KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN UNWK MENGELIMINASI GEN PENYELEKSI ANTIBIOTIK PADA TANAMAN PAD1 (Ovza sativa L.) TRANSGENIK
AGUS RACHMAT
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Vektor Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik pada Tanaman Padi (@a sativa L.) Transgenik adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Surnber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Mei 2006
Agus Rachmat NIM G351020101
ABSTRAK AGUS RACHMAT. Konstruksi Vektor Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik pada Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Transgenik. Dibimbing oleh SUHARSONO dan INEZ H.S. LOEDIN. Gen penanda seleksi diperlukan untuk proses seleksi tanaman transgenik, tetapi tidak diperlukan setelah tanaman transgenik d i i i l k a n . E l i i i gen ini dapat dilakukan dengan memisahkan gen ini dari gen sasaran pada saat integrasi ke dalam genom tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor ekspresi gen yang dapat mengeliiasi gen penanda seleksi resistensi terhadap antibiotika pada tanaman padi transgenik. Ada dua pendekatan yang dilakukan pertama dengan menggunakan double T-DNA dalam satu vektor biner clan kedua menggunakan dua hang yang membawa gen sasaran dan gen penanda seleksi secara terpisah. Vektor biner dengan double T-DNA yang masing-masing mengandung gen cryIAb dan gen hpt (p2TDNAqIAb), dan vektor b i e r yang mengandung gen penyandi biosintesis asam salisilat (pC12SA) dan vektor biner lain yang membawa gen hpt (pC1300 hpt intron) telah berhasil dikonstruksi. Vektor-vektor ini telah digunakan untuk melakukan transformasi genetik kalus melalui A. tumefaciens. Transformasi genetik kalus menghasilkan 16 tanaman transgenik yang te& dari 1 tanaman transgenik yang ditransformasi dengan p2TDNAcryIAb, 10 tanaman transgenik hasil transformasi dengan pC12SA) dan pC1300 hpt intron), dan 5 tanaman trausgenik yang ditransformasi dengan pC1300 hpt intron sebagai kontrol. Hasil analisis tanaman transgenik dengan PCR menunjukan bahwa kedua T-DNA pada plasmid (p2TDNAcTyIAb) dan plasmid pC12SA telah terintegrasi ke dalam genom tanaman. Perlu dilakukan analisis lebih lanjut untuk melihat pola integrasi gen dalam genom tanaman dan pola segregasi pada keturunan berikutnya .
ABSTRACT AGUS RACHMAT. Construction of Gene Expression Vector for Selectable Marker Gene Elimination in Rice (Oryza saliva L.) Transgenic Plant. Under the direction of SUHARSONO and INEZ H.S. LOEDIN. Selectable marker genes are widely used for the efficient transformation of crop plant, but they are not required after transgenic plants were produced. Transformation technic using double T-DNA has been developed to facilitate the removal of the marker gene from plant genome after selection. The aim of reseach was to contruct a gene expression vector for gene elimination of antibiotic resistance gene in transgenic rice plant. In this system a marker gene and gene of interest were placed on separate T-DNA molecules. Two approaches were performed. The first was by the construction of a binary vectors containing two separate T-DNA's. The vector that carried two separate T-DNAs was constructed, one T-DNA contained a drug resistance, selection marker gene (hpt) and the other contained gene of interest cryIAb gene (p2TDNArryIAb). The second approach was the construction of 2 binary vectors for co-transformation, one containing the selectable marker hpt gene (pC!300 hpt intron) the other containing the genes responsible for salycilic acid biosynthesis, pmsB and entC (pC12SA). These vectors were used to carry out rice genetic transformation by A. tumefaciens. Transformation with p2TDNAcryIAb resulted in 1 transgenic plant having the crylAb and hpt selectable marker genes, co-transformation with two separate binary vectors (pC1300 hpt inhon and pC12SA) resulted in 10 transgenic plants containing hpt and pmsB genes, and transformation with pC1300 hpt intron as control resulted in 5 transgenic plants. The results indicated that the two TDNAs in Jectdr p2TDNAcryIAb weik inserted into the rice genbme. Further experiments need to be perfomed to analyze the integration pattern of the two TDNA's and their segregation in the next generation.
KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN UNTUK MENGELIMINASI GEN PENYELEKSI ANTIBIOTIK PADA TANAMAN PAD1 (Oryza sativa L.) TRANSGENIK
AGUS RACHMAT
Tesis sebagai salah satui syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
Nama NIM
: Konstruksi Vektor Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik pada Tanarnan Padi (Oryza sativa L.) Transgenik : Agus Rachrnat : G351020101
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. 1 d z H. Slamet-Loedin Anggota
Dr. Suharsono. DEA Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Dedi Duryadi, DEA
Tanggal Ujian : 2 2 MAR 2006
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkah dan izin-Nya penulis mampu menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis Ekspresi Gen untuk Mengeliminasi Gen dengan judul Konstruksi Vektor Penyeleksi Antibiotik pada Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Transgenik. Selesainya pendidikan dan penelitian ini tidak luput dari bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Suharsono, DEA clan Dr. Inez H. Slamet-Loedin sebagai pembimbing yang selalu mendorong dan menuntuk dapat menyelesiakan penelitian ini, Ketua Program Studi Biologi beserta staf, Direktur Program Pascasarjana IF'B beserta staf yang telah memberikan pelayanan selama penulis menempuh p e n d i d h , Kepala Puslit Bioteknologi LIP1 dan staf yang telah memberikan izin belajar dan penggunaan fasilitas penelitian. Kepada Dr. Inez H. Slamet-bedin dan Sigit Purwantomo penulis mengucapkan terimakasih atas masukan serta bantuan dana yang sangat berarti melalui RUT XII. Penulis juga berterimakasih kepada Wulansih Dwi Astuti, keluarga Sasmita, rekan-rekan mahasiswa Pascasarjana khususnya Program Strldi Biologi 2002, rekan-rekan di Lab. Biologi Molekuler Tanaman Padi dan Rumah Kaca Bioteknologi LIP1 dan semua pihak atas bantuan yang diberikan &lam pelaksanaan penelitian dan penyusunan tesis. Kepada Ibunda R. Hj Djulaeha dan keluarga yang telah mendampingi dengan doa, kesabaran dan ketulusan sampai detik ini penulis mengucapkan terimakasih. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan limpahan taufik dan hidayah-Nya atas segala kebaikan yang diberikan dan mohon maaf atas segala kesalahan. Akhir kata semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan. Bogor, Mei 2006
Anus Rachmat
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 26 Agustus 1970 merupakan putra ke enam dari delapan bersaudara dari pasangan Bapak H. E. Padma (alm) dan Ibu R. Hj. Djulaeha. Penulis menyelesaikan pendidikan formal di SD Negeri 1 Jonggol, S M P Negeri 1 Jonggol dan SMA Negeri 1 Bekasi. Pada tahun 1995 penulis memperoleh gelar Sarjana Biologi dari Universitas Andalas Padang. Pada tahun 2002 penulis diterima sebagai mahasiswa pada Program Studi Biologi, Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Sejak tahun 1996 sampai sekarang penulis bekerja di Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
DAFTAR IS1 Halaman
...............................................................................................ix DAFTAR GAMBAR ...........................................................................................x DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xi PENDAHULUAN ............................................................................................. 1 Latar Belakang ................................................................................................ 1
DAFTAR TABEL
Tujuan
..............................................................................................................
4
TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... DNA Vektor (DNA Pembawa) ..................................................................... Konstruksi DNA Rekombiian ...................................................................... Gen Penyandi Higromisin Fosfotransferase ................................................ Strategi Eliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik ............................................... Gen Penyandi Biosintesis Asam Salisilat .................................................... Gen cry Penyandi 6 Endotoksin ................................................................. Transfomasi Genetik Tanaman Padi melalui Agrobacterium...................... Regenerasi in vitro Tanaman Padi ................................................................. Analisis PCR ..................................................................................................
5 5 6 8 9 11 12 15 19 20
BAHAN DAN METODE ................................................................................. Waktu dan Tempat ........................................................................................ Bahan ........................................................................................................... Metodologi ................................................................................................... Konstruksi Vektor yang Mengandung Double T-DNA ................................ Konstruksi Vektor di Dua Inang yang Berbeda ........................................... KO-kultivasi dan Kultur Tanaman ................................................................ Analisis Tanaman Transgenik .....................................................................
22 22 22 23 25 25 29 31
HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ Konstruksi Plasmid DoubleT-DNA ........................................................... Kontruksi Plasmid Dtla T-DNA Berbeda Inang............................................ Transformasi dan Regenerasi Tanarnan ....................................................... Analisis PCR Tanaman Transgenik ...........................................................
33 33 35
38 40
KESIMF'UCAN DAN SARAN .................................................................... 43 Kesimpulan ..................................................................................................... 43 Saran ...............................................................................:................................. 43 DAFTAR PUSTAKA
........................................................................................ 44
DAFTAR TABEL Halaman
.......................................
1
Jumlah koloni E. coli hasil transformasi
2
Hasil transformasi tanaman .............................................
..
33 40
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Proses transfer T-DNA dari Agrobacterium tumefaciens ke dalam sel tanaman .............................................................................................. 17 2 Plasmid pCAMBIA
..................................................................................
3 Konstruksi vektor ekspresi untuk eliminasi penanda seleksi dengan double T-DNA ................................................................................
4 Lokasi kaset cryIAb dan hpt intron pa& T-DNA
.......................................
22 24 25
5 Konstruksi vektor ekspresi untuk eliminasi penanda seleksi melalui dua inang ...................................................................................... 26 6 LokasipmsB dan gen e n s pada T-DNA dari plasmid pC12SA
................ 27
7 Hasil elektroforesis p2TDNA yang dipotong dengan Ncol dan BglII dan utuh ..............................................................................
33
8 Hasil elektroforesis h g m e n cryIAb dengan enzim restriksi H i n m ................................................................................. 34 9 Hasil elektroforesis h g m e n cryIAb (lajur 1) pemotongan p2T-DNA cryIAb dengan enzim restriksi H i d 1 1 ........................................ 34
10 Hasil elektroforesis pSA yang dipotong dengan enzim restriksi XbaI; XbaI & EcoRI ....................................................... 36 11 Hasil elektroforesis pC12hpt yang mengandung genpmsB yang dipotong dengan XbaI & EcoRl ....................................... 36 12 Hasil elektroforesis DNA pC12hptSA yang dipotong dengan enzim XbaI dan EcoRI ...................................................................
37
13 Hasil elektroforesis gen penyandi biosintesis asam salisilat yang dipotong dengan EcoRl ...................................................... 37 14 Planlet yang ditanam pada media MS yang mengandung higromisin ....... 39
15 Hasil analisis PCR gen hpt
........................................................................
40
...................................................................
41
16 Hasil analisis PCR gen cryIAb 17 Hasil analisis PCR gen pmsB
....................................................................
42
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Media untuk ko-kultivasi dan regenerasi ................................................... 49 2. Media untuk pertumbuhan bakteri ............................................................... 50 3.Isolasi DNA dengan metode CTAB ............................................................ 5 1
PENDAHULUAN Latar Belakang Padi merupakan komoditas pertanian yang banyak diusahakan oleh petani di dunia. Bagi sebagian besar petani, padi mempakan pilihan utama untuk diusahakan dalam upaya memenuhi kebutuhan pangan. Sejalan dengan makin bertambahnya jurnlah penduduk, permintaan terhadap beras pun semakin meningkat. Pada akhir-akhir ini produksi beras nasional mengalami p e n m a n yang sangat berarti. Pada tahun 2000 produksi beras Indonesia sebesar 32.8 juta ton sedangkan pada tahm 2001 produksi berm Indonesia sebesar 31.7 juta ton (BPS & Ditjen BPTP 2002). Konsep penggunaan Agrobacterium tumefaciem sebagai vektor untuk merakit tanaman transgenik mempunyai prospek dan harapan. Beberapa tanaman agronomi dan holtikultura yang memiliki nilai penting secara rutin ditransformasi menggunakan bakteri hi. Sistem transformasi dengan Agrobacterium secara luas telah digunakan untuk introduksi gen asing kedalam genom tanaman (Gelvin SB 1998). Introduksi gen asing ke dalam sel tanaman melalui proses transformasi merupakan ide dari perakitan tanaman transgenik. Keberadaan gen penyeleksi antibiotik atau resistensi herbisida yang kondisinya terus menerus diekspresikan telah menimbulkan beberapa masalah (Granger 2002). Pertama, munculnya kekhawatiran publik tentang terjadinya resistensi dari organisme penggangu. Hal ini terjadi karena produk yang diekspresikan terus menerus dapat berfungsi sebagai agen seleksi sehingga dapat meningkatkan ketahanan bakteri terhadap antibiotik tertentu (dari penggunaan gen penyeleksi antibiotik) dan gulma terhadap herbisida tertentu (dari penggunaan gen penyeleksi herbisida). Kedua, ekpresi gen penyeleksi yang terus menerus mungkin dapat mengganggu produksi karena surnber asam amino dipakai untuk menghasilkan protein yang disandi oleh gen penyeleksi. Ketiga, keterbatasan agen seleksi pada sistem seleksi yang efektif menjadi hambatan jika akan dilakukan penyisipan gen
lain dengan menggunakan gen seleksi sebagai penanda
seleksinya. Adanya sistem seleksi positif, misalnya dengan menggunakan manosa sebagai agen penyeleksi (Lucca et al. 2001) telah memberikan suatu pilihan pengalihan penggunaan senyawa antibiotik dalam sistem seleksi.
Gen penyeleksi antibiotik selalu digunakan dalam sistim transformasi, tetapi gen tersebut biasanya tidak dibutuhkan apabila tanaman transgenik telah dihasilkan Gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik yang telah didapat bukan hanya tidak dibutuhkan lagi, tetapi juga dapat menimbulkan masalah baru. Sebagai contoh, gen resistensi antibiotik yang berbeda hams digunakan bila a& penambahan gen wing ke dalam tanaman transgenik, tetapi sejumlah gen penyeleksi antibiotik yang ada terbatas. Keamanan dari gen penyeleksi antibiotik me~pakaIlmasalah dalam pemasaran produk rekayasa genetik. Keberadaan gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik telah menimbulkan keberatan antara lain berupa kekhawatiran terjadinya transfer gen tersebut ke milcroorganisme dan kemunglunan terganggunya ekspresi gen yang memillki peran penting, serta kesulitan untuk mengintroduksi gen lain karena terbatasnya gen penyeleksi antibiotik yang dapat digunakan. Gen penyeleksi dapat dieliminasi
dari tanaman transgenik
melalui seleksi pada generasi
berikutnya setelah proses segregasi. Gen penyeleksi &pat berpisah dari gen sasaran bila kedua gen tersebut terletak pada kromosom yang berbeda atau
keduanya bebas. Terdapat beberapa metode yang dapat mengeliminasi keberadaan gen penyeleksi antibiotik, antara lain melalui, ko-transfonnasi baik dengan particle
bombardment
maupun dengan double T-DNA, site-specrfc
recombination (Mom & Hooykaas 1992, Zuo JR
et al. 2001), dan inm-
genomic translocation via transposable elements (Cotsafis et al. 2002). Pada
sistem ketransformasi, gen sasaran dipisahkan dari gen penyeleksi antibiotik. Teknik ini dapat menjadi suatu teknik generik yang dapat diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik. Secara alami, beberapa isolat Agrobacterium memiliki lebih dari satu T-DNA, dan tumor crown gall seringkali disebabkan karena ko-transformasi oleh beberapa T-DNA (Hooykaas & Schilperoort 1992). Selain gen sasaran yang diintroduksikan, T-DNA tidak mengintroduksi DNA lain kecuali right border dan leji border dari Agrobacterium itu sendiri ke
dalam genom. Teknik ini dapat menjadi suatu teknik generik yang &pat diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik. KO-transformasi menggunakan double T-DNA dilakukan
dengan memisahkan gen sasaran dan gen penyeleksi antibiotik pada T-DNA yang berbeda. T-DNA adalah daerah DNA yang akan ditransfer dan telah diketahui dibatasi oleh 25 pasangan basa pada masing-masing ujungnya yang dikenal sebagai batas kiri (leji border) dan batas kanan (right border) (Hooykaas & Schilperoort 1992). KO-transformasi dengan menggunakan Agrobacterium melalui double T-DNA memungkinkan dihasilkannya tanaman transgenik tanpa gen penyeleksi antibiotik setelah segregasi (Komari et al. 1996; Matthews et al. 2001; Zhou et al. 2003). Kegiatan transformasi gen melalui perantara alami Agrobacterium tumefaciens telah menjadi kegiatan rutin pada banyak laboratorium di Indonesia. Akan tetapi tanaman transgenik yang dihasilkan dari sistem transformasi ini akan selalu mengandung gen penyeleksi antibiotik. Introduksi gen asing kedalam tanaman tingkat tingg menggunakan teknik Agrobacterium tumefaciens merupakan teknik yang sering digunakan &lam biofogi molekuler dan rekayasa genetik tanaman. Walaupun metode ini pada awalnya digunakan pada
tanaman dikotiledon, tetapi
sekarang telah
dikembangkan pada beberapa tanaman sereal seperti padi, jagung (Hiei et al. 1994). Salah satu keuntungan transfer gen dengan A. tumefaciens adalah efisiensi transformasi yang tinggi. Pada penelitian ini strategi yang dilakukan untuk mengintegrasikan gen penyeleksi yang dapat bersegregasi dengan gen sasaran adalah: 1 ) double T-DNA yang masing-masing membawa gen penyeleksi dan gen sasaran secara terpisah, dan gen sasaran yang digunakan adalah gen cryIAb. 2 ) Dua T-DNA berbeda inang, T-DNA yang satu membawa gen penyeleksi dan T-DNA lainnya membawa gen sasaran pada masing-masing plasmid Gen sasaran yang digunakan adalah gen penyandi asam salisilat yang dibawa oleh plasmid pCambia 1200 yang telah dibuang gen penyeleksinya. Asam salisilat dipilih karena memililu potensi dapat mempertinggi ketahanan tanaman terhadap stres biotik maupun abiotik. Asam salisilat secara alami terdapat dalam tanaman dan terlibat dalam beberapa fungsi fisiologis, seperti pembukaan stomata, induksi pembungaan, dan memiliki peran penting &lam
mengatasi serangan patogen (Verbeme et al.
2000). Penelitian yang dilakukan Verbeme et al. (2000)pada tanaman tembakau menunjukan bahwa gen-gen peningkat ekspresi asam salisilat (genpmsB clan gen
enC) yang berhasil disisipkan temyata dapat meningkatkan daya resistensi
tanaman tersebut terhadap patogen, namun tidak mempengamhi fenotip tanaman tersebut. Kandungan asam salisilat pada tanaman padi berkorelasi positif dengan tingkat ketahanan padi terhadap Pyricularia grisea (Silverman et al. 1995). Gengen yang bertanggung jawab dalam biosintesis asam salisilat dihasilkan oleh Pseudomonm fluorescens (gen pmsB) dan Escherichia coli (gen enlC). Gen-gen
tersebut terlibat dalam jalur biosintesis asam salisilat yang dimulai dari isochorismate sinthase oleh gen entC dan isochorismate pyruvate lyase oleh gen pmsB untuk meningkatkan resistensi terhadap penyakit yang disebabkan oleh
cendawan (Mercado et al. 1989). Penggerek batang m e ~ p d c a nsalah satu hama utama tanaman padi yang kuantitas serangannya semakin meningkat. Penggerek batang me~p&aIIsalah satu hama utama padi di Asia yang mengakibatkan kehilangan produksi sebesar 5 1 0 % (Pathak & Khan 1994) bahkan sampai 60-95% (Wunn et al. 1996). Penanganan hama penggerek batang sampai saat ini masih tergantung pada penggunaan pestisida. Gen cry adalah penyandi protein aktif anti serangga yang diisolasi dari BaciIlw thuringiemis, yaitu bakteri yang menghasilkan suatu kristal protein yang bersifat racun jika terhidrolisis dalam jaringan usus serangga (Dekeyser et al. 1990). Ekspresi gen yang diisolasi dari B. thuringiensis ini pada kultivar IR58 dan Basmati dapat meningkatkan ketahanan terhadap penggerek batang kuning dan bergaris (Wunn et d.1996; Nayak et al. 1997). Wunn et al. (1996) melaporkan tanaman padi yang mengekspresikan gen cyMb dapat meningkatkan ketahanan terhadap hama penggerek batang sampai 100%. Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkonsbuksi vektor ekspresi gen yang dapat mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik dengan menggunakan Olyza sativa sebagai tanaman model.
TINJAUAN PUSTAKA DNA Vektor (DNA Pembawa) Vektor DNA adalah molekul DNA yang dipergunakan untuk untuk membawa dan memperbanyak fragmen DNA yang dibawanya. Vektor hams mampu mengadakan replikasi dalam sel inang sehingga banyak salinan molekul DNA yang dihasilkan. Vektor yang sering digunakan adalah plasmid bakteri. Plasmid adalah bahan genetik ektrakromosom yang diwariskan secara tetap. Ciri-ciri plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen, pembawa informasi genetika, terlepas dari DNA kromosom atau kadangkadang &pat terintegrasi dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri (Lehninger 1994).
Pada penelitian ini digunakan vektor pCambia 1300 dan pCambia 1200, yang memiliki beberapa kelebihan seperti memiliki multple cloning site (MCS), bersifat stabil di Agrobacterium, ukurannya relatif kecil dan jumlah salinannya tinggi dalam E coli. pCambia memiliki pBR322 origin of replication untuk replikasi dalam E coli clan Agrobacterium, pBR322 mob site untuk mobilisasi dari E. coli ke Agrobacterium, membawa gen hpr penyandi ketahnan terhadap higromisin, gen nptll untuk ketahanan terhadap kanamisin, gen gusA serta &pat diuji dengan seleksi biru putih karena membawa gen lacZ(Brown 1996). T-DNA yang ada di dalam vektor pCambia mengandung gen nptZI, gen hpt dan gen gusA. Gen nprII penyandi enzim neomycin phosphotransfrase yang
digunakan sebagai penyeleksi pada bakteri. Enzim tersebut mendetoksifikasi senyawa aminoglukosida
melalui fosforilasi. Gen hpt menyandikan enzim
hygromycin phosphotranferase
yang digunakan sebagai penyeleksi untuk
mengetahui terintegrasinya T-DNA Agrobacrer~um ke dalam genom tanaman, sehingga hanya tanaman transgenik yang dapat hidup di media tumbuh yang mengandung antibiotik higromisin. Gen hpt umum digunakan untuk transformasi genetika sel tumbuhan karena antibiotik higromisin pada konsentrasi tertentu mampu menekan pertumbuhan sel tersbut (Christou et al. 1991). Beberapa jenis vektor &pat digunakan sebagai vektor rekombinan diantaranya: 1) Plasmid yaitu molekul DNA yang mampu bereplikasi dalam
sitoplasma bakteri secara bebas. Plasmid juga membawa gen-gen ketahanan terhadap antibiotik yang berguna sebagai penyeleksi sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan, 2) Virus atau bacteriofage DNA yang &pat membawa DNA sisipan sekitar 15 kb, 3) Cosmid yaitu DNA plasmid yang juga memiliki situs kohesif dari fage. Cosmid memiliki satu atau lebih gen penyeleksi antibiotik dan membawa sisi cos dari fage A. Cosmid dapat membawa DNA sisipan relatif besar (40-45 kb), 4) Shuttle vector ialah molekul DNA yang mampu bereplikasi di dalam dua jensi sel berbeda atau lebih. Beberapa jenis shuttle vector yang banyak digunakan adalah molekul DNA yang mampu bereplikasi dalam sitoplasma bakteri atau khamir (Kleinsmith & Kish 1995). Plasmid dapat diklasifikasikan berdasarkan sifat-sifat utama yang disandi oleh gen-gen dalam plasmid. Klasifikasi tersebut adalah: 1) plasmid fertilitas atau plamid F yang hanya membawa gen tra untuk melakukan transfer plasmid dengan cam konjugasi, 2) plasmid resistensi atau plasmid R, membawa gen yang menyebabkan resistensi tuan rumah terhadap satu atau lebih gen antibakteri, 3) plasmid col, mengkode kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri lain, 4) plasmid degadatif memungkinkan bakteri untuk mengadakan metabolisme molekul yang tidak biasa seperti toluen, dan 5) plasmid virulensi, menyebabkan patogenitas pada bakteri inang, misalnya plasmid Ti pada Agrobacterium yang menimbulkan penyakit crown gall pada tanaman dikotil (Brown 1991). Konstruksi DNA Rekombinan Teknik DNA rekombinan m e ~ p a k a nteknik pembentukan kombinasi
baru dan DNA dengan cara melakukan penylsipan molekul-molekul DNA yang dikerjakan di luar sel dalam suatu vektor dan dintroduksikan ke dalam sel inang sehingga
berkembang biak dalam sel
inang tersebut. Teknologi DNA
rekombinan atau rekayasa genetika pada intinya adalah proses kloning gen (Davis et a[. 1995; Freifelder 1995). Gen merupakan sekuen nukleotida yang menyandi RNA yang dibatasi oleh promoter dan terminator. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan sejumlah gen dari sumber berbeda disatukan untuk membentuk DNA
rekombinan weinsmith & Kish 1995). Tahapan dalam
kloning gen meliputi : penyisipan fragmen DNA yang mengandung gen target ke
dalam molekul DNA vektor, vektor rekombinan dimasukan kedalam sel inang, vektor dalam sel inang diperbanyak seiring dengan pembelahan sel inang dan sekaligus memperbanyak gen yang dibawa. Komponen penting dalam
rekombinasi DNA adalah enzim-enzim
manipulasi DNA serta QNA vektor. Brown (1991) membagi enzim manipulasi berdasarkan jenis dan reaksi yang dikatalisnya menjadi lima golongan yaitu: a) nuklease yaitu enzim yang mampu memotong molekul asam nukleat, b) ligase adalah enzim yang berfhgsi menyatukan molekul asam nukleat, c) polimerase adalah enzim yang &pat mensintesis DNA, d) enzim modifikasi yang mampu mengh~langkan atau menambahkan gugus kimia, dan e) topoisomerase adalah enzim yang mengubah DNA tertutup secara kovalen menjadi DNA supercoil. Pa& kegiatan pengklonan gen hanya dua jenis enzim yang berperan yaitu enzim restriksi endonuklease clan enzim ligase. Enzim yang mampu memotong ruas DNA secara tepat dan konsisten digolongkan kedalam tipe 11 endonuklease restriksi. Enzim ini mendegradasi DNA dengan memecah ikatan posfodiester yang menghubungkan satu nukleotida dengan nukleotida lainnya pada untaian DNA. Salah satu komponen yang diperlukan dalam teknologi DNA rekombinan adalah adanya vektor DNA, yaitu molekul
DNA yang
diperlukan untuk
membawa dan memperbanyak fragmen DNA. Vektor yang sering dipergunakan adalah plasmid bakteri yang merupakan materi genetik ekstra luomosom yang diwariskan secara tetap. Plasmid yang dipergunakan sebagai vektor sebaiknya berukuran kecil dan terbesar adalah 15 kb. Ukuran kecil sangat penting agar dapat memuat fragmen DNA asing yang besar, mudah dikenali dengan peta restriksi, dan menghasilkan jumlah salinan relatif lebih banyak dibandingkan dengan yang berukuran besar (Sambrook 1989). Plasmid yang digunakan untuk rekombinasi DNA
berukuran antara
1.0-250 kb. Plasmid yang berukuran besar biasanya mempunyai jumlah salinan
yang rendah yaitu 1-2 salinan per sel. Sebaliknya plasmid yang berukuran kecil mempunyai jumlah salinan tinggi, jumlahnya dapat mencapai 100 salinan per sel (Brown 1991).
Gen Penyandi Higromisin Fosfotransferase
Modifikasi tanaman secara potensid memberikan peningkatan substansid dalam praktek pertanian, kualitas makanan dan kesehatan manusia Kesuksesan ha1 ini tergantung pada kemampuan mengintegrasikan gen asing ke tanaman inang
dan efisiensi regenerasi dari sel-sel tertransformasi. Efisiensi transformasi yang rendah memerlukan gen marker penyeleksi untuk mengidentifikasi tanaman transgenik (Hare 2002). Penggunaan gen marker dalam proses transformasi
bertujuan memberikan keuntungan selektif untuk sel-sel tertransfonnasi, sehingga mereka tumbuh lebih cepat dan lebih baik serta membunuh sel-sel non transforman (Brasileiro & Aragao 2001) Efektifitas sistem ketahanan terhadap antibiotik tergantung temtama pada bahan seleksinya (selective agent) yang harus sepenuhnya menghambat pertumbuhan sel-sel yang tidak tertransformasi. Konsentrasi terendah dari bahan toksik hams &pat menekan pertumbuhan sel-sel non transforman, akan tetapi tidak memberikan efek yang merusak pa& sel-sel yang tertransformasi (Rodriguez & Nottemburg 2002) Gen-gen ketahanan terhadap antibiotik sebagai marka penyeleksi yang
umum digunakan adalah neomicin fosfotransfm I1 (nptIl) dan higromisin fosfotransfm (hpt). Higromisin umumnya lebih toksik dibandingkan kanarnisin
dan membunuh sel-sel sensitif lebih cepat (Rodriguez dan Notternburg 2002) dan me~pakanpenyeleksi yang lebih disukai untuk transformasi pada tanaman monokotiledon terutama gramineae (Bashir et a[. 2004).Higromisin merupakan antibiotik aminoglikosida yang diproduksi oleh Streptomyces hygroscopicus dan mempakan sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk sistem tanaman dan hewan. Antibiotik ini menghambat sintesis protein dengan cara mengganggu translokasi dan menyebabkan kesalahan translasi pada ribosom 80s (Bashir et al. 2004). Gen penyandi higromisin fosfotransferase (hpt) juga dikenal sebagai aminoglykosida 4 atau aphW
- fosfotransferase (APH 4) dan dinotasikan dengan hp!,
hph
(Rodriguez dan Notternburg 2002). Enzim higromisin
fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt, &pat mendetoksifikasi antibiotik higromisin B (Rodriguez & Nottenburg 2002) dan mengkatalisis fosforilasi
kelompok hydroxyl &lam antibiotik higromisin sehingga membuatnya menjadi tidak aktif (Brasileiro & Aragao 2001). Strategi Eliminasi Gen Penyeleksi Antibiotik KO-transformasi dengan double T-DNA Keberadaan gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik telah menimbulkan keberatan antara lain berupa kekhawatiran tejadinya transfer gen tersebut ke mikroorganisme dan kemunglunan terganggunya ekspresi gen yang memiliki peran penting, serta kesulitan untuk mengintroduksi gen lain. Terdapat beberapa metode yang &pat mengeliminasi keberadaan gen penyeleksi antibiotik, antara lain melalui, ko-transformasi baik dengan parficle bombardment maupun dengan double T-DNA, site-specrfic recombination (Mow dan Hooykaas 1992, Zuo JR et al. 2001), dan intra-genomic translocation via transposable elements (Cotsafii et al. 2002). Pada sistem ko-transformasi, gen sasaran dipisahkan dari gen penyeleksi antibiotik. Teknik ini dapat menjadi suatu teknik genenk yang
&pat diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik. Strategi untuk mendapatkan tanaman transgenik yang hanya mengandung gen sasaran tetapi tidak mengandung gen penyeleksi antibiotik dapat dilakukan dengan teknik ko-transformasi. Ko-transformasi &pat diperoleh melalui kokultivasi dengan satu Agrobacterium yang membawa mengandung
satu plasmid biner
gen penyeleksi dan gen sasaran pada T-DNA yang berbeda.
Depicker et a1 (1985) melakukan kokultivasi pada protoplas tembakau dengan satu Agrobacterim strain C58 yang mengandung dua T-DNA (T-DNA alami dan gen npt 11) pada plasmid Ti nopalin. Frekuensi kalus transforman dari basil
seleksi dengan antibiotik kanamisin (Km) adalah 11% dan hormone independent growth (HN) 8 %. Frekuensi relatif ko-trasnsformasi Km adalah 67% dan HN 73%. Hasil ini mengindikasikan bahwa satu bakteriurn dapat mentrasfer dan mengintegrasikan dua T-DNA sekaiigus dalam satu tahap infeksi. Komari
et
a1 (1996) melakukan ko-kultivasi tembakau dan padi dengan
satu Agrobacterium strain LBA 4404 yang mengandung dua T-DNA (satu gen nptII atau gen hpt sementara yang lain adalah gen p)pada vektor plasmid biner. Dari hasil penelitian dihasilkan 109 tanaman tembakau dan 549 tanaman pad^
yang hidup pada media seleksi higromisin. Dari masing masing transforman yang dihasilkan dari tanaman tembakau 54 dan dari tanaman padi 259 memperlihatkan positif p.Efisiensi trasnformasi adalah 50% untuk tanaman tembakau dan 47 % untuk tanaman padi. Selanjumya dilakukan penyerbukan sendiri secara acak, dm dari hasil segregasi gen ketahanan higromisin atau kanarnisisn serta ekspresi p diamati pada k e t m a n berikumya. Anakan yang hanya mengekpresikan gen p yaitu 56% (519) dari ko-transformasi tanaman tembakau dan 65% (13120) dari hasil ko-transformasi tanaman padi. Hasil ini mengindikasikan bahwa satu T-DNA yang hanya mengandung gen gus telah terintegrasi sekurang-kurangnya kedalam satu lokus yang berbeda. Ko-transformasi dengan dua Agrobacterium Ko-tranforrnasi dilakukan
melalui
ko-kultivasi
Agrobacterium yang mengandung gen penyeleksi antibiotik pada plasmid biner yang berbeda.
men-
dengan dua
dan gen s w a n
Tanaman transforman diseleksi dengan
penyeleksi antibiotik Untuk mendapatkan tanaman transgenik
yang tidak mengandung gen penyeleksi dilakukan segregasi dari ko-trasnsforman dengan
teknik penyilangan Depicker (1985) melakukan ko-kultivasi pada
protoplas tembakau dengan dua Agrobacteriurn yang berbeda menggunakan strain C58 yang mengandung nopalin plasmid Ti dengan wild T-DNA dan plasmid vektor biner
dengan gen n p n . Frekuensi kalus transforman yang
mengandung ketahanan kanamisin adalah 20% dan HN (hormone independent growth) 21%. Frekuensi relatif ko-transformasi sel-sel transforman Km dan HN masing-masing adalah 43% dan 42%. Hasil ini menunjukan bahwa masingmasing sel tanaman mempunyai cukup sisi pelekatan untuk beberapa bakteri dan transformasi satu sel tanaman oleh dua bakteri berbeda mewakili independent event (kejadian bebas). Mc Knight et al. (1987) melakukan kokultivasi daun tembakau dengan dua strain Agrobacterium LBA4404 yang mengandung gen nos (novalin sintase) dan gen nptII pada plasmid biner. Dari 16 tanaman yang diperoleh dengan men-
seleksi kanamisin,
tiga mengandung nopaline. Efisiensi
transformasi ko-kultivasi adaiah 19%. Semua tanaman yang didapat dari kotransformasi disilang terhadap tanaman asli bersegregasi untuk kedua gen yang
mengindikasikan bahwa dua T-DNA berbeda terintegrasi ke &lam lokus yang berbeda. Daley et al. (1998) melakukan ko-kultivasi rapseed dan tembakau dengan satu strain Agrobacterium yang mengandung gen nptII dan gen gus. Dari hail seleksi dengan menggunakan kanamisin diperoleh 34 rapeseed dan 100 tanaman tembakau yang dpat hidup, 21 dan 52 memperlihatkan aktivitas gus untuk masing-masing. Frekuensi transfomasi rapeseed adalah 62 % dan tembakau 52 %. Ketunman dari penyerbukan sendiri hanya mengekpresikan satu transgen
yaitu 40% (8120) dari kotrasnsformasi rapeseed dan 58% (24141) untuk tanarnan tembakau. Segregasi
nptII dan gen gus
setelah penyerbukan sendiri
mengindikasikan bahwa dua T-DNA berbeda terintegrasi kedalam lokus yang berbeda Gen Penyandi Biosintesis Asam Salisilat
Asam salisilat yang secara alami terdapat dalam tanaman terlibat dalam beberapa fungsi fisiologis, seperti pembukaan stomata, induksi pembungaan, dan memiliki peran penting dalam mengatasi serangan patogen (Verbeme et al. 2000). Penelitian Verbeme et al. (2000) pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa ekspresi gen-gen yang mendukung peningkatan ekspresi asam salisilat (gen pmsB dan gen enC) dapat meningkatkan daya resistensi tanaman tersebut terhadap patogen, namun tidak mempengamhi fenotip tanaman tersebut. Kandungan asam salisilat pada tanaman padi berkorelasi positif dengan tingkat ketahanan padi terhadap Pyricularia grisea (Silveman et al. 1995). Jalur biosintesis asam salisilat dimulai dari substrat chorismic acid yang dikatalis oleh enzirn isochorismate sinthare menjadi isochorismic yang diubah oleh enzim isochorismatepruvate lyase menjadi asam salisilat. Gen penyandi enzim isochorismate sinthase telah diisolasi dari Pseudomonas jluorescens dan disebut dengan genpmsB. Dari Lscherichia coli telah diisolasi gen enC penyandi enzim isochorismatepymate base (Mercado et al. 1989). Penyakit blas Penyakit blas yang disebabkan untuk cendawan P. olyrae merupakan salah satu penyakit tanaman padi yang sangat merugikan. Cendawan ini
menyerang dan membentuk bercak pada daun, batang, malai, bunga dan biji. Bercak pada pelepah daun jarang ditemukan. Bentuk khas bercak blas adalah elips yang kedua ujungnya kurang lebih runcing. Bercak yang telah berkembang pada bagian tepi bemama coklat dan bagian tengah benvama putih keabuan. Dalam keadaan lembab bercak akan terus membesar terutama pada varietas peka (Amir & Karden 1991). Pada varietas padi peka, bercak tersebut dapat meluas dan
bersatu sehingga akhimya helai dam mengering dan mati. Pada padi yang tahan, gejala serangan hanya berupa bintik kecil b e m a coklat (Ou 1972). Spora cendawan secara alami menyebar mulai tengah malam karena adanya embun atau hujan. Penyebaran spora akan bertambah banyak sampai menjelang pagi hari dan berakhir pada saat terbit matahari. Pelepasan spora di daemh tropis dapat terjadi pula pada siang hari setelah turun hujan. Embun sangat
berpengaruh terhadap pelepasan spora dan infeksi. Jika periode embun lebih lama, spora yang dilepaskan lebih banyak sehingga infeksi yang terjadi semakin parah
(IRRI 1975). Penyebaran spora dapat terjadi selain oleh embun atau hujan juga oleh angin, biji dan jerami sakit. Cendawan P. orjnae dapat bertahan dalam sisa jerami sakit dan gabah sakit selama lebih dari satu tahun pada suhu kamar. Sedangkan dalam bentuk miselia mampu bertahan sampai lebih dari tiga tahun (Amir & Karden 1991). Gen cry, Penyandi 6 Endotoksin Bacillus thuringiensis adalah bakteri tanah yang selama proses sporulasi
mampu membentuk laistal protein yang bersifat racun apabila terhidrolisis dalam usus serangga.
Bakteri ini sudah digunakan lebih dari 50 tahun sebagai
insektisida biologi (Tu et a[. 2000). Tanaman transgenik menjadi tahan hama karena adanya ekspresi endotoksin yang bersifat seperti insektisida (Insecticidal CrystaI Protein
=
ICP) dari Bacillus thuringiensis (Bt toxin) dalam jaringan
tanaman (Nayak et al. 1997; Wu et al. 1997). Aktivitas insektisida Bt sangat spesifik sehingga endotoksin tersebut tidak toksik untuk serangga non target, burung dan mamalia (Tu et al. 2000). Gen cry adalah penyandi protein aktif anti serangga
yang diisolasi dari
B. thuringiensis yaitu bakteri yang menghasilkan suatu kristal protein yang
bersifat racun jika terhidrolisis dalam jaringan usus serangga (Dekeyser et a1
1990). Gen cry &pat diklasifikasikan berdasarkan protein yang disandikan dan spesifitasnya terhadap serangga yaitu bersifat racun cryI, cry11 cryIII cryIV cryV dan
c f l . Protein yang disandikan oleh gen cry bersifat racun terhadap
serangga ordo Lepidoptera, Diptera dan Coleoptera (Toenniessen 1991) akan tetapi aktivitas bioinsektisida Bt tidak toksik terhadap ordo homoptera (Rao et al. 1998). Pada kondisi normal protein ini sulit larut, tetapi akan larut dalam pH tinggi (diatas 9.5) yaitu kondisi yang biasa ditemukan pada usus tengah larva lepidoptera. Karena itulah Bt merupakan bahan insektisida yang sangat spesifik. Saat larut dalam usus serangga, protoksin dipecah oleh protease usus untuk menghasilkan toksin aktif yang berukuran sekitar 60 kDa Toksin ini diistilahkan sebagai Gendotoksin. Toksin tersebut berikatan dengan sel-sel epitelium usus, membuat lubang-lubang (pori) pada sel membran dan menyebabkan ketidakseimbangan ion. Sebagai akibatnya kerja usus terhenti dengan cepat, selsel epitelium lisis dan isi usus masuk dalam rongga tubuh.
Hal ini akhimya
mengakibatkan keracunan dan matinya larva (Anonim 2000). Penempelan racun
pada usus serangga memerlukan adanya reseptor untuk protein kristal spesifik sehingga terjadi toksisitas, dan pada satu serangga mungkin saja terdapat reseptor berbeda untuk protein kristal berbeda . Kristal protein ini disandikan oleh gen cry. Gen q y yang telah berhasil diidentifikasi adalah sebanyak lebih dari 140 gen dan telah diklasifikasi ulang menjadi 24 kelompok utama (Criclanore et al. 1998). Toksin yang berbeda mempunyai spesifitas yang berbeda untuk serangga yang berbeda. Cry 1 spesifik untuk hama-hama dari ordo Lepidoptera, Cry 2 untuk Lepidoprera dan Diptera, Cry 3 untuk Coleoptera dan Cry 4 untuk Diptera (Maqbool er al. 1998). Beberapa peneliti telah melakukan introduksi gen cry ke dalam tanaman padi. Gen crylAb dari Bacillus thuringiemis mampu meningkatkan ketahanan padl kultivar Tarom molaii terhadap penggerek batang padi kuning dan bergaris (Wu et al. 1997; Ghareyazie et a[. 1997). Nayak et al. (1997) telah mentransfer gen cryIAc ke padi indica varietas IR64 dan dari hasil insect feeding assoy menunjukkan bahwa galur transgenik mampu mengekspresikan toksin pa& level yang mematikan larva penggerek batang padi kuning. Peneliti lain (Tu et al.
2000) menghasilkan galur padi transgenik yang mengandung h i gen crylAc dan gen crylAb, dan menunjukkan ketahanan terhadap penggulung daun dan penggerek batang kuning.
Penggerek batang Penggerek batang merupakan salah satu hama utama tanaman padi yang
kuantitas serangan dari tahun ketahun semakin meningkat. Penggerek batang merupakan salah satu hama utama padi di Asia yang mengakibatkan kehilangan produksi sebesar 5-10% (Pathak & Khan 1994), bahkan bisa sampai 60-95%
(Wunn et al. 1996). Terdapat empat spesies penggerek batang padi
yaitu
penggerek batang kuning (Schirphopaga incertulas), penggerek batang putih (Schirphopaga innotata), penggerek batang bergaris (Chilo supresalis) dan penggerek batang merah jambu (Sesamia injerens). Tiga jenis pertama tergolong famili Pyralidae dan yang terakhir
tergolong famili Noctuidae dan semua
termasuk ordo Lepidoptera. Di Indonesia, dari empat spesies yang ada, hanya dua yang dominan
di daerah
produksi padi yaitu penggerek batang
kuning
(Schirphopaga incertulas), penggerek batang putih (Schirphopaga innotata) W l i n et al. 1995; Soewito et al. 1995). Penggerek batang padi menimbulkan gejala kerusakan melalui liang gerek yang dibuat oleh larva sehingga dapat memutuskan transfort air dan unsur
hara dari akar. Kerusakan yang timbul tergantung pada fase pertumbuhan tanaman. Jika serangan tejadi pada fase vegetatif maka dam tengah atau pucuk tanaman mati karena titik tumbuhnya dimakan, gejda ini disebut sundep. jika seranga tejadi pada fas generatif maka malai akan mati karena pangkalnya dikerat oleh larva sehingga bulir padi menjadi hampa. Gejala serangan pada tahap ini disebut beluk (Soewito et al. 1995). Penanganan penggerek batang sampai saat ini masih tergantung pada penggunaan pestisida. Teknik penyisipan gen asing untuk tujuan pemberian ketahanan terhadap hama telah dikembangkan pada beberapa kultivar padi Indonesia. Salah satu gen ketahanan yang berhasil disisipkan ke kultivar Rojolele adalah ciyIAb penyandi ketahanan terhadap hama dari golongan Lepidoptera melalui bombardment (Slamet-Loedin et al. 1998). Ekpresi gen yang diisolasi
dari B. thuringiensis pda kultivar IR58 dan Basmati dapat meningkatkan ketahanan terhadap penggerek batang kuning dan bergaris (Wunn et al. 1996; Nayak et al. 1997). Wunn et al. (1996) melaporkan bahwa hasil introduksi gen cryIAb ke tanaman padi dapat menekan serangan hama penggerek batang
sampai 100%.
Transformasi Genetik Tanaman Padi melalui Agrobacterium Kemampuan Agrobacterium untuk menjadi mesin genetik alami telah dimanfaatkan sebagai alat genetik yang sangat penting. Kemampuan untuk melakukan transformasi sel tanaman tersebut berhubungan dengan adanya plasmid penginduksi tumor. Istilah tanaman transgenik dalam pengertian luas dipakai untuk tanaman yang memiliki gen asing yang terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen tersebut berfungsi (Uchimiya et al. 1989). Berbagai metode saat ini telah dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik baik melalui transformasi langsung maupun tidak langsung (Herman 1999). Transformasi secara langsung antara lain dengan elektroporasi, fusi dengan PEG @oliethylene glycol), mikro injeksi dan penembakan DNA. Transformasi gen secara tidak langsung ialah melalui vektor A. tumefaciens. Bakteri A. tumefaciens merupakan patogen tanaman. Secara alami melalui mekanisme yang komplek, Agrobacterum mampu memindahkan suatu vektor plasmid yaitu Ti (Tumor inducing) yang terdapat di dalam genom tanaman. Pada plasrnid Ti terdapat bagian-bagian penting yang terkait dalam mekanisme transfer gen. Bagian-bagian tersebut ialah daerah T-DNA dan daerah virulence (vir) pada plasmid Ti. Gen target yang akan diintroduksikan ke dalam T-DNA untuk selanjutnya dipindahkan ke dalam genom tanaman. Gen vir berperan penting dalam rnekanisme pemindahan daerah T-DNA ke dalam genom tanaman. Selain plasmid Ti, ada gen lain yang berperan dalam transfomasi yaitu gen cromosomal virulence (chv). Gen-gen ini berperan dalam pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman (Sheng & Citovsky 1996). Mekanisme transfer DNA dari plasmid Ti ke
dalam genom tanaman disajikan pada gambar 2 (Gelvin 1993). Salah satu ha1 penting
dalam keberhasilan
transformasi melalui
Agrobacterium adalah spesifikasi vektor yang dipergunakan. Sistem vektor
ganda (biner) me~pi3kancara yang umum dilakukan. Pada sistim vektor ganda diperlukan dua plasmid dalam Agrobacterium. Plasmid tersebut adalah plasmid vektor yang mengandung
fragmen DNA
dan plasmid helper
Ti yang
menyediakan gen vir sebagai fasilitator transfer gen ke dalam sel tanaman (Slamet-Loedin
1994). Disamping itu efisiensi
Agrobacterium sangat dipengaruhi
dengan jenis tanaman
transformasi
melalui
kesesuaian antara galur Agrobacteriwn
maupun varietas tanaman yang akan ditransformasi. Varietas
yang berbeda memiliki
respon berbeda
pula terhadap
galur
Agrobacterium yang dipakai &lam proses transformasi genetik.
Keberhasilan Hiei et al. (1994) mentrasnformasi tanaman padi dengan A. tumefaciens menunjukan
keberhasilan
penerapan sistem
transformasi
A. tumefaciens pada monokotil. Secara alami bakteri patogen tanah ini hanya
menginfeksi tanaman dikotil dengan cara mengintroduksi T-DNA dari plasmid Ti bakteri ke dalam inti sel tanaman (Smith & Hood 1995). Dong et al. (1996) menggunakan A. tumefaciens LBA4404 dengan pTok 233 untuk transformasi padi javanica kultivar Gulhont, tetapi efisiensi transformasinya masih sangat rendah. Kemudian Rashid et al. (1996) berhasil mentransformasi tanaman padi IndicaIndia kultivar Basmati menggunakan A. tumefaciens EHA 101 dengan PIG 121
Hm. Diantara berbagai jenis tanaman pangan utama, padi m e ~ p a k a nspesies pertama yang menghasilkan tanaman transgenik fertil. Metode transformasi genetik pada tanaman padi semakin berkembang termasuk pengetahuan tentang berbagai promoter (Terada & Shimamoto 1993). Untuk meningkatkan efisiensi transformasi melalui Agrobacferium pada tanaman monokotil temtama untuk spesies yang rekalsitran seringkali diperlukan berbagai modifikasi dalam metode transformasi
melalui Agrobacferium (Smith & Hood 1995). Transformasi
terhadap kecambah kedelai menggunaka Agmbacterium juga telah berhasil dilakukan oleh Chee et al. (1989). Menurut Sheng dan Citovky (1996) terdapat tiga komponen dalam
A. tumefaciens yang berperan dalam transfer DNA ke dalam sel tanaman, yaitu: 1. Daerah T-DNA
T-DNA yaitu bagian dari tumor inducing plasmid (Ti) yang dimiliki A. tumefaciens ditransfer kedalam sel tanaman, atau T-DNA adalah
bagian DNA yang memiliki ciri khusus yang berada pada 200 kb Ti plasmid Agrobacterium yang diapit oleh sekuen berulang DNA (25) sebagai batas T-DNA. 2. Daerah virulence (vir)
Gen vir ini mempunyai ukuran 35 kb dan terbagi atas 7 macam, yaitu vir A, B, C, D, E, F, G, dan vir H. Gen-gen
vir mensistesis protein
virulence. Protein vir ini berperan di dalam menginduksi terjadiiya trasfer T-DNA dan integrasinya ke tanaman. Ekspresi gen-gen diinduksi oleh adanya senyawa fenolik seperti asetoseringon, monosakarida spesifk (glukosa, arabinosa, galaktosa, fruktosa, dan xilosa), dan kondisi pH juga mempengaruhi
ekspresi
gen vir. Tanaman yang terluka
mengeluarkan cairan dengan keasaman yang khas antara pH 5,O-5,s (Sheng & Citovsky 1996). Senyawa fenolik dan monosakarida terbentuk pa& saat tanaman dikotil luka dengan mengeluarkan getah dan proses ini jarang terjadi pada tanaman monokotil yang perlu penyesuaian kondisi infeksi. Penyesuaian kondisi dapat berupa penambahan fenolik, penambahan monosakarida, dan pengurangan pH.
dalam sel tanaman.
3. Gen chromosomal virulence (chv)
Komponen ini terletak pada kromosom Agrobacterium, yang terdiri atas chv A, chv B, psc A dan art. Gen chv digunakan untuk pelekatan bakteri
ke dalam sel tanaman dengan membentuk senyawa 8-1,2 glukan (Sheng & Citovsky, 1996).
Kemampuan Agrobacterium menyebabkan tumor disebabkan karena adanya plasmid Ti (tumor inducing) di dalam bakteri yang akan menginfeksi tanaman dikotil. Daerah T-DNA dari plasmid Ti ditransfer dan diintegrasikan ke dalam sel tanaman target. Daerah T-DNA mengandung gen-gen penyandi hormon perbmbuhan dan opine. Terintegrasinya T-DNA menyebabkan ekspresi gen-gen untuk mensintesis hormon pertumbuhan dan opin. Opin digunakan sebagai sumber karbon dan nitrogen bagi Agrobacterium (Sheng & Citovsky 1996). Plasmid Ti dapat diadaptasikan sebagai vektor yang berguna untuk transfer gen ke dalam sel tanaman. T-DNA ditentukan oleh adanya sekuens berulang (terdiri dari 25 bp) yang mengapitnya dari bagian kin dan kanan. Sekuens ini diperlukan secara in cis untuk trasnfer T-DNA dan merupakan sekuens pengenalan untuk situs spesifik endonuklease yang disandi oleh gen virD. Hasil pemotongan adalah molekul utas tunggal linier yang diduga sebagai intermediet
untuk transfer T-DNA ke sel tanaman. Hal ini penting untuk
merancang vektor bahwa sekuens pembatas harus mengapit DNA dasar yang akan ditransfer dan m e ~ p a k a nelemen yang beraksi in cis untuk transfer TDNA. Penambahan senyawa fenolik asetosyringone pada tahap kekultivasi bertujuan untuk mengakhpkan gen-gen vir pada Ti plasmid. Proses transfer TDNA diawali dengan dideteksinya senyawa fen01 dan tejadinya pengaktifan
gen vir. Protein dari gen vir A ini akan mengnduksi fosforilasi dari gen vir G yang selanjutnya mengaktifkan gen vir lainnya. Beberapa gen vir berperan &am pemotongan fragmen T-DNA dan pengintegrasian T-DNA ke dalam kromosom sel inang. Integrasi T-DNA akan mengalami sedikit pengaturan kembali secara intra dan inter molekuler, untuk memulihkan system transkripsi dan translasi genom tanaman resipien (Sheng & Citovsky 1996). Pemakaian senyawa
asetosiringon
merupakan
kunci
keberhasilan
transformasi
melalui
Agrobacterium pada tanaman padi. Penambahan glukosa, pH media 5.2 serta
suhu ko-kultivasi antara 22-28 "C juga merupakan kondisi optimum yang diperlukan bagi transformasi padi melalui Agrobacferium(Hiei er al. 1994) A. tumefaciens mempunyai kemampuan untuk mentransfer potongan
DNA (T-DNA) dari Ti plasmid kedalam nukleus sel-sel yang diinfeksi sehingga terintegrasi kedalam genom tanaman dan akan menyebabkan crown gall (Nester er al. 1984). T-DNA mengandung dua tipe gen yaitu gen onkogenik yang
mengodekan enzim yang dilibatkan dalam sintesis auksin dan sitokonin serta berperan dalam pembentukan tumor, gen kedua berperan mengodekan sintesis opin. Senyawa ini dihasilkan karena kondensasi antara asam amino dan gula juga disintesis dan dielaesikan oleh sel-sel crown gall yang kemudian digunakan oleh Agrobacterium sebagai sumber karbon dan nitrogen. Disamping itu T-DNA
ditempatkan pada gen-gen yang berperan dalam katabolisme opin, gen tersebut dilibatkan dalam proses transfer T-DNA
dari bakteri ke sel tanaman dan
transfer plasmid bakteri konjugatif (Hooykass & Schilperoort 1992).
Regenerasi in virro Tanaman Padi Tanaman merupakan organisme multiseluler yang kompleks dengan organ-organ yang memiliki fungsi berbeda. Dengan kemajuan ilmu fisioilogi
tanaman memungkinkan bagian tertentu dari organisme multiseluler tersebut ditumbuhkan secara terpisah dalam keadaan in vitro. Melalui manipulasi lingkungan tumbuh, bagian-bagian tanaman tersebut
dapat diregenersiskan
menjadi tanaman lengkap p i x o n 1985). Regenerasi tanaman merupakan suatu proses perkembangan
yang sangat kompleks. Gunawan (1992) menyatakan
bahwa regenerasi Mtur in vitro terjadi melalui pembentukan organ langsung
dari eksplan, pembentukan embrio langsung dari eksplan, pembentukan organ melalui kalus serta pembentukan embrio melalui kalus. Kalus yang diinduksi dari skutelum merupakan bahan awal yang sangat baik untuk Mtur in vitro padi (Hiei el al. 1994). Chauhan dan Shing (1995) menggunakan media LS + 2mgA2.4-D + 1 mgA kinetin untuk induksi kalus padi Indica cv. HPU799, HPU2421, HPU741, HPU2216 dengan frekuensi induksi
kalus 65.0%96.5% dan kondisi kalus yang kompak, warna putih kekuningan, bentuk nodular dan sebagian besar embriogenik. Pemakaian pengatur zat tumbuh yang tepat sangat berpengaruh dalam keberhasilan regenerasi dalam kultur in vitro padi terutama bagi kelompok rekalsitran. Datta et al. (2001) menggunakan media regenerasi N6 dengan 2 mg4 kinetin dan 1 mg4 NAA pada padi Indica cv. IR72, IR64, IR68899B dan MH63. Nayak et al. (1997) Menggunakan media MS + 3mgA BAP + 1 mgA NAA untuk regenerasi padi Indica IR64, sedangkan Alam et a1 (1998) menggunakan media regenerasi MS + 2 mg.1 kinetin + 0.1 mg/l NAA pada pad^ Indica cv. Vaidehi. Hatsillah (1998) menggunakan media regenerasi LS + 0.3 mg/l BAP + 0.5 mg/l
IAA pada padl lndica cv. Membramo akan tetapi sebagian besar kalus yang tahan terhadap higromisin tidak berhasil membentuk tunas bahkan kalus didominasi oleh akar.
Analisis PCR PCR merupakan teknik analisis tingkat DNA yang dipakai untuk penggandaan urutan basa DNA spesifik secara in vitro dengan memanfaatkan
cara replikasi DNA dengan bantuan enzim polimerase (Davis et al. 1994). Keuntungan teknik PCR diantaranya adalah analisanya cepat, tidak diperlukan DNA &lam jumlah banyak, dapat dilakukan pada fase awal pertumbuhan dan metoda ekstraksi DNAnya relatif sederhana. PCR &pat dipergunakan untuk mengamplifikasi gen yang telah diintroduksikan ke sel tanaman
target untuk
membuktikan keberadaannya. Teknik PCR memunglankan analisis sampel &lam
jurnlah banyak dan waktu singkat untuk mengetahui keberadaan gen yang diintroduksikan (Cha & Thilly 1993; Casas et al. 1995). PCR tejadi melalui reaksi yang berlangsung secara berseri dan berulang dari denaturasi, penempelan primer dan ekstensi atau sintesis yang berlangsung secara otomatis. Pada tahap pertama, molekul DNA didenaturasi dengan meningkatkan suhu sampai 95°C selama 30 detik. Tahap selanjutnya suhu reaksi diturunkan berkisar antara 50 sampai 60°C atau tergantung pada panjang primer dan tahap terakhir suhu dinaikan lagi sampai 72°C untuk mengaktifkan tag polymerase (Krawetz 1998; Muladno 2002).
PCR merupakan metode yang sangat sensitif sehingga dengan satu molekul DNA dapat memperbanyak DNA menjadi jutaan kali lipat setelah 30-40 siklus PCR. Adapun komponen yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah DNA target, primer, deoksynukleoside rriphosphat (dNTP), Taq DNA polymerase, bufer PCR (Muladno 2002). Sekuen primer yang tepat memunglunkan amplifikasi hanya terjadi pada fragmen spesifik dan tepat. Primer untuk PCR sebaiknya terdiri dari 18-28 nukleotida, tidak terdapat duplikat antara k e 2 primer untuk mendeteksi
gen target. Primer harus bersifat komplemen terhadap DNA target. Semakin pendek
ukuran primer (8-mer), maka semakin tidak spesifik fragmen yang dihasilkan. Sebaliknya semakin panjang primer (20-mer)
maka akan semakin spesifik
fragmen yang dihasilkan. Ukuran primer yang lebih besar dari 30-mer sangat jarang digunakan. DNA target yang diamplifikasi hendaknya tidak lebih dari 3 kb
dan sebaiknya kurang dari 1 kb (Brown 1996). Spesifisitas primer harus tinggi dan persen kandungan G + C antara 50-60 % serta mempunyai Tm (OC) kedua
primer sebaiknya sama. Zat lain yang penting adalah dNTF' yang merupakan material utama untuk sintesis DNA baru dalam proses PCR, yang stabil pada -20°C untuk beberapa bulan. dNTP terdiri dari empat senyawa, yaitu dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. Ketidakseimbangan konsentrasi keempat komponen
akan mengurangi kemampuan kinerja enzim Tuq DNA polimerase. Konsentrasi dNTP sebaiknya antara 20-200 pM (Innis & Gelfand 1990).
Enzim polimerase yang digunakan dalam teknik PCR adalah enzim yang
tahan panas supaya pada waktu denaturasi (suhu tinggi) enzimnya tidak rusak. Enzim ini dikenal dengan Tuq DNA polimerase yang diisolasi dari bakteri termofilik Termus aquaticus dan dapat aktif pada suhu 9495°C. Suhu annealing merupakan faktor penting yang menentukan spesifitas suatu PCR. Dengan demikian suhu dan waktu yang digunakan bergantung pada urutan DNA yang akan diamplifikasi. Suhu annealing &pat diduga berdasarkan suhu melting (Tm) antara primer dengan DNA cetakan. Suhu annealing biasanya lebih rendah 3-5°C
dari suhu melting.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Ternpat Penelitian dilaksanakan di Laboratorium
Biologi Molekuler Puslit
Bioteknologi LIP1 Cibinong, Bogor, pada bulan Pebruari -November 2005. Bahan Plasmid pC1300 hpr intron (P. Ouwerkerk, Leiden University, The Netherlands) digunakan sebagai vektor untuk konstruksi vektor ekspresi dengan
double T-DNA, sedangkan plasmid $1200
@ Jefferson, CAMBIA, Canberra,
Australia) digunakan sebagai vektor ekspresi dengan dua sel inang. Gen cryIAb diisolasi dari plasmid pGem4 cryIAb dan digunakan sebagai gen sasaran pada vektor ekspresi dengan double T-DNA. Gen ciyIAb dibawah kendali promoter ubiquitin dan terminator nos dari Bt. Gen SA yang terdii dari pmsB dan entC diisolasi dari pSA (Verberne 2000) dan digunakan sebagai gen sasaran untuk vektor ekspresi dengan dua sel inang. Gen e&
yang berasal dari E. coli dan
pmsB dari P 35s masing-masing dibawah kendali promoter dan terminator pit. Gen hpr yang terletak pada T-DNA dari pC1300 hpt intron digunakan sebagai penanda seleksi baik pada vektor dengan double T-DNA maupun pada vektor ekspresi dengan dua sel inang. Plasmid pC1300 hpt intron diturunkan dari $1300
dan $1200
Ahp diturunkan dari pC1200.
$1300 diijikan pada Gambar 2.
Gambar 2 Plasmid PCAMBIA
Peta fisik pCl2OO dan
Adaptor oligonukleotida yang mengandung LB dan RB digunakan untuk merakit plasmid double TDNA. Adaptor tersebut
adalah oligonukletida
utas 1:
5"ITGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGmAAGATCTTGGCAGGATA TA'ITGTGGTGTAAACAG 3', sedangkan utas 2 adalah 5' CATGCTGTITAC
ACCACAATATATCCTGCAAGATCTTAAACGCTCTTTTCTC'ITAGGTITA CCCAACAT G 3'. A. tumefaciem galw Agl-1 digunakan sebagai perantara transfer gen yang terdapat pada T-DNA ke dalam genom tanaman padi. E. coli DHSa digunakan sebagai inang dalam rekayasa DNA dan pRK2013 digunakan sebagai plasmid helper.
Padi kultivar Rojolele digunakan sebagai bahan untuk hansformasi
genetik
dengan vektor ekspresi. Media untuk ko-kultivasi
tanaman padi
dan regenerasi
disajikan pada Lampiran 1 dan media untuk biakan bakteri
disajikan pada Lampiran 2. Primer untuk mendeteksi gen cryIAb mempunyai urutan basa sebagai berikut :forward (5'- CATTGTGTCTCTCTXCC-3') dan reverse (5'-CCGlT AGAGAAGTTGAAAGG-3').
Untuk mendeteksi keberadaan gen pmsB
digunakan primer dengan: forward 5'ATGCTGCCGCTAAAACCGCCACAA 3'
dan reverse 5' TGACTTGGCCTGCGCCGAGTACGT-3'. Untuk gen
hpt
dideteksi dengan primer forward (5'-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3') dan reverse (5'-GCATCTCCCGCC GTGCAC-3').
Metodologi Untuk merakit vektor ekspresi sehiigga
penanda seleksi &pat
tereliminasi dilakukan melalui dua strategi yaitu : 1. Menggunakan double T-DNA dalarn satu vektor biner yang mengandung gen penanda seleksi antibiotik dan gen sasaran cryIAb. 2. Menggunakan dua inang Agrobacterium tumefaciens yang mengandung
gen penanda seleksi resisten higromisin pada satu inang dan gen sasaran SA yang terdiri daripmsB dan en& pada inang yang lain. Kedua vektor ekspresi tersebut kemudian diintroduksikan ke dalam tanaman padi kultivar Rojolele dengan perantara A. tumefaciens.
Strategi 1 MCS
v
Adaptor RB & LB
dengan situs BsrX dan EeoRl
0RI
cryIAb PZTDNA
Potong dengan enzim H i d 1
Introduksi gen cryIAb ke MCS pada daerah TDNA2
Ligasi
Gambar 3 Konstruksi vektor ekspresi untuk eliminasi penanda seleksi dengan double T-DNA
Konstruksi Vektor yang Mengandung Double T-DNA Strategi untuk konstmksi vektor ekspresi dilakukan seperti Gambar 3.
T-DNA
yang mengandung double
Double T-DNA dibuat
dengan
menyisipkan adaptor oligonukleotida yang mengandung right border dan l e j border (RB dan LB) pada situs BstXI dan EcoRl dari pC1300 hpt intron. Adaptor
ini mengandung situs BglII dan vektor ini selanjutnya disebut dengan p2TDNA
pada situs H i d I I . Kaset cry JAb dibawah promoter ubikuitin dan terminator nos disisipkan kedalam p2TDNA yang kemudian dinamakan dengan p2TDNAcryIAb. Lokasi kaset cryIAb dan kaset hpt intron pada dua T-DNA disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4 Lokasi kaset cryIAb dan hpt intron pada T-DNA Konstruksi Vektor di Dna Inang yang Berbeda Strategi untuk konstruksi dua vektor ekspresi di dua inang yang berbeda dilakukan seperti Gambar 5. Pada penelitian ini gen penanda seleksi resistensi terhadap higromisin sudah diionstruksi
di dalam pC1300 hpt intron
(P. Ouwerkerk, Leiden University, The Netherlands) sehingga hanya pC12SA
yang harus diionstruksi. Gen p m B dan gen entC masing-masing dibawah kendali promotor 35s CaMV dan terminator pit disisipkan ke &lam situs XbaI dan EcoRl
pada
pC1200 yang telah dibuang gen hpr nya yang menjadi pC12SA. Lokasi kaset p m B dan gen entC pada T-DNA dapat dilihat pada Gambar 6. Vektor ini
selanjutnya dimasukkan ke dalam triparenial mating.
A. tumefaciens galur AGL-I melalui
Strategi 2 MCS
1
LB
enfl
Gen penyandi biosintesis asam salisilat
MCS
A. tumefaciens
A. tumefaciens
Gambar 5 Konstruksi vektor ekspresi untuk eliminasi penanda seleksi melalui dua inang
K 35s 7 "
pms~
entc
K35.s
\J
Pit
right border
Gambar 6 Lokasi p m B dan gen enrC pada T-DNA dari plasmid pC12SApmB : penyandi enzim isochorismat gmtthare dari Pseudomonas$uorescenr; enrC: penyandi enzim i s o p a t lyase dari ficherichia coli; Pit: potato proteinase inhibitor. Isolasi DNA Plasmid pC1300 hpt inbon dan pC1200 lsolasi DNA plasmid dilakukan dengan prosedur Mini Preps (Sambrook et a1.1989). Sebanyak 1,5 ml kultur bakteri hasil perbanyakan di LB cair, dimasukkan ke tabung ependorf 1,s ml, lalu disentrifus pada 12.000 rpm selama 1 menit Supematan dibuang dan pelet ditambah dengan 100 pl larutan I (Tris HCI pH 8.0 25 mM, EDTA 10 mM, glukosa 10 mM dan lisozime 2 mglml) lalu divortex hi~~gga suspensi homogen. Kemudian ditambahkan 200 pl larutan I1 (NaOH 0,s M, SDS I%), dan divortex. Selanjutnya ditambahkan 150 pl larutan
III (CH3COONa 3 M pH 4,s) dan divortex lalu d i i i b a s i di es selama 15 menit Kemudian disentrifus pada 12.000 rpm selama 15 menit. Supematan ditambah dengan 1 ml etanol absolut kemudian disentrifus pada 12.000 rpm selama 15 menit. Pelet DNA dicuci dengan 1 ml etanol 70% kemudian disentrifus pada 12.000 rpm selama 15 menit Supematan dibuang dan pelet diieringkan di suhu ruang. Setelah kering pelet ditambah dengan 50 p1 TE (Tris HCI 10 mM pH 8.0 EDTA 1mM ) dan dishpan pada suhu -20°C. Pemotongan pC1300, pCl2OO dan pSA Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi sesuai dengan prosedur yang terdapat pada Promega (1996). Plasmid pC1300 hpr intron dipotong dengan enzim H i d I I , ujung fosfatnya dihidrolisis setelah dipotong dengan metode Promega (1996).
DNA plasmid pC1300 hasil pemotongan ditambah dengan
buffer C W (calf intestinal alkaline phosfatase), air dan enzim C W . Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah inkubasi reaksi dipresipitasi
kembali. Plasmid pC12hpt dipotong dengan enzim Xbal dan EcoRI sedangkan untuk plasmid pSA yang mengandung gen entC dan pmsB dipotong dengan menggunakan enzim Xbol,
Xbal dan EcoRl dan masing-masing tiagmen
diisolasi. Isolasi fragmen Pemurnian fragmen cryIAb dan gen-gen penyandi asam salisilat dari gel dilakukan dengan menggunakan sephoglass brondprep (BP) kit dari Pharmacia. Gel yang mengandung DNA sasaran ditimbang kemudian ditambahkan larutan gel solubilizer (1 pVmg gel) lalu divortex. Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu 60°C selama 10 menit (hingga gel larut). Campuran ini ditambah dengan sephaglass BP 20% lalu divortex d m diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan
12.000 rpm selama 2 menit. Pelet
dicuci dengan wmh buffer (16 x volume sephaglas BP yang ditambahkan) dan dipipet naik turun lalu disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 30 detik (dilakukan 3x). Pelet dikeringkan dan dilarutkan dalam elution buffer. Ligasi Oligonukleotida yang mengandung right dan leff
border dengan
pCl300 hpt intron Proses ligasi dilakukan sesuai dengan prosedur Promega (1996). Reaksi ligasi terdiri atas DNA pC1300 hpt inhon (100 ng) dan oligonukleotida (300 ng) sebagai sisipan, bufer T4-DNA ligase, enzim T4-DNA ligase d m air. Reaksi ligasi dilakukan semalam pada 4OC. Ligasi p2TDNA dengan cryIAb Proses ligasi dilakukan sesuai dengan prosedur Promega (1996). Reaksi ligasi terdiri atas DNA vektor (p2TDNA) dan sisipan (cryIAb) dengan
perbandigan 1:3, buffer T4-DNA ligase, enzim T4-DNA ligase dan air. Reaksi ligasi dilakukan semalam pada 4%. Transformasi El coli dengan DNA hasil ligasi Sebelum dilakukan transformasi E. coli terlebih dahulu disiapkan menjadi sel kompeten. Koloni tunggal E. coli DHSa ditanam pada medium LB cair sebanyak 5 ml selama 24 jam, kemudian diambi12.5 ml biakan dan dimasukan
ke 100 ml LB cair dan di shaker 200 rpm pada suhu 37 OC sampai mencapai OD59o 0,375. Kultur bakteri sebanyak 100 ml disentrifus dengan menggunakan tabung sentrifus 250 ml dan disimpan di es selama 10 menit. Setelah disentrifus pada kecepatan 1,600 x g (3000 rpm) selama 7 menit pada 4 OC, supernatan dibuang dan ditambahkan 20 ml CaCl2 solution (60 m M CaC12, 15% gliserol dan 10 mM PIPES pH.7). Sentrifus kembali selama 5 menit pada 1100 g (2500 rpm) 4 OC, kemudian supernatan dibuang dan pelet ditambahkan
20 ml CaC12
solution. Setelah itu disimpan di es selama 30 menit. Lalu sentrifus kembali selama 5 menit pada 1100 g (2500 rpm) 4 OC. Pelet diambil dan ditamb-
4 ml
CaC12 solution. Sel kompeten disimpan dalam tube 1,5 ml sebanyak 200 pl simpan di -70. DNA vektor rekombinan diiitroduksikan ke dalam sel E.coli kompeten dengan
teknik heat shock. Sebanyak 20 p1 DNA vektor hasil ligasi dicampur
dengan I00 p1 E. coli kompeten dan disimpan di es selama 15 menit. Kemudian campuran diperlakukan dengan heat shock di dalam water bath pada suhu 42OC selama 2 menit, lalu diinkubasi di es selama 10 menit. Selanjutnya 1 ml media
LB ditambahkan ke dalam campuran sel E. coli. Suspensi E. coli kemudian dicampur sampai homogen, kemudian diinkubasi pada suhu 37OC selama 1 jam sambil digoyang pada 250 rpm. Hasil transformasi kemudian disebar pada LB padat yang mengandung kanamisin 50 mgA untuk p2TDNA dan kloramfenikol20 mgA untuk pC12SA, selain itu media seleksijuga mengandung 50 mgA X-gal dan 0,lM IPTG untuk seleksi bii putih. Verifikasi DNA rekombinan Koloni putih diisolasi dan dikulturkan, DNA plasmid dari koloni putih diisolasi dengan prosedur seperti sebelumnya Selanjutnya DNA plasmid yang diperoleh dipotong dengan enzim restriksi yang sama seperti saat pemotongan DNA vektor dan sisipan. KO-kultivasi dan Kultur Tanaman. Steriliiasi Benih Benih padi yang telah dikupas disterilisasi dengan alkohol 70% selama 1 menit (menggunakan tube disposible 100 ml sehingga dapat dikocok), lalu dibilas
1 x dengan aquades steril, setelah itu di rendam dalam larutan 2% Chlorox selama 30 menit. Kemudian dibilas sebanyak 6x masing-masing 15 menit. Benih hasil sterilisasi tersebut dituang ke petri steril dan ditanam pada media IK3. Isolasi Embrio Setelah benih padi tumbuh pada media IK3 yang mengandung 2.5 mgll 2.4-D selama 7 hari, lalu diisolasi skutelumnya dan ditanam pada media IK3 selama 14 hari. Setelah itu diisolasi kalus embriogenik dan ditanam pada media IK3 selama 4 hari untuk digunakan pada transformasi. Transformasi kalus embriogenik menggunakan A. tumfaciens Bakteri A. tumefacien yang telah ditanam pada media AB padat selarna 3 hari dipanen dengan menggunakan spatula steril sebanyak 2-3 petri (bakteri ditanam merata pada permukaan petri dengan menggunakan pengaduk kaca segitiga), kemudian dimasukan ke 100 ml media AAM yang mengandung 100 pM acetosyringone pada erlenmeyer 250 ml steril (biarkan selama 15 menit) kemudian digoyang perlahan agar homogen, ODnya diukur sampai mencapai ODaw: I (satu). Seratus kalus embriogenik
yang telah disiapkan direndam dengan
suspensi bakteri selama 15 menit, setelah itu kalus hasil infeksi ditiriskan pada kertas saring steril (ukuran 20x15 cm) dengan dirolling dari ujung ke ujung agar kering dan diganti sampai 2-3 kali. Kemudian bagian atas ditutup juga dengan kertas saring steril(2 lembar) dan ditekan sambil digoyang perlahan. Setelah kalus kering ditanam pada media ko-kultivasi (IK3
+ 100
asetosiringon) selama 3
hari dengan ditutup dengan plastik hitam. Seleksi dan Regenerasi Kalus dari hasil ko-kultivasi di tanam pada media seleksi I selama 14 hari
kemudian kalus yang resisten di subkultur ke media Seleksi I1 selama 14 hari. Kalus yang resisten ditanam pada media regenerasi (R3B: media IK3 + 0,5 mgll
IAA & 0,3 mgll BAP) dan setiap 2 minggu sekali di subkultur dengan menggunakan media yang s a m a Setelah tumbuh planlet, planlet dipindah ke media MS sampai perakarannya cukup kuat untuk dipindah ke media aklimatisasi
Analisis Tanaman Transgenik Isolasi DNA tanaman Isolasi DNA dilakukan dengan metode CTAB yang telah dimodifikasi : Daun muda bemkuran sekitar 2 cm atau kalus dimasukkan ke dalam efendorf 1,5 ml dan dibekukan dengan nitrogen a i r . Daun digerus sampai halus, kemudian ditambah dengan 750 jd buffer isolasi yang mengandung buffer lisis (0.2 M trisHCL pH 7.5, 0.05 M EDTA, 2 M NaCI, 2% (bhr)) CTAB (Hexadecyltrimethyl ammonium bromide)], buffer ekstraksi [0.35 M sorbitol, 0.1 M tris HCL pH 7.5, 5
mM EDTA], dan 5% @/v) sarkosil dengan perbandingan 2,5 :2,5 : 1. Selanjutnya campuran diinkubasi 1 jam pada suhu 65 OC sambil dibolak-balik perlahan. Dan diitambahkan 750 pl klorofonn:isoamil alkohol (241). Kemudian sampel disentrifus (12.000 rpm, selama 5 menit pada suhu mang). Lapisan atas diambil dan dipindah ke tabung 1,5 ml baru dan ditambah 400 pi isopropanol lalu dibolakbalk hingga gumpalan DNA terlihat. Selanjutnya cairan disentrifus (12.000 rpm, selama 6 menit pada suhu mang) dan cairan dibuang, endapan dicuci dengan 500 p1 70 % etanol dan disentrifus lagi (12.000 rpm selama 3 menit). Cairan dibuang
dan endapan diiering anginkan. DNA dilarutkan dalam 50 jd TE (IOmM his HCL pH 8.0, dan 1 mM EDTA) . Sampel DNA disimpan di 20°C. Analisis PCR Analisis PCR digunakan untuk mendeteksi integrasi gen cryIAb, pmsB
dan hpt. Komposisi bahan yang digunakan dalam i x reaksi PCR di dalam volume akhir 15 pl adalah : I x buffer PCR yang mengandung M ~ * , 0.05 mM dNTP, 0.05 u/ pl Taq polymerase, 2.5 ngl p.l primer forward, 2.5 ng/ pl primer reverse 1 pI DNA hasil isolasi dan ditambahkan dHzO hingga volume mencapai 15 p1. Primer-primer yang digunakan dalam penelitian ini merupakan bagian dari gen cryIAb, pmsB dan hpr. Kondisi PCR adalah pra PCR pada suhu 95 O C 5 menit, denatumi pada 95 OC 1 menit, annealing pada 55°C 1 menit, sintesis DNA pada 72'C 1 menit dan pasca PCR pada 72'C selama 10 menit dengan 40 siklus. Besar
fragmen gen cry Mb yang diharapkan adalah 1012 bp, gen pmB 337 bp dan gen hpr 492 bp.
DNA hasil a m p l i f h i dengan PCR, dianalisis melalui elektroforesis pada gel agarosa 0.8 %. Elektroforesis dilakukan selama 1 jam, 100 volt dalam buffer
0 . 5 Tris ~ Boric Acid EDTA (TBE) (dari stok 5xTBE dengan susunan bahan : 54 g Tris base, 27.5 g Boric acid dan 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 untuk setiap satu liter). Hasil elektroforesis diamati dan difoto menggunakan Bio Rad Gel Doc W
1000.
HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi Plasmid Doubk T-DNA Konstruksi plasmid p2TDNA dengan menyisipkan adaptor yang bempa oligonukleotida yang mengandung right border dan left border pada pC1300 hpt intron
(p2TDNA) telah berhasil dilakukan. Plasmid ini telah berhasil
diintroduksikan ke dalam E. coli walaupun efisiensinya lebih rendah daripada pGem4cryIAb (Tabel I). pGem4cryIAb digunakan sebagai kontrol karena sebagai asal dari gen cryIAb. Tabel 1 Jumlah koloni E. coli hasil transformasi No.
Perlakuan
Jumlah koloni
1
E. coli
(kontrol -)
-
2 3
pGem4 cryIAB p2TDNA
(kontrol +)
TBUD 60
Keterangan : TBUD : terlalu banyak unluk dihitung
Gambar 7 Hasil uji elektroforesis p2TDNA yang dipotong dengan Ncol dan BglII (lajur 1) clan utuh (lajur 2) ;M = Marker h l H i d I I Seleksi E coli yang mengandung p2TDNA didasarkan pada seleksi resistensi terhadap antibiotik kanamisin (50 mgil) yang terdapat dalam media Koloni yang tumbuh selanjutnya diperbanyak untuk isolasi plasmid. Dari 8 koloni yang diisolasi, satu koloni menunjukan adanya penyisipan oligonukleotida yang mengandung right border dan left border. Keberadaan double TDNA diverifikasi dengan menggunakan enzim restriksi Ncol dan BglII sehingga didapat 2 fragmen DNA yang masing-masing berukuran sekitar 8 kb dan 1 kb yang berbeda dengan pola pemotongan DNA pC1300 hpr intron linier (Gambar 7)
Setelah verifikasi terhadap double TDNA, gen cryIAb disisipkan ke dalam vektor tersebut pada situs HindII. Gen cryIAb diisolasi dari pGem4-cryIAb dengan pemotongan menggunakan H i d I I . Pemotongan ini menghasilkan 2 pita masing-masing 2.871 bp yang merupakan pGem4 dan 4.165 bp yang merupakan kaset ctyIAb. Pernumian kaset cryIAb dari gel agarose dilakukan berdasarkan metode sephaglass brand prep dari pharmacia. Keberhasilan pemurnian kaset cryIAb diamati melalui elektroforesis gel agarose dengan ditunjukan adanya pita DNA berukuran 4.165 yang terdiri dari promoter ubuquitin 2.020 bp, gen cryIAb 1.845 bp clan terminator nos 300 bp (Gambar 8). M
1
2
3
4
5
6
Gambar 8. Hasil uji elektroforesis pemotongan pGEM4-cryIAb dengan enzim restriksi Hindm (lajur 1-5) h g m e n kaset cryIAb (lajur 6); M = Marker Hinmll Kaset cryIAb telah disisipkan
ke dalam plasmid p2TDNA pada situs
HindLII didalam T-DNA diantara LB dan RB. Plasmid rekombman ini disebut p2TDNAcryIAb. Penyisipan gen cryIAb
ke dalam p2TDNA dapat terjadi
karena keduanya memiliki situs pemotongan yang sesuai. Koloni yang mampu
tumbuh pada medium LB yang mengandung kanamisin 50 mgA diduga merupakan koloni transforman yang membawa plasmid rekombinan hasil ligasi. Dari koloni ini telah berhasil diisolasi plasmidnya dengan isolasi plasmid skala kecil mengikuti Sambmk et al. (1989). M
1
2
3
4
Gambar 9 Hasil elektroforesis fragmen cryIAb (lajur 1) p2TDNAIHindIl (lajur 2). p2TDNAcrvIAblHindII (laiur 3-4); M = Marker WHindIII
Dari proses transformasi E. Coli dengan menggunakan hasil ligasi antara DNA vektor p2TDNA dengan fragmen cryIAb diperoleh 30 koloni-yang turnbuh pada media yang mengandung kanamisin 50 mfl. Selanjutnya, sebelas plasmid rekombinan yang diisolasi dari
11 koloni tersebut dianalisis dengan
menggunakan enzim restriksi H i d 1 1 untuk menentukan plasmid rekombinan yang benar-benar membawa sisipan ctyIAb (p2TDNAcryIAb). Dari 11 koloni terdapat 2 koloni mengandung 2 h g m e n masing-masing berukuran sekitar 9 kb yang merupakan ukuran dari vektor p2TDNA dan cryIAb yang metupakan kaset sekitar 4.165 kb (Gambar 9).
Konstruksi Plasmid Dua T-DNA Berbeda Inang KO-transformasi
menggunakan
dua
T-DNA
dilakukm
dengan
memisahkan gen sasaran dan gen penyeleksi pada T-DNA yang berbeda dalam dua plasmid. Dalam metode ini digunakan dua plasmid yaitu pC1300 hpt intron untuk membawa gen hpt dan $1200 digunakan untuk membawa gen penyandi biosintesis asam salisilat pada masing-masing Agrobacterium. KO-transformasi ini dapat diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik. Penyisipan gen penyandi asam salisilat (kaset pmsB dan kaset enK) ke dalam vektor
pC1200 yang dibuang gen hpt nya telah berhasil dilalcukan
yang selanjutnya disebut pl2SA.
Penyisipan gen
penyandi asarn salisilat
dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertarna adalah isolasi kaset pmsB dan kaset entC melalui pemotongan plasmid pSA dengan enzim restriksi XbaI dan kombinasi XbaI dan EcoRI. Pemotongan pSA dengan XbaI menghasilkan h g m e n DNA berukuran 91 10 bp yang merupakan plasmid pC1200 dan fragmen 2470 bp yang merupakan kaset enK. Pemotongan pSA dengan XbaI dan EcoRI menghasilkan 4 pita masing-masing 9110 bp (pC1200) dan gen penyandi asam salisilat masing-masing 1890 bp, 1670 bp dan 580 bp (Gambar 10). Fragmen yang berukuran 2.470 bp (kaset entC) dan 1670 bp (kasetpmsB) yang merupakan gen penyandi asam salisilat telah berhasil diisolasi dari gel.
Gambar 10 Hasil elektroforesis pSA yang dipotong dengan enzim restriksi XbaI (lajur 1-3) dan XbaI & EcoRI (lajur 4-6); M = Marker WHindII Fragmen geen pmsB yang berukuran 1670 bp kemudian disisipkan ke dalam plasmid pC12 hpr (plasmid pC1200 yang sudah didibuang gen hpr nya). Hasil ligasi ini telah diintroduksikan ke dalam E. coli dan menghasikan 18 koloni di dalam media yang mengandung 20 mgfl kloramfenikol. Hasil verifikasi dengan enzim Xbal dan EcoRl menunjukkan adanya flagmen yang berukuran 8016 bp $(12
hpt) dan hgrnen yang berukuran 1670 bp yang merupakan
sisipan kaset pmsB (Gambar 11). M
I
2
3
4
5
6
7
Gambar 11 Hasil elektroforesis pC 12hpt yang mengandung gen pmsB yang dipotong dengan enzim restriksi XbaI & EcoRI, M = Marker WHindIII Setelah kaset pmsB
berhasil disisipkan
ke dalam pC12hpt. yang
selanjutnya disebut pCl2hptXE, kemudian kaset enK disisipkan pada situs XbaI
dan diintroduksikan ke dalam E. coli. Transformasi ini menghasilkan 7 koloni. Dari 7 koloni hanya satu koloni yang mengandung kaset pmsB dan kaset enrC.
Plasmid pC12 hpt yang mengandung kasetpmsB dan kaset enK disebut pC12SA (Gambar 12).
Gambar 12 Hasil elektroforesis DNA pCl2hptSA yang dipotong dengan enzim &I dan EcoRI Hasil verifikasi terhadap plasmid yang terdapat di koloni tersebut melalui pemotongan dengan XbaI clan EcoRI menunjukkan adanya fragmen berukuran 8016 bp (pC12hpt) dan gen SA yang masing-masing berukuran 1890 bp, 1670 bp dan 580 bp (Gambar 12). Dalam ha1 ini a& dua kemungkinan orientasi kaset entC di dalam vektor pC12hptXE, yang disebabkan karena kedua ujung DNA
baik pC12hpKE maupun kaset eniC adalah sama yaituXbaI. Perbedaan orientasi
ini didasarkan oleh arah kaset pmsB terhadap kaset enC. Kemungkinan pertama adalah kaset enC mempunyai orientasi berlawanan dengan kaset pmsB dan kemungkinan kedua adalah kedua kaset mempunyai arah yang sarna. Dari hasil verifikasi dengan menggunakan enzim EcoRI didapat pita yang berukuran 8016 bp yang mempakan vektor pC12hpt serta pita yang berukuran 1670 bp dan 580 bp. Hal ini menunjukan bahwa fragmen gen entC menempel pada pC12hpt sesuai dengan versi kedua (Gambar 13). M
1
2
3
4
Gambar 13 Hasil elektroforesis hgmen gen entC (lajur 1); fragmen gen pmsB (lajur 2); DNA pC12hpt dipotong dengan enzim EcoRI (lajur 3) dan pC12 SA dipotong dengan enzim EcoRI.
Transfer vektor rekombinan dari E. coli ke A. tumefaciem strain
Agl-I yang mengandung plasmid pembawa gen-gen vir dan mempunyai ketahanan terhadap karbenisilin 100 mg/l dilakukan dengan teknik tnpurental mating dengan bantuan plasmid helper pRK2013 yang terdapat dalam E. coli. Transformasi dan Regenerasi Tanaman Transformasi kalus dilakukan melalui ko-kultivasi kalus dengan dua Agrobacterium yang masing-masing mengandung plasmid pCambia 1300 membawa kaset hpt dm pCl2SA yang membawa gen penyandi biosintesis asam salisilat. Selain itu, transformasi kalus dilakukan dengan ko-kultivasi kalus dengan A. tumefociens
yang mengandung
p2TDNAcryIAb. Plasmid
p2TDNAcryIAb mengandung 2 TDNA, kaset cryIAb dan kaset hpt. Plasmid double T-DNA masing-masing mengandung gen sasaran dan gen penyeleksi antibiotik. Tanaman hasil transformasi
diseleksi dengan menggunakan
higromisin sebagai media seleksi. Tanaman transgenik yang tidak mengandung antibiotik diharapkan diperoleh dari hasil segregasi pada tanaman generasi berikutnya setelah penyerbukan sendiri. Dari hail transformasi diperoleh sejumlah kalus yang membawa gen penyeleksi hpt sehingga bisa hidup dalam media yang mengandung antibiotik higromisin. Presentasi kalus yang tahan terhadap higromisin pada media seleksi kedua adalah berkisar 35-80%. Kalus tersebut ditumbuhkan dan menjadi tanaman hansgenik generasi I (TO). Pada seleksi tahap kedua masih terdapat banyak kalus resisten, tapi ternyata tidak semua kalus memilki kemampuan beregenerasi. Kemampuan regenerasi kalus setelah proses transformasi
akan sangat menentukau jumlah
planlet yang dihasilkan. Hal ini terkait dengan kombinasi dan konsenbasi h m o n yang digunakan. Menurut Slamet-Loedin et a1 (1997) persentase kalus yang beregenerasi dari tanaman padi javanika dan indica pada media regenerasi (Linsmaer & Skoog 1%5) dengan tambahan 0,3 mg/L BAP dan 0.5 mg/L IAA dengan bahan pemadat 0,2 % phytagel, lebih tinggi daripada agarose. Pada tanaman padi japomka, media regenerasi yang mengandung LS dengan 0,5 mgiL
IAA, 0,3mgR. BAP, 4 % (wlv) sukrosa dan agarosa 1 % (wlv) menghasilkan rata-
rata 6 planlet per kalus (Rueb el al., 1994). Pada minggu ke 2-3 pada media regenerasi, kalus mulai menunjukkan adanya titik hijau sebagai awal pertumbuhan tunas. Efisiensi regenerasi yang diperoleh berkisar 1-10%. Planlet yang diperoleh selanjumya ditanam pada media MS tanpa hormon (Gambar 14).
Gambar 14 Planlet yang ditanam pada media MS yang mengandung 50 mgfl bigromisin Beberapa W o r penting yang menentukan keberhasilan transformasi melalui Agrobacten'um pada tanaman padi antara lain tipe dan umur jaringan yang diinokulasi, vektor yang dipergunakan, genotipe padi, berbagai kondisi
kultur jaringan serta kondisi saat infeksi. Kalus embriogenik merupakan slab satu faldor penting yang menentukan efisiensi transformasi (Hiei et a/. 1997). Secara morfologi, kalus embriogeruk mempunyai bentuk yang teratur, compact (tersusun rapat dan padat), kering dan berwarna putih atau kuning muda, sedangkan kalus non-embriogenik yaitu kalus yang bersifat lembek, kalus tidak membentuk embrio, dan pertumbuhan Musnya lambat, tetapi dapat tumbuh besar
dalam waktu yang lama (Rueb et al, 1994). Setelah ko-integrasi pada genom tanaman gen penyeleksi dan gen sasaran
akan segregasi pada saat pembentukan sel garnet sehingga pada tunman berikumya kedua gen tersebut dapat berpisah. Terintegrasinya T-DNA kedalam lokus yang berbeda
sangat dibutuhkan untuk mendapatkan tanaman yang
mengandung gen sasaran tetapi tidak mengandung gen penyeleksi pada Nrunan berikumya. Secara prinsip ko-integrasi dapat dilakukan dengan menggunakan dua
T-DNA dalam vektor biner yang sama (Depicker et ~1.1985;Komari et al. 1996; Lu et al. 2001) atau dua vektor biner dalam satu Agrobacterium (Daley et a/. 1998) atau dengan dua Agrobacterium yang berbeda (Depicker et ~1.1985; McKnight et al. 1987; Komari et al. 1996). Analisis PCR Tanaman Transgenik. Dari hasil transformasi menghasilkan 16 tanaman transgenik yang terdiri
dari 1 tanaman transgenik yang ditransformasi dengan p2TDNAcryIAb, 10 tanaman transgenik hasil ko-transformasi dengan pC1300 hpt intron dan pC12SA, 5 tanaman transgenik yang ditransformasi dengan
pC1300 hpt intron sebagai
kontrol (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan double T-DNA dalam satu vektor biner clan ko-transformasi dengan dua hang yang membawa gen
sasaran dan gen penanda seleksi secara terpisah dapat digunakan untuk mengintroduksikan dua gen yang berbeda. Tabel 2 Hasil transformasi tanaman Plasmid p2TDNAcryIAb pC12SA pC1300 hpt intron
Jumlah kalus Jumlah tanaman yang diinfeksi independent 100 1 100 10 100 5
Efisiensi transformasi 1% 10 % 5%
1-2 Gambar 15 Hasil analisis PCR gen hpt M=marker Hi&, tanaman yang mengandung hpt, 4-18 = sampel tanaman
=
kontrol
Analisis integrasi transgen di dalam genom tanaman padi dilakukan dengan menggunakan teknik PCR (Polimerase Chain Reaction). Analisis PCR menunjukkan bahwa semua tanaman transgenik mengandung gen hpt (Gambar 15). Analisis integrasi cryIAb menunjukan bahwa kalus dan tanaman yang resisten terhadap higromisin juga mengandung gen cryIAb (Gambar 16).
Teknik PCR mempunyai kelebihan diantaranya sangat praktis tetapi akan menghasilkan positif semu apabila reaksi mengandung kontaminan. Untuk itu analisis integrasi gen dengan teknii PCR perlu menggunakan beberapa kontrol seperti kontxol positif yang mengandung DNA sasaran, kontrol positif yang mengandung DNA tanaman yang telah diidentifikasi mengandung DNA sasaran, kontrol negatif dari tanaman dan kontrol negatif dari media reaksi PCR tanpa
DNA. Dari hasil PCR terhadap gen cryIAb baik DNA yang diisolasi dari kalus maupun tanaman semuanya menunjukan adanya gen cryIAb yang merupakan gen penyandi untuk ketahanan terhadap penggerek batang kuniig (Gambar 16).
Gambar 16 Hasil analisis PCR terhadap gen cry IAb M= marker UHindIII, l= plasmid 2= kontrol tanaman positif crylAb, 3= kontrol tanaman non transgenik 4= kontrol air 5= Tanaman transgenik yang mengandung cryIAb 6-1 I= sampel kalus tanaman Rendahnya regenerasi
kalus menjadi tanaman mungkin dikarenakan
digmakamya media seleksi yang mengandung higromisin pada media regenerasi, sehingga proses diferensiasi sel kalus menjadi tanaman terhambat. tanaman non
transgenik yang mati
menghambat
suplai nutrisi
Sel-sel atau
mengekresikan senyawa toksik. Efek negatif ini mengurangai kemampuan sel transgenik untuk proliferasi
dan diferensiasi menjadi tanaman transgenik.
(Ebinuma et 01.2001). Analisis PCR terlladap 10 tanaman
transgenik
yang ditransformasi
dengan dua plasmid, yang masing-masing membawa gen penyeleksi antibiotik dan gen penyandi biosintesis asam salisilat menunjukan bahwa semua tanaman mengandung gen p m d yang merupakan bagian dari gen penyandi biosintesis asam salisilat. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita yang berukuran 337 bp yang merupakan ukuran dari gen tersebut (Gambar 17).
Gambar 17 Hasil analisis PCR terhadap gen p m B M=marker hlHindIU, I= Kontrol tanaman positif 2= kontrol air 3= kontrol tanaman non transgenik 4-13= sampel tanaman
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Plasmid rekombinan yang mengandung double T-DNA (p2TDNA) yang dapat digunakan untuk eliminasi pen penyeleksi dari tanaman transgenik telah dikonstruksi, gen cryIAb telah berhasil disisipkan ke plasmid p2TDNA. Introduksi plasmid dengan double T-DNA ini telah menghasilkan tanaman transgenik yang mengandung dua gen yang tersisip pada kedua T-DNAnya. Gen pmsB dan entC yang menyandikan biosintesis asarn salisilat telah berhasil disisipkan ke dalam pC12hpt. KO-transformasi katus dengan pC1300 hpt inhon dan pC12SA menghasilkan tanaman transgenik yang mengandung gen penyandi biosintesis asam salisilat dan gen hpt. Analisis PCR menunjukan bahwa tanaman yang diperoleh semuanya mengandung gen yang diintroduksikan baik gen crylAb, hpt dan pmsB yang merupakan bagian dari gen penyandi biosintesis asam salisilat . Saran Hasil tanaman transgenik yang dihasilkan perlu dianalisis lebih lanjut dengan Southern Blot untuk mengetahui jumlah kopi dan Western Blot untuk mengetahui ekspresi gen yang diintroduksi serta dilakukan uji segregasi pada keturunan berikutnya untuk mendapatkan tanaman transgenik yang mengandung gen sasaran tetapi tidak mengandung gen penyeleksi antibiotik.
DAFTAR PUSTAKA Amir M, Karden M. 1991. Pengendaian Penyakit Jamur. Bogor. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. [Anonim] 2000. Bacillus Thuringiensis. Information From The University of Edinburg-The Microbial World. http//helios.bto.ed.ac.uk~bto/mi~robes/ bt/htm 22 juli 2005 Amheim N, Erlich H. 1992. Polymerase chain reaction strategy. Annu. Rev Biochem 61:131-156 Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, Riazuddin S. 2004. Hygromycin based selection of transformants in a local inbred line of Zea mays Q. Pakistan Biol. Sci. 7(3):3 18-323 Biro Pusat Statistik. 2002. Luas dan Intensitas Serangan Organisme Pengganggu Tanaman dan Bencana Alam Padi, Palawija, dan Sayuran di Jawa. Biro Pusat Statistik, Jakarta. Brasileiro ACM, Aragao FJL. 2001. Marker genes for in viho selection of transgenic plants. J. Plant Biotechnol. 3(3) : 113-121 Brown TA, 1991. Pengantar Kloning Gena. Muhammad SA, Praseno, editor. Yogyakarta. Yayasan Essentia Medica. Terjemahan dari: Gene Cloning an ~nhoduction. Brown TA. 1996. Genetics a Molecular Approch. India. Chapman & Hall. Casas AM et al. 1995.
Transgenic sorghum plant via microprojectile bombardment. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 90:11212-11216.
Chee PP, Fober KA, Slightom A, 1989. Transformation of soybean (Glycine mar) by infecting germinating seeds with Agrobacterium twnefaciens. Plant Physiol. 91: 1212-1218. Chee PP. 1991. Using polymerase chain reaction to identify transgenic plant. Di dalam Gelvin SB, Schilpemort. Plant Molecular Biology Manual. Boston. Kluwer academic Publisher. Chauhan RS, Singh BM. 1995. High frequency callusing and plant regeneration from coleoptile tissue of indica rice. Rice Biotech. 23:lO-18 Chauhan RS, Thilly WG. 1993. Specificity, efficiency and fidelity of PCR. PCR method and applications. Rice Biotech. 3:s 18-529.
Christou P, Ford TL, K o h n M. 1991. Production of transgenic rice ( O v a sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Biotechnology 9:957-966. Crickmore et a/. 1998. Revision of the nomenclatur for Bacillus thuringiemis pesticidal crystal proteins. Microbial. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813. Daley M, Knauf VC, Summerfelt KR, Turner Jc. 1998. Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-he transgenic plant. Plant Cell Rep. 17: 489-496. Datta et al. 2001. Enhanced resistance to sheath blight by constitutive exspression of infection related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars. Plant Science 160: 405-414. Davis L, M. Kuehl, Battey J. 1995. Basic Method in Molecular Biology. Appleton & Lange. Norwalk, Connecticut. Deficker A, Hennan L,Jacobs A, Schell J, Van Montagu M. 1985. Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the Agrobacterium /plant cell interaction. Mol Gen Genet 201:477-484. Dekeyser, Inze RP, Van Montagu M. 1990. Transgenic Plants. New York. Plenum Press. Dixon AR. 1985. Plant Cell Culrure: a practical approach. Oxford. IRL press. Dong J, Weimin T, Bucholz WG, Hall TC. 1996. Agrobacferium mediated transformation of Javanica rice. Molecular breeding 2:267-276 Ebinuma H, Sugita K, Matsunaga E, Yamakado M. 1997. Selection of marker& transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. App. Biol. Sciences 94:2117-2121 Ebinuma H, Sugita K, Matsunaga E, Endo S, Yamada K, Komamine. 2001. Systems for the removal of a selection marker and their combination with positive marker. Plant Cell Rep. 20:383-392. Freiffelder D.1987. Molecular Biology. Boston. Jones and Bartlett Publisher, Inc. Ghareyazie B. et al. 1997. Enhanced resistance to two stem borers in an aromatic rice containing a synthetic cryIAb gene. Molecular Breeding 3: 401-414 Gelvin SB. 1998. The introduction gene and expression of transgens in plants. Curr Opin Biotechnol9:227-232).
Granger C. 2002. Pruning back transgenes. ISB News Report. (Mei): 1-6. Gunawan LW. 1992. Penelitian regenerasi in vitro dan kesulitan pengambilan Iceputusan di dalam: Watimena et al. Bioteknologi Tanaman Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman. Dijen Dikti PAU-IPB: 250-255.
Hare PD, Chua N.M. 2002. Excision of selectable marker genes from transgenic plant. Nature Biotechnology. 20575-580 Herman M. 1999. Tanaman hasil rekayasa genetik dan pengaturan keamanannya di Indonesia. Buletin AgroBio 3(1):8-26. Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice ( h a sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6: 271-282. Hooykaas PJ, Schilperoort RA. 1992. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol Biol. (20): 175. Kilin D, Laba IW, Panudju P. 1995. Dampak penggunaan insektisida dalam pengendalian hama wereng coklat dan penggerek batang padi. Prosiding Simposium Penelitian Tanaman Pangan 111. JJakarta, hlm 562-575. Kleinsmith LI, Kish VM. 1995. Principles of Cell and Molecular Biology. New York. Harper Collins College Publisher. Komari T, Hiei Y, Saito Y, Murai N, Kumashiro T. 1996. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants h e fiom selection markers. Plant J. (10): 165-174. Krawetz, 1989. The polymerase chain reaction: opportunities for agriculture. Biotech news an information 1 (6) :897-902 Lehnimger AL. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta. Edangga. Terjemahan dari :Fundamental of Biochemishy. Linsmaier FM, F. Skoog. 1965. Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture. Plantplrysiol. 18:100-127 Lucca P, Ye X, Potrikus I. 2001. Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent. Molecular Breeding (7): 43-49. Maqbool SB, Husnain T, Riazuddin S, Masson L, Christou P. 1998. Effective control of yellow stem borer and rice leaf folder in transgenic rice indica varieties Basmati 370 and M7 using novel Gendotoxin cry2A Bacillus thuringiensis gene. Molec. Breeding 4 : 501-507.
Matthews PR, et al. 2001. Marker gene elimination from barley, using cotransformation with adjacent "twin T-DNAs9'on a standard Agrobucterium transformation vector. Molenr. Breeding (7): 195-202. McKnight TD, Lillis MT, Simpson RB. 1987. Segregation of gene transferredto one plant cell from two separate Agrobacterium strain. Plant Mol. Biol 8:439-445. Mercado B J, Van der Drift KM,Thomas PE, van loon LC, Bakker PA. 1989. Analysis of the pmsCEAB gene cluster involved in biosynthesis of salicylic acid and the siderophore pseudomonine in the biocontrol strain pseudomonas fluorescens WCS 374. Bacterial J. 17l(2) : 1-9. Mozo T, Hooykaas PJ. 1992. Design for novel system for the construction of vectors for Agrobucterium-mediated plant transformation. Mol. Gen. (236): 1-7. Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka. Wirausaha Muda. Nayak P, Basu D, Das S, Basu A, Ghosh D, Ramalaisnan NA, Ghosh M, Sen SK. 1997. Transgenic elite indica rice plants expressing crylAc 6endotoxin of Bacillus thuringiensis are resistant against yellow sternborer (Scirpophaga inceriulas). Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 94:2111-2116. Nester EW, Gordon MP, Amasino RM, Yanofsky MF. 1984. Crown gall: a molecular an physiological analysis. Plant Phyiol35: 387-413.
Ou SH. 1972. Rice Disease. Commonwealth Mycological Institute. England: Kew Surrey. Pathak h 0 , Khan ZR. 1994. Stem Borers. In :Insect Pest of Rice. Los Baros Philippines: ICIPE-IRRI. hlm 65-70. Promega. 1996. Protocol andApplication Guide. USA: Edisi ke 3. Promega. Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, Hinata K. 1996. Transgenic plant production mediated by Agrobacteriurn in indica rice. Plant Cell Rep. 15: 727-730. Rao PSP, Padhi G. 1988. Improved sources of plant resistance to yellow stem borer (YSB) Scirpophaga incertulas Walker in rice. htl. Rice Res. 13:5 Rodriguez RC, Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in genetic transformation especially in plants. CAMBIA. Available at http:www.cambiaip.org/whitepapers/TransgenidAb-~sistanc~W whole.pdf [I8 Agustus 20041
Rueb S. Leneman M. Schilpemort RA, Hensgen LAM. 1994. Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from callus induced on mature rice embryos (Oriza sativa L.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36 :259-264. Slamet-Loedin M. 1994. Transformasi genetik beberapa tanaman: beberapa aspek penting. Hayati 1(2):66-67 Slamet-Loedin M,.Wibowo JL, Hutajulu S, Rahayu W. 1997. Penggunaan dua strain Agrobacterium tumefaciens super virule untuk kokultivasi tanaman padi pada kultivar Cisadane dan Rajalele. Prosiding Kongres I dan Seminar Zlmiah PBPI. Surabaya, 12-14 Maret. Slamet-Loedin JH, Rahayu AS, Deswina P, Punvantorno S, Mulyaningsih ES, Sudhakar D, Gatehouse JA, Altosaar I, Christou PC. 1998. Production of fertile transgenic aromatic Indonesian Javanica rice co-expressing the snowdrop lectin and cry IAb anti-insect proteins. Proceeding of the 4th Asia-Pacific Conference on Agricultural Biotechnology. Soewito T, Harahap Z, Suwamo. 1995. Peningkatan Keragaman Genetik ketahanan varietas padi sawah terhadap wereng coklat. In Syam M, Hermanto, Musaddad a, sunihardi. (ed) Prosiding Simposium Penelitian Tanaman Pangan ZII. Jakarta, 23-25 Agustus 1993.387-397. Sheng J, Citovsky V. 1996. Agrobacterium-plant cell DNA transport: Have virulence proteins, will travel. Plant Cell. 8:1699-1710 Smith
RH, Hood EE. 1995. Agrobacterim tumefaciens transformation of monocotyledon s. Transgenic Res. 2:301-309.
Silverman P, 1995. Salicylic acid in Rice: Biosynthesis, conjugation and possible role. Plantphysiol. 108:633-634. Sambrook J, Fritsch EK, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Terada R, Shimatnoto K. 1993. Rice as model cereal for studies transformation in monocots. J. Plan tRes. Special issues 3:201-211.
of
Toenniessen GH. 1991. Potentially useful genes for rice genetic engineering. Rice Biotechnol. lRRI hlm 253-280. Komari T, Hiei Y, Saito Y, Murai N, Kumashiro T. 1996. Vector carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacteriwn tumefaciens and segregation of transformans h e &om selection marker. Plant J. 10(1), 165-174.
Tu J et al. 2000. Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiemis &endotoxin. Nature Biotechol. 18:1101 1104.
-
Uchimiya H, Handa T, Brar DS. 1989. Transgenic plant. JBiotech. 12:l-20 Verbeme MC, Verpoote R, Bol JF, Mercado-Blanco J, Linthors HJM. 2000. Overproduction of salicylic acid in plants by bacterial transgenes enhances pathogen resistance. Nature Biotechnol. . 18: 779-783 Walkerpeach CR,Velten I. 1994. Agobacterium mediated gen trasfer to plant cells; cointegrate and binary vector system. Plant Molec, Biol. B11-19. Wu C et al. 1997. Transgenic fertile japonica rice plants expressing a modified cry IAb gene resistant to yellow stem borer. Plant Cell Rep. 17: 129-132
Wunn, J, Kloti A, Burkhardt PK, Biswas GCG, Launis K, Iglesias VA, Potrykus I. 1996. Transgenic indica rice breeding line I H 8 expressing a synthetic cryiA(b) gene Erom Bacillus thuringiensis provides effective insect pest control. Biotechnology 14: 171-176. Zhou HY, et al. 2003. Generating marker-free transgenic tobacco by Agrobacterium-riitdiated transformation with double T-DNA binary vector. Acta Bdt. Sin. (45): 1103-1108. Zuo JR, Niu QW, bf~ll'ktSG, Chua NH. 2001. Chemical-regulated, site-specific DNA excisibri iri transgenic plants. Nature Biokchnol. 19: 157-161.
Lampitan 1 Media untuk ko-kultivasi dan regenerasi (Linsmaier & Skoog 1965) Media induksi b l u s LS @H 5.8) Makro element Mikroelement EDTA 36.7mgil Thiamin HCI 0.5 mgfl 30 gll sukrosa 2.5 mgh 2,4-D Myoinositol0,l gfl Phytagel3.75 gll Media ko-koltivasi Media W + 100 pM acetosyringone, pH 5.2) Media seleksi I I I O ~ o H l o o T 5(Media 0 IK3, + 250 mgfl cefotaxime, 50 mg/l higromisin, 50 mgfl timeatin, O,ld, pH 5,8), Media seleksi I1 PIU-CsoH50T50(Media IK3 + 50 mgfl cefotaxime, 50 mg/l higromisin, 50 mgfl timentin, pH 5.8). Media regenetasi R3B Media W + hormon 0,s m@ IAA 0,3 mgfl BAP). Media pemelibaraas planlet MS @H 5,8) Malcro element, mkro element EDTA36.7mgA Vitamin dan AA (pyridoxine-HCt 0.5 mgfl, thiamin HCI 0.1 mgA, nicotinic acid 0.5 mgA, glycine 3 mgA) 30gAsukrosa 0.1 gh my0 inositol 3.75 g/l phytagel
Lampiran 2 Media untuk pertumbuhan bakteri Media AB K2HPo4 NaHzP04 WCI MgS04.7Hz0 KC1 CaClz FeSO4.7H20 Glukosa Agar Bacto Media LB (Luria Bertani) Bacto tripton
10 gfl
Yeast extract
5gfl
NaCl
5gfl
Bacto agar
15 g/l
Media AAM pH 5.2 Makro elemen I AA malm elemen Il AA mikmeli3nenLS EDTA36.7 n t g Asam amino ( L-glutamine 877 r n g , L-asparagine 266 mgA, 1-argiim 228 mgA, I-glycine 75 mgA) pyridoxine-HC11 mgA Thiamin HC10.5 mgfl nicotinic acid 0.5 mgA hormon 2,4-D 0.5 mg/l 30gA sukrosa 100 p M acetosyringone
Lampiran 3 Isolasi DNA dengan metode CTAB
Buffer 2X CTAB (500 ml) 200 ml5X CTAB (I0 % CTAB) 50 ml TRIS 1M pH 8 20 ml EDTA 0.5 M pH 8 140 ml NaCl5 M 5 g PVP (Mr40000) yang di gunakan Mr 25.000 Merck
2 % CTAB 100 mM TRIS pH 8 20 mM EDTA pH 8 1,4 M NaCI I %PVP
0,l X TE Buffer (250 ml)
025 ml TRIS 1 M pH 8 0,05 ml EDTA 0,5 M pH 8
1 mMTRISpH8
0,l m M EDTA pH 8
