi. Vizsgálatainkkal párhuzamosan, hasonló eredményeket közöltek más munkacsoportok is (Sodi et al. 2003; Ergun et al. 2005). A látóélesség minden szemen nagyfokban csökkent a betegség fennállásától és az életkortól függetlenül. A látóélességet – mint a funkciót jelző szubjektív paramétert – összehasonlítottuk a retina két morfológiai jellemzőjével, a foveoláris vastagsággal és a macula térfogattal STGD-ában szenvedő betegeken. Vizsgálataink alapján a betegek legjobb korrigált látóélessége és macula térfogata között lineáris összefüggés volt kimutatható. Hasonló összefüggést találtunk a visus és a foveoláris vastagság között. STGD-ában a retina degeneráció alapvető következménye a lipofuszcin felhalmozódása a retina pigmenthámjában (Holz et al. 2001). A lipofuszcin felhalmozódását eddigi ismereteink szerint az ABCR transzportfehérje hibás vagy hiányos működése okozza, amely a retinális zsírsavanyagcserében és/vagy a fotoreceptorok E-vitamin felvételében játszik fontos szerepet. Ezek alapján a lipofuszcin lerakódását a pigmenthámban, majd a betgség végstádiumában a látóélesség nagyokú csökkenésével járó macula atrófiát a következő tényezők okozhatják: 1. felgyorsult fotoreceptor pusztulás, 2. a fotoreceptorok külső tagjának fokozott fagocitózisa, 3. olyan fotoreceptor részletek felhalmozódása, amelyeket a pigmenthám nem tud lebontani, 4. a lebontó enzimek mennyiségének vagy funkciójának csökkent volta, 5. a pigmenthám működészavara, amely a lipofuszcin citoplazmából történő kiválasztását nem teszi lehetővé.

53

A tünetek jelentkezésének ideje (életkor), a betegségtartam és a látásromlás között eddig egyértelmű összefüggést nem sikerült kimutatni (Fischman et al. 1999). A progressziót valószínűleg az határozza meg, hogy az ABCR gén mely régióját érintette a genetikai hiba. Az eddig megismert mutációk közül, az N-terminális kódoló régióinak hibája esetén figyelték meg a betegség gyorsabb kialakulását és súlyosabb progresszióját (Lewis et al. 1999; Heckenlively et al.2001). A macula térfogat csökkenése vizsgálataink alapján a látásvesztés mértékével mutatott összefüggést. A fovea, és azon belül a foveola pusztulása – ahol a csapok sűrűsége jóval nagyobb, mint a retina egyéb területein – jól magyarázza az általunk tapasztalt látóélesség csökkenést. A foveola sejtjeinek pusztulásával a fixáció helye egyre inkább a macula periférás részei felé tolódik, ahol a retina felépítése – a csapok sűrűségének nagyfokú csökkenése – nem teszi lehetővé a finom, kontrasztos látást. Betegeinkben közel hasonló macula térfogat esetén gyakran különböző látóélességet találtunk. Ennek okai következők lehetnek: 1.

a macula térfogatának csökkenése a fovea olyan centrális részét érintette, amely az éleslátáshoz nagyobb részben járul hozzá;

2.

az OCT-val mért térfogat nem minden esetben tartalmaz működő sejteket, de ezeknek a sejteknek a térfogata többé-kevésbé még megegyezik az egészségesekével.

A macula térfogat csökkenését az OCT vizsgálat szerint a retina diffúz, minden rétegére kiterjedő pusztulása okozza. Eszerint minél nagyobb a térfogatveszteség, annál több csap elvesztésével jár a betegség, így csökkentve a látóélességet. A funduskép és a látóélesség között nem tudtunk szoros összefüggést kimutatni. Néhány esetben kifejezetten atrófiás szemfenéki kép mellett jobb látóélességet találtunk, mint enyhébb szemfenéki elváltozások esetén. Ezt a jelenséget azzal tudjuk magyarázni, hogy ha a retinasorvadás fiatalabb életkorban alakult ki, a beteg még képes egy jobb látóélességgel járó excentrikus fixáció megtanulására, de ha az elváltozások serdülőkor után jelentkeznek, ez a mechanizmus már nem tud érvényesülni. A Stargardt betegség a lassan progrediáló, az orvostudomány mai állása szerint a nem gyógyítható öröklött macula-dystrophiák közé tartozik. Gyógyítására a jövőben a genetikai információ átvitelén vagy a szövetátültetésen alapuló terápia látszik a

54

legvalószínűbbnek. Minden olyan új adat, amely a betegség progressziójára vonatkozik, komoly segítséget nyújthat majd a terápiára alkalmas betegek kiválasztásában. 6.2. A maculapigment változásának vizsgálta STGD-ában SLO segítségével Vizsgálatunkban a maculapigment jelenlétének vagy hiányának kimutatására egy kvalitatív módszert alkalmaztunk, az SLO két lézeres fényforrásának felhasználásával. Ez a módszer más vizsgálók megfigyelése alapján is hatékonyabb eljárás a maculapigment kimutatására, mint a reflexiós denzitometria (Berendschot et al. 2000). Eredményeink arra utalnak, hogy a kék és az infravörös képek összehasonlításával kaphatjuk a legpontosabb eredményeket. A maculapigment csak a kék fényt nyeli el szinte teljesen. A kék és az infravörös fénnyel történő vizsgálatok eredményét összehasonlítva következtethetünk a maculapigment jelenlétére, részleges jelenlétére vagy teljes hiányára. A maculapigmentnek nemcsak a fényelnyelési tulajdonsága egyedi, hanem a foveában megfigyelhető körkörös elhelyezkedése is. Ezért a pigment mennyiségének megítélését nemcsak a kék fény elnyelésének mértéke, hanem a kapott kép geometriája is segítette. Normális mennyiségű maculapigmentnek azt tekintetük, ha kék fényben a fovea közepén egy körkörös elhelyezkedésű sötét gyűrű volt megfigyelhető, amely az infravörös fény számára áttetsző volt. Miután egyéb pigmentekre nem jellemző egy ennyire egyedi elrendeződés, az álnegatív eredmény gyakorlatilag kizárhatóvá vált. A maculapigmentet csökkent mennyiségűnek ítéltük, ha a pigment szimmetrikus elrendeződése megváltozott, vagy a normál állapothoz hasonló reflektivitás mellett a pigment körkörös elrendeződése hiányzott. A maculapigment teljes hiányát azokban az esetekben állapítottuk meg, amelyekben a kék fényben történő vizsgálattal nem volt kimutatható a sötét pigment, vagy a pigment kimutatható volt, de hasonló képet kaptunk infravörös fényforrás használatakor is, és emellett

a

leírt

normál

szimmetrikus

elhelyezkedés

is

megbomlott.

A

hiperpigmentációért valószínüleg a melanin jelenléte volt a felelős, amelyben az összes vizsgált fény elnyelődik, az infravörös fényt is beleértve. Ezek a pigmentált területek betegeinken is a Stargardt betegségben jellemző lipofuszcin lerakódásnak felelhettek meg (Lois et al. 2001). Előfordulhatott olyan eset is, amelyben még jelen volt a maculapigment, de azt az előzőekben ismertetett hiperpigmentció elfedte. 55

Vizsgálataink alapján a látóélesség és a maculapigment mennyisége között szoros összefüggés volt kimutatható. Amennyiben a látóélesség 0,1 vagy annál rosszabb volt, minden esetben a maculapigment kifejezett csökkenését vagy teljes hiányát találtuk. 0,4-nél jobb látóélesség esetén a maculapigment jelenléte mindig kimutatható volt. Ezek alapján arra következtethetünk, hogy a maculapigment mennyisége kapcsolatba hozható a fovea csapjainak működésével. A maculapigment jelenléte a fovea normál morfológiájának egyik jellemzője, utal a csapok jelenlétére és azok egészséges működésére. Érdekesnek tartjuk, hogy korai Stargardt betegségben, ahol kék fény mellett a maculapigment eloszlása normális volt, az infravörös fény már kifejezett eltéréseket mutatott. Az infravörös fényt leginkább a retina pigmenthámja nyeli el, illetve veri vissza, a neuroretina rétegein azonban kifejezett gyengülés nélkül halad át. A betegség korai szakaszában a pigmenthámban figyelhetőek meg az első károsodások. Mivel a kék fény jelentős része elnyelődik a neuroretina elemeiben, ilyen hullámhosszú fény használatakor a pigmenthám szintjén bekövetkező változások rejtve maradhatnak. Ugyancsak leírták, hogy az infravörös fény alkalmas lehet retina pigmenthám károsodásainak kimutatásában (Manivannan et al. 1995; Elsner et al. 1996). Ezek az eredmények értékesek lehetnek a betegség gyógyítási stratégiájában. Amennyiben a csapok súlyosan károsodtak, vagy elpusztultak, csak a sejt- vagy szövetátültetés illetve protézis beültetése segíthet a betegeken. Azokban az esetekben ahol a csapsejtek működőképességét jelező maculapigment jelen van, szóba jöhet a terápiás transzgén vektor segítségével történő bejuttatása. Így a genetikai hibát csökkentve vagy megszüntetve szinten tartható vagy visszaállítható az éleslátás. A maculapigment mennyiség és a csapfunkció (látóélesség) összehasonlításával a foveát érintő más betegségek (időskori macula degeneráció, maculalyuk) esetén is értékes adatokat nyerhetünk. A maculalyukak esetében, ahol a vitreoretinális trakció megszűn(tet)ését a látóélesség javulása is kísérheti, ez kifejezetten fontos lehet. Összefoglalva: Vizsgálatunkban a neuroretina és a pigmenthám progresszív károsodását mutattuk ki Stargardt betegségben. Ez a károsodás a maculapigmentet tartalmazó struktúrákat, a csapokat, a pálcikákat és a Müller sejteket érinti.

56

6.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával A betegség kialakulásához kapcsolt mutációt 23 betegen sikerült kimutatni (65,7%). 48,5 százalékban mindkét allél mutálódott, míg 17 százalékban csak az egyik allélban találtunk eltérést. Vizsgálataink alapján az alábbi következtetéseket vonhatjuk le: 1. Bár a G1961E mutációt hordozó betegek mind a Fischman II. és III. csoportba tartoztak, a betegség progressziója – a maculatérfogat vesztése – ebben a csoportban volt a leglassabb. Ezek alapján arra következtetünk, hogy a G1961E mutációt hordozó STGD-ás betegek prognózisa az átlag betegcsoporthoz képest jobb. Ezt a feltételezést két korábbi tanulmány is alátámasztja (Fischmann et al. ; Gerth et al. 2002), amelyek leírták, hogy a G1961E mutáció nagyfokban csökkenti az ATP-áz enzim aktivitását, de az még mindig közel azonos az egészséges enzim működésével (Sun et al. 2000). 2. Azok a betegek, akik a L541P/A1038V komplex allélt hordozzák, a betegcsoport átlagához hasonló, mérsékelt progressziót mutatnak. In vitro vizsgálatokkal kimutatták, hogy ez a komplex allél az ATP-áz aktivitást csökkenti, de nem oltja ki teljesen (Gerth et al. 2002). Az az alcsoport, amelyben a betegek a L541P/A1038V komplex allél mellett a G863A allélt is hordozták, jobb prognózisúnak bizonyult, mint a csoport átlaga. Ezt a hipotézist más tanulmányok is megerősítették (Fischman et al. 1999; Sun et al. 2000). 3. A IVS 40+5G→A allélt heterozigóta formában hordozó betegek a teljes betegcsoport átlagához képest rosszabb prognózist mutattak. Ez részben ellentmond azoknak az eredményeknek, amelyek szerint ez a mutáció a „splicing”-ot nem változtatja meg teljesen, és ezért részben működőképes ABCA4 fehérje keletkezik (Klevering et al. 1999; Rivera et al. 2000). Más tanulmányok, amelyek a betegség prognózisának meghatározására más vizsgálatokat végeztek (multifokális ERG, fundus autofluoreszcencia) csak részben támasztják alá következtetésünket (Klevering et al. 1999; Gerth et al. 2002).

Ebbe az alcsoprtba nagyrészt magyar roma származású betegek

tartoztak. Esetükben az átlag betegcsoportéhoz képest gyorsabb maculatérfogat 57

pusztulást találtunk, mely egyéb - egyelőre ismeretlen tényezők mellett feltételezésünk szerint összefüggésbe hozható azzal az eredménnyel, hogy ebben a csoportban gyakori előfordulást mutatott az IVS 40+5G→A – 5917delC compound heterozigóta mutáció. 4. Az 5917delC variánst hordozó betegeken figyeltük meg a legrosszabb prognózist. Ez a működésképtelen fehérje képződéséhez vezető „frameshift” mutáció magyarázza azt is, hogy a mutációt homozigóta formában hordozó betegek prognózisa rosszabb volt azokénál, akik egy másik allélel képzett compound heterozigóta mutációt hordoztak. A Fischman I. fenotípus csoportba tartozó betegek egyikén sem sikerült olyan mutációt kimutatni, amely jelenlegi ismereteink szerint a betegség kialakulásához vezet. Bár a betegek száma ebben a fenotípus csoportban meglehetősen alacsony (n=3), más munkacsoportok nagyobb betegszámra vonatkozó eredményei is arra utalnak, hogy a lassan progrediáló vagy késői életkorban jelentkező STGD esetén az átlagnál ritkábban mutatható ki a betegséget okozó genetikai eltérést (Fischman et al. 1999; Gerth et al. 2002). Amennyiben a téves diagnózis lehetőségét kizárjuk és elfogadjuk, hogy a betegség kialakulásához az ABCA4 gén hibája vezet, akkor a fenti esetek kialakulásáért a gén kódoló régióin kívül eső mutáció lehet felelős.

58

6.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között Az utóbbi évtizedben több kutatócsoportnak sikerült a GFP transzgént eredményesen bejuttatni a retina különböző sejtjeibe, kilökődési reakció nélkül (Miyoshi et al. 1997; Bennett et al. 1999; Takahashi et al. 1999; Auricchio et al. 2001; Surace et al. 2003). Hasonló sikeres génterápiáról számoltak be mások is a LacZ nyomjelző gén alklamazása esetén is (Galileo et al. 1999; Derksen et al. 2002; Lotery et al. 2002). Kísérleteinkben lentivírus-vektor segítségével próbáltuk a GFP transzgént bejuttatni humán pigmenthám tenyészetbe és nyulak retinájába. Azért választottuk ezeket a célszöveteket, mert a Columbia Egyetem a humán pigmenthám kutatás területén komoly tapasztalattal rendelkezik (Gouras et al. 1994) és a nyúl retinával addig még nem történt hasonló kísérlet. Választásunkat még az a tény is befolyásolta, hogy a pigmenthám allográf átültetéseinket kilökődési reakció követte, így a génterápia módszerétől reméltük a pigmenthám öröklött betegségeinek jövőbeli gyógyítását. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy a lentvírus vektor képes a GFP gén sikeres bejuttatására a retina pigmenthámsejtjeibe mind in vitro, mind in vivo körülmények között. In vitro körülmények között stabil génexpressziót figyeltünk meg, amely a sejtek osztódása

után

is

hónapokon

keresztül

folyamatosan

tartott.

Ezek

alapján

valószínűsíthető, hogy a gén kromoszómálisan integrálódik, ahogy azt más munkacsoportok is kimutatták (Naldni et al. 1996 A). Bár a génexperesszió mértékében – így a fluoreszcencia erősségében – a sejtek között különbség volt, de ugyanazon sejtben a fluoreszcencia mértéke az idő során nem változott. Az osztódó sejtekben ennek meghatározására nem volt lehetőségünk. Kísérleteinkben a lentivírus képes volt az eredeti pigmenthám lemez sejtjeinek transzdukciójára. Mivel ezek a sejtek nyugalmi állapotban vannak és az osztódásuk csak később indul el a lemez széleinél (Gouras et al. 1994), a vírusvektor alkalmas lehet más, nem osztódó (idegi eredetű) sejtekbe történő génbevitelre is. In vivo körülmények között szintén gyorsan kialakuló génátvitelt figyeltünk meg a pigmenthámsejtekben. Ebben az esetben azonban a génexpresszió nem volt folyamatos, hanem gyulladásos kilökődési reakció kíséretében néhány hét elteltével megszűnt. A kilökődési reakció kizárólag a kezelt területre korlátozódott, és a gyulladás 59

elsősorban az érhártya és a pigmenthám szintjén volt kimutatható, az üvegtestben gyulladás jeleit nem láthattuk. A szövettani vizsgálat limfociták beáramlását mutatta a fenti területen, amelyhez a fotoreceptor réteg károsodása is társult. A kilökődési reakció jól nyomonkövethető volt in vivo is; SLO szerint a leginkább karakterisztikus jel a fluoreszcencia megszűnésén kívül a pigmenthám réteg torzulása, feltöredezése volt. Eredményeinket más kutatócsoportok vizsgálatai is alátámasztják (Stripecke et al. 1999; Gambotto et al. 2000). A kilökődési reakció erőssége arányos volt a GFP gén expressziójának mértékével. Alacsony koncentrációjú vírusoldat esetén, ahol fluoreszcencia nem vagy csak igen kis mértékben volt megfigyelhető, gyulladásos reakció és következményes retinakárosodás nem alakult ki. Amennyiben olyan vírusvektort juttattunk a szubretinális térbe, amely nem tartalmazta a GFP génjét, kilökődési reakciót nem kaptunk. Ezek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy nyulakon az immunreakciót a GFP fehérje termelődése váltja ki. A reakció annak ellenére kialakult, hogy a szubretinális tér relatív immunprivilegizált helyként ismert (Gregerson et al. 1999). Egyértelmű bizonyítékot nem kaptunk arra a kérdésre, hogy a kilökődés sejtspecifikuse, és abban az esetben is kialakul-e, ha a génexpresszió a pigmenthámsejtek helyett inkább a fotoreceptrokban történik. Immunreakció nem volt kimutatható azokban az esetekben, amelyekben a vírusvektorunk a fotreceptorokba irányított integrációért felelős rodopszin promotert tartalmazta. Kilökődési reakció akkor sem fordult elő, amikor az injekciót a szubretinális tér helyett a neuroretina rétegei közé juttattuk be. Ezekben a kísérletekben sokkal gyengébb génexpresszió volt kimutatható, mint amikor a CMV promotert használtuk, és a fluoreszcencia a pigmenthámsejtekben volt megfigyelhető. A gyenge expressziót nem követte kilökődési reakció, amely alapján arra következtetünk, hogy az állat immunrendszerének felismerőképességét az idegen fehérje mennyisége határozza meg. Eredményeink több helyen is különböznek más munkacsoportok eredményeitől, akik hasonlóan, a GFP génjét hordozó vírusvektort juttatták be a szubretinális térbe. Majmokon

hosszantartó

génexpessziót

figyeltek

meg

a

fotoreceptorokban

adenoszatellita vírusvektort használva (Bennett et al. 2000). Esetükben kilökődési reakció nem volt megfigyelhető, bár a pigmenthámréteg atrófiáját kimutatták. Kísérleteikben a génexpresszió szinte kizárólagosan a fotoeceptor rétegre korlátozódott, míg saját vizsgálatunkban dominánsan a pigmenthámsejtekben volt megfigyelhető. 60

Ezek a különbségek részben a vizsgált faj, részben az alkalmazott vírusvektor miatt alakulhattak ki. Több kutatócsoport is kimutatta, hogy a pigmenthám sejtek antigén prezentáló sejtként is működnek (Silbert et al. 1994; Rezai et al. 1997; Dafgard Kopp et al. 1997; Liverisidge et al. 1998), míg a fotoreceptoroknak ilyen tulajdonsága nincsKaplan 1995

. Egy másik munkacsoport azt találta, hogy a lentivírus vektor, amely a LacZ

nyomjelző gént hordozza, képes legalább két hónapig fennálló expressziót kiváltani egér pigmenthámsejtekben a kilökődési reakció jelei nélkül (Galileo et al. 1999). Ebben az esetben azonban mind a vizsgált faj, mind a vizsgált nyomjelző fehérje különbözik a saját kísérleteinkben használtaktól. Takahashi és mtsai sikerrel végeztek kísérleteket a hibás gén bejuttatására lentivírusvektorral az rd egérben. Esetükben szintén nem alakult ki immunrejekció, de ebben a kísérletben is a transzgén a fotoreceptorokban expreszálódott (Takahashi et al. 1999). Ferrer és mtsai vizsgálataiban, Duchenne izomdystrophiában a kísérletes géntranszfer immunreakciót váltott ki a dystrophin termelődésének megindulását követően. Ebben az esetben azonban a transzgén termelődése nem egy immunprivilégizált területen történt (Ferrer et al. 2000).

6.5. A GFP fehérje által okozott immunválasz kivédésére alkalmas módszerek vizsgálata

Kimutattuk, hogy a GFP gén expressziója a nyúl pigmenthámsejtekben immunrejekciót vált ki, annak ellenére, hogy a retina immunprivilegizált helyként ismert (Gregson et al. 2003). A GFP ellenes antitestek jelenléte, és kilökődési reakció idején azok koncentrációjának tetőzése arra utalt, hogy a GFP fehérjét az immunrendszer idegen fehérjeként ismerte fel. Az, hogy a GFP az egyedüli célpontja az immunreakciónak, vagy más idegen fehérjék (pl. vírusfehérjék) is szerepet játszanak a kilökődésben, jelenleg még nem tisztázott, habár a GFP transzgént nem tartalmazó vírus nem váltott ki reakciót (Doi et al. 2000, 2001, 2002). Auricchio és mtsai lentivírus-vektor szubretinális bejuttatása esetén humorális immunválaszt, IgG2b és IgG1 antitestek megjelenését figyelték meg (Auricchio et al. 2001).

61

Immunszuppressziót alkalmazva megelőzhettük a GFP expresszió megszűnését és a következményes szöveti károsodást, amelyek alapján arra következtethetünk, hogy az

immunrendszer

felelős

az

előbbi

változásokért.

Eredményeink

alapján

valószínűsíthető, hogy bármely idegen, a pigmenthámsejtekben expresszálódó fehérjét az immunrendszer felismer, és kilökődési reakciót indít el. Azokban az esetekben, amikor a génátvitelnek célsejtje a pigmenthám, az immunrendszer befolyásolása nélkül csak

átmeneti

eredményekre

számíthatunk.

A

kilökődési

reakciót

azonban

befolyásolhatja a kísérletben alkalmazott vírusvektor. Kimutatták, hogy adenoasszociált vírusvektort alkalmazva a GFP expresszió később kezdődik, mint lentivírus esetében. Ez csökkenti az egy időben termelt idegen fehérje mennyiségét a felismerési időszakban, így a kilökődés elkerülhető lehet. Az immunszuppressziót egy hónapon keresztül alkalmazva sikerült elérnünk, hogy kifejezett génexpresszió – és következményes fluoreszcencia – mellett sem jelentkeztek a kilökődés jelei, és ez a kezelés abbahagyása után sem változott. Feltételezésünk szerint, egy új idegen fehérje csak átmenetileg vált ki immunválaszt, és ha ezt a kritikus időszakot sikerül áthidalni, kilökődési reakció már nem várható. Ennek a felismerési periódusnak a kezdete vagy a szubretinális injekció beadásának időpontja, vagy a GFP expresszió kezdete lehet. Hasonló eredményeket találtak, akik limfocitás choriomeningitis vírussal fertőztek meg egereket immunszuppresziót követően (Cole et al. 1972). Ebben az esetben cyclophosphamide egyszeri adását követően az immunreakció által előidézett agyszövetkárosodás

kivédhető

volt,

míg

azokon

az

egereken,

amelyeken

immunszuppresszió nem történt, a vírusra jellemző súlyos agykárosodás alakult ki. Ez a kísérlet is alátámasztja azt a feltevésünket, hogy létezik az előbb említett felismerési periódus, amely alatt immunszuppressziót alkalmazva elkerülhetjük a kilökődést és a szövetkárosodást. Ebben a rövid időszakban a szervezet védekező rendszere sokkal „éberebben” működik. A szubretinális injekció, amely a vírusvektor bejuttatásához szükséges, beindítja a szervezet immunválaszát, de később, ahogy a beavatkozás hatásai csökkennek, úgy az immunválasz is megszűnik. Az injekció adását kísérő enyhe gyulladásos reakció során olyan sejtek jelennek meg az injekció helyének megfelelően, amelyek képesek az antigén felismerésre. A pigmenthámsejteknek is ismert hasonló tulajdonsága, amely akkor válik kifejezetté, ha a sejteket gyulladásos cytokinek aktiválják (Liversidge et al. 1992; Silbert et al. 1994; Rezai et al. 1997; Dafgard Kopp et al. 1997). A chorioideában 62

megtalálható dendritikus sejtek is képesek a szubretinális térbe történő áramlásra valamely gyulladásos reakció következtében (Jiang et al. 1994). Ismert az is, hogy a dendritikus sejtek képesek bejutni a központi idegrendszer más immunprivilegizált helyeire is gyulladás esetén (Serafini et al. 2000). Az idő, amelyet ezek a sejtek a gyulladás helyén töltenek, meghatározhatja a felismerési periódus hosszát. A fentiek alapján a kísérleteink további pontosítást igényelnek annak érdekében, hogy a felismerési periódus hosszát jobban meg tudjuk határozni, és el tudjuk dönteni azt, hogy az általunk használt összes immunszuppressszív gyógyszer használata szükséges-e a fenti időszak áthidalásához. Ezek alapján talán azt is el lehetne dönteni, hogy a pigmenthám allograft beültetésnél észlelt kilökődési reakció kivédhető-e hasonló immuszuppressziót alkalmazva (Ye et al. 1993; Jiang et al. 1994; Algvere et al. 1999). Kísérleteinkben a génexpresszió kizárólag az injekció okozta ideghártya leválás helyére korlátozódott. Más kutatók által vizsgált egereken (Takahashi et al. 1999) és patkányokon (Miyoshi et al. 1997) lentivírus-vektort használva, az expresszió az egész retina területén megfigyelhető volt, ami azt valószínűsíti, hogy a vírusrészecskék szabadon áramoltak a szubretinális térben. Ezek a különbségek adódhatnak a fajok anatómiai sajátosságaiból, az eltérő sebészi technika vagy az ideghártya leválásának majd visszatapadásának különbözőségeiből. Ezeket a megfigyeléseket ajánlatos megfontolni a génterápia tervezésekor, annak megfelelően, hogy egy adott faj retinájának egészét, vagy csak meghatározott részét kívánjuk kezelni.

63

7. Új eredmények és klinikai jelentőségük

1.a

Elsőként írtuk le, hogy az OCT vizsgálat alkalmas lehet a Stargardt-betegség korai non-invazív diagnosztizálására és annak nyomonkövetésére.

1.b

A

morfológiai

vizsgálatok

paraméterei

alapján

a

beteg

látóélessége

megbecsülhető, amely főleg gyermekkorban nagyon hasznos. 2.a

Megállapítottuk, hogy Stargardt macula-dystrophiában SLO vizsgálattal kimutatható a maculapigment jelenléte vagy annak hiánya.

2.b

A maculapigment a látóélesség meghatározó tényezője.

3.

Magyarországon elsőként vizsgáltuk a STGD-ás betegek genetikai hátterét. A betegek homogén genetikai spektruma alapján lehetőségünk nyílt az egyes mutációs alcsoportok progressziójának pontosabb megítélésére és annak előrejelzésére.

4.

A világon az elsők között végeztünk sikeres géntranszfert lentivírus segítségével a retina pigmenthámjába mind in vivo, mind in vitro körülmények között.

5.

Bebizonyítottuk, hogy a GFP transzgén használatával végzett in vivo génterápia eredményessége hosszú távon csak immunszuppresszió mellett várható.

64

8. Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondok mindazoknak, akik doktori értekezésem elkészítéséhez lehetőséget és támogatást nyújtottak: Prof. Bitó Lászlónak, aki nélkül a kutatás rögös útján nem tudtam volna elindulni. Prof. Peter Gouras-nak, akinek megérkezésemkor az első mondata a következő volt: „Science is fun. We had a couple of talented Hungarians here at Columbia. So have fun.” Prof. Rando Allikments-nek, akiben nemcsak jó kutatási igazgatóra, de jó barátra is találtam. Dr. Kentaro Doi-nak és Dr. Björn Ekesten-nek akiktől az alapkutatási módszereket tanultam. Professzoraimnak: Prof. Salacz Györgynek és Prof. Németh Jánosnak, hogy támogattak kutatásaim és doktori disszertációm elkészítése során. Témavezetőmnek Dr. Farkas Ágnesnek, hogy a vizsgált betegség klinikumába bevezetett és tanácsokért bármikor fordulhattam hozzá. Köszönöm a Klinika munkatársinak, hogy munkám során hasznos tanácsokkal láttak el. Köszönöm a Doktori Iskola dolgozóinak segítőkészségüket. Végül családomnak, hogy nagy türelemmel és folyamatos támogatással segítik munkámat.

65

9. Irodalomjegyzék

Acland GM, Aguirre GD, Ray J, Zhang Q, Aleman TS, Cideciyan AV, PearceKelling SE, Anand V, Zeng Y, Maguire AM, Jacobson SG, Hauswirth WW, Bennett J. Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nat Genet. 2001 May;28(1):92-5.

Algvere PV, Gouras P, Dafgard Kopp E. Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur. J. Ophthalmol. 1999;9:217230.

Allikmets R, Singh N, Sun H, Shroyer NF, Hutchinson A, Chidambaram A, Gerrard B, Baird L, Stauffer D, Peiffer A, Rattner A, Smallwood P, Li Y, Anderson KL, Lewis RA, Nathans J, Leppert M, Dean M, Lupski JR. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat Genet. 1997;15:236–246.

Allikmets R. Further evidence for an association of ABCR alleles with agerelated macular degeneration. Am J Hum Genet. 2000;67:487-491.

Allikmets R, Hutchinson A, Jaakson K, Kulm M, Pavel H. Genotyping microarray (gene chip) for the ABCR (ABCA4) gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 42:S714

Association for Research in Vision and Ophthalmology. 2002. ARVO resolution for the use of animals in research. Association for Research in Vision and Ophthalmology, Rockville, Md. http://www.arvo.org/AboutArvo/animalst.asp.

66

Auricchio A, Kobinger G, Anand V, Hildinger M, O'Connor E, Maguire AM, Wilson JM, Bennett J. Exchange of surface proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction characteristics: the retina as a model. Hum. Mol. Genet. 2001;10:3075-3081.

Azarian SM, Travis GH. The photoreceptor rim protein is an ABC transporter encoded by the gene for recessive Stargardt’ disease (ABCR). FEBS Lett 1997;409:247-252.

Azzouz M, Kingsman SM, Mazarakis ND. Lentiviral vectors for treating and modeling human CNS disorders. J. Gene Med. 2004;6:951–962.

Beatty S, Murray IJ, Henson DB, Carden D, Koh H, Boulton M. Macular pigment and risk of age-related macular degeneration in subjects from northern European population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42:439-446.

Beharry S, Zhong M, Molday RS. N-retinylidene-phosphatidylethanolamine is the preferred retinoid substrate for the photoreceptor-specific ABC transporter ABCA4 (ABCR). J Biol Chem. 2004;279:53972–53979.

Bemelmans AP, Kostic C, Crippa SV, Hauswirth WW, Lem J, Munier FL, Seeliger MW, Wenzel A, Arsenijevic Y. Lentiviral gene transfer of RPE65 rescues survival and function of cones in a mouse model of Leber congenital amaurosis. PLoS Med. 2006;3(10):e347.

Bennett J, Maguire AM, Cideciyan AV, Schnell M, Glover E, Anand V, Aleman TS, Chirmule N, Gupta AR, Huang Y, Gao GP, Nyberg WC, Tazelaar J, Hughes J, Wilson JM, Jacobson SG. Stable transgene expression in rod photoreceptors

67

after recombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer to monkey retina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000;96:9920-9925. Berendschot TT, Goldbohm RA, Klopping WA, van de Kraats J, van Norel J, van Norren D. Influence of lutein supplementation on macular pigment, assessed with two objective techniques. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41:3322-3326. Bernstein PS, Balahov NA, Tsong ED, Rando RR. Retinal tubulin binds macular carotenoids. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;38:167-175. Bernstein PS, Yoshida MD, Katz N, McClane RW, Gellerman W. Raman detection of macular carotenoid pigment sin intact human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;39:2003-2011. Bhosale P, Larson AJ, Fredrick JM, Southwick K, Thulin CD, Bernstein PS. Identification and characterisation of a Pi isoform glutathionS-transferase (GSTP1) as a zeaxanthin-binding protein in the maculaoh the human eye. J Biol Chem. 2004;279:49447-49454. Birch DG, Peters AZ, Locke KL, Megarity CF, Travis GH. Visual function in pateints with cone-rod dystrophy (CRD) associated with ABCR mutations. Vision Sci Appl. 2000;1:53-56. Bone RA, Landrum JT, Tarsis SL. Preliminary identification of the human macular pigment. Vision Res. 1985;25:1531-1535. Bone RA, Landrum JT, Fernandez L, Trasis SL. Analysis of the macular pigment by HPLC: retinal distribution and age study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1988;29:843-849. Bone RA, Landrum JT, Hime GW, Cains A, Zamor J. Stereochemistry of the human macular carotenoids. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:2033-2040.

68

Bone RA, Landrum JT, FriedesLN. Distribution of lutein and zeaxanthin stereoisomers in the human retina. Exp Eye Res. 1997;64:211-218 Boulton M. Aging of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 1991;11:121-151. Boulton M, Dontsov A, Jarvis-Evans J, Ostrovsky M, Svistunenko D. Lipofuscin is a photoinducable free radical generator. J Photochem photobiolB. 1993;19:201-204. Broekmans WM, Berendschot TT, Klopping-Ketelaars IA. Macular pigment density in relation to serum and adipose tissue concentrations of zeaxanthin. Am J Clin Nutr. 2002;76:595-603. Buzzi F. Nuove sperienze fatte sulli occhio umano. Opuscoli Scetti sulle Scienze e Sulle Arti. 1782;5:78. Cao H, Koehler DR, Hu J. Adenoviral vectors for gene replacement therapy. Viral Immunol. 2004;17:327–333. Chen C, Okayama H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and Cellular Biology 1987;7:2745-2752. Cideciyan AV, Aleman TS, Swider M, Schwartz SB, Steinberg JD, Bruckner AJ, Maguire AM, Bennet J, Stone EM, Jacobson SG. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Mol Genet. 2004;13:525– 534. Cole GA, Nathanson N, Prendergast RA. Requirement for theta-bearing cells in lymphocytic choriomeningitis virus-induced central nervous system disease. Nature 1972;238:335-337.

69

Conn PF, Schalch W, Truscott TG. Singlet oxygen and carotenoid interaction. J. Photochem Photobiol B. 1991;11:41-47. Cremers FP, van de Pol DJ, van Driel M, den Holander AI, van Haren FJ, Knoers NV, Tijmes N, Bergen AA, Rohrschneider K, Blankeagel A, Pinckers AJ, Deutman AF, Hoyng CB. Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutation in the Stargardt’s disease gene ABCR. Hum Mol Genet 1998;7:355-362. Curcio CA, Millician CL, Allen KA, Kalina RE. Aging of the human photoreceptor mosaic: evidence for selective vulnerability of rods in central retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:3278-3296. Dafgard Kopp E, Winter-Vernersson AM, Algvere P. Expression of HLA Class I and Class II antigens by human fetal RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. (1997) 38(4) S947. abstract no. 3395. Derksen TA, Sauter SL, Davidson BL. Feline immunodeficiency virus vectors. Gene transfer to mouse retina following intravitreal injection. J. Gene Med. 2002;4:463-469. De La Paz M, Anderson RE. Region and age-dependent variation in susceptibility of the homan retina to lipid peroxidation. Invest Ophthalmol Vis Sci.199;33:3497-3499. DeVries HL, Spoor A, Renske J. Properties of the eye with respect to polarized light. Physica 1953; 19:419-432. Doi K, Gouras P, Kong J. Lentiviral mediated gene transfer of subetinal space: the importance of viral dosage. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41(4), S396, abstract no. 2090.

70

Doi K., Kong. J. Hargitai J. Lentiviral transtuction of retinal pigment epithelium with green fluorescent protein. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42(4), S349, abstract no. 1887. Doi K, Hargitai J, Kong J, Tsang SH, Wheatley M, Chang S, Goff S, Gouras P. Lentiviral transduction of green fluorescent protein in retinal epithelium: evidence of rejection. Vision Res. 2002;42:551-558. Doi K, Kong J, Hargitai J, Goff SP, Gouras P. Transient immunosuppression stops rejection of viral transduced EGFP in rabbit retina. J Virology. 2004;78(20):11327-33. Duan D, Yue Y, Yan Z, Engelhardt JF. A new dual-vector approach to enhance recombinant

adeno-associated

virus-mediated

gene

expression

through

intermolecular cis activation. Nat Med. 2000;6:595–598. Dull T, Zufferey R, Kelly M. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 1998;72:8463–8471. During MJ, Kaplitt MG, Stern MB, Eidelberg D. Subthalamic GAD gene transfer in Parkinson disease patients who are candidates for deep brain stimulation. Hum Gene Ther. 2001;12:1589–1591. Elsner AE, Burns SA, Weiter JJ, Delori FC. Infrared imaging of sub-retinal structures in the human ocular fundus. Vision Res 1996;36:191-205. Erdman JW Jr., Bierer TL, Gigger ET. Absorption and transport of carotenoids. NY Acad Sci. 1993;691:76-85. Ergun E, Hermann B, Wirtitsch M. Assessment of central visual function in Stargardt’s disease/fundus flavimaculatus with ultrahigh-resolution optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:310–316.

71

Eye Disease Case-Control Study Group. Risk factors in neovascular age-related macular degeneration. Arch ophthalmol. 1992;110:1701-1708. Ezra E, Fariss RN, Aylawaard WG, Gregor ZJ, Luthert PJ, Milam AH. Immunocytochemical characterization of macular hole opercula. Arch Ophthalmol 2001;119:223-231. Ferrer A, Wells KE, Wells DJ. Immune responses to dystrophin: imlications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Gene therapy 2000;7:1439-1446. Fishman GA, Farbman JS, Alexander KR. Delayed rod dark adaptation in patients with Stargardt’s disease. Ophthalmology 1991; 98:957-962. Fishman GA, Stone EM, Grover S, Derlacki DJ, Haines HL, Hockey RR. Variation of clinical expression in patients with Stargardt dystrophy and sequence variations in the ABCR gene. Arch Ophthalmol. 1999;117:504–510. Fonda G, Gardner LR. Characteristics and low vision corrections in Stargardt's disease. Educational and vocational achievements enhanced by low vision corrections. Ophthalmology. 1985 Aug;92(8):1084-91.

Fukui T, Yamamoto S, Nakano K, Tsujikawa M, Morimura H, Nishida K, Ohguro N, Fujikado T, Irifune M, Kuniyoshi K, Okada AA, Hirakata A, Miyake Y, Tano Y. ABCA4 gene mutations in Japanese patients with Stargardt disease and retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43:2819–2824.

Gale CRHall NF, Phillips DI, Martyn CN. Lutein and zeaxanthin staus and risk of age-related macular degeneration. Invest Ophtalmol Vis Sci. 2003;2461-2465.

Galileo DS, Hunter K, Smith SB. Stable and eficient gene transfer into the muant retinal pigment epithelial cells of the Mitfvit mouse using a lentiviral vector. Cur Eye Res. 1999;18, 135-142. 72

Gambotto A, Dworacki G, Cicinnati V, Kenniston T,

Steitz J, Tuting T,

Robbins PD, DeLeo AB. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 2000;7:2036-2040.

Gass JDM. Muller cell cone, and overlooked part of the anatomy of the fovea centralis. Arch Ophthalmol. 1999;117:821-823.

Gass JDM, Van Newkirk J. Xanthic scotoma and yellow foveolar shadow caused by pseudo-operculum after vitreoretinal separation. Retina 1992;12:242244.

Gerth C, Andrassi-Darida M, Bock M, Preising MN, Weber BH, Lorenz B. Phenotypes of 16 Stargardt macular dystrophy/fundus flavimaculatus patients with known ABCA4 mutations and evaluation of genotype-phenotype correlation. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002;240:628–638.

Glorioso JC, Fink DJ. Herpes vector-mediated gene transfer in treatment of diseases of the nervous system. Annu Rev Microbiol. 2004;58:253–271.

GoodwinTW. The biochemistry of the Carotenoids. Chapman and Hall 1980

Gouras P, Cao H, Sheng Y, Tanabe T, Efremova Y, Kjeldbye H. Patch culturing and transfer of human fetal retinal epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1994; 232, 599-607. Gregerson DS, Torseth JW, McPherson SW, Roberts JP, Shinohara T, Zack DJ. Retinal expression of neo-self antigen, β-galactosidase is not tolerogenic and

73

creates a targe for autoimune-uveoretinitis. Journal of Immunlogy 1999;163, 1073-1080. Gregerson, DS, Yang J. CD45-positive cells of the retina and their responsiveness to in vivo and in vitro treatment with IFN-gamma or anti-CD40. Invest Ophthalmol. Vis Sci. 2003;44:3083-3093. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science 2003;302:415–419. Hammond BR jr., Johnson EJ, Russel RM. Dietary modification of human macular pigment density. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;38:1795-1801. Hammond BR Jr., Curran-Celentano J, Judd S. Sex differences in macular pigment optical density: relation to plasma carotenoid concentrations and dietary patterns. Vision Res. 1996;36:2001-2012.(A) Hammond Br Jr. Fuld K, Snodderly DM. Iris color and macular pigment optical density. Exp eye Res. 1996;62:293-297. (B) Hammond BR Jr., Wooten BR, Snodderly DM. Preservation of visual sensitivity of older subjects: association with macular pigment density. Invest Ohthalmol Vis Sci. 1998;39:397-406. Hammond BR Jr., Carauso-Avery M. Macular pigment optical density in southwestern sample. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:1492-1497. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Salacz G, Allikmets R. ABCR Mutations and Clinical Phenotype in Hungarian Patients with Stargardt Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:4402-4408.

74

Heckenlively JR, Jacobson SG, Weleber RG, Sheffield VC, Stone EM. An analysis of allelic variation in the ABCA4 gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42:1179–1189.

Hee MR, Izatt JA, Swanson EA, Huang D, Schuman JS, Lin CP, Puliafito CA, Fujimoto JG. Optical coherence tomography of the human retina. Arch Ophthalmol. 1995;113:325–332.

Helmholtz H. Handbuch der physiologischen Optik. Berlin 1924; vol.2 p.304.

Holz FG. Autoflourescence imagging of the macula. Ophthalmologe 2001;98:10-18.

Howarth PA, Bradley LA. Longitudinal chromatic aberration of the human eye and its correction. Vis res. 1986; 26:361-366.

Huang D, Swanson EA, Lin CP, Schuman JS, Stinson WG, Chang W, Hee MR, Flotte T, Gregory K, Puliafito CA. Optical coherence tomography. Science. 1991;254:1178–1181.

Jaakson K, Zernant J, Külm M, Hutchinson A, Tonisson N, Glavac D, RavnikGlavac M, Hawlina M, Meltzer MR, Caruso RC, Testa F, Maugeri A, Hoyng CB, Gouras P, Simonelli F, Lewis RA, Lupski JR, Cremers FP, Allikmets R. Genotyping microarray (gene chip) for the ABCR (ABCA4) gene. Hum Mutat. 2003;22:395–403.

Jaffe GJ, Caprioli J. Optical coherence tomography to detect and manage retinal disease and glaucoma. Am J Ophthalmol. 2004;137:156–169.

75

Jiang, HR, Lumsden L, Forrester JV. Macrophages and dendritic cells in IRBPinduced experimental autoimmune uveoretinitis in B10RIII mice. Investi Ophthalmol. Vis. Sci. 1994;40:3177-3185.

Jiang, LQ, Jorquera M, Streilein JW. Immunologic consequences of intraocular implantation of retinal pigment epithelial allografts. Exp Eye Res. 1994;58:719728.

Johnson EJ, Hammond BR, Russel RM. Relation among serum and tissue concentrations of lutein and zeaxanthin in macular pigment density. Am J Clin Nutr. 2000;71:1555-1562.

Kaplan HJ, Yu XH, Zhang H.: Antigen specific CTL fail to recognize neoretinal antigen in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995;36(4), S201, abstract no. 930. Kaplan J, Gerber S, Larget-Piet D, Rozet JM, Dollfus H, Dufier JL, Odent S, Postel-Vinay A, Janin N, Briard ML. A gene for Stargardt’s disease (fundus flavimaculatus) maps to the short arm of chromosome 1. Nat Genet. 1993;5:308–311. Kaplitt MG, Leone P, Samulski RJ. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 1994;8:148–154. Kaspar BK, Llado J, Sherkat N, Rothstein JD, Gage FH. Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model. Science 2003;301:839–842. Kells AP, Fong DM, Dragunow M, During MJ, Young D, Connor B. AAVmediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Mol Ther. 2004;9:682–688.

76

Khachik F, Spangler CJ, Smith JC Jr., Canfield LM, Steck A, Pfandler H. Identification, quantification, and relative concentration of carotenoids and their metabolitesin the himan milk and serum. Anal Chem. 1997;69:1873-1881. Kim VN, Mitrophanous K, Kingsman SM, Kingsman AJ. Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 1998;72:811–816. Kirik D, Georgievska B, Bjorklund A. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat Neurosci. 2004;7:105–110.

Klevering BJ, van Driel M, van de Pol DJ, Pinckers AJ, Cremers FP, Hoyng CB. Phenotypic variations in a family with retinal dystrophy as result of different mutations in the ABCR gene. Br J Ophthalmol. 1999;83:914–918.

Kochanek S, Schiedner G, Volpers C. High-capacity ‘gutless’ adenoviral vectors. Curr Opin Mol Ther. 2001; 3:454–463.

Koh HH, Murray IJ, Nolan D, Carden D, Feather J, Beatty S. Plasma and macular responses to lutein supplementation in subjects with and without agerelated maculopathy: a pilot study. Exp Eye res. 2004;79:21-27.

Kong J, Kim SR, Binley K, Doi K, Naylor S, Sparrow JR, Gouras P, Allikmets R. Efficient Delivery of Genes Into Photoreceptors by Lentiviral Vectors: Application for Treatment of Stargardt Disease ARVO 2007; abs.1679/B495.

Kurg A, Tonisson N, Georgiou I, Shumaker J, Tollett J, Metspalu A. Arrayed primer extension: solid-phase four-color DNA resequencing and mutation detection technology. Genet Test. 2000;4:1–7.

77

Lehrman S. Virus treatment questioned after gene therapy death. Nature 1999;401:517–518.

Leibler DC, Stratton SP, Kaysen KL. Antioxidant action of β-carotene in liposomal

and

microsomal

membranes:

role

of

carotenoid-membrane

incorporation and α-tocopherol. Arch Biochem Biophys. 1997; 338:244-250.

Lever AM, Strappe PM, Zhao J. Lentiviral vectors. J Biomed Sci. 2004;11:439– 449.

Lewis RA, Shroyer NF, Singh N, Allikmets R, Hutchinson A, Li Y, Lupski JR, Leppert M, Dean M. Genotype/phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt disease. Am J Hum Genet. 1999;64:422–434.

Liversidge J, Forrester JV. Antigen processing and presentation in the eye: a review. Curr. Eye Res. 1992;11(Suppl.):49-58.

Liversidge JM, Forrester JV. Regulation of immune responses by retinal pigment epithelium. in Marmor M.F., Wolfensberger T.J. (szerk.) The retinal pigment epithelium. Oxford University Press, New York, Oxford, 1992: 511527. Lois N, Holder GE, Bunce C, Fitzke FW, Bird AC. Phenotypic subtypes of Stargardt

macular

dystrophy-fundus

flavimaculatus.

Arch

Ophthalmol

2001;119:359-369. Lotery AJ, Derksen TA, Russell SR, Mullins RF, Sauter S, Affatigato LM, Stone E M, Davidson BL. Gene transfer to the nonhuman primate retina with

78

recombinant feline immunodeficiency virus vectors. Hum Gene Ther. 2002;13:689-696. Lu Y. Recombinant adeno-associated virus as delivery vector for gene therapy: a review. Stem Cells Dev. 2004;13:133–145. Luo J, Kaplitt MG, Fitzsimons HL. Subthalamic GAD gene therapy in a Parkinson's disease rat model. Science 2002;298:425–429. Manivannan A, Kirkpatrick JNP, Forrester JV. Clinical investigation of an infrared digital scanning laser ophthalmoscope. Br J Ophthalmol 1994;78:84-90. Marr RA, Rockenstein E, Mukherjee A. Neprilysin gene transfer reduces human amyloid pathology in transgenic mice. J Neurosci. 2003;23:1992–1996. Markham R. Retinal disease and dystrophies. In: Easty DL, Sparrow JM. (szer.) Oxford Textbook of Ophthalmology. Oxford University Press, Oxford 1999;1055–1070. Martinez-Mir A, Paloma E, Allikmets R, Ayuso C, del Rio T, Dean M, Vilageliu L, Gonzalez-Duarte R, Balcells S. Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation int he Stargardt disease gene ABCR. Nat Genet 1998;18:11-12. Martin-Rendon E, Azzouz M, Mazarakis ND. Lentiviral vectors for the treatment of neurodegenerative diseases. Curr Opin Mol Ther. 2001;3:476–481.

Mata NL, Weng J, Travis GH,. Biosynthesis of a major lipofuscin fluorophore in mice and humans with ABCR-mediated retinal and macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:7154–7159.

Mata NL, Tzekov RT, Liu XR, Weng J, Birch DG, Travis GH. Delayed darkadaptation and lipofuscin accumulation in abcr+/– mice: implications for

79

involvement of ABCR in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42:1685–1690.

Maugeri A, Klevering BJ, Rohrschneider K, Blankenagel A, Brunner HG, Deutman AF, Hoyng CB, Cremers FP. Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy. Am J Hum Genet. 2000;67:960-966.

McKelvey T, Tang A, Bett AJ, Casimiro DR, Chastain M. T-cell response to adenovirus hexon and DNA-binding protein in mice. Gene Ther. 2004;11:791– 796.

Miyoshi H, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. Stable and efficient gene transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:10319-10323. Müller

H.

Dies

Xanthophylle)

aus

tagliche

Aufnahme

von

Gesamtnahrungsproben

Carotinoiden und

die

(Carotin

und

Carotinoidgehalte

ausgewahlter Gemuse- und Obstarten. Z Ernahrungswiss 1996;35:45-50. Nakai H, Storm TA, Kay MA. Increasing the size of rAAV-mediated expression cassettes in vivo by intermolecular joining of two complementary vectors. Nat. Biotechnol. 2000;18:527–532. Nakai H, Montini E, Fuess S, Storm TA, Grompe M, Kay MA. AAV serotype 2 vectors preferentially integrate into active genes in mice. Nat Genet. 2003;34:297–302. Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 1996;272: 263-267. (A)

80

Naldini, L, Blömer U, Gage FH, Trono D, Verma IM. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the trangene in adult rat brains injected with lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11382-11388. (B) Naylor EJ, Stanworth A. Retinal pigment and the Haidinger effect. J Physiol (London) 1954;124:543-552.

Németh J, Papp A, Mardin CY, Gründler AE, Jonas JB. Fotografikus és konfokális scanning lézer módszerrel mért látóidegfőméretek összehasonlító vizsgálata. Szemészet 1999;136:73-77.

Papaioannou M, Ocaka L, Bessant D, Lois N, Bird A, Payne A, Bhattacharya S. An analysis of ABCR mutations in British patients with recessive retinal dystrophies. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:16–19.

Papermaster DS, Schneider BG, Zorn M, Kraehenbuhl JP. Immuncytochemical localization of a large intrinsic membrane protein to the incisures and margins of frog rod outer segment discks. J Cell Biol. 1978;78:415-425.

Pluta K, Luce MJ, Bao L, Agha-Mohammadi S, Reiser J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 2005;7:803–817.

Post DE, Fulci G, Chiocca EA, Van Meir EG. Replicative oncolytic herpes simplex viruses in combination cancer therapies. Curr Gene Ther. 2004;4:41–51.

81

Poeschla EM, Wong-Staal F, Looney DJ. Efficient transduction of nondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors. Nat Med. 1998;4:354–357.

Radu RA, Mata, NL, Nusinowitz S, Liu X, Sieving PA, Travis H. Treatment with isoretinoin inhibits lipofuscin accumulation in a mouse model of recessive Stargardt’s macular degeneration. Proc Nat Acad Sci. 2003;100:4742-4747.

Ralph GS, Binley K, Wong LF, Azzouz M, Mazarakis ND. Gene therapy for neurodegenerative and ocular diseases using letiviral vectors. Clin Sci. 2006;110:37-46.

Rapp LM, Maple SS, Choi JH. Lutein and Zeaxanthin concentrations in rod outer segment membranes from perifoveal and peripheral retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41:1200-1209.

Rattner A, Sun H, Nathans J. Molecular genetics of human retinal disease. Annual Review of Genetics 1999; 33:89-131.

Relph K, Harrington K, Pandha H. Recent developments and current status of gene therapy using viral vectors in the United Kingdom. Br Med J. 2004;329:839–842. Rezai KA, Semnani RT, Patel SC, Ernest JT, van Seventer GA. The immunogenic potential of human fetal retinal pigment epithelium and its relation to transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997;38:2662-2671.

Rivera A, White K, Stöhr H, Steiner K, Hemmrich N, Grimm T, Jurklies B, Lorenz B, Scholl HP, Apfelstedt-Sylla E, Weber BH. A comprehensive survey

82

of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and agerelated macular degeneration. Am J Hum Genet. 2000;67:800–813.

Rohll JB, Mitrophanous KA, Martin-Rendon E. Design, production, safety, evaluation and clinical applications of nonprimate lentiviral vectors. Methods Enzymol. 2002;346:466–500. Rotenstreich Y, Fishman GA, Anderson RJ. Visual acuity loss and clinical observations in a large series of patients with Stargardt disease. Ophthalmology 2003;110:1151–1158. Sakhuja K, Reddy PS, Ganesh S. Optimization of the generation and propagation of gutless adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 2003;14:243–254. Schagen FH, Ossevoort M, Toes RE, Hoeben RC. Immune responses against adenoviral vectors and their transgene products: a review of strategies for evasion. Crit Rev Oncol Hematol. 2004;50:51–70. Sedon JM, Ajani UA, Sperduto R. Eye Disease Case-Control Study Group. Dietary Carotenoids, vitamins A, C and E, and advanced age-related macular degeneration. JAMA; 1994;272:1413-1420.

Segal J. Localization du pigment maculaire de la retine. Soc Biol (Paris) 1950;144:1630-1634.

Serafini B, Columba-Cabezas S, Di Rosa F, Aloisi F. Intracerebral recruitment and maturation of dendritic cells in the onset and progression of experimental autoimmune encephalomyelitis. Am J Pathol. 2000;157:1991-2002.

83

Seres A, Seres T, Németh J, Süveges I.: Papillatopográfiai vizsgálatok scanning lézer ophthalmoscop segítségével. Szemészet 1999;136: 37-40.

Silbert JE, Gao EK, Yu XH és mtsai.: Adult murine retinal pigment epthelium is immunogenic. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994;35(4), 1524, abstract no. 1261.

Simonelli F, Testa F, de Crecchio G, Rinaldi E, Hutchinson A, Atkinson A, Dean M, D'Urso M, Allikmets R. New ABCR mutations and clinical phenotype in Italian patients with Stargardt disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000;41:892–897.

Smith AJ, Schlichtenbrede FC, Tschernutter M, Bainbridge JW, Thrasher AJ, Ali RR. AAV-Mediated gene transfer slows photoreceptor loss in the RCS rat model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 2003;8(2):188-95.

Snellen EL, Verbeek AL, Van Den Hoogen GW, Cruysberg JR, Hoyng CN. Neovascular age-related macular degeneration and its relationship to antioxidant intake. Acta Ophthalmol Scand. 2002;80:368-371.

Snodderly DM, Brown PK, Delori FC, Auran JD. The macular pigment. I. Absorbance spectra, localization and discrimination from other yellow pigments in primate retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984;25:660-673.(A) Snodderly DM, Auran JD, Delori FC. The macular pigment. II. Spatial distribution in primate retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984;25:674-675. (B) Snoderly DM, Mare JA, Wooten BR, Oxton L, Gruber M, Ficek T; CAREDS Macular Pigment study Group. Macular pigment measured by heterochromatic flicker photometry in older subjects: the Carotenoids and Age-Related Eye Disease Study. Inevst Ophthalmol vis Sci. 2004;45:531-538.

84

Sodi AC, Capelli S, Menchini F, Menchini U. Optical Coherence Tomography Findings in Hereditary Retinal Degenerations Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 44: E-Abstract 526. Stahl W, Briviba K, Hamusch M. Biological activities of natural and synthetic carotenoids: induction of gap junctional communication and singlet oxygen quenching. Carcinogenesis. 1997;18:89-92. Stanworth A, Naylor EJ. Haidinger's brushes and the retinal receptors. British J Ophthalmol. 1950;34:282-291.

Stargardt K. Über familiäre, progressive Degeneration in der Makulagegend des Auges. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1909;71:534–550.

Stargardt K. Über familiäre, progressive Degeneration in der Makulagegend des Auges, mit und ohne psychische Störungen. Arch Psychiatr Nervenkr. 1918;58:852–887.

Stripecke R, Villacres CM, Skelton D, Satake N, Halene S, Kohn D. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Ther. 1999;6:1305-1312. Sujak A, Okulski W, Gruszeczki WI. Organisation of xanthopyll pigments luten and zeaxanthin in lipid membranes forme with dipamitoylphosphatidycholine. Biochem Biophys Acta. 2000;1509:255-263.

Sun H, Nathans J. Stargardt’s ABCR is localized to the disc membrane of retinal rod outer segments. Nat Genet. 1997;17:15–16.

85

Sun H, Molday RS, Nathans J. Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter responsible for Stargardt disease. J Biol Chem. 1999;274:8269–8281.

Sun H, Smallwood PM, Nathans J. Biochemical defects in ABCR protein variants associated with human retinopathies. Nat Genet. 2000;26:242–246. (A)

Sun L, Li J, Xiao X. Overcoming adeno-associated virus vector size limitation through viral DNA heterodimerization. Nat Med. 2000;6:599–602. Sundelin SP, Nilsson SE, Brunk IT. Lipofuscin-formation in retinal pigment epithelial cells is reduced by antioxidants. Free Radic Biol Med. 2001;31:217225. Surace EM, Auricchio A, Reich SJ, Rex T, Glover E, Pineles S, Tang W, O'Connor E, Lyubarsky A, Savchenko A, Pugh EN Jr, Maguire AM, Wilson JM, Bennett J. Delivery of adeno-associated virus vectors to the fetal retina: impact of viral capsid proteins on retinal neuronal progenitor transduction. J Virol. 2003;77:7957-7963. Surya A, Foster KW, Knox BE. Transducin activation by the bovine opsin apoprotein, J Biol Chem. 1995;270:5024-5031. Takahashi M, Miyoshi H, Verma IM, Gage FH. Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vectormediated gene transfer. J Virol. 1999;73:7812-7816. Thomas CE, Birkett D, Anozie I, Castro MG, Lowenstein PR. Acute direct adenoviral vector cytotoxicity and chronic, but not acute, inflammatory responses correlate with decreased vector-mediated transgene expression in the brain. Mol Ther. 2001;3:36–46.

86

Tõnisson N, Zernant J, Kurg A, Pavel H, Slavin G, Roomere H, Meiel A, Hainaut P, Metspalu A. Evaluating the arrayed primer extension resequencing assay of TP53 tumor suppressor gene. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:5503– 5508. VolpersC, Kochanek S. (2004) Adenoviral vectors for gene transfer and therapy. J Gene Med. 2004 6 (Suppl. 1):S164–S171. Wald G. Human vision anfód the spectrum. Science 1945;101:653-658. Weng J, Mata NL, Azarian SM, Tzekov RT, Birch DG, Travis GH. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt’s disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 1999;98:13–23. Winkler BS, Boulton ME, Gottsch JD, Sternberg P. Oxidative damage and agerelated macular degeneration. Mol Vis 1999;5:e32. Wolbarsht ML. The function of intraocular color filters. Fed Proc. 1976;35:4449. Wooten BR, Hammond BR. Macular pigment: influences on visual acuity and visibility. Prog Retin Eye res. 2002;21:225-240. Ye J, Wang HM, Ogden TE, Ryan SJ. Allotransplantation of rabbit retinal pigment epithelial cells double-labelled with 5-bromodeoxyuridine (BrdU) and natural pigment. Curr. Eye Res. 1993;12:629-639. Yemelyanov AZ, Katz NB, Bernstein PS. Ligand-binding characterisation of xanthophyll carotenoids to solubilized membarne proteins derived from homan retina. Exp Eye Res. 2001;72:381-392. Yemelyanov AY, Katz NB, Bernstein PS. Ligand-binding characterization of xanthophyll carotenoids to solubilized membrane proteins derived from human retina. Exp Eye Res. 2001;72:381-392. 87

Zaripheh S, Erdman JW Jr. Factors thet influence the bioavailabilityof xanthophylls. J Nutr. 2002;132:531S-534S. Zrenner E. Will retinal implants restore vision? Science. 2002 Feb 8;295(5557):1022-5. Review. Erratum in: Science 2002;22;295(5563):2213. Zhang K, Kniazeva M, Han M, Li W, Yu Z, Yang Z, Li Y, MetzkerML, Allikmets R, Zack DJ, Kakuk LE, Lagali PS, Wong PW, MacDonald IM, Sieving PA, Figueroa DJ, Austin CP, Gould RJ, Ayyagari R, Petrukhin K. A5bp deletion in ELOVL4 is asociated with two related forms of autosomal dominant macular dystrophy. Nat Genet 2001;27:89-93. Zhang X, Hargitai J, Tammur J, Hutchinson A, Allikmets R, Chang S, Gouras P. Macular pigment and visual acuity in Stargardt macular dystrophy. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002; 240: 802-809.

88

10. Összefoglalás

A Stargardt betegség (STGD) a leggyakrabban előforduló fiatalkori maculadystrophia, amelynek jellegzetes tünete az általában a huszadik életév előtt jelenkező centrális látóélesség csökkenés. Számos vizsgáló módszer áll rendelkezésre, amelyek a betegek pillanatnyi állapotának felmérésére alkalmasak, azonban a betegség progressziójának megítélésére nem adnak lehetőséget. A Stargardt betegség hátterében zajló összetett molekuláris szintű változásokat csak részben ismerjük, és a terápia jelenleg még nem megoldott. Klinikai vizsgálatokkal kimutattuk, hogy mind az optikai koherencia tomográfia, mind a scanning laser ophthalmoscopia olyan non-invazív eljárás, amely új és értékes információkat ad a betegek állapotáról. Vizsgálataink alapján a betegek legjobb korrigált látóélessége és macula térfogata között lineáris összefüggés volt kimutatható. Hasonló összefüggést találtunk a visus és a foveoláris vastagság között. Az SLO vizsgálatok alapján a látóélesség és a maculapigment mennyisége között szoros összefüggés volt kimutatható. 35 magyar STGD beteg genetikai vizsgálata más népcsoportokkal ellentétben nagyfokú homogenitást mutatott, amely nagyobb betegcsoport esetén elősegítheti a genotípus-fenotípus összehasonlító vizsgálatokat, és a betegség prognózisának korai megítélését. A napról-napra bővülő genetikai ismeretek több öröklődő betegség kezelését teszi már jelenleg is lehetővé. Állatkísérleteinkben sikerrel juttattuk be egy nyomjelző fehérje génjét lentivírus-vektor segítségével a retina pigmenthám sejtjeibe mind in vitro, mind in vivo körülmények között. Kimutattuk, hogy a szervezet immunrendszere számára idegen fehérje által kiváltott kilökődési reakció immunszuppresszió alkalmazásával sikeresen kivédhető. Kísérleteink alapján feltételezhető, hogy a génterápia a Stargardt maculadystrophia egyik kezelési módja lesz a jövőben.

89

11. Summary

Stargardt disease is the most common juvenile-onset macular dystrophy. The disease is characterized by a severe reduction of central vision, often occuring before the age of 20 years. Several clinical data are available to assess the status of a patient, however the prognosis is still hard to predict. The molecular background of this complex pathology is still unclear, and no definitive therapy is available yet. Optical coherence tomography and scanning laser ophthalmascope are two noninvasive methods capable to bring new and valuble information about the patient. Linear correlation was observed between visual acuity and foveolar thickness and between visual acuity and macular volume. SLO examination of STGD patients showed strong correlataion between the amount of pigment in the fovea and visual acuity. Genetic analysis of 35 Hungarian STGD patients showed homogeneous distribution of disease associated mutations in contrast with other ethnical groups, thus it favours genotype-phenotype correlation studies in the Hungarian population. This would help us to determine the prognosis of our - juvenile- patients at an earlier age. Rapid advancing of genetics has allowed us to treat several inhereted diseases already. In our basic research we succesfully transduced the gene of reporter protein into the retinal pigment epithelium using lentivirus vector both in vitro and in vivo nature. The immuno-rejection caused by the foreign protein was succesfully overcome by using immunosuppression. According to our findings, gene therapy seems to be a promising candidate for the treatment of Stargardt macular-dystrophy in the future.

90

12. Publikációk jegyzéke 12.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Salacz G, Allikmets R. ABCR Mutations and Clinical Phenotype in Hungarian Patients with Stargardt Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:4402-4408. IF: 3,643 2.

Doi K, Kong J, Hargitai J, Goff SP, Gouras P. Transient immunosuppression stops rejection of viral transduced EGFP in rabbit retina. J Virology. 2004;78(20):11327-33. IF: 5,398

3. Hargitai J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Allikmets R. Foveolaris vastagság és maculatérfogat változásai Stargardt-maculadystrophiában. Szemészet 2004; 141: 35-40. 4. Zhang X, Hargitai J, Tammur J, Hutchinson A, Allikmets R, Chang S, Gouras P. Macular pigment and visual acuity in Stargardt macular dystrophy. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 2002; 240: 802-809. (társ első szerző) IF:1,191 5. Doi K, Hargitai J, Kong J, Tsang SH, Wheatley M, Chang S, Goff S, Gouras P. Lentiviral transduction of green fluorescent protein in retinal epithelium: evidence of rejection. Vis Res. 2002; 42:551-558. IF:1,956

12.2. Egyéb közlemények 1. Hargitai

J,

Paku

S.

Fém

részecske

az

elülső

szegmentumban

phacoemulsificatio-t követően. SHIOL, Keszthely, 2006 Évkönyv. 2. Hargitai J, Gouras P. Autoimmmune-like retinopathy. Doc Ophthalmol. 2004;109(3):215-21.

91

3. Hargitai J, Farkas Á, Fiedler O, Thirkill EC. Paraneoplasticus retinopathia hatására kialakult késői látásromlás. Szemészet 2004; 141: 31-34. 4. Nemes J, Somfai G, Hargitai J.: A maculamorfologia és a maculafunkció összefüggésének vizsgálata culorbetegekben optikai koherencia tomográfia segítségével. Szemészet 2004; 141: 41-44. 5. Ekesten B, Gouras P, Hargitai J. Co-Expression of Murine Opsins Facilitates Identifying the Site of Cone Adaptation. Visual Neuroscience Visual Neuroscience 2002;19(4):389-93. IF: 1,771 6. Bögi J, Dura E, Fiedler O, Hargitai J, Papp M, Récsán Zs. Gyakori problémák pseudoexfoliatiós szemek kezelésében: a szürkehályog-műtétek komplikációi, az argonlézeres trabeculoplastica hatásossága. Szemészet 1999;136:149-155.

12.3. Idézhető absztaktok az értekezés témájában 1. Vámos R, Hargitai J, Varsányi B, Lesch B, Szabó V, Farkas Á. Research on inherited retinal diseases at the University Eye Clinic, Budapest. Pro Retina Research-colloquium Potzdam, 2006. 2. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G, Allikmets R. Correlation of clinical and genetic findings in Stargardt disease patients from Hungary. SOE 2005, Berlin, Németország. 3. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G. Allikmets R. ABCR Mutations and Clinical Phenotype in Hungarian Patients with Stargardt Disease. ARVO 2005, Fort Lauderdale, USA. 4. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vamos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G., Allikmets R. Correlation of clinical and genetic findings in Stargardt disease patients from Hungary. ARVO 2004, Fort Lauderdale, USA.

92

5. Gouras P, Kong J, Hargitai J, Goff S, Doi K. Transient immunosuppression stops rejection of viral transduced EGFP in rabbit retina. ARVO 2004, Fort Lauderdale, USA. 6. Vámos R, Hargitai J, Somfai G, Farkas Á. Multifocal Electrophysiology and Optical Coherence Tomography in Cases with Stargardt’s Macular Dystrophy. EVER 2003, Allicante, Spanyolország. 7. Gouras P, Goff S, Doi K, Kong J, Hargitai J. Rejection and induced tolerance of viral transduced transgenic proteins in retinal epithelium. “Age-Related Macular Degeneration” (III. International Symposium of the German Ophthalmological Society) 2003, Baden-Baden, Németország. 8. Vámos R, Hargitai J , Somfai G, Farkas Á. Multifocal Electrophysiology and Optical Coherence Tomography in Cases with Stargardt’s Macular Dystrophy. SOE 2003, Madrid, Spanyolország. 9. Somfai G, Hargitai J, Vámos R, Farkas Á, Gouras P, Salacz G. Optical Coherence Tomography in the Study of in Stargardt Macular Dystrophy. SOE 2003, Madrid, Spanyolország. 10. Hargitai J, Somfai G, Vámos R, Farkas Á, Gouras P, Salacz G. Foveal Thickness and Macular Volume Changes in Stargardt Macular Dystrophy. ARVO 2003, Fort Lauderdale, USA. 11. Kong J, Doi K, Hargitai J, Goff SP, Gouras P. Gene Therapy and RPE Transplantation in the RPE65 -/- Mutant Mouse. ARVO 2003, Fort Lauderdale, USA. 12. Vámos R, Hargitai J, Somfai G, Farkas Á, Lesch B, Salacz G. Multifocal Electrophysiology and Optical Coherence Tomography in Cases with Stargardt’s Macular Dystrophy. ISCEV, 2003, Nagoya, Japán.

93

13. Hargitai J, Doi K, Kong J, Ivert L, Gouras P. Lentiviral Transduction of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Retinal Pigment Epithelium Causes Vascular Changes in Rabbit. ARVO, 2002, Fort Lauderdale, USA. 14. Gouras P, Kong J, Kjeldbye H, Hargitai J.: Aging of the Basal Side and Lamina of RPE of Normal and RPE65-/- Mice. ARVO; 2002 május, Fort Lauderdale, USA. 15. Doi K, Hargitai J, Kong J, Goff SP, Gouras P. Onset of Immune Response is Caused by the Amount of Induced Protein, not by the Viral Vehicle Type. ARVO; 2002 május, Fort Lauderdale, USA. 16. Zhang X, Hargitai J, Tammur J, Hutchinson A, Allikmets R, Chang S, Gouras P. Macular Pigment and Visual Acuity in Stargardt Dystrophy. AAO; 2001, New Orleans, USA. (technikai okokból az összefoglaló füzetben nem szerepel) 17. Gouras P, Doi K, Hargitai J, Tsang SH, Goff S. Strategies to Virally Transduce Genes Into Specific Retinal Layers. Europai Uniós Konferencia “New Therapeutic Approaches in Hereditary Eye Disease –From Genes to Cure”; 2001, Prága, Csehország 18. Hargitai J, Kong J, Gouras P, Doi K. Transduction of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Cultured Human Fetal Retinal Pigment Epithelial (RPE) Cells After Lentiviral Infection. Fifth Annual Vision Research Conference; 2001, Fort Lauderdale, USA 19. Doi K, Kong J, Hargitai J, Wheatley M, Tsang SH, Chang S, Goff SP, Gouras P. Lentiviral Transduction of Retinal Epithelium with Green Fluorescent Protein. ARVO; 2001, Fort Lauderdale, USA.

94

12.4. Az értekezés témájában elhangzott előadások 1. Hargitai J, Zernant J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Nemes J, Salacz G, Allikmets R. Correlation of clinical and genetic findings in Stargardt disease patients from Hungary. SOE 2005; Berlin, Németország. 2. Hargitai J, Farkas Á, Fiedler O, Thirkill EC, Salacz G. Paraneoplasztikus retinopathia hatására kialakult késői látásromlás. Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa 2003; Budapest. 3. Hargitai J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Ekesten B, Allikmets R, Gouras P, Salacz G. A fovea vastagság és macula térfogat változásai Stargardt betegségben. Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa 2003; Budapest. 4. Hargitai J, Somfai GM, Vámos R, Farkas Á, Ekesten B, Allikmets R, Gouras P, Salacz G. Foveal thickness and macular volume changes in Stargardt macular dystrophy. Euretina 2003; Hamburg, Németország. 5. Hargitai J, Doi K, Kong J, Salacz G,Gouras P.: Kisérletes génterápia a szemészetben. Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa 2002; Miskolc. 6. Hargitai J: Transduction of Green Fluorescent Protein (GFP) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in RPE after Lentiviral Infection. 2001 május, Columbia Egyetem, New York, USA

13. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai

95