KEMAMPUAN ISOLAT BAKTERI Actinobacillus sp. DALAM MENDEGRADASI p-KRESOL DAN SUNSET YELLOW Prita Olivia Putri1; Subandi1; dan Muntholib1 Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Negeri Malang E-mail:
[email protected]
1
ABSTRAK: Penelitian ini bertujuan menguji kemampuan isolat Actinobacillus sp. dalam mendegradasi p-kresol dan sunset yellow. Degradasi dilakukan dengan menumbuhkan Actinobacillus sp. pada media M9 yang mengandung p-kresol 40 ppm dan sunset yellow 70 ppm. Pengukuran sel bakteri, konsentrasi p-kresol dan sunset yellow dilakukan berturut-turut pada OD600, A276 dan A482. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Actinobacillus sp. fase pertumbuhan lebih efektif dalam mendegradasi p-kresol (56,76%) dibandingkan fase stasioner (36%). Sedangkan dalam mendegradasi sunset yellow, inokulum Actinobacillus sp. fase stasioner lebih efektif (11,88%) dibandingkan inokulum fase pertumbuhan (2,02%). Analisis terhadap hasil degradasi menunjukkan adanya puncak-puncak serapan baru yang mengindikasikan terbentuk senyawa baru. Kata kunci: biodegradasi p-kresol, biodegradasi sunset yellow, Actinobacillus sp. ABSTRACT: The purpose of this research is to test the ability of Actinobacillus sp. in degrading p-cresol and sunset yellow. Degradation was done by growing Actinobacillus sp. in M9 medium which consist of p-cresol 40 ppm and sunset yellow 70 ppm. Cell, p-cresol and sunset yellow concentration were measured at OD600, A276 dan A482 respectively. Result showed that growth phase of Actinobacilllus sp. more effective to degrade p-cresol (56,76%) compare to stationary phase (36%). Meanwhile, in degrading sunset yellow, stationary phase of Actinobacilllus sp. is more effective (11,88%) compare to growth phase (2,02%). Analysis of the degradation products showed a new absorption peaks that indicate the formation of a new compound. Keywords: p-cresol biodegradation, sunset yellow biodegradation, Actinobacillus sp.
Muntholib dkk (2011) berhasil mengisolasi tiga jenis bakteri dari kefir grains yaitu Staphylococcus coagulase negative, Actinobacillus sp., dan Bacillus megaterium. Kefir grains sendiri merupakan konsorsium mikroba yang memiliki komponen utama berupa polisakarida. Isolat bakteri Actinobacillus sp. yang berhasil diisolasi terbukti mampu mendegradasi fenol dengan konsentrasi 2700, 4000, 6000, dan 8000 ppm (Muntholib dkk, 2011). Menurut Khleifat (2007), isolat bakteri Actinobacillus sp. memanfaatkan fenol konsentrasi tinggi sebagai sumber karbon dan energi. Fenol merupakan senyawa kimia yang berbahaya bagi tubuh karena dapat menyebabkan kerusakan pada sistem pembentukan darah yaitu pada sumsum tulang (bone marrow). Gejala keracunan akut oleh fenol ditandai dengan menurunnya kadar eritrosit dan leukosit pada darah (Mahawati dkk., 2006). Sebagian besar senyawa fenolik bersifat karsinogenik dan berbahaya bagi makhluk hidup. Salah satu senyawa fenolik adalah kresol,yang mempunyai nama IUPAC metilfenol, dengan rumus molekul C7H8OH. Kresol terdapat sebagai isomer orto, meta dan para kresol. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa m/p1
kresol dapat menyebabkan iritasi pada kulit, kebutaan, kerusakan pada membran mukosa hingga kematian. Senyawa p-kresol, seperti terlihat pada Gambar 1, dilaporkan lebih berbahaya, senyawa ini bersifat karsinogenik, pemicu terbentuknya sel kanker dalam tubuh (GDCh, 2003). OH
CH3
Gambar 1 Struktur p-Kresol
Penanggulangan pencemaran senyawa fenolik dapat dilakukan dengan berbagai cara seperti klorinasi, ozonisasi dan penyerapan menggunakan karbon. Namun cara tersebut relatif lebih mahal dan menyebabkan pencemaran lingkungan yang lain. Bioremediasi merupakan cara penanggulangan pencemaran senyawa fenolik yang lebih diminati karena lebih efektif serta ramah lingkungan. Biodegradasi dengan memanfaatkan proses enzimatis (Bhattacharya, dkk., 2012) merupakan pilihan yang paling baik dari segi keamanan lingkungan. Salah satu sumber enzim untuk keperluan bioremediasi adalah bakteri Actinobacillus sp. Kemiripan struktur antara p-kresol dan fenol serta terdapatnya ikatan rangkap terkonjugasi pada p-kresol memungkinkan p-kresol mampu didegradasi oleh isolat bakteri Actinobacillus sp. Sunset yellow adalah senyawa azo yang digunakan sebagai bahan pewarna sintetis untuk makanan. Komponen utama penyusun sunset yellow adalah senyawa disodium-2-hidroksi-1-(4-sulfonatofenilazo)naftalena-6-sulfonat disajikan pada Gambar 2. Senyawa ini memberikan warna kuning hingga oranye pada makanan. Penggunaan sunset yellow sebagai pewarna makanan diatur oleh JECFA sejak tahun 1982 dan SCF sejak tahun 1984. Berdasarkan ADI (Acceptable Daily Intake), konsumsi pewarna makanan ini dibatasi hanya sekitar 2,5 mg per kilogram berat badan. Senyawa ini bersifat karsinogenik jika penggunaannya berlebihan (EFSA, 2009).Berdasarkan strukturnya, sunset yellow merupakan salah satu senyawa hidrokarbon aromatik poliinti. Senyawa ini tergolong sebagai senyawa turunan naftalena. Biodegradasi senyawa fenolik oleh bakteri terjadi dengan adanya perombakan pada ikatan rangkap terkonjugasi atau pada cincin aromatik. Sunset yellow yang memiliki tiga gugus aromatik (benzena) dimungkinkan dapat didegradasi oleh isolat bakteri Actinobacillus sp. OH
N
N
O O
Na
S O O
Na
S O
Gambar 2 Struktur Sunset Yellow
O
2
METODOLOGI Penelitian diawali dengan pembuatan kurva pertumbuhan isolatActinobacillus sp. pada media NC (1,5 g pepton dan 0,9 g beef ekstrak) untuk mendapatkan fase pertumbuhan dan fase stasioner. Uji biodegradasi dilakukan terhadap sampel p-kresol 40 ppm dan sunset yellow 70 ppm dalam media M9 (12,8 g Na2HPO4.7H2O, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl dan 1 g NH4Cl). Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Sebanyak 1 ose bakteri dalam 25 ml media NC diinkubasi pada temperatur 37 °C, dengan agitasi 80-90 rpm selama 24 jam. Kemudian diukur nilai Optical Density(OD) menggunakan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 600 nm. Setelah dipastikan nilai OD600sekitar 0,8, diambil 0,4 ml larutan kemudian diencerkan hingga 250 ml. Selanjutnya di inkubasi pada temperatur 37 °C, dengan agitasi 80-90 rpm dan diukur nilai OD600 setiap 2 jam selama 32 jam. Uji Biodegradasi Sebanyak 2 ose bakteri dibiakkan kedalam media NC dan diinkubasi pada 37 °C, 80-90 rpm selama 6 dan 20 jam. Biakan bakteri diambil sebanyak 20 ml kemudian disentrifuge pada 4°C, 6000 rpm selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifuge dibuang, sementara pelet ditambah 1 mL media M9 dan dikocok dengan kuat hingga larut sempurna. Pelet dan media M9 ditambahkan pada 100 mL media M9 yang mengandung 70 ppm sunset yellow dan 100 mL campuran media M9 dan akuades yang mengandung 40 ppm p-kresol. Campuran kemudian diinkubasi pada 37 °C, 80-90 rpm selama 40 jam dan ditentukanOptical Density (OD) setiap 20 jam pada panjang gelombang 600 nm untuk mengetahui kenaikan jumlah sel bakteri. Untuk mengetahui perubahan konsentrasi p-kresol dan sunset yellow yang terdegradasi, campuran disentrifuge terlebih dahulu untuk memisahkan sel bakteri. Supernatan yang jernih diambil untuk diukur serapannya pada panjang gelombang 276 nm untuk p-kresol dan 482 untuk sunset yellow. HASIL DAN PEMBAHASAN Kurva Pertumbuhan Bakteri Hasil kurva pertumbuhan isolat bakteri Actinobacillus sp. di media NC seperti pada Gambar 3. Fase adaptasi tidak ditemukan, dimungkinkan karena inokulum sudah dikulturkan dalam media cair. Fase pertumbuhan berada hingga inokulum berumur 20 jam. Fase selanjutnya merupakan fase stasioner yang dimulai ketika inokulum berumur 20 hingga 30 jam. Ketika inokulum berumur lebih dari 30 jam terjadi penurunan jumlah sel bakteri yang berarti fase kematian telah tercapai.
3
Kurva Pertumbuhan Bakteri Actinobacillus sp 1
OD 600
0,8 0,6 0,4
FaseStasioner
Fase Pertumbuhan
0,2
Fase Kematian
0 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Waktu (jam)
Gambar 3 Kurva Pertumbuhan Isolat Bakteri Actinobacillus sp.
UJI BIODEGRADASI p-KRESOL DAN SUNSET YELLOW OLEH ISOLAT Actinobacillus sp. FASE PERTUMBUHAN (6 JAM) DAN FASE STASIONER (20 JAM) Isolat bakteri Actinobacillus sp. mampu mendegradasi p-kresol yang teramati dengan meningkatnya kekeruhan campuran bakteri dan p-kresol. Peningkatan kekeruhan diartikan sebagai kenaikan jumlah sel bakteri yang diikuti dengan penurunan konsentrasi p-kresol. Pengukuran konsentrasi p-kresol diukur pada panjang gelombang 276 nm. Selama inkubasi 40 jam, inokulum fase pertumbuhan mampu mendegradasi p-kresol sebesar 56,763% sementara inokulum fase stasioner mendegradasi p-kresol sebesar 36% seperti disajikan pada Tabel 1 dan Tabel 2. Tabel 1
Penurunan Konsentrasi p-Kresol Hasil Degradasi Menggunakan Inokulum Fase Pertumbuhan
41,190 ± 2,845
p-Kresol terdegradasi (ppm) 0,000 ± 0,000
p-Kresol terdegradasi (%) 0,000 % ± 0,000
39,000 ± 0,841
2,190 ± 3,687
5,318 % ± 0,818
17,810 ± 3,633
23,381 ± 6,478
56,763 % ± 6,755
Waktu
A276
Konsentrasi p-kresol
0
0,867 ± 0,052
20
0,821 ± 0,292
40
0,376 ± 0,077
Tabel 2
Penurunan Konsentrasi p-Kresol Degradasi Menggunakan Inokulum Fase Stasioner
54,762 ± 0,566
p-Kresol terdegradasi (ppm) 0,000 ± 0,000
p-Kresol terdegradasi (%) 0,000 % ± 0,000
0,870 ± 0,003
41,333 ± 0,141
13,429 ± 0,706
24,522 % ± 1,022
0,738 ± 0,049
35,048 ± 2,309
19,714 ± 1,744
36,000 % ± 3,505
Waktu
A276
Konsentrasi p-kresol
0
1,152 ± 0,012
20 40
4
Penurunan konsentrasi p-kresol degradasi yang menggunakan inokulum fase pertumbuhan lebih tajam dibandingkan degradasi yang menggunakan inokulum fase stasioner seperti disajikan pada Gambar 4.
Amaks p-Kresol (276 nm)
0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300
0,866
Inokulum Fase Pertumbuhan
0,821
Inokulum Fase Stasioner
0,654 0,555 0,376 0
10
20
30
40
Waktu (jam) Gambar 4
KurvaPenurunan Konsentrasi p-Kresol Degradasi Menggunakan Inokulum Fase Pertumbuhan dan Inokulum Fase Stasioner
p-Kresol sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi bagi isolat bakteri Actinobacillus sp. didegradasi untuk dimanfaatkan dalam proses pertumbuhan. Hal ini dibuktikan dengan peningkatan jumlah sel bakteri yang disajikan dalam Tabel 3 dan Gambar 5. Makin cepat pertumbuhan, makin banyak nutrisi yang dibutuhkan sehingga p-kresol sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi bagi isolat bakteri Actinobacillus sp. lebih banyak didegradasi oleh inokulum fase pertumbuhan dari pada inokulum fase stasioner. Dapat dikatakan bahwa inokulum fase pertumbuhan lebih efektif dalam mendegradasi p-kresol dari pada inokulum fase stasioner. Tabel 3Kenaikan Jumlah Sel Bakteri dalam p-Kresol dan Media M9 OD600menggunakan Inokulum fase Inokulum fase pertumbuhan stasioner 0,022 ± 0,005 0,040 ± 0,017
Waktu (jam) 0 20
0,080 ± 0,001
0,129 ± 0,001
40
0,154 ± 0,006
0,219 ± 0,004 0,154
Densitas Bakteri (OD600)
0,160 0,110
0,121
0,080
0,060
0,071 0,022
0,010 -0,040 0
10
20
30
40
inokulum fase pertumbuhan inokulum fase stasioner
Waktu (jam) Gambar 5
KurvaKenaikan Jumlah Sel Bakteri InokulumFasePertumbuhan dan Fase Stasioner dalam p-Kresol dan Media M9 5
Isolat bakteri Actinobacillus sp. juga mampu mendegradasi sunset yellow. Hal ini teramati dengan meningkatnya kekeruhan campuran bakteri dan penurunan konsentrasi sunset yellow. Sunset yellow merupakan senyawa turunan naftalena yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi seperti fenol dan pkresol.Selama inkubasi 40 jam inokulum fase pertumbuhan mampu mendegradasi sunset yellow sebesar 2,022% sedangkan inokulum fase stasioner mampu mendegradasi sunset yellow sebesar 11,888% disajikan pada Tabel 4 dan Tabel 5. Penurunan Konsentrasi Sunset Yellow Degradasi Menggunakan Inokulum Fase Pertumbuhan
Tabel 4
0
0,537 ± 0,054
Konsentrasi SY sisa 50,091 ± 3,150
20
0,530 ± 0,013
49,455 ± 3,022
0,636 ± 0,172
1,270 % ± 1,241
40
0,526 ± 0,004
49,091 ± 1,414
1,000 ± 0,564
2,022 % ± 0,234
Waktu
A482
SY terdegradasi (ppm) 0,000 ± 0,000
SY terdegradasi (%) 0,000 % ± 0,000
Penurunan Konsentrasi Sunset Yellow Degradasi Menggunakan Inokulum Fase Stasioner
Tabel 5
Waktu
A482
0
0,614 ± 0,051
57,091 ± 6,428
0,000 ± 0,000
SY terdegradasi (%) 0,000 % ± 0,000
20
0,558 ± 0,027
52,000 ± 0,643
5,091 ± 0,129
8,917 % ± 0,926
40
0,546 ± 0,041
50,909 ± 1,929
6,182 ± 0,579
11,888 % ± 0,103
Konsentrasi SY sisa
SY terdegradasi (ppm)
Tabel 6 Kenaikan Jumlah Sel Bakteri dalam Sunset Yellow dan Media M9 Waktu (jam) 0
OD600 Menggunakan Inokulum Fase Inokulum Fase Pertumbuhan Stasioner 0,003± 0,001 0,022± 0,003
20
0,006± 0,003
0,030± 0,008
40
0,010 ± 0,003
0,048± 0,006
Jumlah sunset yellow yang dapat terdegradasi oleh Actinobacillus sp. lebih kecil jika dibandingkan dengan p-kresol. Hal ini mungkin disebabkan karena ikatan rangkap terkonjugasi pada sunset yellow lebih banyak dari pada p-kresol serta berat molekul sunset yellow yang lebih besar menyebabkan sunset yellow lebih sukar di degradasi oleh isolat bakteri Actinobacillus sp. Daya degradasi inokulum fase pertumbuhan terhadap sunset yellow lebih kecil dibandingkan inokulum fase stasioner. Kenaikan jumlah sel bakteri dalam sunset yellow (Tabel 6) sangat kecil jika dibandingkan dengan kenaikan jumlah sel bakteri dalam p-kresol. Hal tersebut diduga karena sunset yellow sebagai satusatunya sumber karbon lebih sulit didegradasi oleh isolat bakteri Actinobacillus sp. dan sekedar untuk mempertahankan hidup,yang biasanya terjadi pada fase stasioner. Oleh sebab itu inokulum pada fase ini akan lebih kuat dalam mendegradasi sunset yellow dibandingkan inokulum pada fase pertumbuhan. Hal tersebut juga dibuktikan dengan grafik penurunan konsentrasi sunset yellow yang 6
Amaks Sunset Yellow (482 nm)
lebih tajam dibandingkan inokulum fase pertumbuhan. Sebaliknya kenaikan jumlah sel bakteri inokulum fase stasioner lebih rendah dibandingkan inokulum fase pertumbuhan seperti disajikan pada Gambar 6 dan Gambar 7. 0,620
0,614
0,606
0,600
0,601
0,596
Inokulum Fase Pertumbuhan
0,580 0,560 0,546
0,540 0
10
20
30
Inokulum Fase Stasioner
40
Waktu (jam)
Densitas Bakteri (OD600)
Gambar 6
KurvaPenurunan Konsentrasi Sunset Yellow Degradasi MenggunakanInokulumFasePertumbuhan dan Fase Stasioner
0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000
0,103
0,048
0,044
Inokulum Fase Stasioner
0,030
0,022 0
Inokulum Fase Pertumbuhan
10
20
30
40
Waktu (jam) Gambar 7
KurvaKenaikan Jumlah Sel Bakteri InokulumFasePertumbuhan dan Fase Stasioner dalam Sunset Yellow dan Media M9
ANALISIS HASIL DEGRADASI p-KRESOL DAN SUNSET YELLOW MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis Analisis puncak serapan hasil biodegradasi menggunakan spektrofotometer UV untuk p-kresolmenunjukkan munculnya puncak-puncak serapan baru. p-Kresol sebelum degradasi menyerap maksimum pada panjang gelombang 276 nm, namun setelah degradasi puncak serapannya pada 254,5 nm jika menggunakan inokulum fase pertumbuhan dan pada 259 nm jika menggunakan inokulum fase stasioner.Masing-masing spektrum p-kresol sebelum dan setelah degradasi menggunakan inokulum yang berbeda disajikan pada Gambar 8 dan Gambar 9.
7
Absorbansi (A)
1,5
Sampel p-Kresol 40 ppm tanpa bakteri
A
1 0,5
B
0 245
260
275
290
305
320
335
350
λ (nm) Gambar 8
Absorbansi (A)
A (276 nm: 1,232) B (254,5 nm: 0,408)
Spektrum serapan sampel p-kresol sebelum dan setelah 60 jam degradasi menggunakan inokulum fasepertumbuhan
1,5
Sampel p-Kresol 40 ppm tanpa bakteri
A
1 0,5
Sampel p-Kresol 40 ppm inkubasi 60 jam dengan inokulum fase stasioner
B
0 245
260
275
290
305
λ (nm) Gambar 9
Sampel p-Kresol 40 ppm inkubasi 60 jam dengan inokulum fase pertumbuhan
320
335
350
A (276 nm: 1,232) B (259 nm: 0,5137)
Spektrum serapan sampel p-kresol sebelum dan setelah 60 jam degradasi menggunakan inokulum fasestasioner
Analisis puncak serapan hasil biodegradasi menggunakan spektrofotometer UV untuk sunset yellow menunjukkan munculnya puncakpuncak serapan baru. Sunset yellow sebelum degradasi menyerap maksimum pada panjang gelombang 482 nm, namun setelah degradasi puncak serapannya pada 479,5 nm jika menggunakan inokulum fase pertumbuhan dan menggunakan inokulum fase stasioner. Masing-masing spektrum sunset yellow sebelum dan setelah degradasi menggunakan inokulum yang berbeda disajikan pada Gambar 10 dan Gambar 11. Munculnya serapan baru pada spektrum p-kresol dan sunset yellow setelah degradasi menggunakan inokulum fase pertumbuhan dan inokulum fase stasioner mengindikasikan terbentuknya senyawa baru hasil biodegradasi pkresol dan sunset yellow oleh Actinobacillus sp.
8
Absorbansi (A)
1 B
0,8
Sampel sunset yellow 70 ppm tanpa bakteri
A
0,6
Sampel sunset yellow 70 ppm inkubasi 60 jam dengan inokulum fase pertumbuhan
0,4 0,2 0 440
460
480
500 520 λ (nm)
540
560
580
A (482 nm: 0,7755) B (479,5 nm : 0,7925)
Gambar 10 Spektrum serapan sampel sunset yellow sebelum dan setelah 60 jam degradasi menggunakan inokulum fasepertumbuhan
Absorbansi (A)
1 B
0,8
Sampel sunset yellow 70 ppm tanpa bakteri
A
0,6
Sampel sunset yellow 70 ppm inkubasi 60 jam dengan inokulum fase stasioner
0,4 0,2 0 440
460
480
500 520 λ (nm)
540
560
580
A (482 nm: 0,7755) B (479,5 nm : 0,7925)
Gambar 11 Spektrum serapan sampel sunset yellow sebelum dan setelah 60 jam degradasi menggunakan inokulum fasestasioner
PENUTUP Hasil penelitian membuktikan bahwa Actinobacillus sp. fase pertumbuhan (umur 6 jam) lebih efektif dalam mendegradasi p-kresol yaitu sebesar 56,76% dibandingkan fase stasioner (umur 20 jam) yaitu sebesar 36%. Sedangkan dalam mendegradasi sunset yellow, Actinobacillus sp. fase stasioner lebih efektif (11,88%) dibandingkan inokulum fase pertumbuhan (2,02%). Analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis terhadap hasil degradasi menunjukkan adanya puncak-puncak serapan baru yang mengindikasikan terbentuknya senyawa baru. DAFTAR RUJUKAN Advisory Comittee of Existing Chemicals of the Association of German Chemist (GDCh). 2003. m/p-Cresol Category. Jerman: UNEP Publication. Bhattacharya, S., Das, A. & Nalini, P. 2012. Ex situ Biodegradation of Phenol by Native Bacterial Flora Isolated from Industrial Effluent. J. Chem. Bio. Phy. Sci. Sec. D., 2(2): 1091-1101.
9
European Food Safety Authority (EFSA). 2009. Scientific Opinion on the reevaluation of Sunset Yellow FCF (E110) as a Food Additive. EFSA Journal, 7(11): 1330. Khleifat, K. M. 2007a. Biodegradation of Phenol by Actinobacillus sp.: Mathematical Interpretation and Effect of Some Growth Conditions. Bioremediation Journal, 11(3). Khleifat, K.M. 2007b. Effect of Substrate Adaptation, Carbon Starvation and Cell Density on the Biodegradation of Phenol by Actinobacillus sp. Fresensius Environtment Bulletin., 11(3). Mahawati, E., Suhartono & Nurjazuli. 2006. Hubungan Antara Kadar Fenol Dalam Urin Dengan Kadar Hb, Eritrosit, Trombosit dan Leukosit (Studi Tenaga Kerja di Industri Karoseri CV Laksana Semarang. Jurnal Kesehatan Lingkungan Indonesia., 5 (1). Muntholib, Subandi & Kusumawati, R. 2011. Isolation and Identification of Bacteria in Kefir Grains along with The Ability on Phenol Biodegradation. Prosiding disajikan dalam the 2nd International Seminar on Chemistry, 1(7): 293-296. Jatinangor, 24-25 November.
10
