PROFIL LIPID PEROKSIDA TIKUS Sprague Dawley HIPERGLIKEMIA YANG DIBERI EKSTRAK DAUN WUNGU (Graptophyllum pictum L. Griff)
EMMY KARDINASARI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Profil Lipid Peroksida Tikus Sprague Dawley Hiperglikemia yang diberi Ekstrak Daun Wungu (Graptophyllum pictum L. Griff) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juli 2014 Emmy Kardinasari NIM G84100014
ABSTRAK EMMY KARDINASARI. Profil Lipid Peroksida Tikus Sprague Dawley Hiperglikemia yang diberi Ekstrak Daun Wungu (Graptophyllum pictum L. Griff). Dibimbing oleh WARAS NURCHOLIS dan I MADE ARTIKA. Ekstrak etanol daun wungu terbukti memiliki aktivitas antioksidan menurut uji in vitro. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan partisinya dengan cara in vivo melalui analisis konsentrasi lipid peroksida hati pada tikus galur Sprague Dawley hiperglikemia. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi daun wungu adalah etanol, kemudian dipartisi bertingkat dengan dietil eter, etil asetat, dan n-butanol. Selanjutnya dilakukan uji analisis kualitatif senyawa fitokimia. Analisis lipid peroksida dilakukan dengan mengambil hati sebanyak empat buah dari setiap kelompok, ada tujuh kelompok perlakuan, yakni kelompok normal (K-1), kontrol glibenklamid (K-2), kontrol hiperglikemia (K-3), etanol (K-4), dietil eter (K-5), etil asetat (K-6), dan n-butanol (K-7). Ekstrak etil asetat diketahui mengandung senyawa bioaktif saponin, steroid, dan tanin dengan rendemen ekstrak 0,23%. Ekstrak partisi etil asetat daun wungu dapat menurunkan kadar lipid peroksida hati sebesar 57,19% dan nilai tersebut bebeda nyata (p<0,05) dengan kelompok perlakuan lainnya. Kata kunci: lipid peroksida, daun ungu, antioksidan, hiperglikemia
ABSTRACT EMMY KARDINASARI. Lipid Peroxide Profile of the Sprague Dawley Rats Treated with the Wungu Leaf (Graptophyllum pictum L. Griff) Extract. Supervised by WARAS NURCHOLIS and I MADE ARTIKA. Ethanol extract of the wungu leaf has an antioxidant according to an in vitro test. The purpose of this study was to determine the antioxidant activity of the ethanol extract and its partitions in an in vivo study by analyzing the lipid peroxide concentrations of liver in the hyperglycemic Sprague Dawley rats. Solvents used for the multilevel partition of the etanol extract were diethyl ether, ethyl acetate, and n-butanol. Further step was a phytochemical compounds qualitative test for the extracts. Lipid peroxide analysis was done by taking four livers from each group, there were seven treatment groups; normal group (K-1), glybenclamide control (K-2), hyperglycemia control (K-3), ethanol (K-4), diethyl ether (K-5), ethyl acetate (K-6), and n-butanol (K-7). The ethyl acetate extract contains bioactive compounds such as saponins, steroids, and tannins with a yield of 0,23%. The ethyl acetate extract can reduce the lipid peroxide of the liver by 57,19% and this is significant (p <0,05) with other groups. Keywords : lipid peroxide, wungu leaf, antioxidant, hyperglyemic
PROFIL LIPID PEROKSIDA TIKUS Sprague Dawley HIPERGLIKEMIA YANG DIBERI EKSTRAK DAUN WUNGU (Graptophyllum pictum L. Griff)
EMMY KARDINASARI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
iv
Judul Skripsi : Profil Lipid Peroksida Tikus Sprague Dawley Hiperglikemia yang diberi Ekstrak Daun Wungu (Graptophyllum pictum L. Griff) Nama : Emmy Kardinasari NIM : G84100014
Disetujui oleh
Waras Nurcholis, SSi, MSi Pembimbing I
Dr Ir I Made Artika, MAppSc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
ii
PRAKATA Bismillahirrahmanirrahim Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas semua karunia dan ridha-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini berlangsung sejak bulan Februari 2014 dengan judul Profil Lipid Peroksida Tikus Sprague Dawley Hiperglikemia yang diberi Ekstrak Daun Wungu (Graptophyllum pictum L. Griff). Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Waras Nurcholis, SSi, MSi dan Bapak Dr Ir I Made Artika, MAppSc selaku pembimbing yang telah banyak memberikan arahan, perhatian dan saran. Penghargaan juga penulis sampaikan kepada Kakak Hayatul Rahmi dan Sylvia yang telah bersama-sama melaksanakan penelitian dan membantu proses penelitian ini. Ibu Mary Annie beserta seluruh staf Laboratorium Biokimia yang telah membantu selama penelitian berlangsung. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga untuk segala doa, kasih sayang dan dukungan. Tidak lupa juga untuk teman-teman Biokimia 47 dan seluruh anggota Kementerian Pendidikan dan Keilmuan BEM KM IPB 2013 yang telah menjadi penyemangat dan pemberi inspirasi bagi penulis. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2014 Emmy Kardinasari
DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN METODE Bahan dan alat Metode Penelitian Preparasi Sampel Ekstraksi Daun Wungu (Rauter et al. 2009) Uji Fitokimia (Harborne 1987) Rancangan Percobaan Pengukuran Konsentrasi Lipid Peroksida (Yagi 1994) Analisis Statistik HASIL Rendemen Ekstrak Etanol dan Fraksinya Uji Fitokimia Fraksi Esktrak Etanol Bobot Hati Tikus Lipid Peroksida Hati Tikus PEMBAHASAN Rendemen Ekstrak Senyawa Fitokimia Daun Wungu Bobot Hati Tikus Lipid Peroksida Hati Tikus SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
iv iv iv 1 2 2 2 2 3 3 3 4 5 5 5 6 6 7 8 8 8 9 9 13 13 13 13 16
iv
DAFTAR GAMBAR 1 Rendemen hasil ekstraksi etanol dan fraksi partisi daun wungu 2 Analisis kadar lipid peroksida 3 Skema terjadinya diabetes dan kaitannya dengan stres oksidatif 4 Skema reaksi TBA-MDA
5 7 10 11
DAFTAR TABEL 1 Hasil uji fitokimia ekstrak partisi daun wungu 2 Hasil pengukuran bobot hati tikus
6 6
DAFTAR LAMPIRAN 1 Diagram alir penelitian 2 Perhitungan rendemen ekstrak 3 Perhitungan dosis 4 Kurva standar TMP pengukuran kadar lipid peroksida 5 Data pengukuran absorbansi lipid peroksida 6 Data hasil perhitungan konsentrasi lipid peroksida hati 7 Data bobot hati tikus 8 Analisis data bobot hati (RAL) ANOVA 9 Analisis data lipid peroksida (RAL) ANOVA 10 Dokumentasi penelitian
17 18 18 19 20 21 22 23 24 25
1
PENDAHULUAN Adanya defisiensi insulin pada penderita penyakit diabetes melitus menyebabkan keadaan hiperglikemia. Keadaan ini dapat memicu gangguan pada sistem metabolisme dan kerja organ tubuh (Kamal 2004). Beberapa pemicu penyakit ini adalah adanya keterlibatan radikal bebas. Berdasarkan penelitian Nugroho (2006), diketahui bahwa untuk membuat model hewan coba diabetes dapat dilakukan dengan menyuntikkan komponen diabetogenik yang pada dasarnya merupakan komponen radikal bebas. Potensi keterlibatan radikal bebas dalam memicu munculnya penyakit degeneratif didukung oleh penelitian Milaneschi et al. (2013) terkait dengan kerusakan sel dengan adanya depresi pada manula. Bahaya dari keterlibatan radikal yang memicu stres oksidatif juga memberikan dampak lain, yaitu adanya depresi pada penderitanya. Keadaan hiperglikemia ini terjadi karena sel tidak dapat menggunakan glukosa sebagai sumber energi, akibatnya glukosa tetap berada di dalam darah dan menyebabkan tingginya kadar glukosa darah (hiperglikemia). Sel yang tidak dapat menggunakan glukosa mencari sumber energi lain untuk memenuhi kebutuhan aktivitas metabolismenya. Salah satunya adalah dengan melakukan mobilisasi asam lemak dari jaringan adiposa (Christian 2013). Molekul asam lemak yang dimobilisasi berisiko mengalami penyerangan oleh molekul radikal bebas yang ada di dalam tubuh seperti radikal superoksida (O2•) dan radikal hidroksil (OH•). Peroksidasi lipid adalah proses pembentukan molekul radikal bebas dari molekul lipid yang terdapat di dalam tubuh. Molekul yang dihasilkan dari proses peroksidasi ini dikenal sebagai lipid peroksida. Terbentuknya lipid peroksida terjadi akibat adanya radikal bebas atau atom dengan satu atau lebih elektron bebas di dalam tubuh yang mengikat molekul asam lemak tidak jenuh atau Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA) (Cutler dan Henry 2003). Poly Unsaturated Fatty Acid mengalami penyerangan akibat adanya ikatan rangkap dalam rantai asam lemaknya oleh molekul radikal bebas yang selalu berusaha untuk menstabilkan dirinya. Titik ikatan rangkap pada PUFA memiki energi ikatan yang lebih kecil sehingga mudah diserang oleh molekul radikal bebas (Rubin et al. 2011). Molekul lipid peroksida yang terbentuk dari sebuah reaksi peroksidasi akan mendorong pembentukan molekul lipid peroksida lainnya secara berantai. Proses mobilisasi ini meningkatkan risiko penyerangan PUFA oleh molekul radikal bebas (Yagi 2012). Menurut Suganda (2002), sekitar 80% masyarakat di dunia saat ini telah memanfaatkan obat herbal. Pengobatan ini dinilai lebih aman, ramah lingkungan, dan memiliki efek samping yang lebih kecil dibandingkan dengan penggunaan obat sintetik. Salah satu tumbuhan yang memiliki potensi untuk dijadikan sebagai obat herbal adalah daun wungu (Graptophyllum pictum L. Griff). Daun ini dikenal juga sebagai daun ungu, karotong, atau daun temen-temen. Tanaman wungu diklasifikasikan dalam kingdom Plantae, divisi Spermatophyta, kelas Dicotyledone, ordo Tubiflorae, famili Acanthaceae, dan genus Graptophyllum dengan spesies Graptophyllum pictum. Tumbuhan ini memiliki sinonim, yaitu Graptophyllum hortense. Nees (USDA 2010). Daun wungu diketahui memiliki beberapa khasiat yang dibuktikan mellaui beberapa penelitian. Beberapa diantaranya adalah berkhasiat sebagai antidiabetes, dibuktikan oleh Theresia (2013) melalui penelitiannya secara in vivo. Menurut Sylvia (2014), fraksi etil asetat daun wungu memiliki efek antioksidan setelah dilakukan uji
2
secara in vitro dengan menggunakan metode DPPH. Ekstrak etanol daun wungu diketahui memiliki beberapa kandungan senyawa bioaktif seperti flavonoid, alkaloid, tanin, dan steroid (Irwan 2011). Selain itu, penggunaan daun wungu diketahui memiliki risiko toksisitas yang rendah karena dibutuhkan dosis sebesar 100 mg/kg hingga 1000 mg/kg untuk menimbulkan kerusakan terhadap organ tubuh seperti ginjal, hati, dan jantung (Falachi 2012). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi antioksidan dari ekstrak etanol dan partisi daun wungu pada tikus galur Sprague Dawley hiperglikemia yang diinduksi dengan aloksan. Penelitian ini bermanfaat untuk memberikan informasi mengenai khasiat antioksidan dari daun wungu dan menginisiasi lebih banyak lagi eksplorasi penggunaan tanaman herbal sebagai solusi penanganan berbagai penyakit. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari hingga bulan Mei 2014 di Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia, Gedung Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian pemanfaatan herbal daun wungu (Graptophyllum pictum L. Griff) sebagai antidiabetes dan antioksidan alami.
METODE Bahan dan alat Alat-alat yang digunakan adalah oven, neraca analitik, pipet volumetrik, gelas piala, gelas Erlenmeyer, shaker, rotari evaporator, corong pemisah, labu takar, sudip, corong plastik, sentrifuse, tabung Eppendorf, kandang hewan coba, botol minum, wadah pakan, injektor, gunting bedah, pisau bedah, glukometer (gluko Dr), spektrofotometer UV-Vis, pipet mikro, tip, pH meter, homogenizer elektrik, tabung reaksi, rak tabung, pipet tetes, batang pengaduk, dan bulb. Bahan-bahan yang diperlukan adalah serbuk simplisia daun ungu yang didapat dari Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, hati tikus galur Sprague Dawley, kertas saring, etanol 96%, kapas, tissue, es batu, akuades, dietil eter, etil asetat, nbutanol, dan aloksan. Bahan-bahan untuk uji lipid peroksida hati adalah asam tiobarbiturat (TBA) 1,0% dalam pelarut asam asetat 50%, n-butanol:piridin (15:1 v/v), dan 1,1,3,3-tetrametoksi propana (TMP) 6 M, digunakan untuk pembuatan kurva standar. Bahan-bahan preparasi homogenat hati adalah: KCL dingin 1,15%, sodium dodesil sulfat (SDS) 8,1%, NaOH 1 M, asam asetat 20%, eter, dan akuades. Pengujian fotokimia membutuhkan HCl pekat, H2SO4 pekat, reagen Dragendorff, reagen Meyer, reagen Wagner, kloroform, metanol, logam Mg, FeCl3, asam asetat anhidrat, dan akuades. Metode Penelitian Preparasi Sampel Daun wungu diperoleh dari kebun tanaman obat dari Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka. Daun wungu yang digunakan berusia 3-4 bulan. Sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 50 oC selama 4-5 hari untuk mendapatkan kadar air kurang dari 10%. Simplisia yang sudah kering dihaluskan hingga ukuran 100 mesh dalam bentuk serbuk.
3
Ekstraksi Daun Wungu (Rauter et al. 2009) Simplisia sampel diekstraksi dengan metode maserasi. Maserasi dilakukan dengan merendam sampel dalam etanol 96% menurut perbandingan 1:10 selama 24 jam, selama enam jam pertama diletakkan di dalam shaker selama lima menit dengan interval satu jam. Maserat yang dihasilkan kemudian disaring dan dipekatkan dengan rotari evaporator pada suhu 50 oC. Ekstrak yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam akuades dan diekstraksi partisi dengan perbandingan 1:10:10. Ekstraksi partisi dilakukan dengan 3 pelarut, pelarut pertama adalah dietil eter (2 x 50 mL), etil asetat (2 x 50 mL), dan n-butanol (2 x 50 mL). Kemudian semua sampel dipekatkan dengan diuapkan di dalam oven. Ketiga ekstrak ini kemudian disimpan dan diuji kualitatif senyawa fitokimianya. Ekstrak yang disimpan kemudian dilarutkan dalam tween 80 dengan konsentrasi 5% dengan dosis 50 mg/kg bobot badan (BB). Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji steroid dan triterpen. Hasil partisi ekstrak etanol daun wungu dilarutkan dalam 0,5 mL kloroform dan diuapkan dalam oven bersuhu 50 oC. Residu dilarutkan dengan eter dan ditambah dengan 0,5 mL asam asetat anhidrat. Selanjutnya campuran ini ditetesi dengan 4 sampai 5 tetes H2SO4 pekat melalui dinding tabung tersebut. Jika hasil yang diperoleh berupa cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpen, sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid. Uji alkaloid. Hasil partisi ekstrak etanol daun wungu diuapkan sampai kering, kemudian residu ditambah 1,5-2% HCl dan larutan dibagi dalam empat tabung. Tabung 1 larutan ditambah 0,5 mL larutan asam encer sebagai pembanding, tabung 2 ditambahkan dengan 2 tetes reagen Dragendorff, tabung 3 ditambahkan dengan 2 tetes reagen Mayer, dan tabung 4 ditambahkan dengan 2 tetes reagen Wagner. Jika tabung 2 terbentuk endapan Jingga dan pada tabung 3 terbentuk endapan kekuningan, atau pada tabung 4 terbentuk endapan berwarna kecoklatan maka di dalam ekstrak hasil partisi terkandung alkaloid. Uji flavonoid. Sebanyak 0,1 gram hasil partisi dilarutkan dalam metanol panas 50% lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Logam Mg ditambahkan secara kualitatif ke dalam ekstrak dan ditetesi dengan HCl pekat sebanyak 4 tetes. Terbentuknya warna Jingga atau merah menunjukkan adanya kandungan flavonoid di dalam ekstrak. Uji tanin. Hasil partisi ekstrak etanol yang telah diuapkan diambil sebanyak 0,1 gram dan dilarutkan dalam 2 mL akuades. Campuran ekstrak dengan akuades kemudian ditambahkan dengan 2 tetes FeCl3. Munculnya warna biru kehitaman menunjukkan adanya kandungan tanin galat, sedangkan warna hijau kehitaman menunjukkan adanya kandungan tanin katekol. Uji saponin. Hasil partisi ekstrak etanol daun ungu yang telah diuapkan dilarutkan dengan akuades dengan perbandingan 1:1. Campuran ini kemudian dikocok selama lima menit sampai terlihat busa. Hasil partisi dengan busa yang dapat bertahan selama 30 menit menunjukkan ekstrak tersebut mengandung saponin. Rancangan Percobaan Percobaan dilakukan selama 28 hari dengan 14 hari masa adaptasi dan 14 hari masa perlakuan. Selama masa perlakuan tikus dibagi menjadi 7 kelompok yaitu
4
kelompok normal (K-1) yang hanya dicekok tween 80, kontrol negatif (K-2) yang diinduksi dengan aloksan 150 mg/kg bobot badan (BB) dan dicekok dengan menggunakan tween 80 dengan konsentrasi 5%, kelompok kontrol positif (K-3) yang diinduksi dengan aloksan 150 mg/kg BB dan diberikan obat yang biasa digunakan di pasaran yaitu glibenklamid dengan dosis 0,25 mg/kg bb. Kelompok perlakuan (K-4, K-5, K-6, K-7) yang diinduksi dengan aloksan dengan dosis yang sama dan diberikan ekstrak daun wungu dengan dosis 50 mg/kg bb. Keempat kelompok perlakuan diberikan ekstrak dengan pelarut asing-masing adalah, K-4 etanol, K-5 dietil eter, K6 etil asetat, dan K-7 n-butanol. Setiap kelompok terdiri dari empat ekor tikus. Nekropsi dilakukan pada hari terakhir perlakuan yang bertujuan mengambil hati dari hewan coba setelah dipastikan pada awal perlakuan bahwa hewan coba sudah dalam keadaan hiperglikemia. Jumlah hati dari setiap kelompok yang diambil adalah minimal empat buah sesuai dengan persamaan berikut (Hanafiah 2005): (t-1)(r-1)≥15 Keterangan: t= jumlah ulangan r=jumlah perlakuan Hewan coba yang digunakan telah berada dalam keadaan hiperglikemik. Kondisi hiperglikemik tikus ketika glukosa darah berada di atas angka 110 mg/dL (Montgomery et al. 1993). Setiap kelompok percobaan dalam penelitian ini memiliki kadar glukosa darah sebagai berikut; kelompok normal (K-1)) sebesar 81,5 mg/dL, kelompok kontrol positif (K-2) sebesar 208,25 mg/dL, kelompok kontrol negatif (K3) adalah 141,25 mg/dL, kelompok perlakuan dengan ekstrak etanol (K-4) sebesar 129,75 mg/dL, kelompok perlakuan ekstrak dietil eter (K-5) 128 mg/dL, kelompok perlakuan ekstrak etil asetat (K-6) 127 mg/dL, dan kelompok terakhir adalah kelompok perlakuan dengan ekstrak n-butanol (K-7) sebesar 135 mg/dL (Rahmi 2014). Pengukuran Konsentrasi Lipid Peroksida (Yagi 1994) Pembuatan kurva standar. Kurva standar dibuat dengan menggunakan stok TMP 6 M. Sebanyak 1 µL stok TMP 6 M diambil dan diencerkan menjadi 100 mL stok dengan konsentrasi 60 µM. Stok 60 µM tersebut diencerkan kembali menjadi 0,3; 0,75; 0,9; 1,5; 1,8; 3,0; dan 6,0 µM. Larutan yang telah diencerkan tersebut kemudian diambil sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke tabung reaksi. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan sebanyak 1 mL TBA 1,0% dalam pelarut asam asetat 50%. Selanjutnya campuran tersebut dipanaskan dalam penangas air bersuhu 95 oC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Setelah dipanaskan, campuran akan memiliki warna merah muda, dengan intensitas berbanding lurus dengan konsentrasi. Setelah itu, ke dalam tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL akuades dan 5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), dicampur dengan vorteks, kemudian disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Fase yang dibentuk ada 2 dan fase yang diambil adalah fase berwarna merah muda pada bagian atas yang kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada λ=532. Analisis lipid peroksida hati. Sebanyak 1-2 g hati dibilas dengan KCl dingin 1,15%, dan dikeringkan dengan kertas saring. Homogenat hati dibuat dengan konsentrasi 10% b/v dalam KCl 1,15%. Sebanyak 0,1 mL homogenat hati diambil dan diletakkan ke dalam tabung reaksi secara duplo. Selanjutnya ke dalam setiap
5
tabung reaksi ditambahkan 0,2 mL SDS 8,1% dan 1,5 mL asam asetat 20%, serta diatur menjadi pH 3,5 dengan menggunakan NaOH 1 M. Selanjutnya ke dalam tabung reaksi ditambahkan akuades dan ditambahkan pula sebanyak 1,5 mL TBA 1,0% dalam pelarut asam asetat 50%. Tabung berisi campuran tersebut kemudian dipanaskan pada penangas air bersuhu 95 oC selama 60 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Setelah itu ke dalam tabung reaksi ditambahkan akuades 1.0 mL dan 5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), dicampur dengan vorteks, selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Lapisan berwarna merah muda pada bagian atas adalah lapisan organik yang diambil untuk diukur serapannya dengan spektrofotometer pada λ=532. Analisis Statistik Rancangan Percobaan (Mattjik 2002). Rancangan percobaan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan tujuh kelompok perlakuan dan empat kali ulangan. Analisis data menggunakan ANOVA dengan model rancangan sebagai berikut: Yij = μ + αi + ji Keterangan: Yij = Pengaruh rataan umum αi = Pengaruh perlakuan ke-i εij = Pengaruh galat ke-i dan ulangan ke-j
HASIL Rendemen Ekstrak Etanol dan Fraksinya Sebanyak 500 gram simplisia daun wungu yang didapatkan dari Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB diekstraksi maserasi dengan pelarut etanol. Ekstrak etanol ini kemudian dipartisi secara bertingkat dengan tiga pelarut secara berurutan dari dietil eter, etil asetat, dan n-butanol. Hasil rendemen tertinggi didapatkan dari ekstrak etanol sebesar 4,16%. Ekstraksi partisi yang dilakukan menurunkan nilai rendemen ekstrak di setiap tahap (Gambar 1). 4,5
Rendemen ekstrak (%)
4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Etanol
Dietil eter
Etil asetat
n-butanol
Pelarut
Gambar 1 Rendemen ekstrak etanol dan fraksi partisi daun wungu
6
Uji Fitokimia Fraksi Esktrak Etanol Kandungan utama metabolit sekunder ekstrak etanol daun wungu diketahui melalui uji fitokimia. Pengujian kandungan fitokimia secara kualitatif untuk hasil partisi ekstrak etanol daun wungu belum pernah dilakukan sebelumnya. Berdasarkan lima uji fitokimia yang dilakukan yaitu uji alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, juga steroid dan triterpen diketahui bahwa pada proses ekstraksi partisi terjadi kehilangan beberapa kandungan senyawa bioaktif dari ekstrak daun wungu. Ekstraksi partisi menggunakan dietil eter membuat ekstrak daun wungu kehilangan kandungan flavonoidnya. Sementara itu fraksi dietil eter yang dipartisi dengan pelarut etil asetat kehilangan kandungan flavonoid dan alkaloid. Partisi terakhir dengan menggunakan pelarut n-butanol menyebabkan fraksi ekstrak daun wungu kehilangan kandungan flavonoid, alkaloid, dan tanin. Secara lengkap hasil uji fitokimia ditunjukkan oleh Tabel 1. Tabel 1 Hasil uji fitokimia ekstrak partisi daun wungu Uji
Dietil eter
Etil asetat
n-butanol
Saponin
(+++)
(+++)
(++)
Alkaloid
(+)
(-)
(-)
Tanin
(++)
(++)
(-)
Flavonoid
(-)
(-)
(-)
Steroid & Triterpen
(+)
(+)
(+)
Keterangan: (+++) hasil uji kualitatif komponen bioaktif tinggi, (++) hasil uji kualitatif sedang, (+) hasil uji kualitatif kecil, (-) tidak terdapat komponen bioaktif Bobot Hati Tikus Bagian dari hewan coba yang digunakan untuk mengukur kadar lipid peroksida pada keadaan hiperglikemia adalah bagian hati. Organ hati diambil dengan cara melakukan nekropsi dengan sebelumnya memberikan senyawa anestesi kepada hewan coba, yakni menggunakan eter. Kelompok perlakuan dengan bobot rata-rata hati yang paling ringan adalah kelompok perlakuan ekstrak etil asetat sebesar 7,47 gram, sedangkan kelompok normal memiliki bobot terbesar yakni 9,25 gram. Berdasarkan hasil uji statistik rancangan acak lengkap ANOVA diketahui bahwa perlakuan pemberian ekstrak daun wungu tidak memberikan pengaruh yang signifikan (p<0,05) terhadap bobot hati tikus dari ketujuh kelompok percobaan. Tabel 2 Hasil pengukuran bobot hati tikus
Kelompok
Bobot hati rata-rata (gram)
Normal
9,25a ± 0,65
Kontrol (+)
7,50a ± 1,61
Kontrol (-)
8,37a ± 1,11
Ekstrak etanol
7,77a ± 0,44
Ekstrak dietil eter
8,02a ± 0,92
Ekstrak etil asetat
7,47a ± 0,46
Ekstrak n-butanol
7,53a ± 0,55
n = 4; jumlah hati yang diambil dari setiap kelompok
7
Kosentrasi Lipid peroksida (nmol/gram)
Lipid Peroksida Hati Tikus Potensi antioksidan suatu ekstrak secara in vivo dapat dilakukan dengan mengambil organ hewan coba untuk dianalisis kadar lipid peroksidanya. Setelah dilakukan pengukuran kadar gula darah dan perlakuan ekstrak terhadap tikus yang berada dalam keadaan hiperglikemia dilakukan analisis lipid peroksida hati. Sebanyak 4 sampel hati dari setiap kelompok dianalisis dengan menggunakan metode reaksi TBA dengan MDA (molekul hasil perombakan lipid peroksida). Berdasarkan analisis diketahui bahwa kelompok perlakuan dengan fraksi etil asetat (K-6) memiliki konsentrasi lipid peroksida yang paling rendah yaitu sebesar 59,86 nmol/gram. Sementara konsentrasi tertinggi adalah kelompok perlakuan dengan fraksi n-butanol yakni sebesar 338,57 nmol/g (Gambar 2). Analisis statistik dengan menggunakan ANOVA menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun wungu dengan dosis 50 mg/kg BB memberikan dampak yang signifikan (p<0,05) terhadap kadar lipid peroksida hati tikus. Hasil analisis lanjut Duncan menunjukkan kelompok perlakuan ekstrak etil asetat tidak berbeda nyata dengan kelompok normal dan kontrol positif. Namun berbeda nyata dengan kelompok lainnya. 400,00 338,57d ±14,54
350,00 300,00 179,59c ±62,08
250,00 200,00 150,00
156,04bc ±23,29 113,71ab ±39,50 139,85bc ±22,80 115,10ab ±13,92
100,00
59,86a ±6,86
50,00 0,00 Normal
K(+)
K(-)
Ekstrak etanol
Ekstrak Ekstrak etil Ekstrak ndietil eter asetat butanol
Kelompok Perlakuan
Gambar 2 Analisis kadar lipid peroksida hati
8
PEMBAHASAN Rendemen Ekstrak Kemampuan suatu pelarut dalam menarik komponen metabolit sekunder yang terdapat di dalam sampel ditunjukkan dengan besar kecilnya angka rendemen yang dihasilkan. Proses ekstraksi dengan maserasi adalah yang paling banyak digunakan dalam ekstraksi tanaman herbal, disusul dengan metode distilasi dan perkolasi. Metabolit sekunder ada yang bersifat polar dan nonpolar sehingga pemilihan pelarut harus dilakukan dengan mempertimbangkan faktor tersebut. Selain itu juga faktor kemudahan mendapatkan dan penangan pelarut juga perlu diperhatikan, begitu juga dengan keamanan pelarut jika digunakan (Perwita 2011). Penelitian ini mengunakan metode ekstraksi maserasi yang dilanjutkan dengan partisi bertingkat. Pelarut yang digunakan adalah etanol 96%, dengan pelarut ekstraksi partisi tediri dari dietil eter, etil asetat, dan n-butanol. Hasil partisi ekstrak etanol didapatkan rendemen ekstrak sebesar 4,16% dengan bobot yang didapatkan sebesar 20,78 gram dari 500 gram sampel simplisia. Ekstrak berbentuk pasta ini kemudian diekstraksi dengan metode ekstraksi partisi bertingkat. Prinsip metode ini adalah mengekstraksi sampel dalam dua macam pelarut atau ekstraksi cair-cair dengan tingkat kepolaran pelarut yang berbeda, sehingga memungkinkan pelarut untuk menarik komponen yang sesuai dengan kepolarannya (Rauter et al. 2009). Ketiga pelarut yang digunakan memiliki tingkat kepolaran yang berbeda-beda dengan urutan kepolaran paling tinggi dimulai dari n-butanol, etanol, etil asetat, dan yang terakhir adalah dietil eter. Hasil partisi dinyatakan dalam nilai persen perbandingan hasil pasta setelah penguapan pelarut dengan pasta ekstrak dari hasil ekstraksi sebelumnya. Rendemen fraksi dietil eter diketahui sebesar 0,40%, fraksi etil asetat sebesar 0,23%, dan fraksi n-butanol sebesar 0,14%. Persentase rendemen n-butanol paling rendah dibandingkan yang lainnya karena semakin lanjut partisi dilakukan rendemen ekstrak yang didapatkan semakin kecil. Senyawa Fitokimia Daun Wungu Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi dietil eter daun wungu mengandung saponin, alkaloid, tanin, dan steroid. Irwan (2011) melaporkan bahwa senyawa bioaktif berupa flavonoid, steroid, tanin, dan steroid terdapat di dalam ekstrak etanol daun wungu. Dietil eter tidak dapat menarik komponen flavonoid dari pasta ekstrak etanol, hal ini berkaitan dengan tingkat kepolaran dietil eter yang lebih rendah dibadingkan etanol 96% (Rauter et al. 2009). Pelarut etil asetat dapat menarik komponen saponin, tanin, dan steroid. Hal ini ditandai dengan ketahanan dan jumlah busa yang dihasilkan lebih lama dan lebih banyak menunjukkan ada saponin yang tinggi (Harborne 1987). Warna biru kehitaman yang menunjukkan keberadaan tanin pada fraksi etil asetat. Berdasarkan penelitian Irda (2012), diketahui bahwa ekstrak etil asetat dari daun Psidium guajava L. mengandung 1,16% tanin setelah difraksinasi dan dianalisis dengan kromatografi cair vakum, dan merupakan pelarut terbaik untuk menarik tanin. Hasil penelitian tersebut dapat mendukung bahwa etil asetat merupakan pelarut yang efektif untuk menarik komponen tanin dari ekstrak daun wungu. Tanin termasuk ke dalam golongan polifenol yang sudah sejak lama diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Pelarut n-butanol sebagai pelarut dengan tingkat kepolaran yang paling tinggi berhasil menarik saponin dan steroid. Sedikitnya
9
senyawa fitokimia dalam ekstrak n-butanol disebabkan oleh komponen lainnya telah terekstraksi oleh pelarut sebelumnya dalam partisi bertingkat. Bobot Hati Tikus Penurunan bobot badan merupakan salah satu ciri keadaan hiperglikemia karena tikus dalam keadaan ini akan mengalami peningkatan glikosilasi. Hal ini menyebabkan adanya kelainan biokimia dan morfologi karena adanya perubahan struktur protein tubuh dan mendorong adanya komplikasi diabetes (Shokeen 2008). Selain penurunan bobot badan, adanya penurunan bobot hati juga menunjukkan adanya gangguan hiperglikemik, karena dalam keadaan hiperglikemia terjadi peningkatan oksidasi asam lemak di dalam hati (Carmona et al. 2007). Pengukuran bobot hati menunjukkan bahwa kelompok normal memiliki bobot hati paling tinggi yaitu 9,25 gram, hal ini menunjukkan bahwa pada tikus normal tidak banyak terjadi oksidasi asam lemak. Bobot terendah merupakan kelompok perlakuan ekstrak etil asetat yaitu sebesar 7,47 gram. Hal ini menandakan adanya oksidasi asam lemak yang cukup tinggi (Carmona et al. 2007). Kelompok perlakuan ekstrak etil asetat memiliki konsentrasi lipid peroksida terkecil. Nilai bobot hati yang didapatkan tidak sesuai dengan teori yang menyatakan semakin kecil kandung radikal bebas maka semakin besar bobot hati. Namun, menurut Widowati (2008), ada beberapa penyebab lain yang dapat memicu keadaan ini yakni adanya aktivitas antioksidan fraksi etil asetat yang mampu mengurangi pembentukan komponen radikal bebas dalam sel hati sehingga tidak terjadi stres oksidatif yang dapat memicu akumulasi lemak. Analisis statistik menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun wungu tidak memberikan pengaruh yang signifikan (p<0,05) terhadap besarnya bobot hati tikus. Lipid Peroksida Hati Tikus Diabetes melitus secara metabolisme menyebabkan adanya kesulitan dalam memanfaatkan glukosa sehingga penggunaan sumber energi lain seperti asam lemak atau asam amino tidak dapat dihindari. Carmona et al. (2007) melaporkan bahwa pada tikus percobaan hiperglikemia ditemukan terjadinya kehilangan komponen jaringan lemak yang cukup besar dan juga terjadinya penurunan bobot hati. Menurut Widyastuti (2000), keadaan hiperglikemia berpotensi menyebabkan kerusakan endotel yang menyebabkan peningkatan radikal superoksida. Radikal ini mampu memicu pembentukan radikal lainnya dan meningkatkan peroksidasi lipid. Induksi komponen diabetogenik aloksan bertujuan untuk memberikan dampak destruktif terhadap sel β pankreas sehingga didapatkan kondisi hiperglikemia dari hewan coba. Aloksan pada dasarnya merupakan hasil oksidasi dari asam urat oleh asam nitrat. Aloksan bersifat hidrofilik dan tidak stabil sehingga sangat reaktif dan cenderung menyebabkan kerusakan oksidatif yang memicu munculnya stres oksidatif, khususnya pada sel β pankreas (Yuriska 2009). Asam dialurat yang dihasilkan dari metabolisme aloksan dapat menyebabkan terjadinya reaksi redoks yang dapat menghasilkan radikal superoksida. Radikal superoksida yang terbentuk dapat menghasilkan radikal hidroksil yang berpotensi merusak sel β Langerhans (Nugroho 2006). Aloksan diberikan secara intravena kepada hewan coba dan terbukti memberikan dampak kerusakan terhadap pankreas dengan terdeteksinya kadar gula darah hewan coba yang berada di atas ambang batas kadar gula darah normal yaitu 80 mg/dL sampai dengan 110 mg/dL (Montgomery et al 1993)
10
Mekanisme stres oksidatif akibat hiperglikemia diterangkan pada Gambar 3. Metabolisme karbohidrat akan menghasilkan monosakarida yang dapat dicerna di dalam sel. Kerusakan sel β Langerhans menyebabkan insulin sulit diproduksi. Hal ini menyebabkan absorpsi monosakarida, khususnya glukosa oleh menjadi pasif dan menyebabkan peptida gastrointestinal (GIP) ditransfer menuju pankreas melalui aksis entero-insular (EIA). Hal ini menyebabkan aktivasi reseptor glukosa pada sel β, adanya hambatan pada proses ini menyebabkan keadaan stres oksidatif. Pembentukan lipid peroksida terjadi ketika keadaan stres oksidatif ini mencapai hati dan mengaktifkan Tumour Necrosis Factor-α (TNF-α) dan sitokin sehingga pada jaringan adiposa hati terjadi lipolisis akibat penurunan sensitivitas reseptor insulin (IR) dan reseptor substrat insulin (IR-s). Selain itu, keadaan resisten insulin menyebabkan terjadinya akumulasi lemak akibat tingginya termogenesis pada hipotalamus (Tiwari dan Rao 2002).
Gambar 3 Skema terjadinya diabetes dan kaitannya dengan keadaan stres oksidatif (Tiwari dan Rao 2002)
11
Pengukuran kadar lipid peroksida dalam tubuh hewan coba dilakukan dengan mengambil organ hati. Metode pengukuran yang dilakukan adalah metode asam tiobarbiturat (TBA). Asam tiobarbiturat merupakan senyawa yang dapat membentuk kompleks warna jika bereaksi dengan malonaldehida (MDA). Malonaldehida merupakan molekul hasil degradasi lipid peroksida, sehingga dapat digunakan sebagai parameter tidak langsung dari kerusakan oksidatif oleh adanya peroksidase lipid (Halliwell dan Gutteridge 1999). Deposit lipid peroksida di hati diekstraksi terlebih dahulu melalui proses homogenasi dan penambahan bufer untuk melisis sel. Pengukuran konsentrasi diketahui dengan membuat kurva standar menggunakan TMP yang memiliki struktur mirip MDA dan dapat membentuk kompleks warna yang sama dengan MDA-TBA (Ohkawa et al. 1979). Prinsip reaksi MDA dengan TBA adalah dua molekul TBA dapat bereaksi dengan satu molekul MDA yang menghasilkan kompleks warna merah muda yang dapat terbaca dengan spektrofotometer (Gullen-Sans dan Guzman-Chozas 1998). Skema reaksi TBA dengan MDA dapat dilihat pada Gambar 4. Berdasarkan pengukuran lipid peroksida hati dari setiap kelompok diketahui bahwa konsentrasi lipid peroksida tertinggi adalah kelompok perlakuan dengan fraksi n-butanol (K-7) yaitu sebesar 338,57 nmol/g. Nilai terkecil dimiliki kelompok perlakuan fraksi etil asetat dengan angka 59,86 nmol/g. Nilai ini bahkan lebih kecil dibandingkan dengan kelompok normal yang menunjukkan nilai 115,10 nmol/g. Kadar lipid peroksida hati dalam keadaan normal dengan usia 5 bulan adalah 87,10 nmol/g, hal ini dibuktikan oleh Alviani (2007). Sedangkan perbandingan lain menurut Sayogya (2002) kadar normal lipid peroksida hati tikus adalah 100,46 nmol/g pada usia 8,5 bulan. Tikus Spragur Dawley yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 bulan. Uji statistik menunjukkan kadar lipid peroksida kelompok normal dengan kelompok perlakuan fraksi etil asetat tidak berbeda nyata (p<0,05). Keadaan lipid peroksida kelompok normal yang tinggi terjadi akibat dari pemberian tween 80 dengan konsentrasi 5% tanpa campuran ekstrak daun wungu. Tween 80 diketahui memiliki efek toksik yang mampu menyebabkan hemolisis dan kolestasis pada sel-sel hati berdasarkan pengukuran empedu yang dikumpulkan selama 3 jam dalam penelitian analisis resistensi obat yang dilakukan Ellis et al. (1996). Kelompok kontrol negatif (K-2), yang pada masa akhir perlakuan diketahui memiliki kadar glukosa darah tertinggi (Rahmi 2014), menunjukkan kadar lipid peroksida hati sebesar 139,85 nmol/g. Hal ini karena kelompok kontrol negatif sama halnya dengan kelompok normal, hanya diberikan tween 80. Kelompok kontrol positif (K-2) memiliki konsentrasi 113,71 nmol/g, pemberian glibenklamid untuk kelompok ini memiliki efek samping dapat meningkatkan kadar lipid peroksida hati. Konsumsi glibenklamid diketahui dapat memicu munculnya stres oksidatif (Clarke et al. 1974).
Gambar 4 Skema reaksi TBA dengan MDA (Gullen-Sans dan Guzman-Chozas 1998)
12
Kelompok perlakuan pemberian ekstrak etanol (K-4), fraksi dietil eter (K-5), dan fraksi n-butanol (K-7) memiliki kadar lipid peroksida yang lebih tinggi dari tikus yang diberi fraksi etil asetat. Hal ini disebabakan adanya faktor kemungkinan toksisitas ekstrak, karena dalam penelitian ini tidak dilakukan uji toksisitas dosis, melainkan dosis ditentukan sebesar 50 mg/kg BB secara langsung berdasarkan penelitian Theresia (2012). Ekstrak etanol dan fraksi dietil eter diketahui mengandung alkaloid yang cukup tinggi dan beberapa senyawa golongan alkaloid tergolong cukup toksik. Beberapa golongan alkaloid berpotensi merusak kerja hati karena mampu meningkatkan konsentrasi Cu dan mengganggu metabolisme Fe (Cheeke 1988). Selain itu Rahim (2011) menyatakan bahwa hasil isolasi senyawa alkaloid memiliki konsentrasi toksisitas di rentang sangat toksik yakni dibawah 35,63 μg/mL dan bersifat toksik terhadap Artemia salina Leach. Sementara itu, fraksi nbutanol memiliki konsentrasi lipid peroksida hati yang paling tinggi. Hal ini disebabkan oleh hilangnya metabolit sekunder yang berpotensi sebagai antioksidan selama proses ekstraksi partisi bertingkat. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi n-butanol daun wungu hanya mengandung steroid dan saponin, sehingga menurunkan potensinya sebagai antioksidan. Hasil pengukuran kadar lipid peroksida kelompok perlakuan fraksi etil asetat daun wungu menunjukkan potensi antioksidan yang besar dari fraksi tersebut karena mampu menjaga kadar lipid peroksida pada angka 59,86 nmol/g, nilai yang lebih rendah dari tikus normal. Fraksi etil asetat daun wungu mengandung tanin, saponin, dan steroid. Kandungan saponin dipercaya dapat mengurangi kadar kolesterol dalam darah (Tiwari dan Rao 2002). Selain itu Moshi et al. (2006) melaporkan bahwa ekstrak saponin dari Senseviera sp. yang banyak digunakan sebagai obat tradisional masyarakat Tanzania memiliki potensi antikanker dan antioksidan. Kandungan tanin fraksi etil asetat daun wungu juga memiliki potensi yang besar sebagai antioksidan karena termasuk golongan polifenol. Polifenol diketahui sebagai komponen bioaktif yang dapat bekerja sebagai antioksidan. Tanin juga dapat menurunkan obesitas karena kemampuannya mencegah penyerapan asam lemak pada dinding usus halus (Suharmiati dan Maryani 2003). Bentuk inhibisi pembentukan radikal bebas lipid peroksida biasanya adalah dengan komponen metabolit sekunder ekstrak mengikat lipid peroksida dan menjaganya tetap stabil, sehingga tidak ada reaksi peroksidasi yang kontinu (Khoo 2014). Perbandingan nilai konsentrasi lipid peroksida kelompok ekstrak etil asetat (K-6) dengan kelompok kontrol negatif (K-3) yang tidak diberikan perlakuan pengobatan, adalah sebesar 57,19%. Pemberian ekstrak daun wungu selama sepuluh hari dengan dosis 50 mg/kg BB terbukti mampu menurunkan kadar lipid peroksida hati tikus Sprague Dawley yang berada dalam keadaan hiperglikemik dengan induksi aloksan. Berdasarkan uji statistik ANOVA diketahui bahwa pemberian ekstrak daun wungu berpengaruh secara signifikan (p<0,05) terhadap besarnya kadar lipid peroksida yang terdapat di dalam hati hewan coba. Uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa pengaruh pemberian fraksi etil asetat dari ekstrak etanol daun wungu (K-6) tidak berbeda nyata dengan tikus normal (K-1) dan tikus kontrol positif (K-2) namun berbeda nyata dengan kelompok lainnya. Ini menandakan bahwa fraksi etil asetat efektif menjaga kadar lipid peroksida berada dalam keadaan normal untuk tikus hiperglikemia.
13
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pemberian fraksi etil asetat ekstrak daun wungu dapat menurunkan kadar lipid peroksida hati tikus hiperglikemia yang diinduksi dengan aloksan. Hasil penurunan kadar lipid peroksida tersebut tidak berbeda nyata (p<0,05) dengan tikus normal. Senyawa fitokimia yang terdapat di dalam fraksi etil asetat daun wungu adalah tanin, saponin, dan steroid. Fraksi etil asetat daun wungu berpotensi sebagai antioksidan. Saran Uji toksisitas untuk fraksi etil asetat ekstrak daun wungu perlu dilakukan sebelum diberikan kepada hewan coba. Penelitian lebih lanjut mengenai dosis efektif juga perlu dilakukan. Potensi lain daun wungu perlu dieksplorasi, contohnya sebagai salah satu herbal yang dapat berfungsi sebagai hepatoprotektor.
DAFTAR PUSTAKA Alviani. 2007. Khasiat Ramuan Ekstrak Daun Jati Belanda Terhadap Peroksidasi Lipid Hati Tikus Hiperlipidemia. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Carmona MC, Katie L, Bruno L, Antoine P, Nathalie H, et al. 2007. S 26948: a net Pacific peroxisome proliferator-activated reseptor γ modulator with potent antidiabetes and antiatherogenic effects. Diabetes. 56:2979-2808. Cheeke PR. 1988. Toxicity and metabolisme of pyrrolizidine alkaloids. Journal of Animal Science. 9: 2343-2350. Christian. 2013. Khasiat Antioksidan Ekstrak Pare: Kajian In Vivo pada Tikus Hiperglikemia. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Clarke BF, Campbell IW, Ewing DJ, Beveridge GW, dan MacDonald MK. 1974. Generalized hypersensitivity reaction and visceral arteritis with fatal outcome uring glibenclamide therapy. Diabetes. 23:739-742. Cutler RG dan Henry R. 2003. Critical Review of Oxidative Stress and Aging: Advances in Basic Science, Diagnostic and Intervention, Volume 2. Singapore: World Scientific. Falachi R. Toksisitas Subkronis Ekstrak Etanol 70% Daun Wungu (Graptophyllum pictum (L.) Griff) pada Mencit. [skripsi]. Bogor(ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Giri NL. 2008. Potensi Antioksidan Daun Salam: Kajian In Vivo pada Tikus yang Hiperkolesterolemia dan Hiperglikemia. [skripsi], Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Guillen-Sans R dan Guzman-Chozas M. 1998. The thiobarbituric acid reaction in food, a review. Critical Review in Food Science and Nutrition. 4:315-330.
14
Halliwel B dan Gutteridge JMC. 1985. Free Radicals in Biology and Medicine 3rd Edition. London (UK): Oxford University Press. Hanafiah KA. 2005. Rancangan Percobaan Aplikatif. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): ITB Press. Irda I. 2012. Antioxidant activity of ethyl acetate extract of Red Psidium guajva L. leaves gram in Manoko, Lembang – Indonesia. Injonesian J. Pharm. 23:3640. Irwan F. 2011. Aktivitas Antidiabetes dan Analisis Fitokimia Ekstrak Air dan Etanol Daun Wungu (Graptophyllum pictum (L.) Griff). [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Kamal K. 2004. Homoeopathic Treatment Diabetes Mellitus. India: B. Jain Publisher. Khoo HE, Azrina A, Amin I, Faridah A, dan Muhajir H. 2014. Inhibition of oxidative stress and lipid peroxidation by anthocyanins krom defatted Canarium odontophyllum pericarp and peel using in vitro bioassays. Plos One. 9:1-9. Mattjik AA dan Sumertajaya M. 2000. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Bogor: IPB Press. Milaneschi Y, Matteo C, Eleanor MS, Nicole V, Alka MK, et al. 2013. Lipid peroxidation dan depressed mood in community dwelling folder men and Women. Plos One. 8: 1-8. Montgomery MW, Kersten JR, dan Ghassemi T. 1993. Diabetes and hyperglycemia impair activation of mitochondrial K(ATP) channels. Medical. 1: 111-116. Moshi MJ, Zakaria HM, Ramadhani SON, Pax JM, Appolinary K, et al. 2006. Evaluation do ethnomedical claims and brine shrimp toxicityof som plants used in Tanzania as traditional medicine. African Ethnomedic Network. 3: 48-58. Nugroho AE. 2006. Hewan percobaan diabetes mellitus: patologi dan mekanisme aksi diabetogenik. Biodiversitas. 7:378-382. Ohkawa H et al. 1979. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid. Analytical Biochemistry. 95:351-358. Perwita FA. 2011. Teknologi Ekstraksi Daun Ungu dalam Ethanol 70% dengan Metode Perkolasi. [skripsi]. Semarang (ID): Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. Rahim A. 2011. Uji toksisitas beberapa senyawa alkaloid hasil isolasi dari ekstrak metanol daun Melochia umbellata (Houtt.) Stapf. Var. Deglabrata pada larva Artemis salin Leach. Majalah Farmasi dan Farmakologi. 15: 35-39. Rahmi H. 2014. Aktivitas Ekstrak Daun Wungu (Graptophyllum pictum L. Griff) dalam Menurunkan Kadar Glukosa Darah Tikus Hiperglikemia [tesis]. Bogor (ID): Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Rauter AP et al. 2009. Bioactivity studies and chemical profile of the antidiabetic plant Genista tenera. J. Ethnopharmacol. 122:384-393. Rubin R, David SS, dan Emanuel R. 2011. Rubin’s Pathology: Clinicopathologic Foundations of Medicine. Philadelphia: William & Wilkins. Sayogya AP. 2002. Efek Senyawa Antioksidan Biological Response Modifier (BRMTM) Terhadap Lipid Peroksida Hati Tikus. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
15
Shokeen et al. 2008. Antidiabetic activity of 50% ethanolic extract of Rinicus communis and Ita purified fractions. Food and Chemical toxicology. 46: 3458-3466. Suharmiati dan Maryani. 2003. Penyajian bioaktivitas antidiabetes mellitus tumbuhan obat. Cermin Dunia Kedokteran. 140: 8-13. Suganda AG. 2002. Standarisasi Simplisia, ekstrak dan produk obat bahan alam. Prosiding Simposium Standarisasi Jamu dan Fitofarmaka. Bandung, 26 September 2002. Sylvia. 2014. Aktivitas Antidiabetes dan Antioksidan Daun Wungu (Graptophyllum pictum L. Griff) secara In Vitro. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Theresia R. 2012. Potensi Ekstrak Etanol Daun Wungu (Graptophyllum pictum (L.) Griff) pada Tikus Sprague-Dawley Diabetes yang Diinduksi Aloksan. [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Tiwari AK dan Rao JM. 2002. Diabetes mellitus and multiple terapeutik approaches of phytochemiscals: Present status and future Prospect. Current Science. 83:30-38. Tokur B, et al. 2008. Nutritional composition of krom (Rana esculanta) waste mal. iBiorescue Technol. 5:1332-1338. United States Department of Agriculture [USDA]. 2010. Plant Database: Graptophyllum pictum (L.) Griff. Washington (US): Natural Resources Convention Center USDA. Weir GC dan Susan BW. 2004. Five stage of evolving β-cell dysfunction uring progression to diabetes. Diabetes. 53: 16-21. Widowati W. 2008. Potensi antioksidan sebagai antidiabetes. JKM. 2: 11-21. Widyastuti SK. 2000. Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) sebagai Model Diabetes Mellitus: Pengaruh Hiperglikemia pada Lipid Darah, Serum Oksida Nitrik (NO) dan Tingkah Laku Klinis. [tesis]. Bogor (ID): Program Pasc Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Yagi K. 1994. Lipid peroxide in hepatic, gastrointestinal, and pancreatic diseases, hlm: 165-169. Di dalam: Free Radicals In Diagnostic Medicine. Amstrong D, penyunting. New York: Plenum Press. _______. 2012. Lipid Peroxide in Biology and Medicine. Edinburgh (UK): Elsevier. Yuriska. 2009. Uji fitokimia dan aktivitas antidiabetes ekstrak biji rambutan (Nephelium laapeceum L) dengan berbagai pelarut. Ebers Papyrus. 13:8997.
16
LAMPIRAN
17
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Simplisia Daun Wungu
Ekstraksi Maserasi Etanol 96%
Ekstraksi dietil eter
Ekstraksi etil asetat
Partisi
Partisi
Ekstraksi Partisi nbutanol
Uji Fitokimia: Uji Flavonoid Uji Alkaloid Uji Tanin Uji Saponin Uji Steroid dan Terpenoid
Uji in vivo
Pengukuran Bobot Hati
Pembuatan Kurva Standar
Analisis Lipid Peroksida Metode TBA
18
Lampiran 2 Perhitungan rendemen ekstrak etanol dan partisinya Perhitungan rendemen ekstrak etanol 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 = × 100% 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 20,78 𝑔𝑟𝑎𝑚 = × 100% 500 𝑔𝑟𝑎𝑚 = 4,156% Perhitungan rendemen partisi ekstrak dietil eter 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑠𝑖 = × 100% 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 2,012 𝑔𝑟𝑎𝑚 = × 100% 500 𝑔𝑟𝑎𝑚 = 0,4024% Perhitungan rendemen partisi ekstrak etil asetat 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑠𝑖 𝑒𝑡𝑖𝑙 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑡 = × 100% 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 1,17 𝑔𝑟𝑎𝑚 = × 100% 500 𝑔𝑟𝑎𝑚 = 0,234% Perhitungan rendemen partisi ekstrak n-butanol 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑠𝑖 𝑛 − 𝑏𝑢𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 = × 100% 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 0,71 𝑔𝑟𝑎𝑚 = × 100% 500 𝑔𝑟𝑎𝑚 = 0,142% Lampiran 3 Penentuan dosis
Penentuan dosis pemberian aloksan pada hewan coba Aloksan diberikan sebanyak 150 mg/kg BB diberikan secara intravena dengan volume sebesar 1 mL.
Penentuan dosis glibenklamide - Satu tablet glibenklamid berbobot 5 mg dengan dosis minum oral untuk orang dewasa adalah 3 tablet. Dosis total dalam sehari adalah 15 mg. - Bobot orang dewasa normal diasumsikan 60 kg. Dosis per kilogram BB adalah 15 mg dibagi dengan bobot orang dewasa menjadi 0.25 mg/kg BB. - Dosis untuk hewan coba dengan bobot rata-rata adalah 200 gram 200 𝑔𝑟𝑎𝑚 Dosis hewan coba = 1000 𝑔𝑟𝑎𝑚 × 0,25 𝑚𝑔 = 0,05 mg -
Dosis yang diebrikan kepada hewan coba adalah 0,05 mg perhati yang dilarutkan dalam 1 mL tween 80 dengan konsentrasi 5% Penentuan dosis ekstrak - Dosis ekstrak didapatkan dari literatur berdasarkan penelitian sebelumnya yaitu dari Theresia (2011). Dosis efektif ekstrak etanol
19
-
daun wungu yang dapat menurunkan kadar gula darah hewan coba adalah sebesar 50 mg.kg BB. 200 𝑔𝑟𝑎𝑚 Dosis untuk hewan coba = 1000 𝑔𝑟𝑎𝑚 × 50 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑔 Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 mL tween 80 dengan konsentrasi 5% lalu diberikan secara oral kepada hewan coba.
Lampiran 4 Kurva standar TMP pengukuran kadar lipid peroksida hati [TMP] (µM)
A1(nm)
A2 (nm)
A rata-rata (nm)
0,00
0,000
0,000
0,000
0,30
0,034
0,038
0,036
0,75
0,094
0,098
0,096
0,90
0,116
0,120
0,118
1,50
0,196
0,192
0,194
1,80
0,223
0,231
0,227
3,00
0,390
0,386
0,388
6,00
0,742
0,762
0,752
0,8 0,7
Absorbansi (A)
0,6 0,5 0,4
0,3 0,2 0,1 0 0
1
2
3
4
5
Konsentrasi TMP (µM)
Y = 0,1257X + 0,0025; R = 0,9998
6
7
20
Lampiran 5 Pengukuran absorbansi kadar lipid peroksida hati Kelompok
Ulangan
Normal
1
0,120
0,122
A Rata-rata (nm) 0,121
2
0,133
0,104
0,119
3
0,160
0,160
0,160
4
0,158
0,136
0,147
1
0,102
0,111
0,107
2
0,101
0,101
0,101
3
0,261
0,189
0,225
4
0,129
0,169
0,149
1
0,160
0,157
0,159
2
0,129
0,167
0,148
3
0,283
0,162
0,223
4
0,139
0,228
0,184
1
0,146
0,187
0,167
2
0,202
0,228
0,215
3
0,190
0,159
0,175
4
0,254
0,222
0,238
1
0,321
0,335
0,328
2
0,417
0,121
0,269
3
0,256
0,135
0,196
4
0,105
0,135
0,120
1
0,077
0,075
0,076
2
0,092
0,077
0,085
3
0,098
0,073
0,086
4
0,064
0,064
0,064
1
0,462
0,439
0,451
2
0,524
0,358
0,441
3
0,415
0,416
0,416
4
0,412
0,399
0,406
K (+)
K (-)
Etanol
Dietileter
Etil asetat
n-butanol
A1 (nm)
A2 (nm)
Pengukuran konsentrasi lipid peroksida Persamaan garis dari kurva standar y = 0,1257 x + 0,0025 r= 99,97% Rumus pengukuran konsentrasi lipid peroksida dan kon Contoh perhitungan: Dari persamaan garis kurva standar y = 0,1257x + 0,0025
Misalnya absorbansi sampel 0,077, maka 0,077 = 0,01257 x + 0,0025 X = (0,077 – 0,0025) /0,1257 X = 0,5926 µM Bobot hati yang ditimbang = 1,000 gram Volume total homogenat hati (10% b/v) = 10 mL Volume total homogenat hati yang digunakan 0,1
21
Konsentrasi lipid peroksida dalam mol/gram = C (µM) x volume total homogenat hati (mL)/ volume homogenat yang direaksikan (mL) Bobot hati (gram)
= (0,5926 µM x 10 mL) / 0.1 mL = 59,2681 nmol/gram 1.0 gram Lampiran 6 Pengukuran konsentrasi lipid peroksida hati tikus Tabel 1 Kelompok normal Tabel 5 Kelompok perlakuan ekstrak Ulangan A Konsentrasi dietil eter 1
0,121
2
0,1185
3
0,16
4
0,147
Rata-rata SD
(nmol/g) 94,44 92,45 125,44
0,136625 0,017512
115,10 106,86 13,92
Tabel 2 Kelompok kontrol (+) Ulangan
A
1
0,1065
2
0,1005
3
0,225
4
0,149
Rata-rata
0,14525
SD
0,049695
Konsentrasi (nmol/g) 82,91 78,14 177,11 116,69 113,71 39,50
Tabel 3 Kelompok kontrol (-) Ulangan
A
1
0,1585
2
0,148
3
0,2225
4
0,1835
Ratarata SD
0,178125 0,028682
Konsentrasi (nmol/g) 124,25 115,90 175,12 144,12 139,85 22,80
Tabel 4 Kelompok perlakuan ekstrak etanol Ulangan
A
1
0,1665
2
0,215
3
0,1745
4
0,238
Ratarata SD
0,1985 0,029293771
Konsentrasi (nmol/g) 130,60 169,16 136,96 187,44 156,04 23,29
Ulangan
A
1
0,328
2
0,269
3
0,1955
4
0,12
Rata-rata
0,228125
SD
0,078104
Konsentrasi (nmol/g) 258,98 212,08 153,66 93,64 179,59 62,09
Tabel 6 Kelompok perlakuan ekstrak n-butanol
Ulangan
A
1
0,4505
2
0,441
3
0,4155
4
0,4055
Ratarata SD
0,428125 0,018287
Konsentrasi (nmol/g) 356,36 348,81 328,54 320,59 338,57 14,54
Tabel 7 Kelompok perlakuan ekstrak etil asetat Ulangan
A
1
0,076
2
0,0845
3
0,0855
4
0,064
Rata-rata
0,0775
SD
0,008624
Konsentrasi (nmol/g) 58,66 65,42 66,22 49,13 59,86 6,86
22
Lampiran 7 Data Bobot Hati Tikus Kelompok
Ulangan
Bobot Hati
Rata-rata
SD
Normal
1
9,50
9,25
0,65
2
8,29
3
9,13
4
10,07
2
5,12
7,50
1,61
3
9,20
4
6,94
5
8,73
1
7,56
8,37
1,11
2
10,04
3
8,69
5
7,19
1
7,49
7,77
0,44
2
8,18
3
8,21
5
7,20
1
9,12
8,02
0,92
3
6,68
4
8,55
5
7,73
1
8,08
7,47
0,46
3
7,15
4
6,92
5
7,75
1
6,80
7,53
0,55
2
7,43
3
7,53
4
8,36
K(+)
K(-)
Etanol
DE
EA
NB
23
Lampiran 8 Analisis Data Bobot Hati
24
Lampiran 9 Analisis Data Lipid Peroksida
25
Lampiran 10 Dokumentasi penelitian
Gambar 1 Penyiapan analisis lipid peroksida hati Gambar 4 Perangkat pengambilan darah
Gambar 2 Peletakkan tabung di sentrifugasi klinis
Gambar 5 Pengambilan darah hewan coba
Gambar 3 Piranti analisis glukosa darah
26
Gambar 6 Homogenizer
Gambar 7 Spektrofotometer
27
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Mataram, Lombok pada tanggal 19 Mei 1992 dari ayah bernama Marsih dan ibu bernama Nurwargi (Almh). Penulis merupakan anak pertama dari 4 bersaudara. Pendidikan penulis dimulai dari SDN 5 Lembuak, kemudian melanjutkan pendidikan ke jenjang Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 1 Narmada. Tahun 2010 penulis lulus dari pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Mataram, pada tahun yang sama penulis lolos Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar tahun ajaran 2012/2013 dan 2013/2014. Penulis juga pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) dan didanai DIKTI dengan judul ‘Gel Aromaterapi Atsiri Temulawak sebagai Antihiperkolesterolemia’ (2013). Tahun 2013 penulis juga tercatat sebagai finalis Tanoto Student Research Award untuk judul tulisan yang sama. Penulis juga pernah mendapatkan juara satu dalam Mipa Youth Scientist Challenge FMIPA IPB tahun 2013. Beberapa karya tulisan fiksi penulis juga sempat dimuat oleh majalah Kawanku dan masuk Antologi Cerpen Penerbit Diva Press pada tahun 2013. Penulis aktif dalam kegiatan organisasi kampus, diantaranya sebagai Reporter di Unit Kegiatan Mahasiswa Koran Kampus 2010/2011, Sekretaris Divisi Communication and Information Center (CIC) Community Research and Educatioan of Biochemistry (CREBs) periode 2011/2012 dan Staf Kementrian Pendidikan dan Keilmuan Badan Eksekutif Mahasiswa IPB kabinet ‘Kreasi untuk Negeri’ tahun 2013. Penulis juga pernah aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti panitia Lomba Karya Ilmiah Populer 2011, SPIRIT FMIPA 2012, Explo Science FMIPA 2012, BIK Fair 2012, Seminar dan Kajian Ilmiah Kehalalan 2012, Pesta Sains Nasional 2012, IPB’s Dedication for Education (IDEA) BEM KM IPB 2013, International Scholarship and Education Expo (ISEE) BEM KM IPB 2012/2013. Bulan Juli-Agustus 2013 penulis telah melaksanakan Praktik Lapang di Laboratorium Kimia Analitik, Balai Biotek BPPT Pusat Pengembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Kemenristek RI, Serpong, Tangerang dengan judul Analisis Jaminan Mutu Pengujian Sampel Biskuit dan Kedelai melalui Control Chart.
