Kmenová buňka a její využití v regenerační medicíně S.Filip Klinika onkologie a radioterapie Hradec Králové ÚEM AVČR Praha OPVK – CZ.1.07/2.3.00/20.0274 © 2013
Otázka…Proč? … American Heart Association (AHA) odhaduje, že osmdesát milionů dospělých američanů (přibližně 1:3) mají jednu nebo více forem kardiovaskulárních onemocnění. V USA stojí léčba zhruba 500 miliard USD ročně, a situace se zhoršuje s rostoucí zdravotní zátěží (prostředí, migrace atd.) a jak stárne populace. Hlavním problémem jsou následky infarktu myokardu a progrese srdečního selhání, které vyžadují nákladnou léčbu. Více než 6 milionů lidí v USA trpí srdečním selháním a diagnostikováno je 670 000 nových případů/rok. Mezi hlavní cíle kardiovaskulární léčby je snížení nemocnosti a úmrtnosti v důsledku městnavého srdečního selhání, infarktu, mozkové mrtvice a dalších cévních nemocí, které s tím souvisejí.
Buněčná terapaie
(Laflamme, M.A. and Murry, Ch.E., Nature Biotechnol., 2010)
Otázka…Proč? … Světová zdravotnická organizace (WHO) odhaduje, že celosvětově diabetem typu 2 (tvoří 90-95 procent) trpí 230 milionů diabetiků, a jeho výskyt se zvyšuje alarmujícím tempem. V USA je prevalence 17,9 milionu lidí. Odhaduje se, že celkem (přímé i nepřímé) výdaje na léčbu diabetu v USA činí 174 miliard USD. Průměrné roční výdaje na zdravotní diabetiků v USA je více než 15 000 USD.
Otázka…Proč? … Podle WHO je makulární degenerace důvodem slepoty více než 50% nemocných a očekává se nárůst incidence u starší populace tj. věkem podmíněné makulární degeneraci (VPMD). V USA je asi 2 miliony lidí, kteří trpí VPMD a diagnostikováno je více než 200 000 nových případů/rok.
Otázka…Proč? … Podle WHO se uvádí že přibližně 30 milionů lidí v USA trpí bolestmi zad a přibližně 4,5 milionů mají chronické bolesti zad. Další úroveň léčby je chirurgický zákrok páteře buď celkové výměny brzd nebo spinální fúze. Degenerativní onemocnění meziobratlových plotének (DOP) je hlavní příčinou bolesti zad a může vést k těžkým zdravotním postižením a pracovní neschopnosti. Operace páteře je prosazován pouze v závažných případech DOP, z 4,5 milionu obyvatel pouze 500 000 by byly považovány za kandidáty na operaci.
Tím se vytvoří mezera kolem 4 milionů nemocných, kteří jsou v současné době neléčí. Pacienti s mírnou až středně těžkou DOP jsou běžně léčeni konzervativními postupy, spojen s významnou morbiditou a nižší produktivitu.
Otázka…Proč? … Podle WHO je alogenní transplantace kostní dřeně prováděna přibližně u 55 000 nemocných/rok. Předpokládá se, že více než 70% nemocných u kterých by bylo vhodné použít štěp od nepříbuzného dárce tuto léčbu nemůže absolvovat a to z důvodů, že není vhodný dárce kostní dřeně. Navíc tento léčebný postup je spojený s rizikem GVHD reakce atd.
Využití kmenových buněk Doporučuje se transplantace kmenových buněk u těchto nemocí: • • •
Akutní lymfoblastická leukémie (některé typy) Rakovina kostní dřeně s metastázami Neuroblastom (rozvinutý nádor z centrálního a periferního nervstva)
Předpokládá se možnost použití kmenových buněk • • • • • • • • • • • •
Autoimunitní onemocnění se závažným průběhem Lymfatická leukémie, akutní myeloidní leukémie, chronická myeloidní leukémie a lymfomy Rozvinuté nádory rakoviny prsu a děložního hrdla Náhrady zubů Střevní záněty - m. Crohn Znovuvytvoření B-buněk Langerhansových ostrůvků, které se nachází ve slinivce břišní, u lidí postižených cukrovkou Léčba ochrnutí po úrazu Léčba srdce po infarktu Léčba Parkinsonovy choroby, (možná i léčba Alzheimerovy choroby, amyotrofické laterální sklerózy a dalších závažných degenerativních onemocnění mozku) Léčba dětské mozkové obrny (DMO) Roztroušená skleróza Léčba komplikací diabetu - diabetická noha
Historie •
1973 – profesor Martin Evans a jeho tým izoloval kmenové buňky z myší.
•
1981 – Gail Martinová poprvé použila termín kmenové buňky (stem cells)
•
1995 – Američtí vědci (Wisconsin, USA) získali jako první embryonální kmenové buňky z makaků.
•
1998 – Thomson a jeho tým izolovali lidské embryonální kmenové buňky
•
2001 – Legalizace klonování lidských embryí pro získávání kmenových buněk ve Velké Británii (jako první země), ale blastocysty se musí zničit do věku 14 dní.
•
2003 – V Británii založena UK Stem Cell Bank – první evropská banka kmenových buněk. Linie embryonálních kmenových buněk jsou uchovávány zmrazené v tekutém dusíku.
•
2003 – Vědci (londýnská King College) vytvořili první linii lidských embryonálních kmenových buněk.
•
2004 – Jihokorejští vědci naklonovali 30 lidských embryí, nechali je dorůst do stadia blastocysty a získali z nich klonové buňky.
•
20. října 2005 – v jihokorejském Soulu byla otevřena banka kmenových buněk pro vytváření a dodávání nových linií kmenových buněk. Banka má sloužit také expertům obcházet omezení ve výzkumu kmenových buněk, která některé vlády zavedly (např. USA). Jižní Korea si nehodlá nové linie kmenových buněk nechat patentovat.
Výskyt kmenových buněk Dospělé kmenové buňky • • • • •
kostní dřeň tkáň amniového vaku v placentě (mají gen Oct 4 a gen nanog) – Dr. Stephen Strom, Pittsburgh krev z pupečníkové šňůry tuková tkáň bazální vrstva pokožky
Embryonální kmenové buňky ES buňky (Embryonic Stem Cells, ESCs) – z několikadenního zárodku se zdají být „nejlepší“ kmenové buňky
Získávání kmenových buněk •
•
•
•
Z nepoužitých (určených k likvidaci) několikadenních lidských zárodků (skládá se z několika desítek buněk) z klinik pro umělé oplodnění – embryo se odběrem kmenových buněk zničí, což vyvolává etické problémy. Výzkum z nadbytečných lidských embryí probíhá v mnoha státech světa včetně Česka. Terapeutické klonování (odběr buňky z pacienta → vložení do ženského vajíčka bez jádra → zárodek → blastocysta → z blastocysty se vyjmou kmenové buňky → kultivace kmenových buněk) – eticky spornější. Je v mnoha zemích zakázáno. V České republice se neprovádí, nicméně příslušná legislativa je teprve připravována. Povoleno v Jižní Koreji (a prováděno) a ve Velké Británii (přípravy na terapeutické klonování). Spojení embryonální kmenové buňky a normální lidské buňky. Takové buňky mají některé vlastnosti kmenových buněk, ale obsahují čtyři sady chromozómů. Publikovali to vědci z Harvardovy univerzity v září 2005 v časopise Science. Mezenchymální kmenové buňky (MSCs) se získávají poměrně jednoduše odběrem žádané tkáně, např. punkcí kostní dřeně nebo odběrem tukové tkáně během operace. Po rozrušení mezibuněčných vazeb se mohou kmenové buňky vytřídit na přístrojích nebo se vloží do kultivačních nádob, kde se tyto buňky známé schopností adheze poměrně snadno přichytí a kultivují, zatímco ostatní zralé buňky se „odmyjí“.
Otázka …Kdo? Kmenové buňky: Till a McCulloch - CFU-S (colony forming unit-spleen) metoda slezinných kolonií v roce 1961. Goodmanem a Hodgsonem – termín krevní kmenová buňka…
Nanotechnologie: Jako jeden ze zakladatelů nanotechnologie (třebaže ještě nepoužil toho slova) je označován laureát Nobelovy ceny Richard Feynman, který základní myšlenky představil ve své slavné přednášce nazvané „Tam dole je spousta místa“ (There's Plenty of Room at the Bottom), kterou v roce 1959 přednesl na výroční schůzi Americké společnosti fyziků.
Nanotechnologie
Otázka … Jak? + Vyhledat buňku; Vytvořit tunely skrz buněčnou stěnu a cytoplazmatickou membránu - umožňující prostup pouze specifickým látkám; Použití nanovláken v tkáňovém inženýrství – vytvoření matrice pro uchycení ex vivo kultivovaných buněk náhradní tkáně; Náhrady kostní tkáně, kloubních chrupavek, šlach, svalů, kůže a dokonce i nervové tkáně; Mezi nanotechnologie využité v medicíně bude ale možné zařadit i nanotechnologické stroje (nanoroboti).
Vědecké práce ukazují i na vážná zdravotní a ekologická rizika nanotechnologií. Nanočástice snadno pronikají do lidského těla, jsou biologicky aktivnější než větší částice, mají větší měrný povrch a schopnost dlouhodobě přetrvávat v životním prostředí a hromadit se tam. Nanočástice stříbra o průměru 30 nanometrů a menší se ukládají v tkáních vyvíjejících se embryí ryb a mohou vyvolat závažné malformace včetně krevních výronů do hlavy a otoků, které vedou k úhynu ryb.
Nanomedicína – kmenové buňky • Nanočásticové a supramolekulární systémy pro cílený transport léčiv a genové informace; • Bioanalogické polymery pro tkáňové inženýrství; • Příprava nových polymerů a semisyntetických hybridních makromolekulárních struktur - biologicky aktivních biopolymerů nebo jejich analogů; • Specifické polymerní matrice s biomakromolekulami, buňkami a tkáněmi; • Magnetické nanočástice pro vybrané aplikace v lékařství, zobrazovací magnetickou rezonanci a magnetickou hypertermii; • Biosenzory a příprava funkčních bioanalogických nanostruktur na povrchu umělých objektů. Postupnou depozicí biologických a syntetických makromolekul jsou podle předem; • Příprava detekčních vrstev biosenzorů, afinitní povrchy separačních médií, povlaky umělých povrchů snášenlivé s krví a povlaky stimulující růst buněk a tkání.
Kmenové buňky • Embryonální kmenové buňky • Fetální kmenové buňky • Dospělé kmenové buňky • Cytokiny – regulace • Mikroprostředí • Transdiferenciace, fúze, plasticita
Hematopoetické kmenové buňky (HSCs) Hematopoetické kmenové buňky u myší
Hematopoetické kmenové buňky u člověka
CD34low/-
CD34+
SCA-1+
CD59+
Thy1+/low
Thy1+
CD38+
CD38low/-
C-kit+
C-kit/low
lin-
lin-
Můžeme HSCs identifikovat? Irving Weissman a jeho skupina v roce 1988 • LT-HSC : CD34-, SCA-1+ , Thy1.1+/lo, C-kit+, lin-, CD135-, Slamf1/CD150+ • ST-HSC : CD34+, SCA-1+ , Thy1.1+/lo, C-kit+, lin-, CD135-, Slamf1/CD150+, Mac-1 (CD11b)lo • Early MPP : CD34+, SCA-1+ , Thy1.1-, C-kit+, lin-, CD135+, Slamf1/CD150-, Mac-1 (CD11b)lo, CD4lo • Late MPP : CD34+, SCA-1+ , Thy1.1-, C-kit+, lin-, CD135high, Slamf1/CD150-, Mac-1 (CD11b)lo, CD4lo
Experiment Izolace CD117+ buněk z kostní dřeně ROSA26 myši B6;129S-Gt (ROSA)26Sor
LD 9 Gy
( imunomagnetická selekce )
Buňky kostní dřeně -gal+ ( dárci)
F2 hybrid B6;129S-F2/J ( příjemci )
CD117+/-gal-
CD117+/ -gal+
Reparace krvetvorby
(FACS)
(Histochemické stanovení)
( CFU-GM )
Thymus
Thymus
Transplantace
Sledování distribuce CD117+/-gal+
Slezina
-gal+ buněk kostní dřene
Slezina
8., 12. a 30. den po transplantaci
Kostní dřeň
Žaludek a střevo
Periferní krev
Kostní dřeň
(4 hod. po ozáření)
Kost (Filip, S., et al., J.Cell Mol.Med.)
Distribuce CD117+/-gal+ v thymu 8.den
12.den
30.den
Experiment – plasticita kmenových buněk NSCs
Kardiomyocyty
Kultivace Růstové faktory
Kultivace Růstové faktory + matrice = kardiomyocyty
Fetal neokortex (E14-E15)
Roztok NaCl 0.9% a stabilizující roztok
Reparace krvetvorby…Plasticita kmenových buněk.
Funkce?
Funkce!!!
Filip et al. Current Medical Chemistry 2011, in press.
Zdravotní rizika ….?! Nanočástice jsou na rozdíl od větších částic schopny procházet biologickými membránami do Sumační syndrom vyvolaný interakcí nanočástic buněk, tkání a orgánů; Mohou proniknout do krevního oběhu po nadechnutí nebo pozření;
Eliminační techonologie
Přinejmenším některé z nich mohou pronikat kůží;
Jakmile se ocitnou v krvi, mohou být transportovány tělem a zachycovány v orgánech nebo tkáních včetně mozku, srdce, jater, ledvin, sleziny, kostní dřeně apod.; Mohou proniknout do mitochondrií neboaferéza buněčného jádra; Přístrojová a separace Plasmaferéza Studie prokázaly možnost vyvolání mutací DNA a vyvolání strukturálních změn v mitochondriích, vedoucích dokonce ke smrti buňky; Rheoferéza Nyní jsou na trhu stovky druhů spotřebního zboží obsahujících nanočástice, včetně kosmetiky, krémů na opalování, sportovního zboží, oděvů, elektroniky, výrobků pro děti a novorozence, potravin a obalů potravin. (Bláha, M., Filip, S., et al. Transf Apher Sci)
Otázka … S kým?
Hvang U-suk
Ian Wilmut
G.Bush
Ch. Reeve R.Regan
Reprogramování buněk
Legislativa ve světě a kmenové buňky Zákon č. 227/2006 Sb., o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů. •
Francie a Švédsko – povolen výzkum lidských embryí z potratů, platí zákaz výzkumu lidských embryí vytvářených v laboratoři.
•
Itálie – platí zákaz výzkumu embryonálních kmenových buněk (a zákaz asistované reprodukce a zákaz zmrazování embryí). Schválil to na jaře 2004 italský parlament na nátlak papeže.
•
Německo – povolen dovoz a výzkum lidských embryí z jiných zemí, platí zákaz vytváření lidských embryí k výzkumu.
•
USA neplatí ze státních peněz výzkum na nových buňkách z lidských zárodků, které při vynětí zanikají, ale lze využívat kmenové buňky odebrané ze zárodků před r. 2001. Od té doby jsou kmenové buňky uchovávány a rozmnožovány živé v živném roztoku. V USA tedy nelze získat nové linie kmenových buněk. Významným odpůrcem výzkumu embryonálních kmenových buněk v USA byl prezident George W. Bush. Některé konzervativní náboženské skupiny věří, že omezení by měla být přísnější, zatímco někteří vědci jsou z těchto restrikcí zklamáni. Zákon začal platit v srpnu 2001. Roku 2004 bylo povoleno vytváření lidských embryí k výzkumu v Kalifornii a v New Jersey Barack Obama tento Bushův zákon 9. 3. 2009 vetoval.
•
Na kmenové buňky z pupečníkové krve se nevztahují žádná legislativní omezení. Mají požehnání papeže. V červnu 2011 Vatikán investoval do výzkumu dospělých kmenových buněk 1 milion dolarů.
Ano Efekt léčby
Ne Nežádoucí účinky
Celkové přežití (OS) - Kvalita života (QVL)
Buněčná terapie + nanotechnologie v medicíně „Homing transplantation?…Personalizace léčby?“
Úkoly • • • •
Zdroje kmenových buněk. Nanotechnologie Buněčná terapie a klinické studie. Reparace libovolných tkání? „…čekají miliony diabetiků, nemocných po infarktu myokardu, nemocní po traumatickém poškození nervové tkáně atd.“ • Etika - Politika!
Budoucnost
