Kmenové buňky a tkáňové náhrady – naděje moderní medicíny. RNDr. Pavla Jendelová PhD. Ústav experimentální medicíny AVČR Ústav neurověd, UK 2. lékařská fakulta Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad
Mozek Leonardo da Vinci 1452-1519
Kmenové buňky a regenerativní medicína podpůrný a antiapoptotický účinek
náhrada buněk
Kmenové buňky orgánová výměna
farmaka
Regenerativní medicína
umělé biomateriály tkáňové náhrady
nanotechnologie
zvýšení regenerace (růstové faktory)
Kmenové buňky - definice sebeobnovující se „primitivní“ buňky, které se mohou vyvinout v plně funkční diferencované buňky Dvě hlavní kategorie kmenových buněk • embryonální • neembryonální – čili „dospělé“ nebo somatické kmenové buňky
Dvě vlastnosti, které jsou esenciální pro obě kategorie: • schopnost sebeobnovy (schopnost generovat identické kopie sebe sama) • schopnost diferencovat se (schopnost dát vznik různým diferencovaným buněčným typům - pluripotence)
Mechanismy účinku buněčné terapie Aktivace endogenních kmenových buněk
• Náhrada buněk • Záchrana poškozených buněk • Mobilizace endogeních kmenových buněk
Neurogeneze v mozku
Brain Facts
Zdroje buněk
Je experimentování s lidskými embryonálními kmenovými buňkami v České Republice legální?
ANO
Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů Schválen Poslaneckou sněmovnou dne 26. dubna 2006 Platný od 1. června 2006 jako zákon č. 227/2006 Sb.
Povolení pro práci s lidskými embryonálními kmenovými buňkami Registr linií lidských embryonálních kmenových buněk
Ustavení linií hES buněk nemá 100% úspěšnost Sanatorium HELIOS
10 morul 100%
88 blastocyst 100%
83 izolovaných ICM (?) 94%
1 adherovaná morula 10%
Žádná linie hES buněk 0%
57 adherovaných ICM 69%
14 linií hES buněk 24.6%
Státy, ve kterých byly ustanoveny linie lidských embryonálních kmenových buněk zahrnutých v „International Stem Cell Initiative (ISCI)“. Čísla představují počet hESC linií, jimiž jednotlivé státy přispívají do této mezinárodní aktivity.
ÚEM AVČR a MU v České republice má v ISCI 3 linie hECS. (Nature Biotech, 2005)
Diferenciace embryonálních kmenových buněk
Lidské embryonální buňky – diferenciace ve zkumavce
Integrace lidských embryonálních buněk do mozku také nemá 100% úspěšnost Cv
HuNu
Kompatibilní embryonální kmenové buňky
iPSC
Induced pluripotent cells (účinnost 0.1%) Selekce pomocí resistence na antibiotika pod specifickým promotorem typickým pro pluripotentní buňku (jako je Oct3/4, Nanog)
Výhody: -lze je derivovat přímo z buněk pacienta (jsou imunologicky kompatibilní) -možnost derivace přímo od pacienta s určitou nemocí -možnost diferenciace na typ buněk, které nemoc postihuje -tím je dána možnost hledání vhodných terapií in vitro -eticky akceptovatelná metoda
Výběr na základě morfologie Kolonie iPS
Zdroje buněk
Somatické kmenové buňky z dospělých jedinců • • • • • • • • • •
Mozek Kostní dřeň, periferní krev, cévy Tuková tkáň Kosterní svalstvo, Kožní epitel Trávicí trakt Rohovka, sítnice Dentální pulpa Játra Slinivka
Buněčné populace v kostní dřeni Výhody
Nevýhody
•Dostupnost
• limitované možnosti diferenciace
•Autologní použití •Snadná kultivace
• fúze
•Geneticky modifikovatelné •Nedělají tumory •Podání i.v.
•Tuková tkáň Další zdroje
• Zubní pulpa • Placenta a pupečník
Migrace a funkce MKB v těle příjemce
Modif. from Caplan & Dennis 2006.
Sledování buněk v těle příjemce • Post mortem: histologie, immunohistologie (lipofilní barvičky, BrDU, GFP, Lac Z, xenotransplantace,) X • In vivo: radioizotopy, kontrastní látky pro magnetickou rezonanci
Konstrukce nanočástic
5-30 nm
jádro (odpovědné za změny magnetického pole)
povrch (odpovídá za hlavní biochemické vlastnosti)
ligandy (specifická cílová místa) Intracelulární
20-120 nm Extracelulární
50 nm
Příprava a použití nanočástic k buněčnému značení
Buňky
Nanočástice
Sledování značených buněk pomocí MR
léze
transplantát
d: -1
Jendelová P et al., MRM 50: 767-778, 2003
d: 0
sledování buněk
d: +14
d: +45
MSCs označené pomocí nanočástic železa implantované do mozku potkan s mozkovou lézí
Příklady využití kmenových buněk Různé exprimentální modely
Cévní uzávěr, krvácení do mozku, epilepsie, poranění
Využití MKB v modelu mozkové příhody MKB lze geneticky modifikovat Kontrola
Max. rychlost na treadmilu
hMSC
hMSC + BDNF Nomura et al., 2005
Míšní poranění
• Podání mesenchymových kmenových buněk buněk 7 dní po poranění
Účinek implantovaných MKB na potkany s míšní lézí
Syková a Jendelová, 2005
Míšní léze (po sedmi týdnech)
Motorický test
Míšní léze (po implantaci MSCs)
Motorický test
Úplná míšní léze u laboratorního potkana a výsledek léčby pomocí kmenových buněk kostní dřeně
Měření zachovalé míšní tkáně v místě poranění
Přemostění léze pomocí biomateriálů kavita
BRIDGING THE GAP
HE
1 cm
Hydrogelový most
Umělé biomateriály - hydrogely HPMA-RGD
• Hydratované polymerní porézní materiály (gely)
HEMA B
A
• Vysoký obsah vody (EWC > 97%) • Fyzikální vlastnosti podobné prostředí nervové tkáně.
50 µ m
nanovlákna C
50 µ m
• Chemické vlastnosti široce měnitelné
vstřebatelné HEMA • Vysoká biokompatibilita • Mechanická podpora buňkám a axonům
D
• Umožňuje difuzi růstových faktorů
50 µ m
50 µ m
• V kombinaci s buňkami produkuje růstové faktory na podporu regenerace a vrůstání axonů
Míšní hemisekce 1
Míšní poran ění
2 most
33
Šití dury
Akutní míšní poranění - hemisekce
HE
Schwan. B.
p75
HE
axony
NF160
CV
axony
NF160
CV
astrocyty
GFAP
Míšní poranění –časový průběh
úraz hod
operace (dekomprese, stabilizace) hod
Přijetí do nemocnice
Rekonstrukce míšního poranění Dny, týdny ?
Můžeme stále úspěšně opravit míchu i po delším časovém úseku?
Přemostění chronické léze Kompresní léze
posttraumatická kavita 5 neděl po indukci léze
Implantace hydrogelu Přemostění léze
Přemostění chronické léze HPMA hydrogely
NF160
p75
45
p75
NF160-p75
*
Biomateriály jako nosiče buněk
Buňky
+ Biomateriály HEMA
HPMA-RGD hydrogel v míšním poranění - 6 měsíců po Tx
Funkční testy na modelu chronické léze Motorický test
Test senzitivity
Hejčl, Syková a spol., inImplantace press
Implantace
Týdny po míšním poranění
Týdny po míšním poranění
Poranění + Hydrogel + MSCs Poranění + Hydrogel
Montpellier 9 January 2009
Pouze poranění
48
p<0.05
KB v klinických studiích • Revaskularizace ischemických dolních končetin • Srdeční sval • Chrupavka a kost • Autoimunitní onemocnění • Parkinsonova choroba • Míšní poranění
Klinická aplikace KB u diabetické nohy Jehlou 26G, do hloubky 2-3 cm, vpichy á 1-2ml, celkem cca 40 vpichů
Jirkovská, Syková et al. - 7 patientu IKEM
Léčba ischemické choroby srdeční pomocí KB
-
Revaskularizace Nahrazení nefunkčních kardiomyocytů Podpora regenerace
-
Autologní kosterní myoblasty Autologní buňky kostní dřeně: a) Mononukleární buňky b) CD134+ progenitory c) Mesenchymální buňky nediferencované diferencované
Míšní poranění • 33 pacienti po míšním poranění, • Autologní buňky kostní dřeně, podáno intraarteriálně nebo intravenózně • Zlepšení - 5 ze 6 intraarteriálních aplikací - 8 ze 17 akutních případů (do měsíce po úrazu) - 2 ze 16 chronických (2 -17 měsíců po úrazu) • Bez nežádoucích účinků Syková et al., 2006
Budoucnost KB v regenerativní medicíně • Musíme vypěstovat vhodné buňky pro klinické užití a v dostatečném množství. • Takové buňky musí zůstat tak stabilní, aby stále generovaly dostatečné množství požadovaných buněk, nebo aby produkovaly faktory podporující regeneraci, diferenciaci nebo neurogenesi. • Buňky po přenosu nesmějí vytvářet nádory, nebo vést k přenosu jiných onemocnění. • Tyto buňky musí mít i u člověka potenciál napravit anatomické a funkční defekty. • Umělé biomateriály budou sloužit jako nosiče a mosty, nanotechnologie umožní sledovaní buněk i vnášet potřebné látky.
Děkuji Vám za pozornost !
