KONSENTRASI LIPID PEROKSIDA HATI KELINCI HIPERLIPIDEMIA YANG DIBERI SENYAWA HIPOLIPIDEMIK
AULINE MULIASARI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ii
ABSTRAK AULINE MULIASARI. Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Hiperlipedimia yang Diberi Senyawa Hipolipidemik. Dibimbing oleh SULISTIYANI dan DIMAS ANDRIANTO. Penyakit degeneratif merupakan penyakit pembunuh manusia terbesar di dunia. Salah satu penyebab penyakit tersebut timbul adalah pola makan yang menyukai masakan cepat saji (fast food) dan mengkonsumsinya secara berlebihan sehingga terjadi hiperlipidemia. Hiperlipidemia dapat mengakibatkan peningkatan peroksidasi lipid yang disebabkan oleh radikal bebas di dalam tubuh, seperti organ hati. Penelitian bertujuan mengukur konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia dan menentukan pengaruh pemberian senyawa hipolipidemik terhadap lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia. Kelinci jantan galur New Zealand White sebanyak 24 ekor dibagi menjadi empat kelompok, yaitu kelompok I (normal), kelompok II (hiperlipidemia), kelompok III (ramuan daun jati belanda), dan kelompok IV (lovastatin). Pengukuran konsentrasi lipid peroksida hati kelinci menggunakan metode TBA (asam tiobarbiturat) yang mengukur malondialdehida (MDA) sebagai produk dari reaksi peroksidasi lipid dengan
menggunakan spektrofotometer pada λ = 532 nm (Yagi et al. 1994). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian pakan 0.5% kolesterol dan 5% minyak kelapa dapat menimbulkan kondisi hiperlipidemia. Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia pada kelompok II meningkat dua kali lipat dibandingkan dengan kelompok I. Kelompok III dan IV memiliki konsentrasi lipid peroksida hati yang lebih rendah dibandingkan kelompok II, yaitu sebesar 58.83% dan 49.06%. Data tersebut menunjukkan bahwa ramuan daun jati belanda dan lovastatin dapat menurunkan peroksidasi lipid.
ABSTRACT AULINE MULIASARI. Lipid Peroxide Concentration in The Liver of Hyperlipidemic Rabbits Treated by Hypolipidemic Substance. Under the direction of SULISTIYANI and DIMAS ANDRIANTO. Degenerative disease has caused the highest mortality in the world. The disease may occur due to our life style which prefer fast food than traditional one and overeating resulted in hyperlipidemic. This condition will increase lipid peroxidation caused by free radicals in the body such as in the liver. The objective of this research is to determine the influence of hypolipidemic substance on lipid peroxide in the liver of hyperlipidemic rabbits. Twenty four male New Zealand White rabbits were divided into four group: group I (normal), group II (Hyperlipidemic), group III (mixture of Jati Belanda), and group IV (lovastatin). Lipid peroxide concentration was measured by TBA (thiobarbiturit acid) assay that measure malondyaldehida (MDA) as product of lipid peroxidation using spectrophotometer at λ = 532 nm (Yagi et al 1994). The result of the research showed that feeding rabbits with chow contains 0.5% cholesterol and 5% of palm oil caused hyperlipidemic. Lipid peroxide concentration of rabbit’s liver in group II increased two times compared with group I. Group III and IV had lower lipid peroxide concentration of rabbit’s liver compared with group II which is 58.83% and 49.06%. This data showed that Jati Belanda leave mixture and lovastatin decreased lipid peroxidation in the liver.
iv
KONSENTRASI LIPID PEROKSIDA HATI KELINCI HIPERLIPIDEMIA YANG DIBERI SENYAWA HIPOLIPIDEMIK
AULINE MULIASARI
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
v
Judul Skripsi
: Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Hiperlipidemia yang Diberi Senyawa Hipolipidemik : Auline Muliasari : G44104056
Nama NIM
Disetujui Komisi Pembimbing
drh. Sulistiyani, M.Sc, Ph.D Ketua
Dimas Andrianto, M.Si Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
vi
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat, nikmat, kekuatan, dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan baik dan lancar. Tema yang dipilih dalam penelitian kali ini adalah lipid peroksida hati, dengan judul ”Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Hiperlipidemia yang Diberi Senyawa Hipolipidemik”. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus hingga Desember 2008 di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia FMIPA, IPB, Bogor. Penulis mengucapkan terimakasih kepada drh. Sulistiyani, M.Sc, Ph.D dan Dimas Andrianto, M.Si selaku pembimbing atas segala ilmu yang diberikan serta kesabaran dalam membimbing penulis. Pada kesempatan kali ini penulis juga mengucapkan terimakasih kepada seluruh staf Laboratorium Biokimia dan pusat studi Biofarmaka atas bantuan serta kemudahan dalam menjalankan penelitian ini. Selain itu penulis mengucapkan terimakasih kepada Ibunda, Uda Uki, Ade Astri, Om Woto, Tante Saf, Om Yan, dan Tante Rina atas dukungan moril dan materil untuk penelitian ini. Serta ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Aswan, Iqbal, Udin, Rangga, Falakh, Tyas, Intan, Ela, Hanifah, Dewi, dan seluruh biokimia angkatan 41 atas dukungan morilnya.
Bogor, September 2009
Auline Muliasari
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 13 September 1985 dari pasangan Alfian Zein, B.A (alm) dan dr. Mulyani Noekman. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2003 penulis lulus dari SMU Negeri 42 Jakarta dan baru pada tahun 2004 penulis lulus seleksi masuk IPB melalui Jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa (SPMB) pada Program Studi Biokimia, yang saat itu masih tergabung dengan Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Umum S1 Fakultas Kedokteran Hewan serta Struktur Fungsi dan Biomolekul S1 Biokimia pada tahun akademik 2008/2009. Penulis juga pernah melaksanakan Praktik Kerja Lapangan (PKL) di Laboratorium Mikrobiologi Kelompok Peneliti Biokimia Mikrob, Lembaga Ilmu Pengetahuan Alam (LIPI), Cibinong, Bogor, selama periode Juli sampai Agustus 2007 dan menulis laporan ilmiah yang berjudul Aktivitas Antibakteri Isolat Mikrob dari Maluku: Uji Fisik, Alkohol, dan Total Asam Susu Pasteurisasi. Selain itu penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai Sekertaris Departemen Sumber Daya Manusia Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) pada periode 2006/2007.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA Peroksidasi Lipid........................................................................................... 1 Hati ................................................................................................................ 2 Hiperlipidemia .............................................................................................. 2 Metabolisme Kolesterol ................................................................................ 3 Obat Penurun Kolesterol ............................................................................... 4 Hewan Coba .................................................................................................. 6 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .............................................................................................. 7 Metode Penelitian ......................................................................................... 7 HASIL DAN PEMBAHASAN Masa Adaptasi dan Bobot Badan Hewan Coba ............................................ 8 Perbandingan Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Normal dengan Kelinci Hiperlipidemia .................................................................................. 9 Perbandingan Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Ramuan Jati Belanda dan Lovastatin dengan Hiperlipidemia ......................................... 10 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 11 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 11 LAMPIRAN .......................................................................................................... 13
ix
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Reaksi peroksidasi .............................................................................................. 2
2 Reaksi antara TBA dengan MDA ...................................................................... 2 3 Biosintesis kolesterol .......................................................................................... 4 4 Struktur kimia lovastatin. .................................................................................... 5 5 Jati Belanda. ........................................................................................................ 5 6 Kelinci New Zealand White. ............................................................................... 6 7 Bobot badan selama adaptasi dan perlakuan. ...................................................... 9 8 Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci normal dan kelinci hiperlipidemia..... 10 9 Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia, ramuan & lovastatin. 10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Tahapan penelitian ...................................................................................................14 2 Komposisi pakan standar .........................................................................................15 3 Bobot badan kelinci ................................................................................................16 4 Hasil kurva standar TMP .........................................................................................17 5 Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci dan cara perhitungan ...............................18 6 Analisis statistik .......................................................................................................19
PENDAHULUAN Penyakit degeneratif menjadi penyakit pembunuh manusia terbesar di dunia. Menurut hasil survei kesehatan rumah tangga (SKRT) menyatakan bahwa penyakit jantung koroner telah menjadi penyebab kematian paling tinggi di tahun 1992, 1995, dan 2001, sedangkan menurut WHO (World Health Organization) hingga akhir tahun 2005 penyakit degeneratif telah menyebabkan kematian hampir 17 juta orang di seluruh dunia. Penyakit degeneratif antara lain PJK (penyakit jantung koroner), diabetes melitus, kanker, obesitas, dislipidemia, dan stroke. Faktor yang menyebabkannya adalah pola makan yang menyukai masakan cepat saji (fast food) dan mengkonsumsinya secara berlebihan sehingga terjadi hiperlipidemia. Hiperlipidemia merupakan suatu keadaan tingginya konsentrasi lipid yang ditandai dengan meningkatnya konsentrasi trigliserida, LDL (low density lipoprotein), dan kolesterol darah melebihi batas normal (pada manusia > 200 mg/dl) (Ganong 2001). Faktor-faktor yang menyebabkan hiperlipidemia adalah obesitas, usia, kurang olahraga, stres, gangguan metabolisme, gangguan genetik, dan pola konsumsi makanan sehari-hari yang dapat meningkatkan konsentrasi lipid. Keadaan ini dapat ditimbulkan karena meningkatnya peroksidasi lipid yang disebabkan oleh radikal bebas di dalam tubuh, seperti organ hati. Yagi et al. (1994) menyatakan bahwa peningkatan konsentrasi lipid peroksida di hati dapat merusak sel hati sehingga peroksida akan keluar dari hati menuju pembuluh darah dan dapat merusak organ atau jaringan lain. Alviani (2007) yang menyatakan bahwa konsentrasi lipid peroksida hati tikus normal dan hiperlipidemia berturutturut sebesar 87.10 nmol/g bobot hati dan 523.55 nmol/g bobot hati. Selain itu, pemberian pakan kolesterol sebesar 0.25% mengakibatkan konsentrasi lipid peroksida hati tikus kelompok hiperlipidemia lebih besar lima kali dari pada kelompok normal (Alviani 2007). Oleh karena itu, terdapat hubungan antara kondisi hiperlipidemia dengan konsentarsi lipid peroksida hati pada tikus (Alviani 2007). Kondisi hiperlipidemia yang akan menyebabkan aterosklerosis ini membuat para peneliti mencari obat yang ampuh untuk menurunkan kadar lipid plasma. Oleh karena itu, banyak obat-obatan paten maupun dari tumbuhan yang digunakan sebagai penurun lipid. Obatobatan paten tersebut antara lain golongan asam fibrat, resin, penghambat HMG-KoA reduktase (statin), dan asam nikotinat (niasin) sedangkan obat-obatan dari tumbuhan antara lain jati belanda, temulawak, daun jambu biji, kunyit, dan mahkota dewa (Dalimartha 2002). Penelitian tentang obat penurun lipid plasma telah dilakukan
sebelumnya, sehingga penelitian ini merupakan penelitian lanjutan. Alviani (2007) menyatakan bahwa kelompok hewan coba tikus yang diberi ramuan ekstrak daun jati belanda mampu menurunkan kolesterol sebesar 27.56% secara nyata dibandingkan kelompok hiperlipidemia. Rahayu (2007) menunjukkan bahwa ekstrak ramuan daun jati belanda, temulawak, dan daun jambu biji pada komposisi tertentu mampu menurunkan konsentrasi kolesterol hati pada tikus yang hiperlipidemia. Tombilangi (2004) menyatakan bahwa pemberian pakan kolesterol pada hewan coba kelinci dapat menaikkan konsentrasi lipid peroksida. Berdasarkan penelitian tersebut obatobatan dari tumbuhan mampu menurunkan kolesterol pada tikus dan kelinci yang diberi pakan kolesterol. Penelitian sebelumnya menggunakan plasma darah hewan coba kelinci, sedangkan pada organ hati kelinci belum diteliti. Berdasarkan hal tersebut, konsentrasi lipid peroksida hati pada hewan coba kelinci hiperlipidemia yang diberi senyawa hipolipidemik belum diteliti lebih lanjut. Penelitian bertujuan mengukur konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia dan menentukan pengaruh pemberian senyawa hipolipidemik terhadap lipid peroksida hati kelinci hipierlipidemia. Hipotesis dari penelitian ini adalah pemberian senyawa hipolipidemik dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci yang hiperlipidemia. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi lebih lanjut tentang korelasi antara meningkatnya konsentrasi lipid pada hati kelinci terhadap konsentrasi lipid peroksida dalam hatinya yang diberi senyawa hipolipidemik.
TINJAUAN PUSTAKA Peroksidasi Lipid Lipid merupakan salah satu molekul yang paling sensitif terhadap serangan radikal bebas sehingga terbentuk lipid peroksida. Peroksidasi lipid adalah reaksi yang terjadi antara radikal bebas dengan asam lemak tak jenuh majemuk (Polyunsaturated fatty acid, PUFA) yang sedikitnya memiliki tiga ikatan rangkap (Halliwel dan Gutteridge 1999). Peroksidasi lipid terjadi diakibatkan oleh radikal bebas. Radikal bebas sangat labil dan reaktif sehingga mudah bereaksi dengan setiap zat disekitarnya. Peroksidasi lipid merupakan rantai reaksi yang berlangsung terus menerus, sebab reaksi ini membentuk radikal lipid bebas (R•) yang lain sehingga peroksidasi berlangsung lebih lanjut (Halliwel dan Gutteridge 1999). Umumnya peroksidasi lipid dapat melalui tiga tahap reaksi,
2
yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi (Murray et al 2001). Reaksi peroksidasi lipid diawali dengan pemisahan sebuah atom hidrogen oleh radikal bebas dari suatu grup metilena (-CH2-) PUFA. Radikal tersebut menghasilkan pembentukan suatu radikal karbon (-•CH-) pada PUFA. Radikal karbon ini dapat distabilkan melalui suatu pengaturan ulang ikatan rangkap yang menghasilkan pembentukan diena terkonjugasi. Bila diena terkonjugasi bereaksi dengan O2 akan terbentuk radikal peroksida lipid (ROO•). Selanjutnya radikal peroksi lipid dapat juga menghilangkan sebuah atom hidrogen dari molekul lipid lainnya yang berdekatan untuk membentuk hidroperoksida lipid dan juga membentuk radikal karbon lainnya. Jika radikal karbon lain tersebut bereaksi lagi dengan oksigen maka reaksi peroksidasi lipid akan terus berlanjut. Pembentukan endoperoksida lipid pada PUFA yang mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap akan mendorong pembentukan malondialdehida (MDA) sebagai produk dari reaksi peroksidasi tersebut. Mekanisme reaksi peroksidasi lipid ini dapat dilihat pada Gambar 1. Lipid peroksida atau lipid hidroperoksida merupakan suatu molekul yang stabil pada suhu fisiologis atau suhu tubuh. Kadar lipid peroksida dapat diukur dengan metode asam tiobarbiturat (TBA) yang mengukur adanya MDA. TBA akan bereaksi dengan gugus karbonil dari MDA, yaitu satu molekul MDA akan berikatan dengan dua molekul TBA sehingga membentuk senyawa kompleks berwarna merah (Halliwel dan Gutteridge 1999) (Gambar 2). Terbentuknya warna merah tersebut akan diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm yang sebanding dengan tingkat oksidasi lipid. Pada reaksi ini ada sejumlah senyawa lain yang juga bereaksi dengan TBA, namun karena jumlahnya kecil maka bisa diabaikan. Senyawa-senyawa itu diantaranya adalah glukosa <0.4 mg (2.2 μmol) dan sukrosa <8.56 mg (25.0 μmol)(Ohkawa et al. 1979). Uji TBA ini merupakan uji yang spesifik untuk hasil oksidasi asam lemak tak jenuh dan baik diterapkan untuk uji terhadap lemak pangan yang mengandung asam lemak tak jenuh (Ketaren 1986).
Gambar 1 Reaksi peroksidasi lipid (Murray et al 2001).
Gambar 2 Reaksi antara TBA dengan MDA (Halliwel & Gutteridge 1999). Hati Hati manusia mempunyai berat sekitar 1.5 kg dan karena itu merupakan salah satu organ terbesar pada manusia (Koolman 2000). Walaupun berat hati hanya 2-3% dari berat tubuh namun hati terlibat dalam 25-30% pemakaian oksigen. Hati terdiri dari sel-sel parenkim hati (hepatosit) sekitar 60% dan sel-sel endotel sekitar 30% yang membatasi sinusoid-sinusoid hati, sisanya merupakan sel-sel pembuluh darah, jaringan penyambung, dan saluran empedu (Tangendjaja 1987). Organ hati merupakan pusat dari metabolisme dalam sebagian besar hewan. Organ ini berfungsi dalam proses detoksifikasi senyawa toksik, hematologik, sistem imun tubuh, berperan dalam proses metabolisme biomolekul, dan sekresi produk akhir metabolisme seperti bilirubin, amonia, dan urea (Kaplan dan Pesce 1989). Membran-membran mikrosom hati sangat rentan terhadap peroksidasi lipid, karena membran tersebut banyak sekali mengandung asam lemak tak jenuh. Proses peroksidasi lipid pada mikrosom hati dapat berlangsung secara enzimatis dan nonenzimatis. Proses secara enzimatis yaitu peroksidasi lipid bergantung pada NADPH, sedangkan secara nonenzimatis yaitu peroksidasi lipid yang bergantung pada ion Fe3+, ion ini berfungsi sebagai pengkompleks ADP, pirofosfat, dan EDTA (Halliwel dan Gutteridge 1999). Meningkatnya konsentrasi lipid peroksida dapat menjadi awal rusaknya sel hati. Peningkatan konsentrasi lipid peroksida lebih jauh akan menyebabkan terjadinya nekrosis hati. Menurut Yagi et al. (1994) apabila konsentrasi lipid peroksida di hati meningkat, maka lipid peroksida ini dapat merusak sel hati sehingga peroksida akan keluar dari hati menuju pembuluh darah dan dapat merusak organ atau jaringan lain. Konsentrasi lipid peroksida yang meningkat pada jaringan maupun organ dapat mengakibatkan berbagai penyakit degeneratif, seperti penyakit jantung koroner (PJK) dan stroke. Hiperlipidemia Hiperlipidemia atau hiperlipoproteinemia adalah gangguan metabolisme yang melibatkan peningkatan konsentrasi lipoprotein pada plasma. Hiperlipidemia merupakan suatu keadaan
3
tingginya konsentrasi lipid yang ditandai dengan meningkatnya konsentrasi trigliserida, LDL, dan kolesterol darah melebihi batas normal (pada manusia > 200 mg/dL) (Ganong 2001). Faktor yang mempengaruhi hiperlipidemia adalah obesitas, usia, kurang olahraga, stres, gangguan metabolisme, gangguan genetik, dan pola konsumsi makanan sehari-hari yang dapat meningkatkan konsentrasi lipid atau kolesterol. Makanan yang kaya akan kolesterol dan asam lemak jenuh dapat menekan pembentukan reseptor LDL, sehingga meningkatkan kolesterol di dalam darah (Grundy 1991). Hiperlipidemia dapat meningkatkan resiko aterosklerosis, yaitu penyumbatan pembuluh darah arteri akibat penumpukan lipid pada dinding aorta. Jika aterosklerosis terjadi pada pembuluh darah aorta yang mensuplai O2 ke jantung, maka dapat menyebabkan penyakit jantung koroner (PJK). Faktor yang mempengaruhi patogenesis aterosklerosis adalah hiperkolesterolemia yang disebabkan oleh peningkatan konsentrasi lipoprotein densitas rendah (LDL) (Schwart et al. 1993 dalam Taher 2003). Lemak yang berupa trigliserida atau kolesterol berasal dari bahan makanan masuk ke dalam tubuh dan dicerna dalam usus halus. Selanjutnya diangkut oleh kilomikron dan dihidrolisis oleh lipoprotein lipase menghasilkan asam lemak bebas. Hasil tersebut disimpan di jaringan adiposa dan otot. Akibat dari reaksi tersebut kilomikron akan mengecil dan disebut kilomikron sisa. Kilomikron sisa akan bersirkulasi membawa kolesterol ke hati, kemudian diserap oleh reseptor khusus melalui mekanisme spesific receptor-mediated endocytosis. Kilomikron dan kilomikron sisa merupakan lipoprotein yang mengangkut lemak dan kolesterol yang berasal dari makanan (eksogen). Selain berasal dari makanan, lemak, dan kolesterol juga dapat di sintesis oleh hati. Kolesterol dan trigliserida diangkut dari hati ke jaringan tubuh lainnya dengan cara hati memproduksi VLDL (very low density lipoprotein). Awalnya partikel VLDL mengangkut trigliserida dari hati ke jaringan adiposa. Seperti halnya kilomikron, selanjutnya VLDL mengalami hidrolisis oleh lipoprotein lipase dalam pembuluh darah dan menghasilkan IDL (Intermediate density lipoprotein), hidrolisis lebih lanjut menghasilkan LDL (low density lipoprotein). Lalu partikel LDL akan diendositosis oleh hepatosit setelah terlebih dahulu diikat oleh reseptor LDL (Voet dan Voet 1995). Reseptor LDL merupakan glikoprotein yang merentangkan membran sel dan daerah pengikatan B-100 terletak pada ujung terminal yang tersusun. LDL akan berikatan dengan
reseptor dalam keadaan utuh melalui endositosis. Kemudian LDL dipecah di dalam lisosom yang melibatkan hidrolisis apoprotein dan ester kolesteril yang diikuti oleh translokasi kolesterol ke dalam sel. Reseptor tersebut tidak dihancurkan tetapi kembali ke permukaan sel. Aliran masuk kolesterol ini menghambat kerja HMG-KoA sintase serta HMG-KoA reduktase dengan cara yang terkoordinasi, dan dengan menghambat sintesis kolesterol serta menstimulasi aktivitas ACAT dan mengurangi sintesis reseptor LDL. Peningkatan konsentrasi lipid peroksida dalam tubuh dapat disebabkan oleh kondisi hiperkolesterolemia. Saat kondisi tersebut jumlah LDL meningkat sehingga dapat memperbesar kemungkinan terjadinya oksidasi, sebab ketersediaan substrat yang dapat dioksidasi lebih banyak. Fungsi kolesterol salah satunya sebagai prekursor pembentukan asam empedu yang disintesis di dalam hati. Tahap pertama dari biosintesis asam empedu adalah reaksi 7αhidroksilasi terhadap kolesterol yang dikatalisis oleh enzim mikrosomal, yaitu 7α-hidroksilase. Reaksi ini memerlukan oksigen, NADPH, dan sitokrom P-450 oksidase. Semakin besar konsentrasi kolestrol plasma dalam tubuh hiperkolesterolemia, maka semakin banyak asam empedu yang disintesis, sehingga semakin meningkat pula oksigen dan NADPH yang dibutuhkan serta peningkatan aktivitas sitokrom P-450 oksidase (Murray et al. 2001). Sitokrom P-450 oksidase merupakan enzim yang berperan dalam memperantarai metabolisme retikulum endoplasmik yang menghasilkan radikal superoksida (O2-) (Dhaunsi et al.1992 dalam Wresdiyati 2005). Oleh sebab itu, semakin meningkatnya sitokrom P-450 oksidase, maka radikal bebas yang dihasilkan semakin meningkat pula. Jika produksi radikal bebas terjadi secara berlebihan maka enzim antioksidan dalam tubuh khususnya di organ hati seperti superoksida dismutase (SOD) tidak mampu mengatasinya. Hal ini akan menimbulkan kondisi stres oksidatif, yaitu suatu keadaan yang dapat menyebabkan terjadinya beberapa kerusakan atau kelainan baik proses biokimia maupun fisiologi di dalam sel akibat dari proses peroksidasi lipid. Metabolisme Kolesterol Kolesterol merupakan komponen terpenting membran sel pada hewan. Umumnya kebutuhan kolesterol sehari-hari dapat terpenuhi secara sempurna oleh tubuh melalui sintesis di dalam tubuh (endogen). Pada konsumsi makanan yang beraneka ragam, kurang lebih setengah dari kolesterol berasal dari biosintesis tubuh sendiri yang berlangsung di dalam usus, kulit, dan terutama dalam hati (kira-kira 50%), selebihnya kolesterol diambil dari bahan makanan (eksogen)
4
(Koolman 2000). Pada manusia, secara keseluruhan kolesterol yang digunakan setiap harinya kurang lebih 1gram (Koolman 2000). Biosintesis kolesterol dimulai dengan asetilKoA. Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi empat bagian, antara lain pembentukan mevalonat, pembentukan isopentenil difosfat, pembentukan skualen, dan pembentukan kolesterol (Koolman 2000) (Gambar 3). Selain itu, kolesterol yang berasal dari makanan akan dialirkan melalui darah. Jika kolesterol dihidrolisis lebih lanjut maka akan menjadi asama empedu dan garam-garamnya (dalam hati) dan menjadi hormon steroid (dalam kelenjar endokrin) (Marks et al. 2000). Awalnya biosintesis kolesterol dimulai dari perubahan asetil KoA menjadi asetoasetil KoA kemudian berubah menjadi 3-hidroksi 3metilglutaril-KoA (3-HMG-KoA). Peristiwa ini terjadi bukan di mitokondria melainkan pada retikulum endoplasma (Koolman 2000). Selanjutnya 3-HMG-KoA akan direduksi menjadi mevalonat dengan cara melepaskan KoA. Enzim yang berperan dalam tahap ini adalah HMG-KoA reduktase. Tahap selanjutnya, mevalonat akan didekarboksilasi menjadi isopentenil difosfat dengan menggunakan ATP (adenosin trifosfat). Dengan demikian akan dihasilkan komponen yang membentuk isoprenoid. Isopentenil difosfat akn dibentuk menjadi dimetilalil difosfat melalui isomerisasi. Kedua molekul C5 ini akan berkondensasi menjadi geranil difosfat dan melalui adisi satu isopentenil difosfat lainnya menjadi farnesil difosfat. Farnesil difosfat akan berubah menjadi skualen. Selanjutnya skualen dapat diubah bentuk menjadi siklik dan akan menghasilkan lanosterol. Kemudian langkah selanjutnya, lanosterol akan dilepaskan gugus metil sebanyak tiga gugus secara oksidatif, sehingga akan terbentuk suatu produk akhir, yaitu kolesterol. Tahap lebih lanjut dari perombakan kolesterol atau katabolisme kolesterol akan menghasilkan asam empedu dan hormon steroid. Kolesterol memiliki sifat tidak larut dalam air. Oleh sebab itu, zat ini akan diangkut dalam darah sebagai komponen lipoprotein darah. Kolesterol dalam makanan diserap dari garam empedu ke dalam sel epitel usus. Kolesterol terkemas dalam kilomikron di usus dan dalam VLDL di hati (Mark et al. 2000). Kilomikron di usus akan dibawa ke darah melalui limfe. Selanjutnya kilomikron akan berubah menjadi asam lemak dan gliserol dengan bantuan enzim lipoprotein lipase serta menghasilkan sisa kilomikron. Kilomikron sisa akan berikatan dengan reseptor di sel hati dan mengalami internalisasi melalui endositosis. Setelah dibentuk di hati akan berubah menjadi VLDL yang akan disekresikan ke dalam darah selanjutnya akan berubah menjadi IDL dan hidrolisis lebih lanjut
dari IDL akan menghasilkan LDL. LDL yang terbentuk akan menyediakan kolesterol bagi jaringan (Koolman 2000). Jika terjadi kelebihan kolesterol di jaringan maka HDL akan membawa kembali ke hati.
Gambar 3 Biosintesis kolesterol Obat Penurun Kolesterol Hipolipidemik adalah obat yang digunakan untuk menurunkan kadar lipid plasma (Syarif et al 2003). Tindakan menurunkan lipid plasma merupakan salah satu tindakan yang ditujukan untuk menurunkan risiko aterosklerosis. Obatobatan penurun kolesterol yang dijual secara komersial sudah banyak jenisnya di pasaran. Obat penurun kolesterol tersebut dapat dibagi menjadi empat golongan, yaitu a) resin pengikat empedu yang bekerja dengan cara mengikat asam empedu di usus dan meningkatkan pembuangan LDL dari aliran darah, contoh obat ini adalah kolesteramin dan kolestipal, b) penghambat sintesis lipoprotein yang bekerja dengan cara mengurangi kecepatan pembentukan VLDL dan meningkatkan HDL, contoh obat ini adalah niasin, c) penghambat HMG-KoA reduktase atau golongan statin yang bekerja dengan cara menghambat secara kompetitif enzim HMG-KoA reduktase, contoh obat ini adalah fluvastatin, lovastatin, pravastatin, simvastatin, dan atorvastatin, yang terakhir d) derivat asam fibrat yang bekerja dengan cara meningkatkan aktivitas lipoprotein lipase, contoh obat ini adalah siprofibrat, simfibrat, bezafibrat, klofibrat, fenofibrat, dan gemfibrosil. Pada penelitian ini obat penurun kolesterol yang digunakan dari golongan penghambat HMG-KoA reduktase atau golongan statin, yaitu lovastatin. Lovastatin Lovastatin merupakan salah satu obat penurun kolesterol golongan statin (Albert 1989). Lovastatin sebagai agen hipokolesterolemik mampu menurunkan kadar serum kolesterol, LDL, trigliserol dan VLDL dalam darah (Albert 1989). Obat golongan ini sangat efektif untuk mengobati hiperlipidemia karena merupakan inhibitor kompetitif dari 3-hidroksi-3metilglutaril-koenzim-A (HMG-KoA) reduktase (Goodman dan Gilmans 2001 dalam Rahayu
5
2007). Lovastatin merupakan agen penurun kolesterol yang diisolasi dari Aspergillus terreus (Merck 2005). Lovastatin memiliki rumus umum C24H36O5 yang berbentuk serbuk kristal non higroskopik berwarna putih dan tidak larut dalam air akan tetapi larut dalam etanol, metanol, dan asetonitril. Lovastatin adalah senyawa nonpolar. Berdasarkan strukturnya lovastatin memiliki satu bentuk cincin lakton yang sewaktu-waktu dapat terhidrolisis jika bereaksi dengan asam (Gambar 4). Selain itu lovastatin juga memiliki bentuk ester dan mempunyai ikatan yang terkonjugasi. Lovastatin sering ditambahkan unsur aditif antara lain selulosa, laktosa, magnesium stearat dan pati. Butilat hidroksianisol (BHA) ditambahkan dalam lovastatin sebagai bahan pengawet (Merck 2005). Obat golongan statin ini dapat menurunkan biosintesis kolesterol dengan cara menghambat secara kompetitif enzim HMG-KoA reduktase. Enzim ini merupakan enzim yang mengkatalisis konversi HMG-KoA menjadi mevalonat, suatu prekursor sterol, termasuk kolesterol. Efek tersebut dapat meningkatkan katabolisme fraksional LDL maupun ekstraksi prekursor LDL oleh hati, sehingga mengurangi simpanan LDL plasma. Oleh sebab itu, ekstraksi lintas pertama oleh hati dari obat tersebut cukup besar, maka efek utamanya terjadi di hati (Katzung 2002). Selain obat penurun kolesterol, dalam penelitian ini juga digunakan senyawa bahan alam sebagai penurun kolesterolnya. Senyawa bahan alam saat ini sangat disukai. Obat-obatan alami yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak daun jati belanda.
Gambar 4 Struktur kimia lovastatin.
Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) Jati belanda merupakan tumbuhan yang berasal dari Amerika beriklim tropis. Pohon jati belanda ini mungkin didatangkan oleh bangsa Portugis dan di tanam di Jawa sebagai peneduh. Jati belanda atau jati londo (Jawa tengah) tumbuh baik pada ketinggian 1-800 m di atas permukaan laut. Klasifikasi dari tumbuhan jati belanda, yaitu divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, bangsa Malvales, suku Steruliaceae, marga Guazuma, dan jenis Guazuma ulmifolia Lamk. Tumbuhan jati belanda ini berupa pohon peneduh yang berada di tepi jalan dengan tinggi
10-20 meter. Memiliki batang yang berbentuk bulat, keras, permukaannya kasar, banyak alur, bercabang, dan berwarna hijau keputihan. Daun berbentuk bundar sampai lanset, ujung daun lancip, serta permukaan daun bagian atas berbulu. Berbunga banyak, bentuk bunga agak ramping, serta memiliki mahkota bunga yang berwarna kuning. Bijinya kecil, keras, diameter ± 2 mm, berwarna coklat muda, serta memiliki akar tunggang (Sugati et al 1991). Bentuk tumbuhan jati belanda dapat dilihat pada Gambar 5. Kayu jati belanda dapat dipergunakan untuk pembuatan kertas pada zaman dahulu namun hasilnya tidak begitu bagus sedangkan saat ini kayu jati belanda banyak dibuat sebagai meubel. Daun dan kulit batang jati belanda mengandung alkaloid, serta flavonoid, Selain itu, daunnya mengandung saponin dan tanin. Menurut Soesilo (1989) daun jati belanda mengandung senyawa flavonoid, asam fenolat, tanin, steroid, triterpenoid, dan karotenoid. Komposisi tersebut sesuai dengan hasil penelitian Tombilangi (2004) yang menyatakan bahwa ekstrak etanol daun jati belanda mengandung flavonoid. Daun jati belanda dapat bermanfaat sebagai pelangsing tubuh, sehingga simplisia tanaman ini banyak digunakan di dalam ramuan tradisional jamu galian singset. Lestari dan Muhtadi (1997) yang menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun jati belanda sebanyak 1 g/kg bobot badan pada tikus hiperlipidemia mampu menurunkan kadar kolesterolnya. Namun, hal ini berbeda pada hasil penelitian yang dilakukan Rachmadani (2001) menunjukkan bahwa tikus yang diberikan ekstrak air daun jati belanda sebanyak 1 g/kg bobot badan tidak menunjukan penurunan kadar kolesterol. Pemakaian rebusan daun jati belanda secara berlebihan dapat menyebabkan iritasi usus, sedangkan pemakaian biji tumbuhan jati belanda secara berlebihan dapat mengakibatkan diare atau radang usus (Hyene 1987). Rebusan biji tumbuhan jati belanda yang dibakar dapat digunakan sebagai obat sembelit, sedangkan jika dicampur dengan minyak adas dapat digunakan untuk penyakit perut kembung dan sesak nafas. Biasanya rebusan biji tumbuhan ini digunakan oleh masyarakat dengan cara meminumnya seperti meminum kopi (Hyene 1987).
Gambar 5 Jati Belanda.
6
Hewan Coba Kelinci (Oryctolagus cuniculus) merupakan hewan coba yang sangat penting dan sering digunakan untuk penelitian terutama untuk hiperlipidemia (Gambar 6). Kelinci yang banyak dipelihara di Indonesia saat ini berasal dari kelinci liar di Eropa, terutama dari derah Belanda. Menurut Malole (1989) ada dua jenis kelinci, yaitu kelinci yang berukuran kecil dengan berat kurang dari 2 kg yang berasal dari Belanda dan kelinci yang berukuran besar dengan berat rata-rata 5 kg yang berasal dari Amerika dan Selandia Baru. Jenis kelinci yang sering digunakan sebagai hewan coba adalah bangsa New Zealand White, California, Dutch Belted, dan Lops. Penelitian yang berhubungan dengan biomedis yang erat kaitannya dengan kegiatan seperti diagnosa, penelitian, dan produksi umumnya menggunakan hewan coba tersebut. Selain itu, penelitian tentang toksisitas berbagai zat juga menggunakan kelinci sebagai hewan coba (Malole 1989). Pada umumnya kelinci yang berukuran besar sering digunakan untuk produksi antiserum, sedangkan kelinci yang berukuran kecil lebih efisien jika digunakan untuk uji-uji kualitatif. Kelinci memiliki kemampuan bertahan yang tinggi dalam berbagai macam cuaca namun perkembangannya akan lebih baik pada daerah yang memiliki iklim sedang. Sifat kelinci sangat unik, yaitu dapat memakan kotorannya sendiri. Kotoran kelinci dibagi dua, yaitu kotoran yang dikeluarkan pada siang hari dan kotoran yang dikeluarkan pada malam hari. Kotoran yang dikeluarkan pada malam hari terlihat lebih lunak dan berlendir, serta banyak mengandung vitamin. . Kelinci jantan memiliki berat badan 1.5-7.0 kg dan memiki angka harapan hidupnya antara 510 tahun (Smith 1988). Kecepatan tumbuh 15-20 g/hari hingga umur 8 minggu dan 100-150 g/minggu hingga umur 26 minggu. Setiap hari seekor kelinci minum 80-100 ml air/kg berat badan (Smith 1988). Kelinci sangat mudah terkena berbagai penyakit. Ketika sudah terserang penyakit kelinci tersebut akan sulit sembuh. Hal ini sangat mengganggu jika terjadi saat kelinci yang digunakan adalah untuk penelitian. Namun ada beberapa cara untuk mencegah penyakit pada kelinci, yaitu akomodasi yang baik, makanan tersedia terus-menerus, dan pemeriksaan berkala. Darah kelinci dapat diambil dari pembuluh darah vena atau arteri telinga dengan menggunakan jarum suntik berukuran 23-25 gauge. Selain itu, pengambilan darah dapat dilakukan dari jantung, cara ini biasanya dilakukan untuk mengambil darah dalam jumlah yang sangat besar dan kelinci yang digunakan tidak diperlukan lagi untuk penelitian yang lebih lanjut. Saat ingin diambil darahnya, kelinci terlebih dahulu dipuasakan kurang lebih selama
16-18 jam. Volume darah pada kelinci adalah 4580 ml/kg berat badan dengan kandungan kolesterol normal 10-80 mg/dl volume plasma darah (Smith 1988). Induksi obat atau senyawasenyawa lainnya dapat dilakukan dengan cara subcutan atau di bawah kulit. Kelinci yang digunakan dalam penelitian ini merupakan kelinci galur New Zealand White. Dalam penelitian ini pakan yang diberikan merupakan pakan standar berbentuk pelet yang diberi tambahan kolesterol yang berasal dari kuning telur. Pakan yang mengandung kolesterol tersebut dapat membuat kelinci peka, sehingga kelinci tersebut akan mengalami penumpukan lipid atau hiperlipidemia. Hiperlipidemia adalah salah satu penyebab aterosklerosis. Aterosklerosis dapat ditimbulkan oleh makanan yang mengandung kolesterol pada spesies kelinci, babi, kera, dan manusia (Murray et al 2000). Lain halnya pada hewan coba tikus, anjing, dan kucing merupakan hewan yang resisten terhadap pakan kolesterol. Tiroidektomi atau pengobatan dengan preparat tiourasil akan memudahkan timbulnya aterosklerosis pada anjing dan tikus (Murray et al 2000). Propil tiourasil (PTU) adalah zat antitiroid yang dapat meningkatkan konsentrasi kolesterol darah secara endogen dengan cara merusak kelenjar tiroid. PTU akan menimbulkan kondisi hipotiroid yang dihubungkan dengan peningkatan konsentrasi LDL plasma akibat penurunan katabolisme LDL. Penyebabnya, yaitu pada hipotiroid terjadi penurunan sintesis dan ekspresi reseptor LDL di hati, sehingga LDL banyak beredar di plasma dan menjadi penyebab hiperkolesterolemia (Salter et al 1991 dalam Rahayu 2007). Oleh karena itu, hewan coba kelinci lebih baik digunakan untuk penelitian hiperlipidemia karena kelinci memiliki kepekaan terhadap pemberian kolesterol sehingga memudahkan peneliti.
Gambar 6 Kelinci New Zealand White.
7
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Hewan percobaan yang akan digunakan adalah kelinci jantan galur New Zealand White yang sehat, berumur 4 bulan, dan mempunyai aktivitas normal, dengan bobot 3- 4 kg. Semua kelinci diperoleh dari PT. Indo Anilab, Bogor. Pakan standar kelinci berupa pelet yang didapat dari Balai Penelitian Ternak, Ciawi, Bogor. Pada pakan ditambahkan kolesterol yang didapat dari kuning telur dan minyak kelapa. Selain itu, pakan saat perlakuan ditambahkan lovastatin dan ekstrak ramuan yang diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka (PSB) LPPM IPB. Kandang yang digunakan adalah kandang individual yang dialasi dengan penyaring kotoran. Selain itu kandang juga dilengkapi dengan tempat minum dan makan. Bahan-bahan yang digunakan adalah bahan uji TBA antara lain NaCl dingin 0.9%, KCl dingin 1.15%, sodium dodesil sulfat (SDS) 8.1%, NaOH 1 M, asam asetat 20%, asam tiobarbiturat (TBA) 1.0% dalam pelarut asam asetat 50%, akuades, n-butanol:piridin (15:1 v/v), serta 1,1,3,3-tetrametoksi propana (TMP) sebagai larutan standar. Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, mikropipet, syringe, neraca analitik, vorteks, penangas air, kuvet, spektrofotometer gyneses, homogenizer, pH meter, pengaduk magnetik dan sentrifus klinis. Metode Penelitian Hewan Coba dan Rancangan Percobaan Hewan coba yang digunakan adalah kelinci New Zealand White berjenis kelamin jantan, sehat, dan beraktivitas normal. Kelinci sebanyak 24 ekor dibagi menjadi empat kelompok yang masing-masing terdiri dari 6 ekor kelinci. Kelinci diadaptasikan selama dua minggu dengan diberi pakan standar sebelum diberi pakan perlakuan agar cara hidup dan makanannya menjadi seragam. Pada minggu ketiga, kelinci diberi pakan sesuai dengan kelompoknya masingmasing. Kelompok kelinci ditentukan berdasarkan kesamaan bobot badannya. Ada empat kelompok kelinci, yaitu kelompok I (normal), kelompok II (hiperlipidemia), kelompok III (ramuan jati belanda), dan kelompok IV (lovastatin). Kelompok I diberi pakan standar, kelompok II diberi pakan kolesterol, kelompok III diberi pakan perlakuan (campuran pakan kolesterol dan ramuan jati belanda), dan kelompok IV diberi pakan kolesterol yang telah bercampur dengan lovastatin (dosis 0.57 mg/kg BB). Seluruh kelompok akan diberikan makan dengan pakannya masing-masing setiap pagi hari dari
minggu ke-3 hingga minggu ke-10 dan diberi minum akuades. Kelompok normal diberi pakan standar sebanyak 150 g/ekor/hari; kelompok hiperlipidemia diberikan pakan kolesterol, yaitu campuran pakan standar, 0.5% kolesterol dari tepung kuning telur dan 5% minyak kelapa sebanyak 150 g/ekor/hari; kelompok perlakuan diberi pakan dengan campuran pakan kolesterol dan ramuan daun jati belanda sebanyak 80 g/ekor/hari pada pagi hari, kemudian pada sore harinya diberi pakan dengan campuran pakan kolesterol sebanyak 70 g/ekor/hari; kelompok lovastatin diberi pakan dengan campuran pakan kolesterol dan lovastatin sebanyak 80 g/ekor/hari pada pagi hari dan 70 g/ekor/hari pakan kolesterol pada sore hari. Pembuatan Ekstrak Ramuan Daun Jati Belanda Daun jati belanda dicuci bersih dan dikeringkan dalam oven. Setelah kering, bahan tersebut diekstraksi dengan pelarut etanol 70% secara maserasi. Hasil dari maserasi tersebut diuapkan dengan rotary evaporator. Campuran ekstrak etanol daun jati belanda dicampurkan dengan bahan lainnya yang dibuat sesuai formulasi dari PSB. Pembuatan Pakan Kolesterol Pakan kolesterol yang digunakan dalam penelitian ini dibuat dari kuning telur ayam. Pakan kolesterol dibuat dari 0.5% kolesterol (dari kuning telur ayam), 5% minyak kelapa, dan pakan standar sampai 100%. Pakan standar di dapat dari Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor. Semua bahan dicampur merata dan dibentuk menjadi seperti pelet. Tepung kolesterol dibuat dari kuning telur ayam yang dikeringkan dengan metode Momuat et al (2001) yang telah dimodifikasi. Rebus telur ayam selama 30 menit atau sampai matang, kemudian kuning telurnya dipisahkan dari putih telurnya. Kuning telur yang telah matang, dilumatkan diatas loyang sampai menjadi bubuk. Kemudian diratakan tipis diatas loyang dan dikeringkan dalam oven pada suhu 65 °C selama 24 jam. Bubuk kuning telur yang telah kering diblender agar semakin halus. Pembuatan Pakan Ramuan Jati Belanda Pakan yang akan digunakan merupakan pakan kolesterol yang ditambahkan dengan ramuan daun jati belanda pada komposisi tertentu. Semua bahan tersebut dicampurkan secara merata dan dibentuk seperti pelet. Dosis tidak dapat disebutkan karena terkait dengan kepentingan hak paten dari mitra industri yang bekerjasama dalam penelitian ini.
8
Pengukuran Lipid Peroksida (Yagi 1994) Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan stok pereaksi 1,1,3,3-tetrametoksi propana (TMP) 6 M yang diencerkan dengan akuades menjadi 0.75, 1.5, 3.0, 6.0, dan 9.0 μM. Larutan masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 4 ml ke dalam tabung reaksi. Lalu masing-masing tabung ditambahkan 1 ml TBA 1.0% dalam pelarut asam asetat 50%, dipanaskan di penangas air mendidih pada suhu 95 °C selama 60 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Selanjutnya pada masing-masing tabung ditambahkan 1.0 ml akuades dan 5 ml nbutanol:piridin (15:1 v/v), diaduk dengan vorteks, lalu disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Lapisan atas yang terbentuk pada larutan diambil, lalu serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm dengan spektrofotometer. Pengukuran kadar lipid peroksida hati dilakukan pada akhir perlakuan. Sebanyak 1-2 g hati disimpan dalam larutan NaCl dingin 0.9%. Hati segar dibuat 10%b/v homogenat hati dalam larutan KCl dingin 1.15%. lalu diambil sebanyak 0.1 mL homogenat ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya ke dalam tiap tabung ditambahkan 0.2 mL SDS 8.1% dan 1.5 mL asam asetat 20%, serta diatur pHnya dari 2.5 menjadi pH 3.5 oleh NaOH 1 M dengan menggunakan pH meter. Kemudian ditambahkan 0.7 mL akuades dan 1.5 mL TBA 1.0% dalam pelarut asam asetat 50% dan dipanaskan ke dalam penangas air mendidih pada suhu 95 °C selama 60 menit. Setelah dipanaskan selanjutnya didinginkan pada suhu ruang. Lalu tiap tabung ditambahkan 1 mL akuades dan 5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), diaduk dengan vorteks, disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit,dan diambil lapisan atasnya, lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Analisis Statistik (Mattjik & Sumertajaya 2000) Hasil yang didapatkan dianalisis dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Model rancangan tersebut adalah: Yij = μ + τi + εij Keterangan: μ = pengaruh rataan umum τi = pengaruh rataan ke-i, i=1, 2, 3, 4 εij = pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j= 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8 Yij = pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Data yang telah diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance) pada selang kepercayaan 95% dan taraf α 0.05, uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Semua data dianalisis dengan program SAS.
HASIL DAN PEMBAHASAN Masa Adaptasi dan Bobot Badan Hewan Coba Bobot badan kelinci dibagi menjadi dua, yaitu bobot badan selama adaptasi dan bobot badan selama perlakuan. Selama masa adaptasi semua kelinci pada setiap kelompok perlakuan mengalami kenaikan bobot badan, walaupun hanya diberikan pakan standar. Bobot badan ratarata kelinci selama masa adaptasi pada minggu pertama dan kedua nilainya ditunjukkan pada Tabel 1. Dari nilai tersebut bobot badan rata-rata kelinci selama masa adaptasi berkisar 3 kg. Berdasarkan uji ANOVA, bobot badan kelinci selama masa adaptasi tidak berbeda nyata (P<0.05). Artinya, bobot badan kelinci selama minggu pertama dan kedua adaptasi diperoleh hasil yang tidak nyata atau tidak signifikan pengaruh bobot badan terhadap kelompok perlakuannya. Hal tersebut bisa terjadi karena pada awal adaptasi, kelinci selama dua minggu diadaptasikan dengan lingkungan. Selain itu, kelinci diberikan kandang individual serta diberikan pakan standar dan minum pada setiap kelinci. Hal ini dilakukan agar kelinci terhindar dari stres dan mengamati kondisi kelinci tersebut apakah masih dapat dipergunakan selama penelitian. Pakan standar yang diberikan pada setaip kelinci sebanyak 150 gram/ekor. Penimbangan hewan coba dilakukan setiap dua minggu sekali dan sebelum melakukan penimbangan kelinci dipuasakan terlebih dahulu. Hal ini dilakukan untuk mengecek kondisi kelinci tersebut baik dalam hal kesehatan dan kebersihan selama berlangsungnya penelitian. Bobot badan rata-rata kelompok I, II, III, dan IV dari minggu ke-2 hingga minggu ke-10 nilainya dapat dilihat dalam Tabel 2. Maka, berdasarkan tabel dibawah ini rata-rata bobot badan kelinci, yaitu sebesar 3 kg. Bobot badan tersebut tidak jauh berbeda dengan bobot badan selama adaptasi. Berdasarkan pengujian statistika tidak ada perbedaan yang nyata dalam bobot badan kelinci selama perlakuan terhadap kelompok perlakuannya. Selama perlakuan bobot badan kelinci mengalami kenaikan, namun pada kelompok IV yang diberikan lovastatin terlihat mengalamin sedikit penurunan pada minggu keenam (Gambar 7)(P<0.05). Tabel 1 Bobot badan kelinci selama adaptasi
Kelompok
I II III IV
Bobot badan minggu-1 (kg) 3.03±0.53 2.93±0.53 3.06±0.37 2.98±0.50
Bobot badan minggu-2 (kg) 3.12±0.45 3.13±0.50 3.17±0.31 3.16±0.45
9
Tabel 2 Bobot badan kelinci selama perlakuan
Kelompok
Bobot badan (kg) Minggu-4 Minggu-6 Minggu-8 3.18±0.50 3.19±0.48 3.21±0.45 3.30±0.37 3.28±0.39 3.27±0.35 3.13±0.34 3.11±0.31 3.06±0.39 3.03±0.29 2.87±0.39 3.02±0.32
Minggu-2 3.12±0.51 3.23±0.51 3.05±0.24 3.16±0.29
I II III IV
B o b o t B a d a n (K g )
4
3
2
Normal
Minggu-10 3,25±0.39 3.28±0.52 3.17±0.34 3.19±0.35
minggu dan kelompok kolesterol 1% selama 12 minggu. Penelitian tersebut mendukung hasil penelitian yang dilakukan ini, meskipun ada perbedaan antara lain pemberian jumlah kolesterol dan jenis kelinci yang digunakan.
Hiperlipidemia 1
Lovastatin Ekstrak
0 -4
-2
0
2
4
6
8
Perbandingan Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Normal dengan Kelinci Hiperlipidemia
10
Minggu Ke-
Kurva Bobot Badan Selama Percobaan
Gambar 7 Bobot badan selama adaptasi dan perlakuan. Hal tersebut dapat terjadi karena pemberian pakan pada setiap kelompok berbeda dengan awal adaptasi. Pakan yang diberikan masih dalam jumlah 150 gram/ekor, namun ada perbedaan pada kelompok yang diberikan lovastatin dan ramuan jati belanda. Pada kelompok lovastatin dan ramuan pakan yang diberikan secara dua tahap dengan perbandingan 80 gram/ekor dan 70 gram/ekor pada setiap harinya. Hal ini mungkin berpengaruh terhadap stres kelinci terhadap lingkungannya. Penelitian yang dilakukan oleh Alviani (2007) menyatakan bahwa setelah pemberian pakan kolesterol tinggi bobot badan tikus meningkat sebesar 25% secara nyata dibandingkan saat kondisi adaptasi sedangkan bobot badan tikus normal meningkat sebesar 13% secara tidak nyata dibandingkan dengan keadaan adaptasi. Namun secara statistika pada kelompok perlakuan (pemberian ekatrak daun jati belanda), bobot badan hingga akhir percobaan tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kelompok hiperlipidemia selama perlakuan (Alviani 2007). Perbedaan tersebut terjadi karena penelitian yang dilakukan Alviani memakai hewan coba tikus sedangkan penelitian ini menggunakan hewan coba kelinci. Selain itu, kolesterol yang dipakai dalam penelitian ini sebesar 0.5% sedangkan penelitian Alviani memakai 0.25% serta hewan coba tikus diinduksi dengan PTU terlebih dahulu untuk membuat hewan model menjadi hiperlipidemia sehingga terjadi stres pada tikus. Dalam penelitian lain yang dilakukan oleh Kainuma (2006) menyatakan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dalam bobot badan kelinci putih jepang antara kelompok normal, kelompok kolesterol 1% selama 8
Salah satu perlakuan yang bisa digunakan untuk memicu terjadinya lipid peroksida adalah dengan mengurangi konsumsi vitamin E, vitamin C, dan β-karoten serta kondisi hiperglikemia (Winarsi 2007). Dalam penelitian kali ini, untuk menstimulasi terjadinya lipid peroksida digunakan cara diet lemak tinggi atau hiperkolesterolemia. Pemberian pakan kolesterol 0.5% menaikan konsentrasi lipid peroksida hati sebesar 209.20% dibandingkan dengan konsentrasi lipid peroksida hati normal atau meningkat dua kali lipat dibandingkan normal. Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci normal dan hati kelinci hiperlipidemia berturut-turut sebesar 109.763±41.48 nmol/g bobot hati dan 339.382±86.66 nmol/ g bobot hati (Gambar 8). Berdasarkan uji statistika, nilai tersebut secara nyata sangat berpengaruh atau sangat signifikan jika dibandingkan antara nilai lipid peroksida hiperlipidemia dengan normal. Maka pemberian pakan standar yang ditambahkan kolesterol 0.5% dan minyak kelapa 5% mempengaruhi kenaikan lipid peroksida hati. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Alviani (2007) bahwa konsentrasi lipid peroksida hati kelompok hiperlipidemia yang diberi pakan kolesterol sebesar 0.25% lebih besar lima kali secara bermakna dari pada kelompok normal. Selain itu, Kainuma (2006) menyatakan bahwa tingkat lipid peroksida pada jaringan hati kelompok kolesterol 1% selama 12 minggu lebih tinggi dari kelompok kolesterol 1% selama 8 minggu ataupun kelompok normal. Berdasarkan penelitian tersebut semakin lama waktu pemberian diet lemak tinggi maka konsentrasi lipid peroksida pada jaringan hati akan semakin meningkat. Senyawa lipid peroksida lebih banyak didalam jaringan jika dibandingkan dengan didalam darah (Yagi et al 1994). Hal ini sesuai dengan penelitian Adji (2004) yang menyatakan bahwa konsentrasi lipid peroksida darah dalam
10
k o n s e n tra s i L P O ( n m o l/g )
500
A
400 300 200
B
100 0 normal
hiper kelompok
Gambar 8
Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci normal dan kelinci hiperlipidemia.
Perbandingan Konsentrasi Lipid Peroksida Hati Kelinci Ramuan Jati Belanda dan Lovastatin dengan Hiperlipidemia Perlakuan terhadap kelinci yang diberi diet lemak tinggi akan mengakibatkan kelinci menjadi hiperlipidemia. Oleh karena itu, kelinci tersebut akan diberikan senyawa yang akan menurunkan kadar lemak tersebut antara lain ramuan daun jati belanda dan lovastatin. Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci yang diberikan ramuan daun jati belanda sebesar 139.722±25.79 nmol/gram bobot hati (Gambar 9). Penurunan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci tersebut sebesar 58.83% secara nyata dibandingkan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia. Hal ini tidak sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Alviani (2007) yang menyatakan bahwa penurunan konsentrasi lipid peroksida hati yang diberi ramuan ekstrak daun jati belanda dengan satu kali dosis dan dua kali dosis tidak berbeda nyata dengan kelompok hiperlipidemia. Perbedaan ini terjadi karena penelitian terdahulu menggunakan hewan coba tikus sedangkan saat ini menggunakan kelinci. Hal ini mungkin terjadi karena tikus tidak memiliki kantung empedu sehingga kolesterol yang menumpuk di hati akan dibuang melalui usus ke fesesnya, sedangkan
kelinci memiliki empedu maka kolesterol yang menumpuk di hati akan dihidrolisis lebih lanjut menjadi asam empedu. Penurunan konsentrasi lipid peroksida ini menunjukkan bahwa ramuan daun jati belanda mampu menurunkan lemak sehingga ramuan daun jati belanda terbukti efektif untuk menurunkan oksidasi lipid pada hewan coba tersebut. Hal ini didukung oleh penelitian Mahendra (2005) menyatakan bahwa jati belanda memiliki efek farmakologis seperti menghentikan diare dan peluruh lemak. Penurunan konsentrasi lipid peroksida ini mungkin terjadi karena adanya senyawa-senyawa bioaktif yang terkandung didalam daun jati belanda seperti tanin, steroid, flavonoid, musilago yang mampu menurunkan lipid dalam darah. Konsentrasi lipid peroksida pada hati kelinci yang diberikan lovastatin sebesar 172. 893±37.26 nmol/gram bobot hati (Gambar 9). Penurunan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci yang diberikan lovastatin sebesar 49.06% jika dibandingkan dengan hiperlipidemia. Artinya, secara statistika nilai tersebut secara nyata dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Jorge (2005) yang menyatakan bahwa obat golongan statin mampu menurunkan secara nyata lipid peroksida dari LDL teroksidasi maupun normal. Maka, menurunnya konsentrasi lipid peroksida hati seiring dengan fungsi obat golongan statin yaitu menurunkan kolesterol LDL dan trigliserda dalam tubuh. Penurunan konsentrasi lipid peroksida yang dibarengi dengan menurunnya lemak didalam tubuh ada kaitannya dengan fungsi lain obat golongan statin dalam hal ini lovastatin yaitu mengurangi stres oksidatif. Hasil penelitian ini mendukung penelitian yang dilakukan Rosenson (2004) yang menyatakan bahwa obat golongan statin mampu mengurangi pembentukan superoksida-NADPH melalui cell line turunan monosit di dalam kultur serta mampu mengurangi tingkat radikal superoksida yang efeknya hanya dapat diterangkan secara parsial oleh suatu pengurangan dalam kolesterol LDL. 500 450 konsentrasi LPO (nmol/g)
keadaan normal sekitar 0.46 ng/ml. Selain itu, penelitian Kainuma (2006) menyatakan bahwa tingkat lipid peroksida plasma kelompok kolesterol 1% selama 8 minggu lebih besar daripada kelompok kolesterol 1% selama 12 minggu maupun kelompok normal. Jika dibandingkan dengan lipid peroksida dalam hati, nilai konsentrasi lipid peroksida darah jauh lebih kecil. Hal ini terjadi karena terdapat senyawa radikal bebas seperti radikal hidroperoksil (HO2•), radikal superoksida (O2•) dan hidroksil radikal (OH•) yang dibentuk dalam sel sebagai senyawa antara dari reaksi transport elektron di mitokondria sel hati sehingga akan lebih mudah menyerang jaringan ekstrahepatik (Winarsi 2007).
A
400 350 300 250 B 200
B
150 100 50 0 hiper
ramuan
lov
k elom pok
Gambar 9
Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia, ramuan dan lovastatin.
11
SIMPULAN DAN SARAN Perlakuan selama 10 minggu dengan pemberian pakan kolesterol menaikan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia secara nyata sebesar 209.20% dibandingkan dengan normal atau dua kali lipat meningkat dibandingkan normal. Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci yang diberikan ramuan daun jati belanda dan lovastatin berturut-turut sebesar 58.83% dan 49.06% dibandingkan dengan hiperlipidemia. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kedua perlakuan tersebut dapar menurunkan peroksidasi lipid dan memiliki aktivitas antioksidan. Senyawa bioaktif dari ramuan daun jati belanda perlu diteliti lebih lanjut. Hal ini perlu dilakukan agar dapat mengetahui dengan pasti senyawa yang berperan penting dalam menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati kelinci hiperlipidemia.
DAFTAR PUSTAKA Mattjik AA, Sumertajaya M. 2000. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab Jilid I. Bogor: IPB Press. Adji P. 2004. Daya antioksidasi saponin akar kuning (Archangelisia flava(L)Merr) sebagai mekanisme hepatoproteksi pada tikus yang diberi parasetamol. [Skripsi]. Bogor: Departemen Kimia FMIPA IPB. Alviani. 2007. Khasiat ramuan ekstrak daun jati belanda terhadap peroksidasi lipid hati tikus hiperlipidemia. [Skripsi]. Bogor: Departemen Biokimia FMIPA IPB. Aryantha IP, Widayanti S, Yuanita. 2004. Eksplorasi fungi deuteromycetes (Aspergillus sp. dan Penicillium sp.) penghasil senyawa antikolesterol lovastatin. [Laporan Penelitian]. Bandung: FMIPA ITB. Astawan M. 2009. Cegah Hipertensi dengan Pola Makan. [terhubung berkala] http://www.depkes.co.id/artikel.html [6 April 2009].
Terjemahan dari: Review of Medicinal Physiology. Grundy SM. 1991. Multifactorial etiology of hypercholesterolemia: Implication for prevention of coronary heart disease. Arterioclerosis and thrombosis. 11: 16191635. Halliwel B, Gutteridge JMC. 1999. Free Radical in Biology and Medicine. Ed-3. New York: Oxford University. Hyene K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Indonesia. Jorge PAR, Almeida EA, Ozaki MR, Jorge M, Carneiro A. 2005. Effects of atorvastatin, fluvastatin, pravastatin, and simvastatin on endothelial function, lipid peroxidation, and aortic atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. J Cardiology 84:4. Kainuma et al. 2006. Cholesterol-fed rabbit as a unique model of nonalcoholic, nonobese, non-insulin-resistant fatty liver disease with characteristic fibrosis. J Gastroenterol 41:971-980 Kaplan LA, Pesce AJ. 1989. Clinical Chemistry. Ed-3. New York: Mosby Tear Book. Katzung BG. 2002. Farmakologi Dasar dan Klinik. Jakarta: Salemba Medika. Terjemahan dari: Basic and Clinical Pharmacology. Ketaren S. 1986. Minyak dan Lemak Pangan. Jakarta: UI Pr. Koolman J, Rohm KH. 2000. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Wanandi S, penerjemah. Jakarta: Hipokrates. Terjemahan dari: Color Atlas of Biochemistry. Lestari, Muchtadi. 1997. Uji aktivitas antihiperlipidemia daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) pada tikus [laporan penelitian]. Bandung: Universitas Padjajaran.
Albert AW. 1989. Lovastatin. Cardiovascular Drugs Reviews VII. 7: 89-109.
Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid II. Thenawidjaja M, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Cantarow A. 1962. Clinical Biochemistry. St. Louis: SN.
Mahendra B. 2005. 13 Jenis tanaman Obat Ampuh. Jakarta: Penebar Swadaya.
Dalimartha S. 2002. Resep Tumbuhan Obat untuk Menurunkan Kolesterol. Jakarta: Penebar Swadaya.
Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Suatu Pendekatan Klinis. Pendit Bu, penerjemah; Suyono J, Sadikin V, Mandera LI, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: basic Medical Biochemistry: A clinical Approach.
Ganong WF. 2001. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Ed-20. Djauhari Widjajakusumah, penerjemah. Jakarta: EGC.
12
Malole MB, Pramono SU. 1989. Penggunaan Hewan-hewan Percobaan di Laboratorium. Bogor: IPB Pr. Merck. 2005. Tablets Mevacor® (Lovastatin). USA: Merck&Co. MIMS Annual. 2004. Indonesia Index of Medical Specialties. Ed-16. Indonesia: United Business Media. Muhilal. 1991. Teori radikal bebas dalam gizi dan kedokteran. Cermin Dunia Kedokteran 73: 9-11. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 1999. Biokimia Harper. Ed ke-24. Hartanto A, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry. Momuat LI, Sulistiyani, Khomsan A, Sajuthi D. 2001. Minyak sawit mempercepat regresi aterosklerosis aorta pada kelinci hiperkolesterolemia ringan, tetapi tidak pada yang hiperkolesterolemia berat. Media Gizi Keluarga 25: 26-34. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. 1979. Assay for lipid peroxide in animal tissue by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 95: 351-358. Rachmadani. 2001. Ekstrak air daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) berpotensi menurunkan kadar lipid darah tikus strain wistar. [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia FMIPA IPB. Rahayu YS. 2007. Khasiat ekstrak ramuan daun jati belanda terhadap konsentrasi kolesterol hati tikus yang hiperlipidemia. [skripsi]. Bogor: Departemen Biokimia FMIPA IPB Rosenson RS. 2004. Statins in atherosclerosis: lipid-lowering agents with antioxidant capabilities. J Atherosclerosis 173: 1-12. Sayogya AP. 2002. Efek senyawa antioksidan Bioligical Response Modifier (BRM™) terhadap kadar lipid peroksida hati tikus. [skripsi]. Bogor: Departemen Kimia FMIPA IPB. Sugati S, Syamsuhidayat, Hutapea JR. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I). Jakarta: Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan RI. Smith JB, Mangkoewidjojo S. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan, dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: UI Press. Syarif et al. 2003. Farmakologi dan Terapi. Jakarta: UI Press
Taher A. 2003. Peran fitoestrogen kedelai sebagai antioksidan dalam penanggulangan aterosklerosis. [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana IPB. Tangendjaja A. 1987. Buku Ajar Patologi Klinik. Jakarta: Universitas Tarumanegara. Soesilo S. 1989. Vadamekum Bahan Obat Alam. Jakarta: Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Tombilangi AK. 2004. Khasiat ekstrak daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) terhadap kadar lipid peroksida darah kelinci yang hiperlipidemia. [skripsi]. Bogor: Departemen Kimia FMIPA IPB. Voet D, Voet JG. 1995. Biochemistry. New York: J Wiley. Winarsi H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius [WHO] World Health Organization. 2009. Cardiovascular disease. http://www.who/programmesandproject/card iovasculardisease [14 Apr 2009]. Wresdiyati T, Astawan M. 2005. Deteksi secara imunohistokimia antioksidan superoksida dismutase (SOD) pada jaringan tikus hiperkolesterolemia yang diberi pakan rumput laut. [laporan penelitian]. Bogor: FKH IPB. Yagi K. 1994. Lipid peroxides and related radicals in clinical medicine. Di dalam: Free Radicals in Diagnostic Medicine. Amstrong D, penyunting. New York: Plenum Pr. Yomes AT. 2006. Sifat prooksidan dan antioksidan vitamin C dan teh hijau pada sel khamir Candida sp. berdasarkan peroksidasi lipid. [skripsi]. Bogor: Departemen Kimia FMIPA IPB.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Tahapan penelitian
HEWAN PERCOBAAN KELINCI BERJUMLAH 24 EKOR
NORMAL
HIPERLIPIDEMIA
N=6
N=6
HIPERLIPIDEMIA + LOVASTATIN
HIPERLIPIDEMIA + EKSTRAK
N=6
N=6
PENGAMBILAN DARAH SELAMA 10 MINGGU
PEMBEDAHAN ORGAN HATI
ANALISIS LIPID PEROKSIDA HATI
ANALISIS STATISTIKA
15
Lampiran 2 Komposisi pakan standar Komposisi pakan standar kelinci (Rb-12) Komposisi Karbohidrat Lemak Protein Serat kasar Abu Air Kalori (kkal)
Pakan Standar (% AKG) 28,14 8,71 17,01 12,00 22,94 11,20 259,00
16
Lampiran 3 Bobot badan kelinci (kilogram) Kelompok Normal No Kelinci 12 13 18 22 53 55 Rataan Stdev
Adaptasi -4 0 3,10 3,20 2,50 2,50 3,80 3,80 3,50 3,40 2,60 2,90 2,70 2,90 3,03 3,12 0,53 0,45
4 2,90 2,60 4,00 3,50 3,00 3,10 3,18 0,50
Perlakuan 6 2,80 2,70 4,00 3,50 3,05 3,10 3,19 0,48
8 3,05 2,55 3,95 3,30 3,20 3,20 3,21 0,45
10 3,10 2,60 3,80 3,40 3,30 3,30 3,25 0,39
2 3,60 4,00 2,80 2,80 2,80 3,40 3,23 0,51
4 3,70 3,80 2,90 3,00 3,10 3,30 3,30 0,37
Perlakuan 6 3,60 3,90 3,00 2,90 3,10 3,15 3,28 0,39
8 3,50 3,85 2,90 3,00 3,10 3,25 3,27 0,35
10 3,50 3,90 2,90 Dibedah 2,80 Dibedah 3,28 0,52
2 3,00 3,40 3,10 3,60 2,80 3,30 2,90 3,16 0,29
4 3,00 3,00 3,10 3,60 2,70 3,00 2,80 3,03 0,29
Perlakuan 6 2,90 2,60 3,10 3,60 2,70 2,40 2,80 2,87 0,39
8 3,00 2,80 3,20 3,65 2,70 2,90 2,90 3,02 0,32
10 3,10 3,00 3,20 3,80 2,70 3,40 3,10 3,19 0,34
4 2,60 3,10 3,10 3,60 3,00 3,40 3,13 0,34
Perlakuan 6 2,65 2,90 3,10 3,50 3,10 3,40 3,11 0,31
8 2,50 2,80 3,00 3,30 3,15 3,60 3,06 0,39
10 2,60 3,00 3,30 3,20 3,30 3,60 3,17 0,34
2 3,00 2,70 4,00 3,40 2,90 3,00 3,17 0,47
Kelompok Hiperlipidemia No Kelinci 11 16 17 21A 24 52 Rataan Stdev
Adaptasi -4 0 3,40 3,60 3,70 3,00 2,80 3,80 2,30 2,60 2,50 2,60 2,90 3,20 2,93 3,13 0,53 0,50
Kelompok Lovastatin No Kelinci 6 7 8 20 21B 48 50 Rataan Stdev
Adaptasi -4 0 3,15 3,10 3,40 3,60 3,10 3,00 3,70 3,80 2,30 2,50 2,60 3,30 2,60 2,80 2,98 3,16 0,50 0,45
Kelompok Ramuan Jati Belanda Adaptasi No Kelinci -4 0 10 3,25 2,80 14 3,00 3,30 15 2,90 3,10 19 3,70 3,70 47 2,80 3,00 49 2,70 3,10 Rataan 3,06 3,17 Stdev 0,37 0,31
2 2,70 3,10 3,20 2,80 3,20 3,30 3,05 0,24
17
Lampiran 4 Hasil kurva standar TMP 25/11/2008 A1
A2
0.000 0.093 0.157 0.244 0.579 1.019
0.000 0.099 0.173 0.337 0.727 1.202
A rataan 0.000 0.096 0.165 0.291 0.653 1.111
kurva standar 1,400 1,200 1,000 absorbansi
Konsentrasi (µM) 0.00 0.75 1.50 3.00 6.00 9.00
0,800 y = 0,1316x - 0,0212 R2 = 0,9948
0,600 0,400 0,200 0,000 -0,2000,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
konsentrasi (µM)
29/11/2008 A1
A2
0.000 0.139 0.199 0.464 0.631 1.396
0.000 0.152 0.288 0.615 1.295 1.831
A rataan 0.000 0.146 0.244 0.540 0.963 1.614
kurva standar 2,000 absorbansi
Konsentrasi (µM) 0.00 0.75 1.50 3.00 6.00 9.00
1,500 1,000
y = 0.2072x - 0.0025 R2 = 0.9983
0,500 0,000 0,00
5,00
10,00
konsentrasi (µM)
4/12/2008 A1
A2
A rataan
0.00 0.75 1.50 3.00 6.00 9.00
0.000 0.097 0.176 0.367 0.943 1.378
0.000 0.090 0.171 0.363 0.990 1.399
0.000 0.094 0.174 0.365 0.967 1.389
kurva standar 1,600 y = 0,1594x - 0,0402
1,400
R2 = 0,9933
1,200 absorbansi
Konsentrasi (µM)
1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 -0,2000,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
konsentrasi
5/12/2008 A1
A2
0.000 0.094 0.243 0.532 0.936 1.641
0.000 0.092 0.233 0.526 0.933 1.640
A rataan 0.000 0.093 0.238 0.529 0.935 1.641
kurva standar 1,800 y = 0,1785x - 0,0299
1,600
R2 = 0,9912
1,400 1,200 absorbansi
Konsentrasi (µM) 0.00 0.75 1.50 3.00 6.00 9.00
1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 -0,2000,00
2,00
4,00
6,00
konsentrasi
8,00
10,00
18
Lampiran 5 Konsentrasi lipid peroksida hati kelinci dan Cara Perhitungan Hiperlipidemia
Normal No Kelinci
A
[LPO] (nmol/g)
55 12 18 53 13 7 rata‐rata
0.194 0.140 0.102 0.131 0.502 0.126 0.199
146.93 122.49 50.43 90.14 161.25 87.34 109.763
SD
0.15
41.48
Ramuan jati belanda
No Kelinci
A
[LPO] (nmol/g)
11 17 16 24 21a 52 rata‐rata SD
0.502 0.530 0.617 0.530 0.352 0.571 0.517 0.09
397.57 418.84 412.30 256.99 213.95 336.64 339.382 86.66
Lovastatin
No Kelinci
A
[LPO] (nmol/g)
15 14 47 10 49 19b
0.261 0.212 0.278 0.280 0.202 0.230
188.96 135.52 135.38 136.34 129.92 112.21
rata‐rata SD
0.244 0.03
139.722 25.79
No Kelinci
A
[LPO] (nmol/g)
6 8 20c 22 48 50 21b
0.256 0.330 0.331 0.281 0.308 0.323 0.270
124.76 160.47 202.18 174.17 189.30 227.85 131.52
rata‐rata
0.300
172.893
SD
0.03
37.26
Contoh perhitungan: Dari persamaan garis kurva standar y = 0.1316x – 0.0212 Misal absorbansi sampel 0.140, maka 0.140 = 0.1316x – 0.0212 X = 1.2249 Bobot hati ditimbang = 51.1506 gram Volume total homogenat hati = 511.5060 ml (10% b/v) Volume total homogenat hati yang digunakan 0.1 ml Konsentrasi lipid peroksida dalam nmol/g: = C(μM) x vol. tot hom hati (ml)/ vol. hom hati yang digunakan Bobot hati (g) = 1.2249 μM x 511.5060 ml/ 0.1 ml = 122.49 nmol/gram 51.1506 gram
19
Lampiran 6 Analisis statistik Bobot badan selama adaptasi Hasil Analisis Ragam The GLM Procedure Class Level Information Class
Levels
Values
KELOMPOKKELINCI
4
ekstrak hiperlip lovastin normal
NOKELINCI
7
1234567
ADAPTASI
2
12
Number of Observations Read
56
Number of Observations Used
56
Hasil Analisis Ragam The GLM Procedure Dependent Variable: RESPON Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
31
58567142.86
1889262.67
36.13
<.0001
Error
24
1255000.00
52291.67
Corrected Total
55
59822142.86
R-Square
Coeff Var
Root MSE
RESPON Mean
0.979021
8.337062
228.6737
2742.857
Source
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
KELOMPOKKELINCI
3
2003928.57
667976.19
12.77
<.0001
NOKELINCI
6
42584642.86
7097440.48
135.73
<.0001
18
13716071.43
762003.97
14.57
<.0001
ADAPTASI
1
231428.57
231428.57
4.43
0.0461
KELOMPOKKEL*ADAPTASI
3
31071.43
10357.14
0.20
0.8967
NOKELINCI(KELOMPOKK)
20
Lanjutan lampiran 6 Source
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
KELOMPOKKELINCI
3
2003928.57
667976.19
12.77
<.0001
NOKELINCI
6
42584642.86
7097440.48
135.73
<.0001
18
13716071.43
762003.97
14.57
<.0001
ADAPTASI
1
231428.57
231428.57
4.43
0.0461
KELOMPOKKEL*ADAPTASI
3
31071.43
10357.14
0.20
0.8967
NOKELINCI(KELOMPOKK)
Tests of Hypotheses Using the Type III MS for NOKELINCI(KELOMPOKK) as an Error Term Source KELOMPOKKELINCI
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
3
2003928.571
667976.190
0.88
0.4716
Bobot badan selama perlakuan The SAS System The GLM Procedure Class Level Information Class
Levels
Values
KELOMPOK KELINCI
4
ekstrak hiperlip lovastin normal
NOKELINCI
7
1234567
PERLAKUAN
4
1234
Number of Observations Read
112
Number of Observations Used
112
21
Lanjutan lampiran 6 The SAS System The GLM Procedure Dependent Variable: RESPON Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
39
117800178.6
3020517.4
158.19
<.0001
Error
72
1374821.4
19094.7
111
119175000.0
Corrected Total
R-Square
Coeff Var
Root MSE
RESPON Mean
0.988464
4.935133
138.1837
2800.000
Source
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
KELOMPOKKELINCI
3
2140178.57
713392.86
37.36
<.0001
NOKELINCI
6
82792187.50
13798697.92
722.64
<.0001
18
32540133.93
1807785.22
94.67
<.0001
PERLAKUAN
3
40535.71
13511.90
0.71
0.5506
KELOMPOKKE*PERLAKUAN
9
287142.86
31904.76
1.67
0.1120
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
KELOMPOKKELINCI
3
2140178.57
713392.86
37.36
<.0001
NOKELINCI
6
82792187.50
13798697.92
722.64
<.0001
18
32540133.93
1807785.22
94.67
<.0001
PERLAKUAN
3
40535.71
13511.90
0.71
0.5506
KELOMPOKKE*PERLAKUAN
9
287142.86
31904.76
1.67
0.1120
NOKELINCI(KELOMPOKK)
Source
NOKELINCI(KELOMPOKK)
22
Lanjutan lampiran 6 Tests of Hypotheses Using the Type III MS for NOKELINCI(KELOMPOKK) as an Error Term Source
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
3
2140178.571
713392.857
0.39
0.7584
KELOMPOKKELINCI
Lipid peroksida hati kelinci Hasil analisis Ragam The GLM Procedure Class Level Information Class
Levels
Values
treat
4
ekstrak hiperlip lovastat normal
Number of Observations Read
28
Number of Observations Used
28
Hasil analisis Ragam The GLM Procedure Dependent Variable: kons LPO(nmol/gr) Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
3
221008.2925
73669.4308
30.59
<.0001
Error
24
57805.1102
2408.5463
Corrected Total
27
278813.4027
R-Square
Coeff Var
Root MSE
kons Mean
0.792675
25.77031
49.07694
190.4399
Lanjutan lampiran 6
23
Source treat
Source treat
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
Pr > F
3
221008.2925
73669.4308
30.59
<.0001
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr > F
3
221008.2925
73669.4308
30.59
<.0001
Hasil analisis Ragam The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for kons Alpha
0.05
Error Degrees of Freedom Error Mean Square
Number of Means Critical Range
24 2408.546
2
3
4
54.14
56.87
58.61
Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping
Mean
N
Treat
A
339.38
7
hiperlip
B
172.89
7
lovastat
139.72
7
ekstrak
109.76
7
normal
B C
B
C C
