KÓROKI MUTÁCIÓK AZONOSÍTÁSA ÖRÖKLETES ANGIOÖDÉMÁBAN ÉS A C1-INH GÉN MUTÁCIÓS ADATBÁZISÁNAK LÉTREHOZÁSA

KÓROKI MUTÁCIÓK AZONOSÍTÁSA ÖRÖKLETES ANGIOÖDÉMÁBAN ÉS A C1-INH GÉN MUTÁCIÓS ADATBÁZISÁNAK LÉTREHOZÁSA Szerző: Kalmár Lajos Ph.D. hallgató, Semmelweis Egyetem Budapest Témavezető: Dr. Tordai Attila

Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézet Budapest, 2005. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Molekuláris orvostudományok tudományág, Elméleti és Klinikai Immunológia program. Bírálók: Dr. Váradi András, Dr. Karcagi Veronika Szigorlati bizottság: Dr. Fekete György, Dr. Béres Judit, Dr. Gál Péter, Dr Vásárhelyi Barna

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...................................................................................................................3 1. BEVEZETÉS ..........................................................................................................................................4 1.1. AZ ANGIONEUROTIKUS ÖDÉMA TÖRTÉNETE .......................................................................................4 1.2. AZ ANGIOÖDÉMA KIALAKULÁSÁNAK PATOMECHANIZMUSA ..............................................................4 1.3. AZ ÖRÖKLETES C1 INHIBITOR DEFICIENCIA ........................................................................................6 1.4. A SZERZETT C1 INHIBITOR HIÁNY ......................................................................................................6 1.5. AZ ANGIOÖDÉMA DIAGNOSZTIKÁJÁNAK SZEMPONTJAI ......................................................................7 1.6. TERÁPIA ...........................................................................................................................................11 1.7. AZ ÖRÖKLETES ANGIOÖDÉMA MOLEKULÁRIS HÁTTERE ...................................................................15 1.8. GENETIKAI ADATBÁZISOK ................................................................................................................21 2. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................................23 3. VIZSGÁLT EGYÉNEK ......................................................................................................................24 4. MÓDSZEREK ......................................................................................................................................25 4.1. KOMPLEMENT VIZSGÁLATOK ...........................................................................................................25 4.2. MINTAGYŰJTÉS ................................................................................................................................25 4.3. DNS KIVONÁS ..................................................................................................................................26 4.4. SOUTHERN-BLOT ANALÍZIS ...............................................................................................................26 4.5. GÉNDÓZIS ANALÍZIS .........................................................................................................................27 4.6. PRIMER TERVEZÉS ............................................................................................................................28 4.7. DIREKT DNS SZEKVENÁLÁS.............................................................................................................30 4.8. PCR-RFLP ÉS MULTIPLEX ALLÉLSPECIFIKUS PCR...........................................................................33 4.9. A C1-INH GÉN MUTÁCIÓS ADATBÁZISÁNAK LÉTREHOZÁSA ............................................................35 5. EREDMÉNYEK...................................................................................................................................38 5.1. MOLEKULÁRIS DIAGNOSZTIKAI STRATÉGIA .....................................................................................38 5.2 A MUTÁCIÓSZŰRÉS EREDMÉNYE ANGIOÖDÉMÁS CSALÁDOKBAN. .....................................................39 5.3. ÖSSZEGYŰJTÖTT MUTÁCIÓS ADATOK A HAEDB-BEN .......................................................................43 5.4. A HAEDB MŰKÖDÉSE ......................................................................................................................44 6. MEGBESZÉLÉS ..................................................................................................................................50 6.1. DIAGNOSZTIKAI MÓDSZEREK BEÁLLÍTÁSA .......................................................................................50 6.2. BETEGSÉG OKOZÓ MUTÁCIÓK A C1-INH GÉNBEN ............................................................................50 6.3. MUTÁCIÓK ELNEVEZÉSE A KUTATÁSBAN ÉS A HAEDB-BEN ............................................................52 6.4. A HAEDB HELYE A DIGNOSZTIKÁBAN ÉS A KUTATÁSBAN ................................................................52 6.5. NEM PUBLIKÁLT MUTÁCIÓK AZ ADATBÁZISBAN...............................................................................53 6.6. A HAEDB ÖSSZEVETÉSE AZ IDEÁLIS ADATBÁZISSAL........................................................................53 7. ÖSSZEFOGLALÁS .............................................................................................................................56 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..............................................................................................................57 9. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................................................58 ÖSSZEFOGLALÓ ...................................................................................................................................65 SUMMARY...............................................................................................................................................66 ÉRTEKEZÉSSEL KAPCSOLATOS PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE .................................................68

2

Rövidítések jegyzéke AANO ACE ANOVA C1 C1r C1s C1 inhibitor C1-INH C2 C4 CCM cDNS CDS CG, CpG Cp DGGE DHPLC chromatography) DNS dNTP E EACA EDTA ELISA HA HAE HANO HGMD HGVS HIV HUGO LSDB mRNS OMIM PCR PDF PHP POP6 RFLP SSCP TE

Szerzett angioneurotikus ödéma (aquired angioneurotic oedema) Angiotenzin konvertáz enzim Variancia analízis (analysis of variance) Komplement 1 fehérje Komplement 1 fehérje r alegység Komplement 1 fehérje s alegység Komplement 1 észteráz inhibitor (a fehérje jelölése) Komplement 1 észteráz inhibitor (a gén jelölése) Komplement 2 fehérje Komplement 4 fehérje Kémai úton történő heteroduplex hasítás (chemical cleavage of mismatch) Reverz transzkripcióval készült komplement DNS szál Kódoló DNS szekvencia Citozin-guanin dinukleotid Crossing point Denaturáló gradiens gélelektroforézis (denaturing gradient gel electrophoresis) Denaturáló nagynyomású folyadék kromatográfia (denaturing high performance liquid Dezoxiribonukleinsav Dezoxinukleotid-trifoszfát keverék (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Egység (gyógyszernél, készítménynél) Epszilon-amino kapronsav Etiléndiamin-tetraecetsav Enzimhez kapcsolt immunoszorbens „assay” (Enzyme linked immunosorbent assay) Heteroduplex analízis Örökletes angioödéma (hereditary angioedema, nemzetközileg alkalmazott elnevezés) Herediter angioneurotikus oedema (Magyarországon klinikumban használt elnevezés) The Human Gene Mutation Database Human Genome Variation Society Emberi immundeficiencia vírus (Human immundeficiency virus) Human Genome Organisation Locusspecific Database Messenger ribonukleinsav Online Mendelian Inheritance In Man Polimeráz lánc reakció Portable document format Pre hypertext processor Performance optimized polymer 6 Restrikciós fragmens hossz polimorfozmus Szimpla szálú konformációs eltérés (single strand conformational polimorphysm) Tris-EDTA

3

1. Bevezetés 1.1. Az angioneurotikus ödéma története 1876-ban elsőként J. L. Milton számolt be részletesen egy feltehetően angioödémás betegről, a szindrómát „gigantikus ödéma”-ként jellemezve.78 Az angioödémára jellemző akut subcutan ödéma első teljes klinikai leírását 1882-ben közölte Heinrich Quincke.93 1888-ban Sir William Osler írta le a betegség klinikai tüneteit, és megfigyelései alapján a kórképet az angioneurotikus ödéma örökletes formájának nevezte.86 Egy 24 éves nőbeteg kórtörténetét mutatta be, akinek krónikus recidiváló ödémás rohamai voltak, és akinek a családjában öt generáción keresztül hasonló tüneteket figyelt meg. 1917-ben Crowder mutatott rá arra, hogy a betegség autoszomális domináns öröklésmenetű.41 Levy és Lepow 1959-ben írták le a klasszikus komplement kaszkád első komponensének inhibitorát, majd 1961-ben Pensky és munkatársai azonosították a C1 észteráz inhibitor (C1 inhibitor) fehérjét.75,90 A következő évben Landerman, majd 1963-ban Donaldson és Evans közölték, hogy a herediter angioneurotikus ödéma oka a C1 inhibitor fehérje deficienciája.71,49 A C1 inhibitor fehérjével és a herediter angioneurotikus ödémával foglalkozó kutatások azóta feltárták a betegség biokémiáját, genetikáját és patomechanizmusát. A pontos biokémiai mechanizmus ismeretében a „neurotikus” jelző egyre ritkábban szerepel az elnevezésben, általában a betegség örökletes illetve szerzett angioödémaként ismert. Értekezésemben a továbbiakban én is az angioödéma elnevezést használom. 1.2. Az angioödéma kialakulásának patomechanizmusa A C1 inhibitor fehérje a szerpin típusú szérum proteáz inhibitorok csoportjába tartozik, amelyet elsősorban a májsejtek, kisebb részben a monocyták és a fibroblasztok is szintetizálnak. A fehérje fő funkciója bizonyos véralvadási és kinin-felszabadító enzimek gátlása, valamint szerepe van a veleszületett immunitás egyik fontos effektorrendszerének, a komplementrendszer működésének szabályozásában.43 A C1 inhibitor célproteázai a C1-komplex két alegysége (C1r és C1s), valamint a kallikrein, a plazmin, a XIIa (Hageman faktor) és a XIa faktor fehérjék. A plazma C1 inhibitor deficienciájának következtében (csökkent fehérje mennyiség, csökkent fehérje

4

aktivitás, vagy fehérje ellenes ellenanyag jelenléte) a komplement kaszkád klasszikus útjának autoaktivációja jön létre, amelynek eredményeként csökken a plazma C2 és C4 szintje. A kontrollálatlan komplement aktiválódás során keletkezett C2 fragmentumok vazoaktív, kininszerű mediátorok (C2-kinin) felszabadulását váltják ki. Másfelől, ha szövetkárosodás jön létre, a Hageman faktor hatására a prekallikreinből kallikrein, a nagy molekulatömegű kininogénből bradykinin szabadul fel. Ezen anyagok tehetők felelőssé az angioödéma jellegzetes tüneteiért.8,31,76,81,98

1. ábra. A C1 inhibitor hiány következtében kialakuló angioödéma patomechanizmusának vázlata. Az ábrán a C1 inhibitor gátló hatásának támadáspontjai láthatók piros ponttal jelölve. C1 inhibitor hiány esetén, az ábrán feltüntetett rendszerek aktiválódása vazoaktív mediátorok (bradykinin, C2 kinin) felszabadulásához, és így ödéma képződéséhez vezet. A fekete nyilak a rendszeren belüli átalakulásokat, míg a kék nyilak a rendszerek közötti aktivációs utakat jelölik.

A C1 inhibitor deficiencia etiológiáját tekintve lehet örökletes, illetve szerzett, a két típus klinikai tüneteit illetően nem különbözik egymástól.

5

1.3. Az örökletes C1 inhibitor deficiencia Az örökletes angioödéma ritkán előforduló betegség, gyakorisága az európai populációkban 1:10000-1:50000 között van.43 Az említett gyakorisági adatok alapján Magyarországon mintegy 200-1000 beteg valószínűsíthető. Mivel értekezésem egyik célja, a genetikai háttér bemutatása, ezért a betegség örökletes formájával és a háttérben álló genetikai eltérésekkel a későbbiekben részletesen foglalkozom. 1.4. A szerzett C1 inhibitor hiány A szerzett C1inhibitor hiány esetén az angioödémás epizódok a negyvenes életévekben kezdődnek, negatív családi anamnézis mellett. 1969-ben Constanzi, Donaldson és munkatársai közöltek egy esetismertetést, amelyben a C1 inhibitor deficiencia cryoglobulinaemiához társult.38 1972-ben Caldwell és munkatársai egy lymphoproliferativ betegségben szenvedő beteg angioödémáinak hátterében diagnosztizálták a C1 inhibitor deficienciát.28 Azóta több közlemény jelent meg, amelyekben a fehérje deficienciája különféle betegségekhez társult. Ilyenek a benignus és malignus lymphoprolíferatív betegségek, a monoklonális gammopathia cryoglobulinaemiával, a Churg-Strauss vasculitis, a rectum-, és gyomor carcinoma, a hepatitis B és C, az Echinococcus és a Helicobacter pylori fertőzés, a xanthomatosis, valamint a szisztémás lupus erythematosus.61,62,30,89,37,88,68,80 A szerzett C1 inhibitor deficienciában a C4 és a C1 inhibitor fehérjék csökkent koncentrációja és aktivitása mellett jellegzetes a csökkent C1 hemolítikus aktivitás, amely differenciál diagnosztikai jelentőségű az örökletes és a szerzett forma elkülönítésében, mivel örökletes angioödémában ez az érték mindig normális. 1986-ban a C1 inhibitor deficiencia új típusáról számoltak be, amelyet II. típusú szerzett angioneurotikus ödémának (AANO) neveztek el, és amelyben a C1 inhibitor elleni autoantitesteket mutattak ki.5 Az oligoklonális vagy monoklonális jellegű C1 inhibitor fehérje elleni autoantitestek mellett a csökkent C4 és C1 inhibitor aktivitás jellemzi az AANO-t. Ezt az autoimmun típusú C1 inhibitor deficienciát azokban a betegekben feltételezték, akikben nem tudtak háttérbetegséget kimutatni.

6

Cicardi és munkatársai vizsgálatai azonban ezt a feltételezést nem támasztották alá, mivel lymphoproliferativ kórképekhez társuló angioödémákban is detektáltak C1 inhibitor elleni antitesteket.32 1.5. Az angioödéma diagnosztikájának szempontjai 1.5.1. Családi anamnézis A C1 inhibitor deficiencia örökletes típusában a családi anamnézis pontos és részletes felvétele mellett szükséges a családtagok szűrése is. A betegek 75%-ában a közvetlen családtagoknál is felismerhető a kórkép, a fennmaradó 25%-ban újonnan kialakult mutáció áll a betegség hátterében (sporadikus esetek).48 1.5.2. Klinikai tünetek A C1 inhibitor hiány klinikai tünetei az ödéma lokalizációjától függően rendkívül sokfélék lehetnek, és az alábbi két nagyobb csoportra oszthatók: Subcutan ödémák: A subcutan ödémák, amelyek leggyakrabban a végtagokon, az arcon, a nyakon, a törzsön, a gluteális tájon, a nemi szerveken jelentkeznek, nem fájdalmasak, nem gyulladásos jellegűek, és nem okoznak viszketést. Néha urticariához hasonló jellegű, esetleg erythemás szélű lehet a bőrön lévő elváltozás. A periorbitális és a periorális megjelenés ritka, de ha a szájnyálkahártya ödémája kifejezett, akkor az alsó- és felsőajak nagyfokú duzzanata alakulhat ki.2 Submucosus ödémák: A submucosus ödéma érintheti a felső légutak nyálkahártyáját (száj, garat, gége, uvula), melynek során néhány órán belül olyan súlyos gégeödéma jöhet létre, ami fulladásos halált is okozhat. Külső megjelenési formáját tekintve nem különíthető el egyéb, pl. allergiás ödémáktól. A betegség mortalitása az intenzív terápia illetve a speciális kezelések bevezetése előtt 25-30% volt, a halálozás felét gégeödéma által okozott fulladás idézte elő. Az angioödémás betegek a szokásos szteroid, adrenalin, antihisztamin kezelésre

7

nem reagálnak, ezért a betegség korai diagnosztizálásának elmaradása miatt gyakran esnek át sürgős tracheotomián.2,55 A gyomor-bél traktus falát érintő submucosus ödéma gyakran akut hasi tüneteket utánozhat. Görcsös hasi fájdalom, pseudoobstruktio, a rohamokat követően vizes hasmenés jelentkezhet. Ennek oka a fokozott folyadék-beáramlás a bélcsatorna lumenébe az ödémás bélfalból. Jellemző tünet a hányinger, hányás is, amely olyan nagyfokú

folyadékvesztéssel

járhat, hogy hypovolémiás sokkot idézhet elő.

Differenciáldiagnosztikai szempontból lényeges, hogy az abdominális roham alatt láz, leukocytosis nincs, bár előfordulhat fehérvérsejtszám emelkedés az intravasculáris dehidratációval párhuzamosan. A hasi ultrahang vizsgálat során néha jól megfigyelhető az ödémás, megvastagodott bélfal és a szabad hasűri folyadék. Az ascites kimutatása és annak terápiát követő felszívódása döntő fontosságú lehet.108 A megfigyelések szerint az angioödémábanban szenvedő betegek körében lényegesen gyakoribb a hyperaciditás ill. a fekélybetegség. Ez a megállapítás azért lényeges, mert ha a beteg hasi fájdalmai az adekvát kezelést követően is fennmaradnak, gastroscopia és aciditás-vizsgálat indokolt.42 Extraabdominális tünetek is jelentkezhetnek, pl. nehézlégzés, mellkasi feszülés érzése. A törzsön megjelenő ödéma során a pleura ill. a pericardium is érintett lehet. Amennyiben az ödéma a központi idegrendszert érinti, átmeneti fejfájás, aphasia, hemiplegia, epileptiform görcsök léphetnek fel. 1.5.3. A tünetek jelentkezési ideje, fennállása, gyakorisága Az örökletes angioödéma tünetei újszülötteken ritkán észlelhetők, inkább kisiskolás-, serdülő-, valamint fiatal felnőttkorban alakulnak ki. Az időskori megjelenés főleg a szerzett formára jellemző. Az ödéma okozta tünetek rohamszerűen jelentkeznek, általában 24-72 óráig állnak fenn, de extrém esetben 4 órától akár egy hétig is fennmaradhatnak. Általában spontán megszűnnek. Megjelenésük gyakorisága változó, lehet hetente, havonta 1-2 alkalommal, de előfordulhat, hogy évekig nem jelentkeznek.2

8

1.5.4. Kiváltó tényezők A betegség kialakulásának hátterében egyértelműen a fizikai vagy szellemi stressz áll. A rohamok kialakulását egyaránt provokálhatják kisebb nagyobb mechanikai sérülések, hosszantartó rossz közérzet, vagy komolyabb lelki trauma. Megfigyelték, hogy egyes nőbetegeknél a menstruációval függtek össze a rohamok. Menses előtt a tünetek megjelenhetnek, illetve kifejezettebbé válhatnak. A terhesség ideje alatt a rohamok sűrűbben ismétlődhetnek, azonban teljes tünetmentesség is előfordulhat.22,82 A fogamzásgátló tabletták egyértelműen rontják a betegség lefolyását.6,117 A betegek egy része a rohamok előtt különös panaszokról számol be, pl. az izmokban érzett feszülésről. A kiváltó tényezők közül a pszichés stressz és a mechanikai trauma - amely lehet igen csekély mértékű is - a leggyakoribb. Triviális dolgok, pl. gyermekek esetében az írás, különböző játékok folyamatos használata, felnőttek esetében gépírás, kerti munka, a lovaglás, nem ritkán a nemi aktus is kiválthat ödémát. Bizonyos ételek fogyasztása után is kialakulhat ödéma. Szöveti mechanikai traumával

járó

műtéti,

diagnosztikai,

fogászati,

gégészeti,

aneszteziológiai

beavatkozások, endoszkópos eljárások (szájüreg-gége, nyak, nyelőcső területén) szintén provokálhatnak súlyos ödémát. Az örökletes angioödémában szenvedő betegek esetében a fentiekben említett terápiás és diagnosztikai beavatkozások különleges körültekintést és megfelelő előkészítést igényelnek, mivel a betegek az esetleges gégeödéma miatt rövid időn belül súlyos, életveszélyes állapotba kerülhetnek.2 1.5.5. Társulás más betegségekkel A kivizsgálás során figyelembe kell venni, hogy az örökletes angioödémában szenvedő betegek körében gyakoribbak az autoimmun betegségek, mint az átlag népességben. Beszámoltak szisztémás lupus erythematosushoz, rheumatoid arthritishez, Sjögren- syndromához, membrano-proliferatív glomerulonephritishez társuló örökletes angiödémáról is.50,65 Az autoimmun kórképekkel való gyakoribb társulás pontos hatásmechanizmusa még nem ismert, valószínűleg a komplement rendszer klasszikus útjának kóros aktivációja vezet az abnormális immunregulációhoz. A C4 és C2 fehérjék csökkent

mennyisége

miatt

az

immunprecipitátumok

csökken.42,79

9

feloldásának

kapacitása

1.5.6. Laboratóriumi vizsgálatok A C1 inhibitor hiány miatt fellépő angioödéma potenciálisan életveszélyes állapotot idézhet elő, de kezelhető, ezért fontos a diagnózis korai felállítása. A családi anamnézis, a tünetek megjelenési formája, gyakorisága felvetheti az örökletes angioödéma gyanúját, de a betegség pontos azonosítása csak a komplement faktorok meghatározásával lehetséges. A komplement rendszer laboratóriumi vizsgálatával elkülöníthető az örökletes angioödémás betegek mintegy 85%-át kitevő I. típusú (HAE I, csökkent C1 inhibitor fehérje szint), illetve a fennmaradó 15%-ot kitevő II. típusú (HAE II, normális vagy emelkedett fehérje szint, kóros fehérje funkció) rendellenesség.26,120 A C1 inhibitor koncentráció tehát - ha nagyon alacsony, vagy ha a normál értéknél magasabb - diagnosztikus értékű. Rohamok alatt mindkét örökletes típus esetén a C2 és C4 fehérjék plazmaszintje a normál érték alá csökken a C1s kontrollálatlan működése miatt. Az alacsony C4 plazmaszint az egyik legérzékenyebb mutatója a betegségnek. Tünetmentes periódusban lehet közel normál értékű, de a roham alatt szintje mindig csökken, így a betegség aktivitásának jó indikátora (a terápiás effektus mérésére is alkalmas). A megfelelő profilaxisban részesített betegek C4-szintje szignifikánsan emelkedik, sőt normális is lehet. A szerzett forma esetén a C1 inhibitor koncentráció normális vagy csökkent, a C1 inhibitor aktivitás, valamint a C2 és C4 plazmaszint egyaránt csökkent. Jellemző paraméter a csökkent C1 hemolítikus aktivitás (amely a normál érték körülbelül 10%-a), valamint egyes esetekben a C1 inhibitor elleni autoantitestek jelenléte (1. táblázat). 1. táblázat. A szérum komplement faktorok jellegzetes változásai C1 inhibitor deficienciában. C1 inh. hiány C1 inh. C1 inh. anti-C1-inhibitor C1 C4 C3 típusa koncentráció aktivitás autoantitest HAE I N N ↓ ↓ ↓ ∅ HAE II N N N vagy ↑ ↓ ↓ ∅ Szerzett típus N +/N vagy ↓ ↓ ↓ ↓ ↓: csökkent; ↑: emelkedett; N: normális

10

1.5.7. Genetikai diagnosztika A fehérjék kimutatására irányuló laboratóriumi vizsgálatok angioödémában a tünetek megjelenése előtt, azaz a korai gyermekkorban még nem elég megbízhatóak.83 A betegség, illetve a genetikai érintettség korai felismerésében kulcsszerepe van a DNS alapú diagnosztikának. A betegség korai felismerése kiemelkedő fontosságú, hiszen ezáltal a felnövő gyereket fel lehet készíteni arra az életmódra, mellyel később elkerülheti a súlyos ödémás rohamok kialakulását. A pontos és korai diagnózis felállítása segít abban, hogy a beteg már a klinikai tünetek első jelentkezésekor tisztában legyen a teendőkkel, ezáltal elkerülje a felesleges, és sokszor veszélyes, téves orvosi beavatkozásokat. A C1-INH gén instabilitása (később részletezem) a kutatókat és a diagnosztikai laborokat speciális módszerek és stratégiák kidolgozására késztette.44,109,120 A génen találhatók kiemelten instabil régiók, amelyekben gyakoribbak a betegségokozó mutációk, azonban jellemzően előforduló, ismétlődő mutációt ritkán sikerült a génben azonosítani. Az örökletes angioödéma genetikai diagnosztikája ezért a mutáció keresésre épül. A mutáció keresés klasszikus módszere a restrikciós enzim hasításra épülő Southern-blot technológia, mely manapság már csak a nagy méretű génátrendeződések kimutatására használatos.35,106 A betegségokozó mutáció kimutatására a legbiztosabb módszer a direkt DNS szekvenálás, ennek költséges kivitelezése miatt azonban több laboratórium használ mutáció szűrő módszereket. Ezek a technológiák a DNS heteroduplex analízisén (HA) alapulnak, ide sorolható a kémiai úton történő heteroduplex hasítás (CCM), a szimpla szálú konformációs polimorfizmus vizsgálat (SSCP), a denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE), és a denaturáló nagynyomású folyadék kromatográfia (DHPLC).16,20,39,57 Ezek a módszerek bár csökkenthetik a mutáció keresés költségeit, de sokszor hosszadalmas a rendszerek beállítása, és a mutáció találati valószínűség sem 100%-os.

1.6. Terápia Az örökletes angioödémás betegek kezelése az alábbi három módon történik: -

Az akut roham kezelése

-

Rövid távú profilaxis

11

-

Hosszú távú profilaxis

1.6.1 Az akut roham kezelése Az akut roham megnyilvánulhat részben gégeödéma, részben a bélfalat érintő ödéma formájában. A gégeödéma külső megjelenésében nem különíthető el egyéb allergiás és gyulladásos mechanizmus alapján kialakuló ödémáktól, de a szokásosan alkalmazott adrenalin, antihisztamin, szteroid terápiára nem reagál. A gégevizenyő progressziója esetén csak az intubáció ill. a tracheotomia a lehetséges kezelés. Az időben alkalmazott szakszerű terápia életmentő lehet, és a beteget megóvhatjuk a felesleges műtéti beavatkozásoktól. Lehetséges alternatíva a kezelésben a friss fagyasztott plazma.91 Ez a vérkészítmény tartalmazza a hiányzó komplement faktorokat. Veszélye, hogy kockázatot jelent a fertőzések átvitelére ill. alloimmunizációra. A legmegfelelőbb terápiás készítmény a tisztított, liofilizált, hepatitis B-re, C-re illetve HIV-re szűrt C1 inhibitor fehérje koncentrátum.27 A készítményből 500-1000 E intravénásan adva, 30 perc és 2 óra közötti időtartamon belül megszünteti a tüneteket és a panaszokat. Eddigi alkalmazása során allergiás tüneteket nem észleltek. A terápiás hatás kb. 3-5 napig áll fenn, függően a kezelés előtti plazma C1 inhibitor szinttől, illetve a beadott dózistól. Súlyos esetben ismételt adagok adása válhat szükségessé. A C1 inhibitor koncentrátum alkalmazásának anyagi megfontolásai is vannak, hiszen a készítmény igen drága. Az újabb készítmények 4°C-on 3 évig tarthatók el.13,114 Valószínűleg a betegség ritka előfordulása miatt viszonylag későn kezdtek el foglalkozni a fehérje rekombináns rendszerekben való előállításával. A rekombináns fehérje előállítását tovább nehezíti, hogy a természetesen előforduló, funkcionális jelentőséggel bíró jelentős mértékű glikozilációt nehéz nem humán rendszerekben reprodukálni. A jelenleg fázis II. kipróbálás alatt lévő egyetlen rekombináns C1 inhibitor fehérjekészítményt transzgenikus nyulak tejéből vonják ki.85 A C1 inhibitor fehérjekészítmények hátránya, hogy alkalmazásuk intravénás bevitellel történik, ami jelenleg kizárólag orvosi felügyelet mellet történhet meg. Az

12

újabb gyógyszerkutatások során olyan molekulákat igyekeznek kifejleszteni, melyek akár az akut, akár a hosszú távú terápiában orálisan alkalmazható gyógyszerként kerülhetnének forgalomba. Az egyik ilyen molekulacsoport lehet a kallikrein inhibitorok csoportja. Az angioödéma klinikai tüneteinek kialakításában fontos szerepet játszik a vazoaktív bradikinin, mely a kallikrein aktiválódásának eredményeként szabadul fel. A szarvasmarhából kivont aprotonin nevű kallikrein inhibitort már évtizedekkel ezelőtt alkalmazták az angioödéma kezelésére, később azonban betiltották, mivel bizonyos esetekben végzetes kimenetelű anafilaxiás reakciót váltott ki.77,92 Egy újonnan kifejlesztett kallikrein inhibitor (DX-88, mely egy szintetikus Kunitz domén fehérje) azonban sokkal ígéretesebb lehet a betegség kezelésében, mivel megfelelően magas szelektivitást és affinitást mutat a kallikrein fehérjék szempontjából, ugyanakkor nem vált ki immunreakciót.60,116 Szintén reménykeltő eredmények születtek fázis II. vizsgálatokban a bradikinin receptor antagonista Icatibant-tal kapcsolatban. Ez a molekula hasonló kémiai szerkezetű a bradikininhez, azonban aminosav összetételének köszönhetően nem aktiválódik a két kulcsfontosságú bradikinin hasító enzim (karboxipeptidáz és ACE) hatására. Az Icatibant a bradikininnel megegyező mértékű affinitást mutat a B2 receptorok iránt, de kötődésével nem aktiválja azt, így hatékonyan gátolhatja a bradikinin érfal-permeabilitást fokozó hatását.4,110 1.6.3. Rövid távú profilaxis Abban az esetben, ha az örökletes angioödémábanban szenvedő beteg olyan diagnosztikai vagy sebészi beavatkozás előtt áll (elsősorban fej, nyak, gége területén) amely traumás hatása miatt ödémát, vagy akár akut rohamot válthat ki, a rövid távú profilaxis indokolt. A beavatkozások előtt 4-5 nappal 600 mg/nap mennyiségű danazol (vagy nagyobb dózisú stanosolol, tranexámsav illetve epszilon-amino kapronsav [EACA]) adása javasolt.40,53,73,101 A kiválasztott gyógyszer adása a beavatkozás után még további 4-5 napig szükséges. Amennyiben a beteg előzőleg már hosszú távú profilaxisban részesült, a beavatkozás idejére a fenntartó dózist meg kell emelni. Alkalmazható friss fagyasztott plazma is a beavatkozás előtti napon (2 egység), valamint közvetlenül a manipuláció előtt ugyanekkora mennyiségben. A legbiztonságosabb és leghatásosabb rövid távú prevencióra alkalmas szer a C1 inhibitor koncentrátum.72,74

13

1.6.2. Hosszú távú profilaxis Hosszú távú gyógyszeres kezeléssel illetve a provokáló tényezők kiiktatásával a betegek nagy részénél kivédhetők az akut rohamok. Ezt a megelőző terápiát abban az esetben alkalmazzák, ha a beteg kórelőzményében már több alkalommal volt életveszélyes állapotot előidéző ödémás roham illetve, ha a tünetek gyakran jelentkeznek (hetente, havonta 1-2 alkalommal). A választható gyógyszeres kezelés típusai a következők: Antifibrinolitikus szerek: Epszilon-aminokapronsav (EACA), illetve tranexámsav. 1966-ban kezdték alkalmazni ezeket a szereket, melyek részben a plazminogént inaktiválják, részben a C1 aktivációját gátolják. A kezdeti jó eredményeket (a rohamok gyakorisága és súlyossága csökkent) követően nem kívánt mellékhatások (izomfájdalom, trombózis, vérnyomás emelkedés) miatt alkalmazásuk kevésbé terjedt el. Főleg gyermekeknél és terheseknél javasolt, akiknél a csökkentett hatású anabolikus szteroidok adása nem ajánlott.14,56,84 Csökkentett hatású anabolikus szteroidok: 1960-ban Spaulding és munkatársai közölték megfigyelésüket, mely szerint a metil-tesztoszteron

alkalmas

az

örökletes

angioödémában

kialakuló

rohamok

kivédésére.103 Bár a pontos hatásmechanizmus még nem ismert, a metil-tesztoszteron valószínüleg fokozza a C1 inhibitor termelődését a májban, illetve emeli a C4 plazmaszintjét is. A későbbiekben bizonyítást nyert, hogy a csökkentett hatású szintetikus androgén, a danazol növeli a plazma C1 inhibitor szintjét, és ezáltal képes kivédeni a rohamokat. Ugyanakkor a mellékhatások szempontjából kedvezőbb szer, mint a tesztoszteron. Hasonló mechanizmus révén hat a stanosolol is. Lényeges, hogy mindig a legkisebb terápiás dózist alkalmazák, mert így csökkenthetők a nem kívánt mellékhatások (testsúlynövekedés, izomfájdalmak, izomgörcsök, gastrointestinális zavarok, menstruációs zavarok, gyermekeknél fejlődési zavarok, virilizáció, hirsutizmus). Amennyiben a terhes anya danazolt szedett, a születendő leánygyermek maszkulinizácója is előfordulhat.1,33,34,58,63

14

Ritkán, főleg gyermekeknek és terhes nőknek indokolt esetben heti egy alkalommal a C1 inhibitor koncentrátum is adható folyamatos profilaxisként. 1.6.4. A szerzett C1 inhibitor deficiencia kezelése A betegség szerzett formájának gyógyszeres terápiájáról kevesebb ismeret áll rendelkezésünkre. Legkézenfekvőbb megoldásnak tűnik az alapbetegség feltárása és annak gyógyítása.12,25,59 A plazmaferezis nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket. Hatásos lehet a danazol és tranexamsav maximális dózisban való alkalmazása, másik alternatíva a C1 inhibitor koncentrátum. 1.7. Az örökletes angioödéma molekuláris háttere 1.7.1. A C1 inhibitor fehérje A plazmában található C1 inhibitor fehérje 104 kDa tömegű 478 aminosavból álló peptidlánc. A fehérje egy szerkezetileg evolúciósan igen konzervált szerpin (szerinproteáz inhibitor) doménből (365 aminosav), illetve egy - csak a C1 inhibitorra jellemző - N-terminális peptidszakaszból (113 aminosav) áll. A fehérje nagymértékben glikozilált, tömegének közel 30%-át a szénhidrát oldalláncok teszik ki (a glikozilációs helyek nagy része az N-terminális régióban található, szerepük még nem ismert).21,24 A többi szerpin típusú fehérjéhez hasonlóan, a C1 inhibitor reaktív centrumával a célproteázok aktív centrumához kötődik, és ott fejti ki gátló hatását. A folyamatban először egy reverzibilis enzim-inhibitor komplex alakul ki, majd a C1 inhibitor fehérje konformációs átalakuláson megy keresztül, és az egyik béta-redős szerkezetű része bekötődik a célproteáz aktív centrumába. Ezzel egy stabil enzim-inhibitor komplex alakul ki, így gyakorlatilag csapdába ejti a proteáz fehérjét, miközben a C1 inhibitor fehérje elhasad. A kialakult fehérje komplex annyira stabil, hogy az esetek jelentős részében a komplex specifikus receptoroknak köszönhetően hamarabb eltávolítódik a keringésből, minthogy az inhibitor felszabadulna a komplexből.45,67,107,115 1.7.2. A C1-INH gén A C1-INH gén a 11. kromoszómán található, 17 kilobázis hosszúságú, 8 exonból áll. Az első exon, a második exon első szaksza és a nyolcadik exon egy jelentős része

15

nem transzlálódó régió.96,118 A gén molekuláris sajátosságai következtében instabil, ennek tudható be a sporadikus esetek gyakori előfordulása (a betegek 25%-a de novo, negatív családi anamnézisű eset).29,43,109 A C1-INH gén 17 teljes intragenikus Alu szekvenciát tartalmaz. Az Alu szekvenciák mintegy 300 bázispár hosszúságú jellegzetes bázissorrendű nukleinsav szakaszok, melyeket az Alu restrikciós enzimek hasítani képesek (innen ered az elnevezésük). Szerepük az örökletes angioödéma kialakításában azért fontos, mert ezek a szakaszok asszimetrikus DNS rekombinációban vehetnek részt, amely a C1-INH génben kóros intragenikus átrendeződéshez vezethet.95 A hibás rekombináció esélyét tovább növeli az a szerkezeti sajátosság, hogy az említett Alu szekvenciák jelentős része ellentétes irányultságú, és ily módon az Alu szekvenciák közötti rekombináció a génen belül is, és nem csak a homológ kromoszómák között jöhet létre.104 Az aszimmetrikus rekombináció miatt kialakuló molekuláris változások jellemzően nagyobb méretű deléciók (DNS-szakasz kiesések), inszerciók (DNS-szakasz beékelődések), duplikációk (DNS-szakaszok megkettőződése), melyek végeredménye szinte

minden

esetben

az

allél

működésképtelenné válása (nem

megfelelő

transzkripció), és ezáltal I. típusú örökletes angioödéma kialakulása.10,35 A mechanizmus alapján elviekben elképzelhető lenne egy nagyobb méretű inverzió (DNS szakasz megfordulás) kialakulása is, erre azonban nem található példa az irodalomban. A lehetséges génátrendeződésekre példák a 2. ábrán láthatók.

16

2. ábra. Alu szekvenciák miatt kialakuló deléciók lehetséges mechanizmusa a C1-INH génben. a: aszimmetrikus, interkromoszómális rekombináció, b: intrakromoszomális rekombináció. Az ábrán a téglalapok az exonokat, a nyilak az Alu szekvenciákat (iránnyal) jelölik.

Az ilyen típusú génátrendeződéseknek jellemző a kialakulási ideje. A gametogenezis során a meiozis egy meghatározott szakaszában a kromatinállomány oly mértékben összesűrűsödik, és a gének/kromoszómák oly mértékben kerülnek közel egymáshoz, hogy lehetővé válik a rekombináció. Ez a természetben a változatosság és a genetikai alkalmazkodás egyik alapfolyamata, azonban a C1-INH génben, ebben a stádiumban következhet be egy esetleges génátrendeződés. Tehát az említett ok miatt kialakuló de novo mutáció valamelyik szülő ivarsejtjében alakul ki. Genetikai instabilitást okozhatnak a genomban található CG (vagy CpG) dinukleotidok is. Ilyen dinukleotid található a fehérje reaktív centrumában lévő 444. arginin aminosavat kódoló kodonban is (CGC, 8. exon). A CpG dinukleotidok potenciális metilációs helyek a genomban, mely metiláció után a citozin bázis deaminálódhat, és C→T (CGC→TGC) vagy G→A (CGC→CAC) tranzíciók jöhetnek létre.102 Ezek a pontmutációk aminosavcseréhez, és ezáltal (mivel a kodon a fehérje mutációra legérzékenyebb részét, a reaktív centrum egyik aminosavját kódolja) a fehérje kóros működéséhez vezethetnek (3. ábra). A II. típusú örökletes angioödémában az esetek túlnyomó többségében a szóban forgó régió mutációja a kóroki tényező.

3. ábra. Példák a C1-INH gén 8. exonjában található 444. arginin (Arg) kodonjában bázisszubsztitúció révén kialakuló pontmutációkra. A négyzetek felső részén található betűk a DNS bázissorrendet mutatják a leolvasási keretnek megfelelő tripletekbe (kodon) rendezve, míg az alsó részen található három betűs rövidítések a kódolt aminosavakat jelölik.

17

A 444. arginin körüli régióban egy másik érdekes mechanizmus is okozhatja a genetikai struktúra megváltozását, ami azonban nem köthető a metiláció következtében kialakuló deaminálódáshoz. Ebben a régióban több pontmutációt, valamint deléciót és inszerciót is találtak.11,15,70 A mutációk kialakulásának oka, hogy a DNS-szakasz ezen részén lévő GC gazdag régióban a DNS replikáció során a polimeráz enzim „megállhat” és ezáltal lehetőség nyílik különböző kisebb-nagyobb hibák kialakulására. Jó példa erre az egymással ellentétes irányú ismétlődések miatt kialakuló úgynevezett hairpin (hajtűkanyarszerű) kitüremkedés. Ilyen esetben az egyik DNS szál a replikáció során önmagával illeszkedik össze, és a polimeráz enzim egyszerűen figyelmen kívül hagyja a „hajtű” nukleotidjait, és folytatja a másolást (4. ábra). Az ilyen deléciók, inszerciók következménye szinte minden esetben I. típusú angioödéma.18,54

18

4. ábra. A hajtűkanyar miatt, a replikáció során kialakuló mutációk típusai. Panel I: Deléció kialaklása ellentétes irányú ismétlődések miatt. A. A két komplementer DNS szál a könnyebb elkülönítés miatt eltérő vastagsággal jelölve. A piros színű, ellentétes irányú nyilak az ismétlőső szekvenciarészleteket mutatják. B. A vastagabbik szálon a replikáció során a két szál szétválása után kialakul a „hairpin” struktúra. C. A félkész DNS szál és a polimeráz enzim időlegesen levállik a templát szálról. D. A szintetizálandó szál újra kötődik a templáthoz, azonban átcsúszva a „hairpin” struktúra túloldalára. E. A folytatódó polimerizáció kizárja a „hairpin” struktúra nukleotidjait. Panel II: Inszerció kialakulása ellentétes irányú ismétlődések miatt. A. A két komplementer DNS szál a könnyebb elkülönítés miatt eltérő vastagsággal jelölve. A piros ellentétes irányú nyilak az ismétlőső szekvenciarészleteket mutatják. B. A replikáció rendben végbemegy az ellentétes ismétlődéseket tartalmazó szakaszon. C. A félkész DNS szál és a polimeráz enzim időlegesen leválik a templát szálról, a „hairpin” struktúra kialakul a félkész szálon. A stuktúra 3’ vége anellálódik a templát szál 5’ ismétlődésével, ezzel gátolja a temlát szálon a hajtűkanyar kialakulását. D. A folytatódó polimerizáció duplikációhoz vezet.19

A C1-INH gén három helyen is tartalmaz olyan speciális repetitív szekvenciákat (pl. CAACAACAA), ahol a kettősszálú DNS két szála egymás mellett elcsúszva helytelenül illeszkedhet egymáshoz. Ennek során úgynevezett „körte-alakú” (cruciform)

19

kitüremkedések keletkezhetnek a nukleinsav láncon, amelyet a javítómechanizmusok általában egyszerűen levágnak (5. ábra).17 Ezek a hibák a DNS lánc megkettőződésekor jönnek létre, mivel a nukleinsavlánc másolását végző enzim, a DNS-polimeráz, nehezebben képes a repetitív szekvenciák másolására. Ilyen szakaszok replikációjakor sokszor előfordul, hogy az enzim a már megkezdett ismétlődő szekvencia közepén a másolást abbahagyja, és leválik a DNS szálról. Később természetesen újra csatlakozik, közben azonban a félkész másolat elcsúszhat, így egy kis hurok keletkezik, melyet a DNS javító mechanizmusok kivághatnak.19 A három repetitív szekvencia közül egy a 8. exon nem transzlálódó régiójában található, melynek mutációi nagy valószínűséggel nem járnak funkcionális következménnyel. További két repetitív szekvencia található az 5. exonban, amelyek mutációi mind I. mind II. típusú örökletes angioödéma kialakulásához vezethetnek. A trinukleotid repeat szekvenciákon kialakuló körteformájú replikációs hibák sokszor három nukleotid kieséséhez vezetnek, melyek csak kis változást okoznak (1-2 aminosavat érinthetnek), de a leolvasási keretet nem csúsztatják el. Néha azonban ezekben az esetekben is előfordulhat olyan mutáció mely a leolvasási keret eltolódásához, ezáltal hibás fehérjéhez vezet.11,112

5. ábra. Körte alakú kitüremkedések a DNS-láncon. Az ábrán olyan szekvencia sajátosságok miatt kialakuló, körtealakú DNS másolási hibák láthatók, melyek a C1-INH génben mutációk (elsősorban inszerciók és deléciók) kialakulásához vezethetnek.19

20

1.7.3. Betegség okozó mutációk a C1-INH génben Bár az örökletes betegségek előidézésében szerepet játszó mutációk felderítése elsősorban a molekuláris diagnosztika feladata, az angioödéma esetében a C1-INH génen kialakult mutációk a gyógyító orvosokon és betegeken kívül a kutatók számára is szolgálnak értékes információval. Mivel a fehérjét még nem sikerült kristályosítani, így minden

újabb

megismert

mutáció

közelebb

vihet

a

szerkezet

és

funkció

összefüggéseinek megismeréséhez.23 Az örökletes angioödéma nagy fenotípusos szórást mutat, egyes betegek havonta akár több rohamot is átélnek, míg mások akár évekig tünetmentesek maradhatnak.3,55 A környezeti tényezők mellett ebben szerepe lehet a C1-INH gén mutációk természetének is, jelentős genotípus-fenotípus összehasonlítás eddig azonban még nem született.111 A betegségokozó mutációkkal kapcsolatos kutatások egyik alapfeltétele a mutációk ismerete, és rendszerezése. Ebben a folyamatban nagy segítséget nyújt egy olyan adatbázis, ahol a leírt mutációkkal kapcsolatban a lehető legtöbb adat naprakészen rendelkezésre áll. 1.8. Genetikai adatbázisok Az Internet fejlődésének és a „web-barát” adatbázisrendszerek kialakulásának köszönhetően mára jelentős számú mutációs adatbázis áll a kutatók rendelkezésére.36 A bioinformatikai szolgáltatások ezen ága, bár minőségét tekintve igen tág határok között mozog, mégis nagyon fontos eszköze a keletkező óriási mennyiségű információ rendszerezésének. 1.8.1. Központi mutációs adatbázisok A genom összes génjében leírt mutációk feltüntetésére törekvő adatbázisokat központi adatbázisoknak nevezzük. Az ilyen gigantikus méretű on-line források esetében általában egy non-profit szervezet biztosítja a működési feltételeket, így ezeknél a hozzáférés általában ingyenes. Jó példa a központi mutációs adatbázisra az OMIM (Online Mendelian Inheritance In Man: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), vagy a HGMD

(The

Human

Gene

http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html).

21

Mutation

Database:

Ezeknek az adatbázisoknak nagy előnye, hogy az összes gént azonos struktúrában, konzekvensen kezeli, hátránya azonban a robosztussága, mely miatt az újonnan leírt mutációk akár 2-3 év késéssel kerülnek be a rendszerbe. A központi mutációs adatbázisok általában csak az alapinformációt tartalmazzák a mutációkkal kapcsolatban (pozíció, nukleotid/aminosav csere, referencia). 1.8.2. Lókusz specifikus adatbázisok A központi mutációs adatbázisok kiegészítéseként jöttek létre a lókusz specifikus adatbázisok (LSDB), melyek többnyire egy gént, vagy néha egy géncsoportot, esetleg egy betegségtípushoz kapcsolódó géneket tartalmaznak.64 Ezek az adatbázisok kutatócsoportok, vagy kisebb tudományos társaságok gondozásában vannak, akik általában maguk is végeznek genetikai munkát az érintett területen. A lókusz specifikus adatbázisok előnye a kis méretükből fakad, ezek az on-line információforrások általában naprakész információt tartalmaznak az adott génnel kapcsolatban. Ezen rendszerek nagy előnye még, hogy megfelelő szabályozás mellett a nem publikált mutációkat is tartalmazhatják, nagymértékben növelve a rendelkezésre álló információ mennyiségét. Hátrányuk éppen a sokrétűségükből fakad, hiszen az adatokat a legkülönfélébb formában tálalják. A lókusz specifikus adatbázisokban tárolt mutációs információ mennyisége jelentős szórást mutat, a központi adatbázisokra jellemző alapadat mennyiségtől akár a teljes klinikai, fenotípusos és módszertani hátteret magába foglaló internetes oldalakig. Néhány évvel az első lókusz specifikus adatbázisok megjelenése után már megfogalmazódtak azok az alapelvek, melyek az egységesítést, szolgálnák. Azok az adatok, melyek minimálisan szükségesek egy ilyen adatbázisban, a mutációs rekord részleteiben: -

Az allélre jellemző egyedi azonosító

-

A bekerült adat forrása (publikált cikk, absztrakt, a leíró adatai)

-

Az alléllel kapcsolatos alapadatok (faj, gén, referencia szekvencia)

-

Az allél megfelelő interpretációja (megnevezés, típus, nukleotid változás, nevezéktan, stb.)99,100 A megfelelő nomenklatúrai, adattárolási és interpretációs elvek lefektetése után

Claustres és munkatársai tudományos közleményben írták le az ideális lókusz specifikus adatbázis követelményeit.36

22

2. Célkitűzések Célom volt a rendelkezésemre álló magyarországi örökletes angioödémás betegpopuláció kórokozó mutációinak kimutatása, feltérképezése. A C1-INH gén vizsgálatára alkalmazott technológiák beállításával és pontos dokumentálásával egy olyan diagnosztikai eszközparkot kívántam létrehozni, amely egyszerűen alkalmazható később más betegségek genetikai diagnosztikájában is. A betegségben a kóroki mutációk megismerésével lehetőség nyílik a családon belüli gyors, pontos és korai diagnosztikára. Az újonnan leírt missense mutációk ismerete hozzájárulhat a fehérje szerkezet-funkció összefüggéseinek feltárásához. Az örökletes angioödéma szakterületén folyó európai együttműködés keretében egyértelmű igényként merült fel a C1-INH gén internetes lokusz-specifikus mutációs adatbázisának létrehozása. A nagy mennyiségben keletkező mutációs adat kezelésére modern, a kor követelményeinek megfelelő tároló rendszert kívántam kidolgozni. Ezt a tevékenységet a következő célkitűzésekkel kezdtem meg: -

A C1-INH gént érintő valamennyi ismert DNS-szekvencia változás folyamatosan megújuló, legteljesebb gyűjteményének létrehozása

-

Az összegyűjtött adatok sokoldalú kereshetősége

-

Az érintett laboratóriumok közötti információ-áramlás elősegítése

-

Hasznos információ-forrás biztosítása egy-egy új szerkezeti variáns betegség-okozó szerepének eldöntéséhez.

23

3. Vizsgált egyének Az általunk vizsgált örökletes angioödémában szenvedő betegek Dr. Farkas Henriette klinikus szakorvos közreműködésével kerültek hozzánk. A betegek gondozása és szakszerű ellátása a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömbjében az erre szakosodott Angioödéma Központban történik. A dolgozat készítéséig 26 család (23 I. és 3 II. típusú család, 64 beteg) mintáját dolgoztuk fel a genetikai vizsgálatok elvégzésére.

A

betegek

az

ország

minden

területéről

származnak,

mivel

Magyarországon kizárólag ez a központ foglalkozik gondozásukkal. Az angioödéma központban történik a genetikai tanácsadás is. A diagnózis felállítása minden esetben a klinikai tünetek és a komplement laboratóriumi eredmények együttes értékelése alapján, a diagnosztikai kritériumoknak megfelelően történt. A szükséges populációgenetikai vizsgálatokhoz egy korábbi véradó gyűjtésből származó kontroll populációt használtunk, amelyből véletlenszerűen választottunk ki 50 egyént és azokat anonim módon kezelve végeztünk kontroll vizsgálatokat.

24

4. Módszerek 4.1. Komplement vizsgálatok A C1 inhibitor deficienciával kapcsolatos fehérjevizsgálatok a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömbjében a Komplement Laboratóriumban történtek. Az általuk használt módszerek rövid áttekintése: -

A C3, a C4 és a C1 inhibitor koncentráció mérése egy immunkémiai módszerrel, radiális immundiffúzióval történik. Ez egy antigén- (a vizsgált komplement fehérjék) antitest (agaróz gélre felvitt) kötődési reakció, ahol a sugárirányú diffúzió révén kialakult precipitációs gyűrű átmérője a bemért minta antigén tartalmától függ. Ebből az átmérőből aztán standardok segítségével számítható ki a vizsgált fehérje koncentrációja.

-

A komplementrendszer aktiválhatóságának vizsgálata során a mintánkhoz ún. aktiváló

ágensként

birkavörösvérsejtet

adnak,

amelyet

az

aktivált

komplementrendszer enzimatikus kaszkádja hemolizál. A felszabaduló hemoglobin mennyisége arányos a minta aktiválható összkomplement mennyiségével. -

C1 inhibitor aktivitás mérésére két módszer áll rendelkezésre: -

Enzimgátlásos módszer (DADE Behring kit): a felhasznált kit tartalmaz C1 észteráz enzimet, és annak egy mesterséges szubsztrátját. Ha a vizsgált minta alacsony aktivitású, vagy kevés aktív C1 inhibitort tartalmaz, nem gátolja a C1 észteráz

működését,

így

az

általa

hasított

szubsztrát

mennyisége

(spektrofotometriásan mérve) fordítottan arányos lesz az inhibitor aktivitással. -

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) módszer (Quiedel C1 inhibitor ELISA kittel) Ha a fenti diagnosztikai módszerek segítségével igazolható a betegség fennállása,

a továbbiakban indokolt az örökletes angioödéma hátterében álló genetikai eltérések feltérképezésére. 4.2. Mintagyűjtés A betegektől genetikai vizsgálatra EDTA-val alvadásgátolt, 10 ml perifériás vért kapunk, melyet fagyasztva szállítanak intézetünkbe. Amennyiben erre lehetőség nyílik, egy családon belül akár az összes beteg családtagtól kérünk vért. A családi 25

halmozottságot mutató esetekben a klinikus partnertől részletes családfa információkat is kapunk. Beteg családonként egy személyt vizsgáltunk, és a kapott eredmények függvényében vizsgáltuk tovább a hozzátartozókat. 4.3. DNS kivonás A vizsgálatainkhoz szükséges DNS kivonása a perifériás vérben található fehérvérsejtekből történik. A megfelelő mennyiségű és minőségű DNS-t egy gyári kit segítségével, a Gentra cég által gyártott Puregene DNA Isolation Kit-tel vonjuk ki a gyári protokollban leírtak alapján. A kit első lépésben feloldja a vörösvértesteket. A felszabadult hemoglobint többszöri desztillált vizes mosással távolítjuk el. Ezután a fehérvérsejteket feloldása következik, illetve ha szükséges proteináz-K enzimes emésztéssel segíthető a sejt feltárás. A lizátumból a fehérjét a következő lépésben tömény sóoldatos kicsapással távolítjuk el. A megmaradt, nagyrészt DNS-t tartalmazó oldatból, nyagyobb tisztaságot elérendő propil-alkoholos kicsapást, majd 70%-os etanolos mosást alkalmaz a módszer. A tisztított DNS oldatot Tris-EDTA (TE) oldatban oldottuk be, és hosszútávon -20ºC-on tároltuk. A Southern-blot analízishez szükséges nagyobb mennyiségű DNS előállításához a vegyszer és a vér mennyiségét 3-4-szeresére növeljük. Az elkészült DNS oldat koncentrációját és tisztaságát fotometriás méréssel ellenőrizzük. 4.4. Southern-blot analízis A nagymennyiségű genomiális DNS-t tartalmazó oldatot BclI restrikciós endonukleázzal emésztettük. A keletkezett fragmentumokat Souther-blot technikához speciálisan kifejlesztett agarózból készült gélben (SeakemLE 0,75%-os) méret szerint szeparáltuk. Az elektroforézist követően a DNS-t NaOH-dal denaturáltuk, majd kapilláris transzfer útján nylon membránra vittük át (blottolás). A fixálás után radioaktívan jelölt szondával (A C1-INH gén cDNS-ét használva) hibridizáltunk, mely specifikusan csak C1-INH gént kódoló a DNS szakaszhoz kötődik. A cDNS szondát bakteriális plazmidba klónozva Mario Tosi franciaországi laboratóriumából kaptuk. A C1-INH gént kívülről határolja két BclI-enzim hasítási hely, míg a génen belül ez az enzim nem hasít.105 A genomiális DNS-t tehát ezzel az enzimmel emésztve, a

26

keletkezett fragmentumok között a gén (akár normál, akár mutáns) teljes hosszában jelen lesz. Normál esetben ez egy 20 kilobázis hosszúságú DNS szakasz. A hibridizációt követően autoradiográfiával tettük láthatóvá a Southern-blot eredményét. Amennyiben a betegnél az egyik allélon legalább 1 kilobázis nagyságot meghaladó deléció vagy inszerció van, az előhívott filmen megjelenik egy újabb csík (extra fragmens), ami jelzi a mutáns, deléciót vagy inszerciót tartalmazó allél jelenlétét. A 7. ábrán a normál mintázat mellett három általunk talált különböző típusú deléciós mutáns Southern-blot képe látható.

7. ábra. a: A Southern blot analízishez használt BclI enzim emésztési helyei (vastag vonal: a gén teljes szakasza, téglalapok: exonok); b: Southern blot analízis autoradiogramja (1: normál mintázat, 2-4: deléciós mutánsok). A 2. számú mintában körülbelül 9 kilobázisos, míg a 3-4 mintában 2-4 kilobázisos deléció látható.

4.5. Géndózis analízis A Southern-blot technológiával észlelt kisebb kiterjedésű eltérések (3-4 kilobázis) esetében fontos kérdés volt annak bizonyítása, hogy ezek a deléciók érintik-e valamelyik exont (a génben vannak 3-4 kilobázisnál nagyobb intronok), hiszen ebben az esetben tekinthetjük valóban betegség-okozónak a felfedezett mutációt. Mivel autoszomális domináns betegségről van szó, így egy normál gén kópia minden egyénben jelen van, a feladat tehát a betegek esetében az, hogy megkeressük azt az exont vagy exonokat, amelynek mennyisége fele a többi exonhoz képest. A kérdés megválaszolására valós idejű PCR és relatív mennyiségi elemzési technikát alkalmaztunk. Ennek során exon-specifikus PCR-reakciókat végeztünk a 3-8. exonokat amplifikáló primerekkel egy kettős szálú DNS-re specifikus fluoreszcens SybrGreen elnevezésű fluoreszcens festék jelenlétében. Minden esetben egy normál és egy deléció szempontjából pozitív mintát hasonlítottunk össze. A valós idejú PCR-készülékben (LightCycler, Roche) végrehajtott mérés során a készülék minden ciklusban rögzíti az 27

aktuális fluoreszcencia értéket, ami egyenesen arányos az abban az időpillanatban jelenlevő kettős szálú PCR-termék mennyiségével. A készülék által számított, legnagyobb fluoreszcencia-növekedési sebességet mutató ciklusszám, a crossing point (Cp) érték pedig információt ad a kiindulási templát mennyiségére vonatkozóan. A rendszert sikerült úgy optimalizálni, hogy a vizsgálni kívánt kétszeres mennyiségi különbséget is reprodukálhatóan kimutassa. A valós idejű PCR technológián alapoló géndózis mérést a Southern-blot kiegészítéseként használtuk, a jövőben azonban akár kiválthatja a munka- és időigényes tradícionális módszert. 4.6. Primer tervezés A C1-INH gén vizsgálatára saját PCR primereket terveztünk. Korábbi elképzeléseink szerint mi is alkalmaztunk volna mutáció szűrő módszert (single strand conformational polymorphism, SSCP), azonban a nehézkes beállítás, alacsony találati arány, és a direkt szekvenálás optimalizálása után a módszert elvetettük. Az SSCP technológiához tervezett primereknél célunk volt, hogy a teljes kódoló régiót lefedjük olyan oligonukleotidokkal, amelyek maximum 200 bázispáros PCR terméket amplifikálnak, mivel így nagyobb találati arányra számíthattunk volna. A PCR primerek tervezésekor fontos szempont volt, hogy minden oligonukleotid hasonló tulajdonságokkal (a keletkező PCR termék mérete, Tm) rendelkezzen, így nem csak a saját párjával képes amplifikálásra, hanem a különböző primerek egymással könnyebben kombinálhatók. Ennek köszönhetően az eredetileg SSCP-hez tervezett primereket fel tudtuk használni a direkt szekvenáláshoz, a géndózis méréshez és a szükséges populációs vizsgálatokhoz is. A PCR primereket a bárki számára szabadon hozzáférhető Primer3 programmal terveztük (http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3_www.cgi).97 A felhasznált primerek tulajdonságait és az általuk lefedett szakaszokat a 2. táblázat és a 8. ábra foglalja össze.

28

2.táblázat. A C1-INH gén SSCP analíziséhez tervezett primerek szekvenciája, olvadáspontja (Tm) és a keletkező PCR termék mérete (az elnevezés alapja: HANO[exon][exonon belüli sorrend][forward/reverse]). Primer

Szekvencia

Tm

Exon 1

PCR termék hosszúsága 156 bp

2

213 bp

3

179 bp

3

176 bp

3

176 bp

3

173 bp

4

183 bp

5

180 bp

5

191 bp

6

200 bp

7

180 bp

7

178 bp

8

156 bp

8

181 bp

8

179 bp

HANO1f

5’-GGCCAGCCAATAGCTAAGAC-3’

58,95 °C

HANO1r

5’-ACTCCATGCTTTCCACCCTA-3’

59,55 °C

HANO2f

5’-GGAGGGAATTCGCTAAGAGG-3’

60,17 °C

HANO2r

5’-ATCCCACAAGGGACCACATA-3’

60,05 °C

HANO3af

5’-GGACTGTGCCTCGTAGTAAGAAA-3’

59,83 °C

HANO3ar

5’-GGATGGGTTCAACGAATAGC-3’

59,39 °C

HANO3bf

5’-GCTATTCGTTGAACCCATCC-3’

59,39 °C

HANO3br

5’-CTGTTGGGAGCTGGGTAGTT-3’

59,21 °C

HANO3cf

5’-CAACCCACCCAACCAACTAC-3’

60,13 °C

HANO3cr

5’-GCTGAGAAGGCGTGGTAGAG-3’

60,16 °C

HANO3df

5’-GGGGGATGCTTTGGTAGATT-3’

60,15 °C

HANO3dr

5’-TGGGAGTGTCCAACAAATGA-5’

59,94 °C

HANO4f

5’-ATCTCTGCCCTTTGTTGCAG-3’

60,40 °C

HANO4r

5’-CAGACACTGCCCATTCCTG-3’

60,25 °C

HANO5af

5’-CTCTCAAATCGTGCTCATGG-3’

59,39 °C

HANO5ar

5’-CAGGTGTTGATGAGCTCCAA-3’

59,83 °C

HANO5bf

5’-CCCCAGAGTCCTAAGCAACA-3’

60,25 °C

HANO5br

5’-GGACCCAGAATGGGAAGACT-3’

60,31 °C

HANO6f

5’-AGCAACCCTCCCACCTCT-3’

59,64 °C

HANO6r

5’-TTCAAACAGGAGAAGGAAAGG-3’

58,42 °C

HANO7af

5’-CCAGGAGAGAGATGCGGTAG-3’

59,97 °C

HANO7ar

5’-GTTTCTCCATGATGGCCTTG-3’

60,46 °C

HANO7bf

5’-ACATGGAACAGGCTCTCAGC-3’

60,42 °C

HANO7br

5’-GGCCTGGGAGTAACCCTAAG-3’

59,96 °C

HANO8af

5’-CATGCTGGCTTCTGACTCTG-3’

59,73 °C

HANO8ar

5’-CCACCCCAGTCTCTGTCAGT-3’

60,15 °C

HANO8bf

5’-ATGCAGCACCAGACAGTGC-3’

61,09 °C

HANO8br

5’-AGGCCCTGGGGTCATATACT-3’

59,67 °C

HANO8cf

5’-AGCCTCCGCCATCTCTGT-3’

60,95 °C

HANO8cr

5’-GAGCTGAGGCTGGAGAGGTA-3’

59,70 °C

29

8. ábra. A C1-INH gén exonjait lefedő PCR termékek lokalizációja (vékony csík: nem kódoló szekvencia; fekete téglalap: transzlálódó exon-szakasz; üres téglalap: nem transzlálódó exonszakasz). A keletkező PCR termék méretét bázispárban tüntettük fel. A szekvencia alsó részén található számok a genomiális DNS pozíciókat jelölik az X54486 (GeneBank) referencia szekvenciához viszonyítva.

4.7. Direkt DNS szekvenálás

A szekvenálással vizsgálni kívánt exont először polimeráz láncreakcióval (PCR) sokszoroztuk fel. A fragmensek sokszorozásához a korábban megtervezett primerek közül

az

exononkénti

legszélső

oligonukleotidokat

használtuk

(pl:

HANO3af+HANO3dr, HANO8af+HANO8cr). A fragmensek sokszorozásához standard 30

PCR körülményeket alkalmaztunk (95°C: 30 mp.; 60°C: 45 mp.; 72°C: 45 mp.), vegyszerként a Promega cég által gyártott PCR Master Mix-et (amely tartalmazta a dNTP-keveréket, a Taq polimerázt és a megfelelő puffert) alkalmaztuk a gyári protokollok szerint. A PCR reakciót 40 μl térfogatban végeztük, melyből 5 μl-t használtunk fel a reakció eredményességét ellenőrző agaróz gélelektroforézishez. Az elektroforézis során, a keletkezett termékeket 2,5%-os (hagyományos) agaróz gélben vizsgáltuk ethidium-bromidos festés és molekulaméret-marker alkalmazása mellett Az elkészült specifikus PCR termékeket tartalmazó oldatot a Montage PCR Kit (Millipore) segítségével tisztítottuk meg a be nem épült primerektől és nukleotidoktól. A módszer egy egyszerű membránszűrésen alapul, amelyben az alkalmazott membrán az 50 bázisnál rövidebb oligonukleotidokat átengedi (a primereink ebbe a tartományba esnek), míg a PCR termék fennmarad a membránon, ahonnan azt később eluálható. A pontos bázissorrend meghatározására a Sanger-féle láncterminációs technika alapján működő BigDye Terminator kit-et (Applied Biosystems) használtuk. Ebben a kitben a szekvenálás lényegét adó didezoxi nukleotidok fluoreszcens festékkel vannak jelölve, a négy különböző nukleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) négy különböző színnel. A láncterminációs szekvenálás lényege, hogy a polimeráz enzim azokat a láncokat nem tudja folytatni, ahová didezoxi nukleotid épült be, így megfelelő reakció után a szekvenáló PCR termékben minden egyes bázisnak megfelelő hosszúságú PCR termékek keletkeznek. Ezek olyan fluoreszcens festékkel vannak jelölve, amilyen az utolsó bázisnak megfelelő jelölt nukleotid volt. Az elektroforézis során ennek köszönhetően egy kapillárisban futtatható a teljes szekvenálás (ellentétben a hagyományos izotóppal jelölt poli-akrilamid gélen futatott szekvenálásokkal), mely a kiértékelést könyebbé, automatizálhatóvá teszi. Az automata szekvenátorban lehetőség van nagy mintaszám egyszerre történő vizsgálatára is, mivel az eszköz automatikusan adagolja a mintát. A szekvenátorból érkező nyers adatot (fluoreszcencia érték változásokat) a megfelelő szoftver segítségével lehet olvasható szekvenciává formálni. A rendszer optimalizálásakor a vásárolt reagens leírásához képest több jelentős változtatást hajtottunk végre, egyrészt arányaiban többszörösére (2-5x) emeltük a bevitt PCR-termék és primer mennyiséget, és emeltük a reakció anellációs hőmérsékletét (50°C→55°C). Szintén jelentős változtatás (és komoly költségmegtakarítás), hogy a gyári BigDye Terminator kit-et 8x hígításban is optimálisan tudtuk használni. A pontos

31

bázissorend megállapítása érdekében minden esetben forward és a reverz primerrel is végeztünk szekvenálást. A szekvenáló reakció termékének megtisztítása a be nem épült fluorescensen jelölt nukleotidoktól Sephadex G-50 Superfine gyöngyökkel (Amersham Biosciences) töltött Multiscreen-HV plate-ekkel (Millipore) történt. Ez a rendszer a duzzasztott gyöngy segítségével méret szerinti szeparáláson alapul. A be nem épült kis méretű jelölt nukleotidok a gyöngyök belsejébe diffundálnak, míg a nagyobb méretű DNS fragmentumok kizáródnak, és az átfolyó oldatban maradnak. A rendszer nagy előnye, hogy a duzzasztott gyöngy hetekig felhasználható, és a plate-es megoldásnak köszönhetően a módszer nagy mennyiségű minta feldolgozására is alkalmas. A megtisztított termékek elektroforézisét az ABI 310 Genetikai Analizátor (Applied Biosystems) elnevezésű automata kapilláris szekvenátoron végeztük. Az elektroforézis körülményeit a szekvenáló reagens leírása alapján állítottuk be (Run module: Seq POP6 (1ml) E; Dye Set/Primer Mobility Files: DT POP6 {BD Set-Any Primer}). A műszer által kiadott nyers adatokat a Sequencing Analysis Software segítségével dolgoztuk fel. A kapott szekvenciákat a génbankból letöltött normál szekvenciához hasonlítottuk. A normál szekvenciákkal való összehasonlításra több programot is kipróbáltunk, az ezekből nyert tapasztalatokat a következő pontokban foglalom össze: -

Factura (Applied Biosystems): A Sequencing Analysis szoftver része a szekvenálásban előforduló heterozigóta allélek felkutatásában segít. A program egyik legfontosabb paramétere (mellyel gyakorlatilag az érzékenysége adható meg), az a beállítás, hogy a vizsgált szekvenciában milyen eltérést vegyen heterozigóta (vagyis két kevert nukleotid) státuszúnak. Ez a paraméter egy százalékos érték, amely megadja, hogy az egy pozícióban szereplő két csúcs közül a kisebbik csúcs a nagyobbiknak legalább hány %-a kell hogy legyen. Ezt az értéket 30%-ra állítva (a gyári beállítás 50%), gyakorlatilag minden heterozigóta genotípust meg lehet találni, bár az érzékenység növelésével a hamis pozitív jelzések száma is nő. Ezt a módszert leginkább az elkészült szekvenciák minőségének ellenőrzésére, és a heterozigóták észlelésére használtuk.

-

DNASIS (Molecular Biology Insight): Ez a komplett programcsomag a szekvenátor által elkészített és feldolgozott állományokat kezeli, és azokat összehasonlítja különböző alignment technikákat alkalmazva a normál DNS szekvenciával. A 32

szoftver szintén jól kezeli a GeneBank fájlokat, így a megtalált mutáció rögtön ráhelyezhető a génre, illetve a fehérjére. Ezt a programot leginkább a megtalált mutációk pontos meghatározására, pozíciójuk, fehérje szekvenciára gyakorolt hatásuk leírására használtuk. -

Mutation Surveyor (SoftGenetics): A modern molekuláris genetika ezen szoftvere egyesíti magában azt a tudást, amihez korábban 2-3 külön programra volt szükség. A szoftver alkalmas a szekvenátorról érkező nyers állományok kezelésére, és azokat saját rendszerében dolgozza fel. A programban ezek után lehetőségünk nyílik a normál szekvenciával (GeneBank formátum) való összehasonlításra. A rendszer érzékenységét növelhetjük azzal, ha az összehasonlításban kontrolként egy normál genotípus szekvenciáját is használjuk. A kiértékelés és összehasonlítás minden paramétere állítható, testreszabható. Mivel ez a szoftver csak később került kezünkbe, így leginkább a kész szekvenlálások újboli ellenőrzésére használtuk. A 10. ábrán példák láthatók a szekvenálás során talált eltérésekre.

10. ábra. Példák szekvenálással azonosított szekvencia eltérésekre. Az ábrán három különböző mutáció látható, felső sorban a normál kontroll szekvenciával, az alsó sorban pedig a szekvencia eltérést hordozó szekvenciával. Az elnevezésekben a tradícionális nevezéktant (ld. később) használtuk.

4.8. PCR-RFLP és multiplex allélspecifikus PCR Amennyiben direkt szekvenálással megtaláltuk a betegségokozó mutációt a vizsgált betegben, akkor a további családvizsgálatban egyszerűbb, célzott mutáció kimutató módszereket alkalmaztunk. Szintén fontos volt az irodalomban még le nem írt

33

aminosavcserét okozó (missense) mutációknál a betegségokozó státusz bizonyítása, azaz annak kizárása, hogy a talált szekvenciaeltérés esetleg egy ártalmatlan polimorfizmus. Utóbbi esetben az irodalomban alkalmazott normák szerint 50 egészséges egyént (100 kromoszóma) kell megvizsgálni, és ha nem találjuk meg a kérdéses eltérést, akkor ez a polimorfizmus jelleg ellen szól. Az újonnan felfedezett kis méretű deléciók és inszerciók esetében a kérdéses családtagoknál sokszor egy egyszerű PCR reakció is elegendő volt a mutáció kimutatására, hiszen ezek az eltérések elég nagy méretűek voltak ahhoz, hogy a mutációt tartalmazó PCR termék agaróz gélen méreténél fogva elkülönüljön a normál PCR terméktől. Amennyiben lehetőségünk volt, akkor célzott vizsgálatra alkalmaztuk a PCRRFLP (polimeráz láncreakció és restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) módszert, melyben a vizsgálni kívánt génszakaszt felsokszorozzuk, majd egy megfelelő restrikciós enzimmel emésztjük. Az enzimet úgy választjuk meg, hogy másképpen eméssze a normál, illetve a mutáns allélről amplifikálódott PCR terméket. A keletkezett különböző hosszúságú DNS szakaszokat agaróz gél elektroforézissel választjuk szét, és ethidium-bromiddal tesszük láthatóvá. Amennyiben nem volt alkalmas PCR-RFLP módszer a mutáció kimutatására, akkor saját fejlesztésű multiplex allélspecifikus módszert alkalmaztunk. Ennek lényege, hogy a már meglévő primer párhoz (amely a mutációt magában foglaló génszakaszt sokszorozza fel) tervezünk egy allélspecifikus primert, és a három oligonukleotidot megfelelő arányban, egy reakcióelegyben alkalmazzuk. Ezzel a módszerrel minden reakcióban kapunk egy kontroll PCR terméket, illetve a mutációra pozitív allélek esetében egy plusz fragmenst, ami a mutáció jelenlétét egyértelműen jelzi. Az általunk tervezett multiplex allélspecifikus rendszerek primereit és a PCR termékek hosszúságát a 3. táblázat tartalmazza.

34

3. táblázat. A populációs vizsgálatokban használt multiplex allélspecifikus rendszerek alapadatai. Ezekben a rendszerekben a már meglévő primer párokat kiegészítve egy újabb oligonukleotiddal olyan eszközt kapunk, mely megbízhatóan alkalmas nagy mennyiségű minta genotípusának meghatározására. A korábban megtervezett és használt primereket kis betüvel, az újonnan tervezett allélspecifikus primereket pedig nagy betüvel jelöltem. Primerek elnevezése és szekvenciája: HANO3cf 5’-caacccacccaaccaactac-3’ HANO108Tyr 5’-GCCCAGGACCTGTTACTCTCTA-3’ HANO3cr 5’-gctgagaaggcgtggtagag-3’ HANO7bf 5’-acatggaacaggctctcagc-3’ HANO386Val 5’-CCCAATTTCTCCATGATTGAGAGCATAA-3’ HANO7br 5’-ggcctgggagtaaccctaag-3’

Exon 3

Méret 176 bp* 109 bp*

7

178 bp** 144 bp***

*HANO3cr primerrel, **HANO7br primerrel, ***HANO7bf primerrel

4.9. A C1-INH gén mutációs adatbázisának létrehozása A HAEdb elnevezésű angol nyelvű mutációs adatbázis az Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetében működő MTA Támogatott Kutatóhelyek Irodája (TKI) Membránbiológiai Kutatócsoport szerverén kapott helyet. A Linux operációs rendszer alatt működő adatbázis rendszer a világ bármely pontjáról elérhető a http://hae.biomembrane.hu internet címen (11. ábra). 4.9.1. Programozási alapok Az adatok tárolása a nyílt forráskódú MySQL adatbázis rendszerben történik (www.mysql.org). Ez az adatbázis rendszer tartalmazza az adatbázis összes adatát a mutációk összes paramétereitől a felhasználók regisztrációs adatáig. A MySQL könnyen használható, de mégis nagy kapacitású rugalmasan bővíthető adatbázis rendszer, mely igen könnyen kapcsolható a webes alkalmazásokhoz. Az adatbázis és a felhasználó közti hidat, vagyis a grafikus felületet PHP programnyelven írtuk (www.php.net). Ez a programozás szerver oldali műveletekkel dolgozik, így a felhasználó operációs rendszertől, és webböngészőtől függetlenül bárhonnan használhatja az adatbázist. 4.9.2. A program elkészítésének lépései Az „in silico” munkát egy tervezési fázis előzte meg, melyben az alapstruktúrát fektettük le. Ekkor döntöttünk arról is, hogy a genetikai sajátosságok miatt a mutációkat 35

két nagy csoportba osztjuk: az 1 kb méretet meghaladó nagy (gross) szerkezeti eltérések, illetve minden egyéb, ebbe a kategóriába nem illő, rövidebb DNS-szakaszt érintő (micro) szerkezeti eltérés. Az adatbázis minőségét és használhatóságát folyamatosan teszteltük, és erre független külső személyeket (külföldi genetikus kollégákat) is megkértünk. Az adatbázison végrehajtott változtatásokat egy erre külön kialakított oldalon jelenítjük meg, illetve a változásokat verziószám váltással jelöltük. A jelenlegi állapotig bezárólag történt változásokat a következő pontokban foglalom össze [verziószám szintaktikája:
adatbázis

motor

fejlesztésének

éve>.
fejlesztések>.
fejlesztések> (installálás dátuma)]: -

Version 2002.0.0. (2002.10.8): A Béta 1. verzió (a béta jelölés a nem végleges, teszt fázisban lévő szoftvert jelöli), vagyis az első verzió, mely már tartalmazta az alap funkciókat (adat feltöltés, módosítás, keresés).

-

Version 2002.0.1. (2002.10.31): A Béta 1-en vérehajtott változtatások (új paraméterek hozzáadása a mutációs rekordhoz).

-

Version 2003.0.0. (2003.02.25): A Béta 1-en vérehajtott változtatások (HAEreg kereszthivatkozások létrehozása, hozzáadása a mutációs rekordhoz).

-

Version 2003.1.0. (2003.03.17): Beta 2 verzió. Jelentős fejlesztés a grafikus megjelenítésben, és számos új link hozzáadása egyéb örökletes angioödémával, vagy a C1-INH génnel kapcsolatos internetes oldalra. Kisebb hibajavítások az adatbázis motoron.

-

Version 2003.2.0. (2003.04.14): Alpha 1 verzió (az alpha jelölés a stabil verziót jelenti, mely általában a béta fejlesztési verzióból fejlődik ki). Fejlesztések a grafikus megjelenítésen és az „Add note” funkció integrálása az adatbázisba. Korábbi tesztelési adatok törölve, állandó felhasználók hozzáadása.

-

Version 2003.2.1. (2003.12.10): Kisebb fejlesztések a keresés eredményeként szolgáló listás nézeten, és a statisztika oldal létrehozása.

-

Version 2003.3.0. (2004.03.01): Grafikus adatbázis létrehozása és letölthetővé tétele az oldalon.

-

Version 2005.1.0. (2005.01.08): Biztonsági fejlesztés. Új típusú felhasználó kezelés, random jelszó generálás és kiküldés elfelejtett jelszó esetén.

-

Version 2005.2.0. (2005.04.26): Új számozási renszer, a hagyományos és HUGO nomenklatúrák párhuzamos használata.

36

A HAEdb elkészítése és tesztelése során több külföldi genetikus kutató segítségünkre volt. Kiemelt figyelmet szentelt az oldal fejlődésének/fejlesztésének a spanyol angioödéma kutatócsoport vezetője Margarita Lopez Trascasa (Madrid) és a franciaországi laboratórium vezetője Mario Tosi (Rouen).

37

5. Eredmények 5.1. Molekuláris diagnosztikai stratégia Az örökletes angioödéma két típusának kialakulásához részben más-más mechanizmusok vezethetnek, ezért a diagnosztikai stratégia kidolgozásakor a két típust külön vizsgáltuk. Az I. típusú angioödéma esetében először az esetleges nagyméretű deléciók és inszerciók detektálása a feladat, amelyeket Southern-blot technológiával lehet kimutatni. Ezzel a módszerrel várhatóan az I. típusú betegek körülbelül 20%-ában találunk

génátrendeződést.9,105

A

Southern-blot

módszerrel

detektált

mutáció

lokalizálása egy általunk kifejlesztett valós idejű PCR technológián alapuló géndózis méréssel történik. Amennyiben nem találtunk nagyméretű inszerciót vagy deléciót, a gén kódoló szakaszain direkt szekvenálással keressük meg a betegségokozó mutációt. Az irodalmi adatok alapján felállítottunk egy sorrendet, mely alapján elsőként azokat az exonokat szekvenáltuk, ahol gyakrabban írtak már le angioödémát okozó mutációt (elsőként a 3. és 8. exon, majd az 5. és 7.). Az örökletes angioödéma II. típusában a nagy deléciók, inszerciók jelenléte az eddigi irodalom alapján kizárható, tehát a Southern-blot technika nem indokolt. Ebben az esetben azonban különös figyelmet kell szentelni a 8. exonban található reaktív centrumot kódoló régiónak. Az irodalmi adatok alapján az esetek jelentős részében ebben a régióban keletkezik mutáció, így ugyan megfelelő mennyiségű fehérje képződhet, de funkciójában károsodni fog.87 Ezek alapján első lépésként indokoltnak találtuk a 8. exon direkt szekvenálását, különös figyelemmel a reaktív centrum közepén elhelyezkedő 444. arginint kódoló régiót. Az örökletes angioödéma általunk alkalmazott diagnosztikai stratégiáját a 6. ábrán foglaltam össze.

38

6. ábra. Az örökletes angioödémás betegeknél végzett genetikai vizsgálatok általunk alkalmazott protokolljának sémája. Rövidítések: neg.: negatív; poz.: pozitív eredmény. Az ábra bal oldala az I. típusú, míg a jobb oldala a II. típusú örökletes angioödéma esetében alkalmazott stratégiát mutatja.

5.2 A mutációszűrés eredménye angioödémás családokban. A 23 I. típusú örökletes angioödémás család közül 4 esetben (17,4%) mutattunk ki nagyméretű deléciót, ami megfelel a nemzetközi adatoknak.105,109 A négy pozitív esetből egynél mintegy 9 kb méretű, a másik háromnál pedig 2-4 kb méretű deléciókat észleltünk. A kisebb kiterjedésű eltérések esetében a valós idejű PCR technológián alapuló géndózis mérést alkalmaztuk a deléció lokalizálására. A normál és a deléció szempontjából pozitív minták crossing point értékeinek összehasonlítása azt mutatta, hogy mindhárom esetben a 4. exonra specifikus PCR-ek esetében volt szignifikáns mértékben nagyobb különbség a két minta crossing point értéke között az összes többi exonhoz viszonyítva (14. ábra). Ez a különbség tehát mindhárom esetben a 4. exon érintettségét támasztotta alá. Az Alu-szekvenciák 3. és 4. intronokban észlelhető gyakorisága miatt ez az eredmény megfelel a várakozásnak.29

39

14.ábra. 3 kilobázisos deléciót hordozó mintán végzett géndózis analízis eredménye. Az ábrán látható kiértékeléshez három párhuzamos mérés átlagát használtuk fel, a vizsgált másik két 2-4 kilobázisos deléciót hordozó családban azonos eredményt kaptunk. A függőleges tengelyen a gén megfelelő exon amplifikációja során kapott crossing point értékek különbségét ábrázoltuk (mutáns-normál allél). Amennyiben a két genotípusban azonos az exonok kópiaszáma (azaz nem érintett az exon a deléció által), akkor a különbség a nullához közeli. Azonban, ha egy exon a deléció által érintett, azaz abból fele mennyiségű kópia található, akkor az az exon az amplifikáció során nagyobb crossing point értéket ad (kisebb koncentráció miatt), így a mutáns és a normál különbsége pozitív irányba megnő. Az ábrán látható, hogy a deléció érintette a 4. exont, így annak a többi exonhoz képest kópiaszáma csökkent, crossing point értéke nőtt, szignifikánsan eltérve a többi exon összehasonlítástól (a szignifikanciát ANOVA statisztikai teszttel igazoltuk).

A fennmaradó 19 I. típusú örökletes angioödémás család esetében didezoxiláncterminációs technikával és automata kapilláris elektroforézissel elvégeztük a C1INH gén teljes kódoló régiójának és az mRNS hasítási helyek (az exon-szélekkel szomszédos szakaszok) teljes szekvencia elemzését. Mindösszesen 16, egyetlen bázist vagy néhány bázisos DNS-szakaszt érintő kóroki mutációt azonosítottunk, mivel három mutáció két-két, a rendelkezésünkre álló adatok szerint egymással rokoni kapcsolatban nem álló családnál fordult elő. Az általunk kimutatott mutációk közül 13-at a 4. táblázat tartalmaz alapvető keletkezési mechanizmus és azon belül pozíció szerint csoportosítva, míg a kimutatott három hasítási variánst az 5. táblázat tartalmazza.

40

4. táblázat. Az általunk azonosított 13, kódoló régiót érintő C1-INH gén mutáció a keletkezési mechanizmus és a lokalizáció szerinti csoportosításban. Genomiális DNS-pozicó

Exon

Aminosav-pozicio

Következmény

Stop kodon kialakulásához vezető bázis-szubsztitúciók (non-sense mutációk): 2238C>T 4467C>T 16872C>T

3 4 8

Gln10Stop Gln201Stop Arg472Stop

A fehérjeszintézis idő megrövidült fehérjelánc.

előtti

leállása,

Kisméretű deléciók/inszerciók a kódoló régióban: 2534_2535del

3

Cys108fs

2579_2620del

3

Leu124_Ala137del

14107delA

7

Asp347fs

16749_16775dup

8

Ile440fs

A deléció közvetlen közelében stop-kodon keletkezik. Megmarad a helyes leolvasási keret, de a C1INH fehérje A hélixéből 14 konzervált aminosav hiányzik. Leolvasási-keret eltolódás, korai stop-kodon keletkezik 22 aminosav-távolságban. Leolvasási-keret eltolódás, a reaktív centrum aminosavai is megváltoznak.

Aminosav-cseréhez vezető bázis-szubsztitúciók (missense mutációk): A Cys108 és Cys183 aminosavak közötti diszulfid híd nem alakulhat ki. Egy másik közölt, kóroki mutáció (Cys183Tyr) érinti a 2533G>A 3 Cys108Tyr diszulfid híd kialakításában partner aminosav helyet.120 Polaritás- és töltés-változással járó aminosavcsere. A feltételezett I. hélix második 14224A>T 7 Asp386Val aminosavát érinti.21 14181A>C 7 Thr372Pro Korábban leírt kóroki mutáció.111 Két másik közölt, kóroki mutáció (Val451Met , Val451Gly) érinti ezt az aminosav helyet.20,111 A Val451 aminosav 16810T>A 8 Val451Glu kiemelkedő fontosságú a C1-INH megfelelő térszerkezetének kialakulásához.52,66 Korábban leírt kóroki mutáció, kóros 16870G>A 8 Gly471Glu térszerkezetű fehérje keletkezik.20 Egy másik közölt, kóroki mutáció 16885C>G 8 Pro476Arg (Pro476Ser) érinti ezt az aminosav helyet.111 A korábban nem közölt mutációkat vastagítással jelöltük. A mutáció elnevezésénél a Carter és mtsai (carter1991) által lefektetett hagyományos nevezéktant alkalmaztuk.

A 16 kóroki mutáció közül 13 még korábban nem ismert eltérés volt, ezeket a táblázatban vastagon szedett karakterekkel jelöltük. A felfedezett új mutációk keletkezési mechanizmusuk szerint a következőképpen csoportosíthatók: 2 non-sense (stop-kodont eredményező bázis-csere); 4 kisméretű deléció/duplikáció; 4 mis-sense (aminosavcserét eredményező bázis-csere); és 3 mRNS-hasítási (splice) variáns. Az említett négy mechanizmus közül a nonsense, illetve deléciók esetében egyértelműen valószínűsíthető a fehérjelánc jelentős megrövidülése. Ezeket a mutációkat további vizsgálatok nélkül kóroki mutációnak tekintettük.

41

Az újonnan felfedezett négy missense mutáció kóroki szerepének bizonyítása összetettebb feladat. Első lépésként megállapítottuk, hogy konzervált, szerkezeti szempontból fontos aminosavat érintő, és/vagy polaritás/töltésváltozással is járó cserék következtek be. Megerősítettük a családon belüli szegregációt, azaz az egészséges családtagoknál vad típusú szekvenciát, érintett családtagoknál pedig heterozigóta mutációt észleltünk az érintett szakaszon. A további bizonyítás érdekében, az esetleges polimorfizmus-jelleg

kizárására

három

újonnan

felfedezett

missense

mutáció

(Cys108Tyr, Asp386Val és Pro476Arg) szempontjából vizsgáltuk az 50 egészséges személyből álló kontroll csoportot, azaz 100 egészséges kromoszómát. Erre a célra két mutáció esetében allélspecifikus multiplex rendszert használtunk, míg a harmadik mutációt ScrFI restrikciós endonukleázzal végzett PCR-RFLP módszerrel mutattuk ki. Mindhárom mutáció esetében a kontroll csoport egyöntetűen negatív eredményt adott. 5. táblázat. Az általunk azonosított 3 mRNS hasítási (splice) variáns lokalizáció szerinti csoportosításban. Mutáció IVS2SD+1G>A 2696_2697insT IVS3SD+1G>A

intron konszenzus normál 2 mutáns normál 3 mutáns normál 3 mutáns

Bázis pozíció az mRNS splicing régióban -1 +1 +2 +3 +4 +5 G G T A/g A/t G G G T A T G G T A T G A G G T A A G G G T A A T G G T A A G G T A A G A

A mutációk által érintett bázisokat vastagítással, nagyobb méretű karakterekkel jelöltem. A hasítási régióra jellemző konszenzus szekvenciát Zhang munkája alapján képeztük.119 A -1 jelzésű pozíció az exon utolsó bázisát jelöli, a +1 jelzésű pozíció pedig az első intronikus bázist.

A három új mRNS-hasítási (splice) variáns (táblázat) közül két G>A bázis-csere a leginkább konzervált, exon-határral szomszédos, +1 pozíciójú guanint érinti, míg a harmadik mutáció, egy T-inszerció (beékelődés) a +3 pozícióban eltolja a konszenzus hasítási donor szekvenciát. A pozitív családon belüli szegregáció mellett az mRNShasítási (splice) variáns mutációk hatását az Interneten hozzáférhető, Neural Network Splice Site Prediction elnevezésű számítógépes program segítségével is vizsgáltuk (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html).94

A

program

a

választott

0,1

valószínűségi küszöb érték mellett egyik szerkezeti variáns esetében sem jelzett mRNS hasítást. Mind az újonnan felfedezett missense mutációk, mind az mRNS-hasítási (splice) variánsok esetében elvégeztük a teljes kódoló régió szekvencia-elemzését, és további szekvencia eltérést nem találtunk.

42

A három II. típusú aangioödémában szenvedő család esetében a 8. exon reaktív centrumot tartalmazó régiójának célzott szekvencia-analízisével mindhárom, egymással rokoni kapcsolatban nem levő családnál azonos, korábban leírt, aminosav-cserét eredményező

mutációt,

a

16788C>T

(Arg444Cys)

szekvencia-eltérést

azonosítottunk.87,102 5.3. Összegyűjtött mutációs adatok a HAEdb-ben

A HAEdb az értekezés írásakor 150 különböző C1-INH mutációt tartalmazott a 6. táblázatban bemutatott, keletkezési mechanizmus szerinti megoszlásban (a mutációk típus szerint vannak felsorolva, mellettük a rekordok számával, és azok százalékos arányával a teljes adatbázishoz viszonyítva). Az adatbázisban tárolt mutációk eloszlását összehasonlítva a jelenlegi teljes HGMD (The Human Gene Mutation Database) adatbázissal (tárolt mutációk száma: 45875) néhány eltérést tapasztalhatunk, mely a C1INH gén molekuláris sajátosságaiból adódik. Az Alu szekvenciák miatt kialakuló nagy méretű gén átrendeződések (HAEdb: 14,7%; HGMD: 7,9%) és a korábban ismertetett mechanizmusok következtében kialakuló kisebb deléciók/inszerciók (HAEdb: 28,6; HGMD: 24,2) gyakoribbak, míg a missense/nonsense mutációk ritkábbak (HAEdb: 44,6%; HGMD: 57,2%) a C1-INH génben. A legnagyobb hányadot így is az aminosavcserét okozó mutációk teszik ki, de szintén gyakoriak az olvasási keret eltolódását okozó inszerciók/deléciók.

6. táblázat. A HAEdb-ben a dolgozat írásakor található valamennyi mutáció keletkezési mechanizmus szerinti bontásban. Mutáció típus Nagy méretű mutációk Mis-sense (aminosav-csere) Olvasási keret eltolódás (frameshift) inszerció/deléció miatt Non-sense (stop-kodon) mRNS hasítási (splice-site) variáns Olvasási keret eltolódást nem okozó, kisméretű inszerció/deléció Promoter Egyéb Összesen:

Rekordok száma (%) 22 (14,7) 54 (36) 36 (24) 13 (8,6) 14 (9,3) 7 (4,6) 2 (1,4) 2 (1,4) 150 (100)

A mutációk pozíciója szerinti leválogatása (7. táblázat) azt mutatja, hogy a gén egészét érinthetik a mutációk. Ha a mutációk gyakoriságát 100 bp kódoló régióra vonatkoztatjuk, a 8. exon kiemelkedő érintettsége észlelhető. Ennek egyik oka, hogy a 43

C1 inhibitor fehérje legfontosabb szerkezeti elemét, a reaktív centrumot ez az exon kódolja. Másik ok, hogy a kezdeti genetikai vizsgálatok során több laboratóriumban csak a 8. exonban kerestek mutációt, és ezeket az adatokat közölték.20,57 7. táblázat. A HAEdb-ben található micro mutációk DNS-szerkezeti egység szerinti bontásban. Pozíció

A kódoló régió mérete

promoter 1. exon 1. intron 2. exon 2. intron 3. exon 3. intron 4. exon 4. intron 5. exon 5. intron 6. exon 6. intron 7. exon 7. intron 8. exon Összesen:

Mutációk száma

50 498 134 203 139 219 253 1496

2 1 1 2 3 19 2 11 12 2 10 2 13 1 47 128

Mutációk száma 100 bp kódoló szakaszra vetítve

4 3,8 8,2 5,9 7,2 5,9 18,6

A nem kódoló szakaszok mérete: 1. exon: 37; 2. exon 5’vég: 22; 8. exon 3’ vég: 264. A 100 bp kódoló szakaszra vetített mutáció-mennyiség számítása: mutáció szám/kódoló régió méret x 100. A számítást csak a kódoló régiót tartalmazó szerkezeti egységek esetében végeztük el. A teljes mértékben nem kódoló szakaszokat tartalmazó szerkezeti egységeket dőlt karakterrel jelöltük.

5.4. A HAEdb működése A HAEdb-hez bárki szabadon hozzáférhet, a keresés és az adatok exportálása nincs jelszóhoz kötve. Új mutáció felvitelére egy ingyenes regisztráció elvégzése után van lehetőség. A rendszerbe felvitt mutációkat két nagyobb kategóriába soroltuk: az 1 kb méretet meghaladó nagy (gross) szerkezeti eltérések, illetve minden egyéb, ebbe a kategóriába nem illő, rövidebb DNS-szakaszt érintő (micro) szerkezeti eltérés. A C1 inhibitor mutációs adatbázisban minden mutációnak van tulajdonosa, ez gyakorlatilag az a labor, amely az adott mutációt elsőként publikálta. Amennyiben a kérdéses labor nem viszi be az általa leírt szekvenciaeltéréseket, akkor ezt az adatbázis adminisztrátora teszi meg. Amennyiben új mutáció kerül felvitelre az adatbázisba, akkor a kurátorok ellenőrzik a felvitt adatok nevezéktanának és számozásának helyességét, a genomiális és protein szintű változás összefüggését. 44

Az adatbázis létrehozásakor igyekeztünk figyelembe venni a Claustres és munkatársai által 2002-ben lefektetett, lókusz-specifikus adatbázisra vonatkozó alapelveket.36

11. ábra. A HAEdb bejelentkező oldala.

5.4.1. Az adatbázisban tárolt alapadatok A mutációs adatbázis legfontosabb feladata, hogy a humán C1-INH génre vonatkozó mutációs adatokat pontosan, ellenőrzötten, kategorizáltan és felhasználóbarát módon tárolja. Szintén fontos követelmény, hogy a mutációkat egyszerűen lehessen keresni, exportálni és saját elvek alapján csoportosítani. A HAEdb készítésekor ezeket az alapelveket szem előtt tartva hoztuk létre az adatbázis alapvázát. A mutációs rekord tartalmazza a pontos genomiális, kódoló szekvencia (CDS) és fehérje elnevezést, a mutációt először leíró publikáció hivatkozását (a Pubmed absztraktra mutató link formájában), és a mutáció helyét a génen (exon vagy intron száma). 5.4.2. Az adatbázisban tárolt további adatok Az adatbázis létrehozásakor igyekeztünk olyan szerkezetet felépíteni, mely minél szélesebb körű információval látja el a felhasználót. Az előbbiekben felsorolt alapadatok mellett a mutációs rekord tartalmaz a mutációt hordozó beteg családi környezetéről információt, az egymással rokoni kapcsolatban nem álló betegek 45

számával és a szekvencia eltérés angioödémában betöltött szerepével kapcsolatos adatokat. Továbbá minden mutációhoz tartozik egy megjegyzés mező, ebbe a mutáció tulajdonosa írhatja bele a fontosnak vélt mutációval kapcsolatos információkat (metodika, fenotípus, stb.), illetve a többi regisztrált felhasználó fűzhet hozzá megjegyzéseket (például, ha megtalálták a saját betegeik között a már leírt mutációt). A 12. ábrán egy jellemző mutációs rekord látható, amelyen az egyes adatok jól láthatóan elkülönülnek egymástól.

12. ábra. Az Arg444Cys mutációs rekordja a HAEdb-ben.

Az adatbázis pillanatnyi alapadatait a statisztikai oldalon lehet megtekinteni, ahol az összes bevitt mutáció száma mellett információt kaphatunk az adatbázisban regisztrált tulajdonosokról és a két mutáció típus (gross/micro) arányáról is. Az adatbázis oldaláról pdf (portable document format) formátumban letölthető egy grafikus mutációs adatbázis is, melyen a gén érintett szakaszain jól átlátható módon fel vannak tűntetve a rendszerben található szekvencia eltérések (13. ábra). A HAEdb nem tartalmaz információt a mutációval kapcsolatos fenotípusról, mivel erre a feladatra egy másik internetes adatbázis készül (www.haeregister.org).

46

13. ábra. A grafikus adatbázis egy tipikus része. A mutáció elhelyezkedésének megfelelően pirossal jelöltük a fehérje-, és a DNS szintű elnevezéseket, valamint a mutációt leíró publikáció PubMed azonosító számát. A különböző szimbólumok a különböző típusú (missense, nonsense, deléció, stb.)mutációkat jelölik.

5.4.3. Interaktív funkciók a HAEdb-ben A mutációs adatbázis készítésekor fontosnak tartottuk, hogy az az adattárolás mellett az információ cseréjében, áramlásában is központi szerepet tölthessen be a C1INH genetikájának kutatásában és a molekuláris diagnosztikában is. Az interaktivitást az alábbi két funkció segíti: -

A mutációs rekord megjegyzés mezője egyfajta információgyűjtő hely a különböző laboratóriumok adott mutációival kapcsolatos tapasztalatainak. Ide bármelyik regisztrált felhasználó felviheti az országában tapasztalt előfordulási adatot, vagy más jellemző státuszát („add note” funkció). A mutáció kimutatására alkalmazott metodikák

részletei

szintén

ide

kerülhetnek,

segítve

ezzel

azoknak

a

laboratóriumoknak a munkáját, amelyek segítségnyújtást remélve látogatnak el az oldalra. -

A megjegyzés mezőbe írt információ akkor értékes igazán, ha az el is kerül az érdeklődőhöz. Erre a célra egy adatbázis figyelő levelező szolgáltatást építettünk a rendszerbe. A program érzékeli, ha bármi változás van az adatbázisban. Amennyiben egy új mutáció kerül az adatbázisba, akkor a levelezési listára feliratkozottak arról a nap végén kapnak egy figyelmeztető levelet (a regisztrált felhasználók automatikusan felkerülnek a levelezési listára). Amennyiben egy új 47

megjegyzés kerül az adatbázisba az „add note” funkció segítségével, akkor a mutáció tulajdonosa azonnali értesítést kap a változásról, a levelezési listán szereplő címek pedig szintén a nap végén értesülnek a történtekről. 5.4.4. A mutációk elnevezése a HAEdb-ben (nomenklatúra) A C1 inhibitor mutációs adatbázisban a megfelelő mutációs elnevezés használata kulcsfontosságú a rendszer használhatósága szempontjából. Mivel a laboratóriumok által általánosan használt hagyományos elnevezés nem felel meg a jelenleg támasztott követelményeknek, ezért a HAEdb-ben párhuzamosan alkalmazunk többféle mutációs nomenklatúrát. A DNS szintű eltérés megnevezése három különböző módon történik: -

Hagyományos

elnevezés:

A

legtöbb

örökletes

angioödémával

foglalkozó

laboratórium a hagyományos számozást használja a mutációk elnevezésekor. Ezt a számozási rendszert először Carter és munkatársai használták.29 Ez a rendszer az általuk leközölt C1-INH genomiális szekvenciára alapul (GenBank: X54486), ebben a számozásban az 1. pozíció az első exon első nukleotidja (traszkripciós iniciációs hely). Ez a nukleotid a 1183. pozícióban szerepel az X54486 referencia szekvenciában. A hagyományos és a HUGO elnevezési rendszerek közötti átjárhatóságot az 1183 értéknyi különbség figyelembe vétele biztosítja. -

HUGO genomiális elnevezés: A nagy genetikai kutatásokat összehangoló szervezetek (HUGO: Human Genom Organisation, HGVS: Human Genome Variation Society) már régóta dolgoznak azon, hogy a mutációk elnevezésének szabályozása egyértelmű, átlátható és egységes legyen.7,46,47 Az általuk ajánlott elnevezés is bekerült az adatbázisba („g.”) előjel használatával. Ennek a rendszernek a számozása is az X54486 számú referencia szekvencián alapszik, itt azonban az 1. pozíció a referencia szekvencia első nukleotidja. Míg a hagyományos elnevezésnél a tulajdonos némi szabadságot élvez a mutációk nomenklatúráját illetően, addig ebben az elnevezési rendszerben ez szigorú szabályokhoz van kötve (a mindenkori ajánlásokra mutató link megtalálható az oldalon).

-

HUGO CDS elnevezés: Szintén az egységesség biztosítása érdekében került bele az adatbázisba a mutáció „Coding DNA Sequence (CDS)” pozíció szerinti elnevezése. A CDS egy olyan virtuális DNS szakasz, amely csak a fehérje kódolásért felelős szekvenciát tartalmazza. A CDS szekvencia első pozíciója mindig a start metionin kodon első „A” nukleotidja. A CDS az mRNS szekvenciával ellentétben nem

48

tartalmazza a 3’ és az 5’ nem transzlálódó régiókat. A számozás alapjául az NM_000062 számú GeneBank referencia szekvencia szolgál (mRNS szekvencia), melyben a hatvanadik nukleotid az 1. pozíció. Ezen mutáció elnevezések a „c.” előjelet kapják az adatbázisban, elnevezésük szintén szigorú szabályokhoz kötött. A HAEdb-ben a fehérje szintű változás elnevezése két módon történik, mivel a hagyományos és a HUGO által elfogadott számozás itt sem egyezik. Bár mindkettő ugyanarra a referencia szekvenciára épül (protein: NP_000053), és a HUGO szerinti számozás is ez alapján történik, a hagyományos elnevezés szerint az 1. számú pozíció a 23. aminosav, amely a szignál peptidet nem tartalmazó, szekretált fehérje első aminosava. A HUGO szerinti fehérje elnevezés a „p.” előjelet kapja, és az 1. pozíció a szignál peptidet is tartalmazó fehérje 1. aminosava. A két elnevezési rendszer között tehát 22 értéknyi különbség van. A C1-INH gén jól ismert, a reaktív centrum működéséhez elengedhetetlen 444. arginin a HOGO elnevezés szerint tehát 466. arginin.

49

6. Megbeszélés 6.1. Diagnosztikai módszerek beállítása Az Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetének Molekuláris Genetikai laboratóriumában végzett munkám nagymértékben hozzájárult a laboratóriumban

diagnosztikai

célra

használni

kívánt

módszerek

rutinszerű

alkalmazásához. Az örökletes angioödéma monogénes betegség, a betegség kialakításáért felelős gén rövid, kevés exonja jól vizsgálható, így jó eszköz volt arra, hogy a laboratóriumban korábban még nem alkalmazott módszereket beállítsuk rajta. A nagyméretű deléciók lokalizálására elsőként alkalmaztunk valós idejű PCR-hez kötött géndózis analízist, korábban ezt a vizsgálatot a C1-INH génen vagy elhanyagolták, vagy kevésbé megbízható szemi-kvantitatív módszerrel végezték.51 Az angioödémában végzett munka során, talán legfontosabb technológiaként, a direkt szekvenálás is rutin eszközzé vált, azóta több új munka is épül ezekre az alapokra (pl.: hemofília-A és -B, juvenilis hemokromatózis). A „nedves” laboratóriumi munka mellett komoly szerep jut az „in silico” munkának is. A kapott eredmények kiértékelésére alkalmazott programok megfelelő ismerete nélkül nehéz a nagy mennyiségű adat értelmezése. A közvetlen szekvencia analízis az automata kapilláris szekvenátorhoz kapott szoftverekkel történt, azonban a szekvenciák összehasonlítására, a deléciók/inszerciók értelmezésére új programokat is használtam (Softgenetics: Mutation Surveyor, MBI: DNASIS). A splice site mutációknál alkalmazott internetes predikciós eszköz megismerése és használata szintén szükséges és hasznos lesz a jövőbeni munkában. A komplett diagnosztikai stratégia kidolgozása, a mutációk megfelelő, szabványszerű interpretálása biztosítja az örökletes angioödéma és hasonló genetikai betegségek stabil, megbízható genetikai diagnosztikáját. 6.2. Betegség okozó mutációk a C1-INH génben Az általunk vizsgált 26 örökletes angioödémás családban a talált mutációk típus szerinti megoszlása megegyezik az eddig leírt adatokkal. Összehasonlításként a jelenleg legnaprakészebb információforrást, a C1-INH mutációs adatbázist használhatjuk.69

50

Az irodalomban leírt adatokkal megegyezően mi is jelentős arányban találtunk nagy méretű génátrendeződéseket, ami alátámasztja az intragenikus Alu szekvenciák genetikai instabilitásban betöltött szerepét.109 Szintén jelentős hányadban (~25%) az irodalmi adatoknak megfelelően, találtunk „de novo” (azaz a családban újonnan megjelenő) mutációs eseteket.87 Az általunk leírt missense mutációk közelebb vihetnek a fehérje szerkezetének megismeréséhez, hiszen ezek az aminosav cserék jelezhetik az érintett régó fontosságát. Az általunk talált betegségokozó mutációk közül három (14181A>C, 16870G>A, 16788C>T) már korábban közlésre került más kutatócsoportok által.20,102,111 A 183. pozícióban lévő cisztein aminosav a 108. ciszteinnel képez diszulfid hidat, ezt az intramolekuláris kapcsolatot megszüntető változást (Cys183Tyr) már korábban leírták, mint kóroki mutációt.21,120 Ez az eredmény alátámasztja az általunk talált 2533G>A (Cys108Tyr) szekvenciaeltérés kóroki szerepét. A szintén áltlunk leírt 14224A>T (Asp386Val) polaritás változással járó kóroki mutáció a feltételezett I. hélix második aminosavát érinti.21 A 8. exonban található 16810T>A mutáció az érintett I. típusú angioödémás családban „de novo” képet mutatott. Az antitrypsin homológiájára készült három dimenziós modell szerint ez az aminosav a szerpinek között kiemelkedően konzervált C1 ß-redős molekularészletben található.52,113 A kiemelkedően konzervált 451. pozíciójú valin aminosav a fehérje megfelelő szerkezetének kialakulásához szükséges.66 Ugyanebben a pozícióban valin-metionin és valin-glicin (Val451Met, Val451Gly) aminosavcsere már kóroki mutációnak volt leírva.20,111 A 16885C>G mutáció az kiemelkedően konzervált C-terminális prolin aminosavat érinti.21 Ebben a kodonban már szintén írtak le kóroki mutációt (Pro476Ser).111 A három korábban nem publikált missense mutáció családon belűl a betegséggel szegregálódott, és ezeket a mutációkat az 50 egészséges személyt tartalmazó kontroll mintán nem találtuk meg. A szerkezeti változások, a családon belüli öröklésmenet és a populáciogenetikai vizsgálatok bizonyítják a mutációk kóroki szerepét. Három nonsense mutációt találtunk a vizsgált betegpopulációban, ezek közül egy már korábban leírt mutáció (16872C>T), míg a másik kettő még nem publikált szekvencia eltérés (2238C>T, 4467C>T).111 Ezek a mutációk a korai stop kodon kialakulása miatt megrövidült, és így működésképtelen fehérjét eredményeznek. Az irodalomban még nem leírt három kis méretű deléciót és egy duplikációt találtunk az általunk vizsgált I. típusú angioödémás családokban. A 2534_2535delCT és 51

14107delA mutáció leolvasási keret eltolódást és ennek következtében korai stop kodon kialakulását eredményezik. A két egymással rokoni kapcsolatban nem álló családnál talált 2579_2620del42 mutáció ugyan nem okoz leolvasási keret eltolódást, de jelenlétében egy 14 aminosavas szakasz esik ki a feltételezett A hélixből (három erősen konzervált aminosavval). A deletálódott aminosavak a következők (a konzervált aminosavakat aláhúzással jelöltem): LeuValAspPheSerLeuLysLeuTyrHisAlaPheSerAla.21 Az általunk talált 16749_16775dup mutáció leolvasási keret eltolódást okoz, és ezáltal károsítja a 8. exon C-terminális normál szekvenciáját. Három korábban nem leírt mRNS hasítási variánst (splice-site mutációt) (638G>A, 2695G>A, 2696_2697insT) találtunk az általunk vizsgált betegpopulációban. Ezek a mutációk az exon-intron határon található splice-donor helyeket változtatják meg, ezáltal a mRNS érés nem tud megfelelően végbemenni. A mutációk splice-donor helyre kifejtett hatását az internetes Neural Network slpice-site jósló oldal segítségével is teszteltük, és kóroki hatásúnak találtuk.94 A program a beállított 0,1-es valószínűségi érték mellett a mutáció hatására nem jelzett exon-intron határt, míg a normál szekvenciáknál igen. A mutációt hordozó mindhárom családban betegséghez kapcsolt szegregációt találtunk. Három mutációt (638G>A, 2579_2620del42 és 2533G>A) találtunk meg egyszerre két-két családban. A családtagok megkérdezése és lakóhelyük megvizsgálása után valószínűsíthető, hogy nincs a családok között rokoni kapcsolat. 6.3. Mutációk elnevezése a kutatásban és a HAEdb-ben A tudományos közleményekben igyekszünk áttérni a HUGO által javasolt egységes, szabványos nomenklatúrára.7,46,47 A mutációs adatbázisban minden elterjedt és szükséges elnevezést integráltunk, hiszen az adatbázis elsődleges feladata a gyors, naprakész és bárki számára könnyen értelmezhető információszolgáltatás. 6.4. A HAEdb helye a dignosztikában és a kutatásban A létrehozott C1-INH gén mutációs adatbázis naprakész információkkal szolgál a molekuláris diagnosztika és a kutatás számára. Az összegyűjtött információk ellenőrzött formában kerülnek az adatbázisba. 52

Az adatbázis alapfunkcióinak köszönhetően logikus és könnyen átlátható, ugyanakkor öszetettebb kérdések feltevésére is alkalmas felületen böngészhet a felhasználó. Az adatbázis kiegészítő tulajdonságai elsősorban az információáramlást és cserét hivatottak szolgálni. A beépített szolgáltatásoknak köszönhetően, a HAEdb a jövőben a C1-INH génnel és fehérjével kapcsolatos kutatások egyik tudásbázisává nőheti ki magát. A rugalmas adatbázis rendszernek és könnyen konfigurálható grafikus felületnek köszönhetően a jövőbeli kérések, ötletek, új szolgáltatások egyszerűen integrálhatók lesznek a meglévő rendszerbe. 6.5. Nem publikált mutációk az adatbázisban Az adatbázis a szűk angioödémával foglalkozó európai kutatói és diagnosztikai társaságban már elismerést nyert, így ezek után megpróbáljuk szélesebb körben is megismertetni a potenciális felhasználókkal. Az

internetes

adatbázis-gyűjtőrendszerekbe

(HGVS,

HGMD,

OMIM)

referenciaként való bekerülés, illetve az örökletes angioödéma diagnosztikájával is foglalkozó cégeknél történő információkérés nagyszámú új mutáció bevitelét vonhatja maga után. Ezen mutációk jelentős hányada lesz ugyan kóroki mutációnak besorolva, de sokak valószínüleg még nem szerepelnek majd publikációban. A nem publikált mutációk tárolására már most is fel van készítve az adatbázis, azonban ennek a problémának a kezelése nem teljesen egyértelmű. Amennyiben később esetleg ezt a mutációt egy másik laboratórium tudományos cikkben leközli, akkor szabályaink szerint a publikáló laboratórium válik az adatbázisban a mutáció tulajdonosává. Ennek tecnikai és elméleti hátterét még egyeztetni kell, a többi európai laboratóriumot is bevonva az álláspontok kialakításába. 6.6. A HAEdb összevetése az ideális adatbázissal Claustres és munkatársai 2002-ben megjelentetett cikkükben egy átfogó szűrővizsgálat eredményeként (amelyben valamennyi akkor elérhető internetes lókuszspecifikus adatbázist hasonlították össze), virtuálisan megalkották az idális lókuszspecifikus adatbázist.36 A HAEdb létrehozásakor igyekeztünk követni az 53

említetett szerzők által kijelölt útvonalat, ezért adatbázisunk sokban megfelel az ott lefektetett követelményeknek. Az ideális adatbázis követelményei a következők (a felsorolásban aláhúzva azok a tulajdonságok, melyek megtalálhatóak az általunk létrehozott adatbázisban): -

Általános követelmények: adatbázis neve, kurátorok, az adatbázis céljai, készítés dátuma, utolsó frissítés, opciók listája, konzorcium tagok, készítők listája, hivatkozás feltüntetése, szerzői jog, jogi nyilatkozat.

-

Linkek más szerverekre: a génnel kapcsolatos oldalakra, betegséggel kapcsolatos oldalakra,

központi

adatbázisokra,

betegség

adatbázisokra,

szekvencia

adatbázisokra, fehérje adatbázisokra, publikációs adatbázisokra. -

A HAEdb oldala nem tartalmaz információt a klinikusok és a betegek részére. Ezek az információk más oldalakon (melyekre találhatók linkek az oldalon) naprakészen rendelkezésre állnak, így nem tartottuk szükségesnek az információ duplikálását. Ezen linkek valódiságát és tartalmát rendszeresen figyeljük, így biztosítva az ellenőrzött, megfelelő információforrást.

-

Adatbázisunkban

a

C1-INH

génnel

kapcsolatos

lényeges

informciókat

megjelentetjük oldalunkon, a fehérjével kapcsolatos információk ugyanakkor egyelőre hiányoznak. Az adatbázisunk jövőbeni fejlesztésének egyik lehetséges irányvonala a fehérjeadatok minél szélesebb körű integrálása az adatbázisba. -

Az on-line mutációfelviteli rendszerünk megfelel a HUGO által támasztott követelményeknek, nevezéktani rendszerünket úgy alakítottuk ki, hogy bárki számára könnyen értelmezhető legyen.

-

A mutációs adatok megjelenítése: részletes mutációs tábla, összefoglaló tábla, polimorfizmus

tábla,

grafikus

megjelenítés,

statisztikák.

A

C1-INH

gén

polimorfizmusok jelenleg is bekerülhetnek az adatbázisba, ezek elkülöníthető kezelése azonban még fejlesztést igényel. -

A HAEdb-ben az adatbázis kurátorai felelősek az adatok ellenőrzéséért. Az adatbázis struktúrája élesen elkülöníti azokat a mutációkat, melyeket még nem publikáltak tudományos közleményben.

-

A C1-INH mutációs adatbázisa nem tartalmaz beteg információkat. A fenotípusos adatok rendszerezésére és tárolására egy külön adatbázist készítettek az angioödéma diagnosztikájával foglalkozó európai laboratóriumok (www.haeregister.org).

-

Az adatbázisunk kereső motorja minden lehetőséget megad az oldal látogatójának ahhoz, hogy megtalálja a keresett adatokat, és ezzel megfelel az ideális adatbázis 54

követelményeinek. A kereső oldalon elsőként olyan állandó linkek találhatók, melyek eredményére a látogatók esetlegesen kíváncsiak. Az egyszerű keresés lehetőséget ad gyors, rövid kulcsszavas keresésre, mely a mutáció pozíciójára, vagy akár típusára is irányulhat. A fejlett kereső az összetett, szűrt keresések elvégzésére alkalmas, ebben gyakorlatilag az adatbázisban tárolt bármely információ alapján lehet specifikusan szűrni.

55

7. Összefoglalás Az örökletes angioödéma genetikai diagnosztikájának beállításával az Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetében egy új eszközpark áll rendelkezésre az öröklődő betegségekben való betegségokozó mutáció keresésére. A modell betegségen beállított módszerek alkalmasak hasonló monogénes betegségek genetikai diagnosztikájára. A módszer-háttér mellett a szoftveres eszközök is szolgálják a gyors és nagy kapacitású munkavégzést. A diagnosztizált betegségokozó mutációk ismeretében az érintett családokban lehetőség van családszűrést végezni, így gyorsan, egyszerűen és megbízhatóan tudunk az öröklődés és a betegség státuszáról információval szolgálni. A klinkai tünetek kialakulása és a fehérje paraméterek diagnosztikája csak a serdülőkor kezdetekor válnak értékelhetővé. A genetikai diagnosztikának a feltérképezett családokban tehát fontos szerepe van a súlyos következmények megelőzésében, a betegségre való lelki felkészítésben, és a gyors differenciál-diagnosztikában. A C1-INH gén lókuszspecifikus adatbázisának létrehozásával segíthetjük az együttműködéses munkákat, egységesítjük, egy adatbázisba rendezzük a világ különböző tájain keletkező mutációs adatokat, és segítséget nyújtunk az olyan laboratóriumoknak, melyek újonnan kezdenek ezzel a területtel foglalkozni. A HAEdbben lefektetett szabályok, nevezéktani, csoportosítási sémák a többi európai laboratóriummal történt egyeztetés után váltak az adatbázis részévé, így biztosítva az egységes, mindenki által elfogadott irányelveket. Az általunk leírt új betegségokozó mutációk bekerültek a mutációs adatbázisba, és így szolgálhatják az ott leírt célokat. A további kutatások keretében igyekszünk a genetikailag és fenotípusosan is részletesen feltérképezett hazai betegpopulációban genotípus-fenotípus összefüggéseket keresni.

56

8. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek Dr. Tordai Attilának, az Országos Gyógyintézeti Központ Haematológiai és Immunológiai Intézet Molekuláris Biológiai Laboratóriumatóriuma vezetőjének, amiért lehetővé tette számomra, hogy kutatócsoportjában dolgozhassam, munkámat végig figyelemmel kísérte, építő kritikáival segítette értekezésem megírását. A Southern-blot analízisek elvégzéséért köszönetet mondok Bors András PhD hallgatónak, valamint a kutatócsoport többi tagjának dr. Andrikovics Hajnalkának, Szilvási Anikónak, Horváth Csongornénak, Pfundt Antalnénak, Szaver Gabriellának és Bakonyi Ildikónak állandó támogatásukért. Köszönetettel tarotozom Dr. Farkas Henriettének a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinkai Tömbjében működő Angioödéma Központ vezetőjének, amiért rendelkezésünkre bocsátotta a betegek vizsgálathoz szükséges vérmintákat. További köszönet illeti az Angioödéma Központ többi dolgozóját is, kiemelve a fehérje vizsgálatokért felelős Dr. Varga Liliant, a komplement laboratórium vezetőjét, a vérminták rendszerezéséért és szakszerű kezeléséért. A mutációs adatbázis létrehozásában nagy szerepe volt kollégámnak Dr. Hegedűs Tamásnak, köszönöm a programozási és adatbázis elemek megalkotásában nyújtott segítségét. Köszönet illeti Dr. Sarkadi Balázst, amiért helyet adott az adatbázisnak kutatócsoportja szerverén, és a Ph.D. tanulámányaim során nyújtott szakmai segítségéért. Köszönetet mondok továbbá azon külföldi kutatóknak (Margarita Lopez Trascaza, Madrid; Mario Tosi, Rouen) akik tevékenyen részt vettek és javaslataikkal, kritikáikkal hozzájárultak az adatbázis kialakításához.

57

9. Irodalomjegyzék 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

12. 13. 14. 15. 16. 17.

Agostoni A, Bergamaschini L, Martignoni G, Cicardi M, Marasini B. Treatment of acute attacks of hereditary angioedema with C1-inhibitor concentrate. Ann Allergy 1980;44:299-301. Agostoni A, Cicardi M. Hereditary and acquired C1-inhibitor deficiency: biological and clinical characteristics in 235 patients. Medicine (Baltimore) 1992;71:206-15. Agostoni A. [Vasopeptidases and their inhibitors]. Recenti Prog Med 2002;93:519-22. Akbary AM, Wirth KJ, Scholkens BA. Efficacy and tolerability of Icatibant (Hoe 140) in patients with moderately severe chronic bronchial asthma. Immunopharmacology 1996;33:238-42. Alsenz J, Bork K, Loos M: Autoantibody-mediated acquired deficiency of C1 inhibitor. N Engl J Med 1987; 316: 1360-66 Andre F, Veysseyre-Balter C, Rousset H, Descos L, Andre C. Exogenous oestrogen as an alternative to food allergy in the aetiology of angioneurotic oedema. Toxicology 2003;185:155-60. Antonarakis SE. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group. 1998; Hum Mutat 11:1–3. Areaza EE, Shing K, Grant JA : Hereditary angioedema : clinical and biochemical heterogenity. AM Allergy 1988; 61: 69-74 Ariga T, Carter PE, Davis AE 3rd. Recombinations between Alu repeat sequences that result in partial deletions within the C1 inhibitor gene. Genomics 1990;8:607-13. Ariga T, Hoshioka A, Kohno Y, Sakamaki T, Matsumoto S. A de novo deletion in the C1 inhibitor gene in a case of sporadic hereditary angioneurotic edema. Clin Immunol Immunopathol 1993;69:103-5. Aulak KS, Eldering E, Hack CE, Lubbers YP, Harrison RA, Mast A, et al. A hinge region mutation in C1-inhibitor (Ala436–Thr) results in nonsubstrate-like behavior and in polymerization of the molecule. J Biol Chem 1993;268:1808894. Bain BJ, Catovsky D, Ewan PW. Acquired angioedema as the presenting feature of lymphoproliferative disorders of mature B-lymphocytes. Cancer 1993;72:3318-22. Bergamaschini L, Cicardi M, Tucci A, Gardinali M, Frangi D, Valle C, et al. C1 INH concentrate in the therapy of hereditary angioedema. Allergy 1983;38:814. Birgeson L. Tranxemic acid in the treatment of hereditary angioedema {letter}. Am J Med 1991; 91: 102. Bissler JJ. DNA inverted repeats and human disease. Front Biosci. 1998 Mar 27;3:d408-18. Bissler JJ, Aulak KS, Donaldson VH, Rosen FS, Cicardi M, Harrison RA, et al. Molecular defects in hereditary angioneurotic edema. Proc Assoc Am Physicians 1997;109:164-73. Bissler JJ, Cicardi M, Donaldson VH, Gatenby PA, Rosen FS, Sheffer AL, et al. A cluster of mutations within a short triplet repeat in the C1 inhibitor gene. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:9622-5.

58

18. Bissler JJ, Donaldson VH, Davis AE 3rd. Contiguous deletion and duplication mutations resulting in type 1 hereditary angioneurotic edema. Hum Genet 1994;93:265-9. 19. Bissler JJ, Meng QS, Emery T. C1 inhibitor gene sequence facilitates frameshift mutations. Mol Med 1998;4:795-806. 20. Blanch A, Roche O, Lopez-Granados E, Fontan G, Lopez-Trascasa M. Detection of C1 inhibitor (SERPING1/C1NH) mutations in exon 8 in patients with hereditary angioedema: evidence for 10 novel mutations. Hum Mutat 2002;20:405-6. 21. Bock SC, Skriver K, Nielsen E, Thogersen HC, Wiman B, Donaldson VH, et al. Human C1 inhibitor: primary structure, cDNA cloning, and chromosomal localization. Biochemistry 1986;25:4292-301. 22. Boeckers M, Bork K. [Contraception and pregnancy in hereditary angioedema]. Dtsch Med Wochenschr 1987;112:507-9. 23. Bos IG, Hack CE, Abrahams JP. Structural and functional aspects of C1inhibitor. Immunobiology 2002;205:518-33. 24. Bos IG, Lubbers YT, Roem D, Abrahams JP, Hack CE, Eldering E. The functional integrity of the serpin domain of C1-inhibitor depends on the unique N-terminal domain, as revealed by a pathological mutant. J Biol Chem 2003;278:29463-70. 25. Bouillet L, Ponard D, Drouet C, Dumestre C, Pernollet M, Bonerandi JJ, et al. [Acquired angioneurotic edema: clinical and biological characteristics in 9 patients]. Presse Med 2000;29:640-4. 26. Bowen B, Hawk JJ, Sibunka S, Hovick S, Weiler JM. A review of the reported defects in the human C1 esterase inhibitor gene producing hereditary angioedema including four new mutations. Clin Immunol 2001;98:157-63. 27. Brackertz D, Kueppers F. Hereditary angioneurotic oedema. Lancet 1973;2:680. 28. Caldwell JR, Ruddy S, Schur PH, Austen KF. Acquired C1 inhibitor deficiency in lymphosarcoma. Clin Immunol Immunopathol 1972;1:39-52. 29. Carter PE, Duponchel C, Tosi M, Fothergill JE. Complete nucleotide sequence of the gene for human C1 inhibitor with an unusually high density of Alu elements. Eur J Biochem 1991;197:301-8. 30. Casali P, Borzzini P, Pioltelli P, Invernizze F, Zanussi C: Acquired C1 esterase inhibitor deficiency in essential cryoglobulinemia and macrocryoglobulinemia. Acta Haemat 1978; 59: 277-84 31. Cicardi M, Agostoni A. Hereditary angioedema. N Engl J Med 1996; 334:16667. 32. Cicardi M, Beretta A, Colombo M, Gioffre D, Cugno M, Agostoni A. Relevance of lymphoproliferative disorders and of anti-C1 inhibitor autoantibodies in acquired angio-oedema. Clin Exp Immunol 1996;106: 475-80. 33. Cicardi M, Bergamaschini L, Cugno M, Hack E, Agostoni A : Long-term treatment of hereditary angioedema with danazol. Ann Intern Med 1980; 93: 809-12 34. Cicardi M, Castelli R, Zingale LC, Agostoni A. Side effects of long-term prophylaxis with attenuated androgens in hereditary angioedema: comparison of treated and untreated patients. J Allergy Clin Immunol 1997;99:194-6. 35. Cicardi M, Igarashi T, Rosen FS, Davis AE 3rd. Molecular basis for the deficiency of complement 1 inhibitor in type I hereditary angioneurotic edema. J Clin Invest 1987;79:698-702.

59

36. Claustres M, Horaitis O, Vanevski M, Cotton RGH. Time for a unified system of mutation description and reporting: a review of locus specific mutation databases. Genome Res 2002;12:680–688. 37. Cohen SH, Koethe SM, Kozin F, Rodey G, Arkins JA, Fink JN. Acquired angioedema associated with rectal carcinoma and its response to danazol therapy: acquired angioedema treated with danazol. J Allergy Clin Immunol 1978;62:217-21. 38. Constanzi JJ, Donaldson VH: Activation of complement by monoclonal cryoglobulin associated with cold urticaria. J Lab Clin Med 1969; 74 902-908 39. Cotton RG, Rodrigues NR, Campbell RD. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85:4397401. 40. Crosher R. Intravenous tranexamic acid in the management of hereditary angiooedema. Br J Oral Maxillofac Surg 1987;25: 500-6. 41. Crowder JR, Crowder TR: Five generations of angioneurotic edema. Arch Intern Med 1917, 20:840-852 42. Cugno M, Nuijens J, Hack E, Eerenberg A, Frangi D, Agostoni A, Cicardi M: Plasma levels of C1 inhibitor complexes and cleaved C1 inhibitor in patients with hereditary angioneurotic edema. J Clin Invest 1990; 85: 1215-20 43. Davis AE, Whitehead AS, Harrison RA, Dauphinais A, Bruns GAP, Cicardi M, Rosen FS: Human inhibitor of the first component C1: characterization of cDNA clones and localization of the gene to chromosome 11. Proc Natn Acad Sci USA 1986; 83: 3161-65 44. Davis AE 3rd. C1 inhibitor and hereditary angioneurotic edema. Annu Rev Immunol 1988;6:595-628. 45. de Smet BJ, de Boer JP, Agterberg J, Rigter G, Bleeker WK, Hack CE. Clearance of human native, proteinase-complexed, and proteolytically inactivated C1-inhibitor in rats. Blood. 1993 Jan 1;81(1):56-61. 46. den Dunnen JT, Antonarakis SE. 2000. Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Hum Mutat 15:7–12. 47. den Dunnen JT, Antonarakis SE. Nomenclature for the description of human sequence variations. Hum Genet 2001;109:121–124. 48. Donaldson VH: C1 inhibitor in hereditary angioneurotic edema: Type I and II. Boehring Inst Mitt 1989; 84: 151-60 49. Donaldson VH, Evans RR. A biochemical abnormality in hereditary angioneurotic edema: absence of serum inhibitor of C’ 1-esterase. Am J Med 1963;35:37-44. 50. Duncan IJ, Tymms KE, Carney G. Rheumatoid arthritis and hereditary angioedema. J Rheumatol 1988;15:700-2. 51. Duponchel C, Di Rocco C, Cicardi M, Tosi M. Rapid detection by fluorescent multiplex PCR of exon deletions and duplications in the C1 inhibitor gene of hereditary angioedema patients. Hum Mutat 2001;17: 61-70. 52. Eldering E, Verpy E, Roem D, Meo T, Tosi M. COOH-terminal substitutions in the serpin C1 inhibitor that cause loop overinsertion and subsequent multimerization. J Biol Chem 1995;270: 2579-87. 53. Farkas H, Gyeney L, Gidofalvy E, Fust G, Varga L. The efficacy of short-term danazol prophylaxis in hereditary angioedema patients undergoing maxillofacial and dental procedures. J Oral Maxillofac Surg 1999;57:404-8.

60

54. Frangi D, Cicardi M, Sica A, Colotta F, Agostoni A, Davis AE 3rd. Nonsense mutations affect C1 inhibitor messenger RNA levels in patients with type I hereditary angioneurotic edema. J Clin Invest 1991; 88:755-9. 55. Frank MM, Gelfand JA, Atkinson JP. Hereditary angioedema: the clinical syndrome and its management. Ann Intern Med 1976;84:580-93. 56. Frank MM, Sergent JS, Kane MA, Alling DW. Epsilon aminocaproic acid therapy of hereditary angioneurotic edema: a double-blind study. N Engl J Med 1972;286:808-12. 57. Freiberger T, Kolarova L, Mejstrik P, Vyskocilova M, Kuklinek P, Litzman J. Five novel mutations in the C1 inhibitor gene (C1NH) leading to a premature stop codon in patients with type I hereditary angioedema. Hum Mutat 2002;19:461. 58. Gadek JE, Hosea SW, Gelfand JA, Frank MM: Response of variant hereditary angioedema phenotypes to danazol therapy: genetic implications. J Clin Invest 1979; 64: 280-86 59. Gelfand JA, Boss GR, Conley CL, Reinhart R, Frank MM. Acquired C1 esterase inhibitor deficiency and angioedema: a review. Medicine (Baltimore) 1979;58:321-8. 60. Gonzales-Quevado T, Caballero T, Cicardi M, Bork K, Williams A. The synthetic Kunitz domain protein DX-88 to treat angioedema in patients with hereditary angioedema [abstract]. Int Immunopharmacol 2002;2:1318. 61. Grace RJ, Jacob A, Mainwaring CJ, McVerry BA: Acquired C1 esterase inhibitor deficiency as manifestation of T-cell limphoproliferative disorder. Lancet 1990; 336: 118 62. Hauptmann G, Petitjean F, Lang JM, Oberling F. Acquired C1 inhibitor deficiency in a case of lymphosarcoma of the spleen: reversal of complement abnormalities after splenectomy. Clin Exp Immunol 1979; 37:523-31. 63. Hopfl R, Schwarz S, Fritsch P, Hintner H: Long-term danazol therapy for hereditary angioedema. Dtsch Med Wochenschr 1990; 115: 133-38 64. Horaitis O, Cotton RGH. The challenge of documenting mutation across the genome: the human genome variation society approach. Hum Mutat 2004;23:447–452. 65. Hory B, Haultier JJ. Glomerulonephritis and hereditary angioedema: report of 2 cases. Clin Nephrol 1989;31:259-63. 66. Huber R, Carrell RW. Implications of the three-dimensional structure of a1 antitrypsin for striker and functions of serpins. Biochemistry 1989;28: 89518966. 67. Huntington JA, Carrell RW. The serpins: nature's molecular mousetraps. Sci Prog. 2001;84(Pt 2):125-36. 68. Jordan RE, McDuffie FC, Good RA, Day NK: Diffuse normolipemic plane xanthomatosis: An abnormal complement component profile. Clin Exp Immunol 1974; 18: 407-15 69. Kalmar L, Hegedus T, Farkas H, Nagy M, Tordai A. HAEdb: a novel interactive, locus-specific mutation database for the C1 inhibitor gene. Hum Mutat. 2005 Jan;25(1):1-5. 70. Kawachi Y, Hibi T, Yamazaki S, Otsuka F. A novel donor splice site mutation in the C1 inhibitor gene of a patient with type I hereditary angioneurotic edema. J Invest Dermatol 1998;110:837-9. 71. Landerman NS. Hereditary angioneurotic edema, I: case reports and review of the literature. J Allergy 1962;33:316-29.

61

72. Langton D, Weiner J, Fary W. C1-esterase inhibitor concentrate prevents upper airway obstruction in hereditary angio-oedema. Med J Aust 1994;160:383-4. 73. Lehmann A, Lang J, Boldt J, Saggau W. Successful off-pump coronary artery bypass graft surgery in a patient with hereditary angioedema. J Cardiothorac Vasc Anesth 2002;16:473-6. 74. Leimgruber A, Jaques WA, Spaeth PJ. Hereditary angioedema: uncomplicated maxillofacial surgery using short-term C1 inhibitor replacement therapy. Int Arch Allergy Immunol 1993;101:107-12. 75. Levy LR, Lepow IH: Assay and properties of serum inhibitor of C1 esterase. Proc Soc Exp Biol Med 1959, 101: 608-611 76. Madalinski K, Chorezykiewicz M, Prokopowicz K, Kramer J, Zychowicz C: Immunological and genetic studies on hereditary angioedema. Rocz Akad med Bialymst 1995; 40: 634-41 77. Marasini B, Cicardi M, Martignoni GC, Agostoni A. Treatment of hereditary angioedema. Klin Wochenschr 1978;56:819-23. 78. Milton IL. On giant urticaria. Edinburgh Med J 1876;22:513-4. 79. Morgan BP, Walport MJ: Complement deficiencies and disease. Immunology Today 1991; 12: 301-6 80. Nakamura S, Yoshinari M, Saku Y, Hirakawa K, Miishima C, Murai K, et al. Acquired C1 inhibitor deficiency associated with systemic lupus erythematosus affecting the central nervous system. Ann Rheum Dis 1991;50:713-6. 81. Nielsen EW, Gran JT, Straume B, Mellbye OJ, Johansen HT, Mollnes TE. Hereditary angio-oedema: new clinical observations and autoimmune screening, complement and kallikrein-kinin analyses. J Intern Med 1996;239:119-30. 82. Nielsen EW, Johansen HT, Hogasen K, Wuillemin W, Hack CE, Mollnes TE. Activation of the complement, coagulation, fibrinolytic and kallikrein-kinin systems during attacks of hereditary angioedema. Scand J Immunol 1996;44:185-92. 83. Nielsen EW, Johansen HT, Holt J, Mollnes TE. C1 inhibitor and diagnosis of hereditary angioedema in newborns. Pediatr Res 1994;35: 184-7. 84. Nilsson Im, Andersson L, Bjorkman SE: Epsilon aminocaproic acid (E-ACA) as a therapeutic agent based on 5 years’ clinical experience. Acta Med Scand Suppl 1966; 448: 1-46 85. Nuijens J, Van Doorn M, Van Dam T, Burggraaf K, Levi M, Hack E, et al. A phase I study of recombinant human C1-INH in asymptomatic patients with hereditary angioedema-HAE. Int Immunopharmacol 2002; 2:1315-6, [abstract]. 86. Osler W. Hereditary angio-neurotic oedema. Am J Med Sci 1888;95:362-7. 87. Pappalardo E, Cicardi M, Duponchel C, Carugati A, Choquet S, Agostoni A, et al. Frequent de novo mutations and exon deletions in the C1inhibitor gene of patients with angioedema. J Allergy Clin Immunol 2000;106:1147-54. 88. Pascual M, Widmann JJ, Schifferli JA. Recurrent febrile panniculitis and hepatitis in two patients with acquired complement deficiency and paraproteinemia. Am J Med 1987;83:959-62. 89. Pasquali J-L, Christmann D, Modert F, Belval PC, Storck D, Hauptmann G: First case of acquired functional C1:INH deficiency: Association with angioedema during Churg and Strauss vasculitis. Int Arch Allergy Appl Immunol 1984, 74: 284-85

62

90. Pensky J, Levy LR, Lepow IH: Partial purification of serum inhibitor of C1 esterase. J Biol Chem 1961; 236: 1674-1979 91. Pickering RJ, Good RA, Kelly JR, Gewurz H. Replacement therapy in hereditary angioedema: successful treatment of two patients with fresh frozen plasma. Lancet 1969;1:326-30. 92. Proud G, Chamberlain J. Letter: anaphylactic reaction to aprotinin. Lancet 1976;2:48-9. 93. Quincke HI. U¨ ber akutes umschriebenes Hauto¨dem [About an acute described skin edema]. Monatshe Prakt Dermatol 1882;1:129-31. 94. Reese MG, Eeckman FH, Kulp D, Haussler D. Improved splice site detection in Genie. J Comput Biol. 1997 Fall;4(3):311-23. 95. Rosen FS, Alper CA, Pensky J, Klemperer MR, Donaldson VH: Genetically determined heterogeneity of the C1 esterase inhibitor in patiens with hereditary angioneurotic edema. J Clin Invest 1971; 50(10) : 2143-49 96. Rosen FS, Pensky J, Donaldson V, Charache P. Hereditary angioneurotic edema: two genetic variants. Science 1965;148:957-8. 97. Rozen S, Skaletsky HJ. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press 2000, Totowa, NJ, pp 365-386. 98. Schreiber AD, Kaplan AP, Austen KF: Inhibition of C1-INH of Hageman factor fragment activation of coagulation, fibrinolysis and kinin generation. J Clin Invest 1987; 316: 1525-1530 99. Scriver CR, Nowacki PM, Lehvaslaiho H. Guidelines and recommendations for content, structure, and deployment of mutation databases: II. Journey in progress. Hum Mutat. 2000;15(1):13-5. 100. Scriver CR, Nowacki PM, Lehvaslaiho H. Guidelines and recommendations for content, structure, and deployment of mutation databases. Hum Mutat. 1999;13(5):344-50. 101. Sheffer AL, Fearon DT, Austen KF, Rosen FS. Tranexamic acid: preoperative prophylactic therapy for patients with hereditary angioneurotic edema. J Allergy Clin Immunol 1977;60:38-40. 102. Skriver K, Radziejewska E, Silbermann JA, Donaldson VH, Bock SC. CpG mutations in the reactive site of human C1 inhibitor. J Biol Chem 1989;264:3066-71. 103. Spaulding WB. Methyltestosterone therapy for hereditary episodic edema (hereditary angioneurotic edema). Ann Intern Med 1960;53:739-45. 104. Stoppa-Lyonnet D, Carter PE, Meo T, Tosi M. Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human C1 inhibitor locus to deleterious rearrangements. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87:1551-5. 105. Stoppa-Lyonnet D, Duponchel C, Meo T, Laurent J, Carter PE, Arala-Chaves M, et al. Recombinational biases in the rearranged C1-inhibitor genes of hereditary angioedema patients. Am J Hum Genet 1991;49:1055-62. 106. Stoppa-Lyonnet D, Tosi M, Laurent J, Sobel A, Lagrue G, Meo T. Altered C1 inhibitor genes in type I hereditary angioedema. N Engl J Med 1987;317:1-6. 107. Storm D, Herz J, Trinder P, Loos M. C1 inhibitor-C1s complexes are internalized and degraded by the low density lipoprotein receptor-related protein. J Biol Chem. 1997 Dec 5;272(49):31043-50.

63

108. Talavera A, Larraona JL, Ramos JL, Lopez T, Maraver A, Arias J, et al. Hereditary angioedema: an infrequent cause of abdominal pain with ascites. Am J Gastroenterol 1995;90:471-4. 109. Tosi M. Molecular genetics of C1 inhibitor. Immunobiology 1998;199: 358-65. 110. Turner P, Dear J, Scadding G, Foreman JC. Role of kinins in seasonal allergic rhinitis: icatibant, a bradykinin B2 receptor antagonist, abolishes the hyperresponsiveness and nasal eosinophilia induced by antigen. J Allergy Clin Immunol 2001;107:105-13. 111. Verpy E, Biasotto M, Brai M, Misiano G, Meo T, Tosi M. Exhaustive mutation scanning by fluorescence-assisted mismatch analysis discloses new genotypephenotype correlations in angiodema. Am J Hum Genet 1996;59:308-19. 112. Verpy E, Biasotto M, Meo T, Tosi M. Efficient detection of point mutations on color-coded strands of target DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:1873-7. 113. Verpy E, Couture-Tosi E, Eldering E, Lopez-Trascasa M, Spath P, Meo T, et al. Crucial residues in the carboxy-terminal end of C1 inhibitor revealed by pathogenic mutants impaired in secretion or function. J Clin Invest 1995;95:350-9. 114. Waytes AT, Rosen FS, Frank MM. Treatment of hereditary angioedema with a vapor-heated C1 inhibitor concentrate. N Engl J Med 1996;334: 1630-4. 115. Whisstock J, Skinner R, Lesk AM. An atlas of serpin conformations. Trends Biochem Sci. 1998 Feb;23(2):63-7. 116. Williams A, Baird LG. DX-88 and HAE: a developmental perspective. Transfus Apheresis Sci 2003;29:255-8. 117. Yip J, Cunliffe WJ. Hormonally exacerbated hereditary angioedema. Australas J Dermatol 1992;33:35-8. 118. Zahedi K, Prada AE, Davis AE: Structure and regulation of the C1 inhibitor gene. Behring Inst Mitt 1993; 93: 957-58 119. Zhang MQ. Statistical features of human exons and their flanking regions. Hum Mol Genet 1998;7: 919-932. 120. Zuraw BL, Herschbach J. Detection of C1 inhibitor mutations in patients with hereditary angioedema. J Allergy Clin Immunol 2000;105: 541-6.

64

Összefoglaló A C1 észteráz inhibitor (C1-INH) deficienciája miatt kialakuló örökletes angioödéma autoszomális domináns öröklésmenetű, kórképére rohamokban jelentkező, subcutan és submucosalis oedemák jellemzők. A komplement rendszer laboratóriumi vizsgálatával elkülöníthető az összes örökletes angioödémás beteg mintegy 85%-át kitevő, I. típusú (csökkent C1 inhibitor fehérje szint), illetve a II. típusú (normális vagy emelkedett

fehérje

szint,

kóros

fehérje

funkció)

rendellenesség.

Genetikai

vizsgálatunkat 26 érintett család (23 I., és 3 II. típusú család, összesen 64 beteg) esetében alkalmaztuk. A 23 HANO-I család közül southern-blot technikával 4 esetben mutattunk ki nagyméretű deléciót. A fennmaradó 19 I. típusú örökletes angioödémás esetben 13 korábban még nem leírt, egyetlen bázist vagy néhány bázisos DNS-szakaszt érintő kóroki mutációt azonosítottunk (g.638G>A, g.2238C>T, g.2534_2535delCT, g.2579_2620del42,

g.2533G>A,

g.2695G>A,

g.2696_2697insT,

g.4467C>T,

g.14224A>T, g.14107delA, g.16749_16775dup, g.16810T>A, g.16885C>G), míg három család esetében már korábban leírt mutációt találtunk. A három II. típusú család esetében a 8. exon reaktív centrumot tartalmazó régiójában korábban leírt, aminosavcserét eredményező mutációt, a g.16788C>T azonosítottunk. Az általunk beállított molekuláris genetikai módszerekkel hazánkban elsőként végeztük el sikeresen a kóroki mutációk azonosítását egy jelentős számú betegcsoportnál. A központi mutációs adatbázisok (OMIM, HGMD) tartalmaznak C1-INH génre vonatkozó mutációs adatokat, ezek azonban ritkán frissülnek, nem interaktívak és nincs bennük lehetőség összetett kereséseket végzni. Az általunk elkészített, HAEdb-nek keresztelt adatbázis (http://hae.biomembrane.hu) a MySQL szabadon hozzáférhető adatbázis kezelő rendszert alkalmazza, a grafikus megjelenítés pedig PHP programmal történik. Az adatbázis az alapfunkciók mellet több olyan szolgáltatást is tartalmaz, melyek elsősorban az interaktivitást, a kommunkációt szolgálják. A HAEdb az értekezés írásakor 150 különböző C1-INH mutációt tartalmazott, melyek közt gyakorlatilag valamennyi mechanizmussal keletkezett szekvencia eltérés előfordul. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az általunk újonnan létrehozott dinamikus és interaktív mutációs adatbázis segítséget adhat új mutációk lokalizációjában, esetleges kóroki szerepük meghatározásában, és megkönnyítheti a közös adatfeldolgozást, illetve nemzetközi populációs tanulmányok végzését.

65

Summary Hereditary angioneurotic edema (HAE) is an autosomal dominant disorder characterized by episodic local subcutaneous and submucosal edema caused by the deficiency of activated C1 esterase inhibitor protein (C1-INH, type I: reduced serum antigen level, type II: reduced activity and normal serum antigen level). The aim of the present study was to determine the disease-causing mutations among Hungarian HAEpatients. The estimated number of affected HAE-families in Hungary is 40-50, out of which 26 families (type I:23, type II:3) managed in a single center were enrolled in the current study. To detect large deletions/insertions, we used Southern-blotting analysis followed by real time PCR based gene dosage analysis. In the absence of large structural changes, we employed direct sequencing covering the whole coding region and splicing sites of the C1-INH gene. Large deletions were detected in 4/23 (17.4%) type I families. We found the g.16788C>T (p.Arg444Cys) mutation in each 3, type II HAE-families. In the remaining type I families, 13 previously unreported mutations (g.638G>A, g.2695G>A,

g.2238C>T,

g.2534_2535delCT,

g.2696_2697insT,

g.4467C>T,

g.2579_2620del42,

g.2533G>A,

g.14224A>T,

g.14107delA,

g.16749_16775dup, g.16810T>A, g.16885C>G) were detected in 16 families affecting primarily exon 3 (6/13) of the C1-INH gene. In the 3 remaining families, known mutations were identified affecting primarily exon 8 (2/3). Published C1-INH mutations are represented in large universal databases (e.g., OMIM, HGMD), but these databases update their data rather infrequently, they are not interactive, and they do not allow searches according to different criteria. The HAEdb, a C1-INH gene mutation database (http://hae.biomembrane.hu) was created to contribute to the following expectations: 1) help the comprehensive collection of information on genetic alterations of the C1-INH gene; 2) create a database in which data can be searched and compared according to several flexible criteria; and 3) provide additional help in new mutation identification. The website uses MySQL, an open-source, multithreaded, relational database management system. The user-friendly graphical interface was written in the PHP web programming language. Several attributes (e.g., affected exon, molecular consequence, family history) are collected for each mutation in a standardized form. This database may facilitate future comprehensive analyses of C1INH mutations and also provide regular help for molecular diagnostic testing of HAE patients in different centers.

66

67

Értekezéssel kapcsolatos publikációk jegyzéke

68