HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolom dengan bantuan pompa/tekanan. Komponen pokok yang ada dalam alat HPLC :
1. Gradien Controller/Solvent Reservoir : Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus dimilipore (pori-pori + 5μm) dan didegass. 2. Pompa : Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom. 3. Sample Introductions/Injector : Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan bantuan syringe. 4. Kolom : Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan. 5. Detektor : Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom. 6. Data Output : Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh.
Perbandingan Antara Kromatografi Cairan Klasik dan HPLC Klasik - Jenis partikel pengisi kolom
- Partikel besar berpori
- Diameter partikel (μm)
- 100 - 250
- Diameter kolom (mm)
- 10 – 50
- Panjang kolom (cm)
- 50 – 200
- Tekanan (atm)
- 0,1 – 1
- Kec Alir (mL/menit) - Waktu Pemisahan - Kapasitas - HETP - Resolusi
- ≤ 0.1 - Lama - Besar (preparatif) - 200 -1
HPLC - Perikular - Mikropartikulat - 37 – 50 - 5 – 10 -1–3 -2–6 - 50 – 100 - 10 – 50 - 30 – 50 - 100 – 200 - 0.5 – 5 - Cepat - Lebih kecil - 10.000 -7
KEUNTUNGAN HPLC • • • •
Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data Volume sampel kecil Daya pisah tinggi Merupakan metode analitis – – – – –
• • •
Cepat Peka Akurat Tepat Reproducible
Juga Preparatif Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas
POMPA (Sistem Penyalur Fasa Gerak) • • • •
Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak Bebas pulsa Perlu “de gasser” Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar • Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien • Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)
JENIS – JENIS POMPA • Pompa bolak – balik (reciprocating pump) – – – –
Paling banyak digunakan Jumlah vol pelarut tidak terbatas Dapat digunakan untuk elusi gradien Menghasilkan aliran berpulsa
• Pompa jenis penyuntik (syringe pump) – Kapasitas ruang pelarut 250 – 500 mL – Untuk kolom – kolom kecil (micro bore columns) – Menghasilkan aliran bebas pulsa
Metode Pemisahan Umum dalam HPLC Tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluat ; – Fasa Normal • Fasa gerak nonpolar • Fasa diam polar
– Fasa Terbalik • Fasa gerak polar • Fasa diam nonpolar
Typical stationary and mobile phases for normal and reverse phase chromatography
DETEKTOR HPLC Tergantung pada jenis senyawa dalam eluat ; – – – – – – –
Spektrofotometer UV – Visible Indeks bias Spektrofluorimeter ( zat berfluoresensi ) Konduktivitas listrik ( zat ionik ) Spektrometer infra merah Spektrometer massa ( LC – MS ) Spektrometer NMR ( LC – NMR )
Jenis Detektor Karakteristik HPLC
Daftar Pustaka • VOGEL’S, 1989. Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 5th edition. Longman Scientific & Technical. John Wiley & Sons, Inc. New York. • Albert K., 2002. On-Line LC-NMR and Related Techniques. John Wiley & Sons Ltd. England. • Sadek P. C., 2002. The HPLC Solvent Guide. 2nd. Wiley Interscience. John Wiley & Sons, Inc. New York. • Synder, L.R., Kirkland, J.J., Glaich. J. L., Practical HPLC Method Development. 2nd . Wiley-Interscience. New York.
Analisis Kafein dalam Tablet dengan Metode HPLC
Fasa Gerak
Siapkan campuran pelarut H2O : MeOH : AcOH (69:28:3) grade HPLC atau PA yang sudah dimilipore dan didegass.
Larutan Standar Internal
Siapkan larutan asam benzoat dalam metanol dengan konsentrasi kira – kira 6 mg/mL
Larutan Stok Standar
Larutkan secara akurat sejumlah tertentu standar kafein grade USP/PA dengan pelarut campuran ( MeOH : Asam asetat glacial 95:5 ) dengan konsentrasi kira – kira 0.25 mg / mL
Preparasi Standar
Pindahkan20 mL larutan stok standar dan 3 mL larutan standar internal ke dalam labu ukur 50 mL, encerkan dengan pelarut campuran seperti diatas sampai tanda batas, dan dihomogenkan.
Preparasi sample uji kafein
Timbang sample kafein yang sudah dihaluskan sekitar 250 mg, dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. tambahkan 75 mL pelarut campuran, kocok dengan shaker sekitar 30 menit. Encerkan sampai tanda batas dengan pelarut campuran, dan dihomogenkan. Pindahkan 2 mL larutan ini dan 3 mL larutan standar internal ke dalam labu ukur 50 mL,encerkan sampai tanda batas, dan dihomogenkan.
Sistem Kromatografi HPLC dilengkapi dengan detector UV dengan λ 275 nm dan kolom C-18. Kecepatan alir eluen sekitar 2 mL /menit.
Prosedur Analisis Suntikkan sekitar 10 μL larutan preparasi standar dan larutan sample yang sudah dipreparasi secara terpisah, ke dalam HPLC. Waktu retensi kafein sekitar 0.5, asam benzoate sekitar 1. Hitung kadar kafein (C8H10N4O2) dalam sample uji dengan rumus; 2500 C ( Rv / Rs ) C
; Konsetrasi dalam mg/mL standar kafein USP / PA dalam preparasi standar
Rv & Rs ; Rasio factor respon puncak analit dan puncak standar internal yang didapat dari preparasi sample uji kafein dan preparasi standar.
PETUNJUK PENGGUNAAN ALAT KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) HP 1100, AGILENT CHEMSTATION
LABORATORIUM KIMIA BAHAN ALAM DAN LINGKUNGAN JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN BANDUNG 2007
PERHATIAN ! • SEBELUM MEMAKAI ALAT HARAP KONFIRMASI JADWAL KE BAGIAN ADMINISTRASI SEKURANG-KURANGNYA SEMINGGU SEBELUMNYA
• SEBELUM MEMAKAI ALAT, HARAP MENGISI KELENGKAPAN ADMINISTRASI •
UNTUK PEMULA HARAP MEMBACA & MEMAHAMI PETUNJUK INI SEBELUM MENGOPERASIKAN ALAT
•
HARAP UNTUK SELALU MENGIKUTI PETUNJUK PENGGUNAAN
•
UNTUK MENGHINDARI HAL-HAL YANG TIDAK DIINGINKAN, SEBAIKNYA
PENGGUNA
MINTA
PENDAMPING
PENGOPERASIAN MELALUI BAGIAN ADMINISTRASI •
SEMUA ELUEN, SAMPEL YANG DIBAWA HARUS SUDAH DISARING DENGAN MILLIPORE DAN DIAWAGASKAN
•
APABILA TERJADI KESALAHAN ATAU KERUSAKAN SEKECIL APAPUN
PADA
SECEPATNYA
ALAT
MAUPUN
MELAPOR,
SOFTWARE,
HARAP
MENCOBA
UNTUK
JANGAN
MEMPERBAIKI SENDIRI •
SETELAH SELESAI MENGGUNAKAN ALAT, CHECK ALIRAN LISTRIK, KEBERSIHAN DAN KERAPIHAN ALAT DAN RUANGAN. JIKA TIDAK DIGUNAKAN, SAKLAR HARUS SELALU MATI DAN ALAT SELALU DITUTUP DENGAN PENUTUP YANG TERSEDIA
•
SETIAP MENGGUNAKAN ALAT HARUS SELALU MEMAKAI ALAS
KAKI
YANG
BERSIH
DAN
KERING,
UNTUK
MENGHINDARI SENGATAN LISTRIK •
ALAT
TIDAK
BOLEH
DINYALAKAN
KETIKA
DI
LUAR
RUANGAN SEDANG ADA PETIR, KILAT ATAU HALILINTAR
I.
Sekilas Pengenalan Alat HPLC HP 1100.
Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang ada di jurusan Kimia FMIPA Unpad adalah HPLC type HP 1100 buatan Hewlet Packard. Alat ini terdiri dari 3 bagian perangkat keras, yaitu: •
Alat HPLC-nya sendiri yang terdiri atas : (penampakan dari atas ke bawah) botol eluen, injektor, pompa, kolom dan detektor.
•
Seperangkat komputer yang terdiri atas : CPU, monitor, keyboard, mouse dan mouse pad.
•
Printer HP Laserjet 6L.
Setiap alat dilengkapi dengan penutupnya yang harus selalu dipasang jika alat sedang tidak digunakan untuk menghindari debu dan kotoran. Dalam komputernya, telah dipasangkan pengolah data Agilent Chemstation dengan dasar MS-Windows NT. Untuk kelancaran penggunaan, selain mengolah data dilarang memasukkan disket atau CD ke dalam komputer dan atau mengotak-atik software lain yang terdapat didalamnya (misalnya menulis dalam notepad).
PEDOMAN PENGGUNAAN
PREPARASI SAMPEL •
Sampel harus dalam bentuk larutan.
•
Untuk skala analisis sampel dalam µL, konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal adalah sekitar 40 ppm.
PREPARASI FASA GERAK •
Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.
•
Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore
kemudian
diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut. •
Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan, untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.
•
Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang digunakan.
PENYALAAN ALAT •
Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa kembali seperti semula.
•
Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).
•
Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).
•
Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)
•
Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)
•
Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.
MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION •
Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul tampilan : Windows NT workstation version 4.00 Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)
Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00) secepatnya, kemudian tekan ENTER. •
Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.
•
Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu diisi apa-apa, langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG PASSWORD PADA PENGOLAH DATA !
•
Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No
•
Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik pada menu Instrument 1 Online. Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan pengolahan data tanpa penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat komputernya saja). Menu ini misalnya digunakan untuk print out kromatogram yang belum sempat dilakukan atau untuk melakukan print ulang kromatogram yang sudah ada.
•
Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.
PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih dahulu untuk menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan juga dimaksudkan agar alat benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram yang dihasilkan akan bagus. Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation, klik menu Run Control. Kemudian : •
Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.
•
Klik menu Instrument, klik pada set up pump >set gradient fasa gerak >set laju alir >set waktu run dan post run catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1 uL/menit untuk menghemat eluen.
•
Klik pada kolom, klik control, klik on.
•
Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible), tergantung sample yang akan diinjeksikan.
•
Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi kolom yang diinginkan.
•
Klik menu Instrument, klik Set
Up DAD Signals untuk mengatur
panjang gelombang detektor yang diinginkan. Masukkan panjang gelombang pilihan disertai dengan tanda X. •
Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang lebih 45-60 menit untuk menstabilkan.
•
Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang diinginkan (jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT ! Naikkan Perlahan....Agar tekanan pompa stabil...!
PERSIAPAN INJEKSI INGAT.....:
TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI
•
Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)
•
Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas
•
Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan line dengan jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline pada skala nol tekan BALANCE.
•
Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL, klik SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut keterangan sampel.
•
Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.
•
Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak utama ke kolom. Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan ganti dengan sampel lain, kolom harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit), pencucian masukkan ke dalam file CUCI.
CARA INJEKSI •
Ambil alat injek (syringe).
•
Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya metanol)
•
Kemudian bilas syringe dengan sampel
•
Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau gelembung udara
•
Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar terpasang loop 20 uL
•
Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas), injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress data aquasition.........
•
Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...”Run in Progress Data Analysis”.
•
Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running cuci kolom ke dalam file cuci.
PRINT OUT KROMATOGRAM •
Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap sampel yang telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA ANALYSIS.
•
Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih file mana yang akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang diinginkan. Segera akan keluar tampilan kromatogram yang dipanggil.
•
Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang dipanggil tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE. Maka segera akan muncul nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor yang ada yaitu DAD (Diode Arays Detector) sangat sensitif, maka setiap puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat terintegrasi sehingga puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita tampilkan waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK
sampai muncul tanda X merah. Atau dapat langsung klik di menu X merah yang biasanya ada di layar. Untuk menghapusnya, klik dengan X merah tersebut di tempat-tempat yang waktu retensinya tidak ingin ditampilkan. •
Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik SPECIFY REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang diinginkan. Setelah siap, klik PRINT REPORT lalu tunggu sebentar sampai komputer menampilkan print previewnya. Kemudian klik pada icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.
•
Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu VIEW, klik METHOD AND RUN CONTROL.
