KEMAMPUAN Azospirillum sp. JG3 DALAM MENGHASILKAN LIPASE PADA MEDIUM CAMPURAN DEDAK DAN ONGGOK DENGAN WAKTU INKUBASI BERBEDA Nurosid 1) , Drs. Oedjijono, M.Sc.2), Puji Lestari, S.Si., MSi.3) 1) Mahasiswa Fakultas Biologi Unsoed, 2) Dosen Fakultas Biologi Unsoed, 3) Dosen Fakultas Sains dan Teknik Unsoed Departement of Microbiologi, Biology Faculty Jenderal Soedirman University, Purwokerto. Accepted, 21 Juli 2008
ABSTRACT A Research was conducted to know capability of Azospirillum sp. JG3 in producing lipase and effect of different time incubations to produce lipase by Azospirillum sp. JG3 in a mixture of rice bran and tapiocca waste. Qualitative test on the capability of Azospirillum sp. JG3 to produce lipase conducted in vitro and quantitative test of lipase production by the bacterium conducted experimentally used completely Randomized Design Method (RDM). Treatment was incubation times and each treatment was repeated three times. Lipase activity produced by Azospirillum sp. JG3 was measured by titration of fatty acids liberated from olive oil with 0,05 N NaOH. Result of the research showed that Azospirillum sp. JG3 grown in a mixture of rice bran and tapiocca waste was capable of producing lipase. Based on Analisis of Varians (ANOVA) affect of incubation times to lipase activity produced by Azospirillum sp. JG3 was very significant different (P<0,01). The highest lipase production found at incubation time of 96 h with activity equal to 0,266 U/minute. Key word : Azospirillum sp. JG3, rice bran, tapiocca waste, lipase production 285,51 mg/liter dari total medium kultur,
I. PENDAHULUAN Azospirillum merupakan bakteri tanah penambat nitrogen nonsimbiotik. Bakteri ini hidup bebas di dalam tanah, baik di sekitar
sehingga
dapat
meningkatkan
efisiensi
pemupukan. Azospirillum selain mampu menambat
maupun dekat dengan perakaran. Potensinya
nitrogen
telah diketahui oleh peneliti memiliki banyak
pertumbuhan, juga mampu merombak bahan
manfaat baik dalam tanah maupun pada
organik di dalam tanah. Bahan organik yang
tanaman, sehingga banyak diaplikasikan sebagai
dimaksud adalah bahan organik yang berasal
biofertilizer. Eckert et al. (2001) melaporkan
dari kelompok karbohidrat, seperti selulosa,
bahwa
sebagai
amilosa, dan bahan organik yang mengandung
biofertilizer karena mampu menambat nitrogen
sejumlah lemak dan protein. Lydia (2004)
(N2) 40-80% dari total nitrogen dalam rotan, dan
melaporkan bahwa Azospirillum sp. JG3
30% nitrogen dalam tanaman jagung. Akbari et
adalah bakteri tanah yang diisolasi dari akar
al. (2007) menyatakan bahwa bakteri tersebut
tanaman jagung. Menurut Oedjijono dkk.
juga menghasilkan hormon pertumbuhan hingga
(2003), bakteri ini mampu tumbuh pada
Azospirillum
digunakan
dan
menghasilkan
hormon
2 medium campuran dedak dan onggok yang
satu tanaman yang diketahui menghasilkan
mengandung sejumlah karbohidrat, protein dan
lipase adalah biji Wijen (Sesamun indicum)
lemak.
(Suhendra dkk., 2004). Pada manusia dan Dedak dan onggok merupakan hasil
hewan, lipase yang dihasilkan terdapat pada
sampingan dari olahan padi dan singkong serta
kelenjar pankreas. Kelompok yeast yang dapat
masih memiliki kandungan nutrisi yang cukup
manghasilkan lipase adalah dari Candida
banyak. Hasil penelitian Lubis et al. (2002)
rugosa (Fadiloglu and Erkemen, 2002), dan
dalam Nadiyah et al. (2005) melaporkan bahwa
dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger
kandungan nutrisi yang terdapat dalam dedak
dan Penicillium aurantiogriseum (Mahadik et
diantaranya adalah serat kasar 7,0-11,4%,
al., 2002; Lima et al., 2005). Adapun pada
karbohidrat 34,1-52,3%, lemak 15,0-19,7%,
kelompok bakteri,
protein 11,3-14,4% dan sejumlah kecil sumber
adalah dari genera Bacillus, Aeromonas,
vitamin.
Menurut
Pseudomonas,
onggok
masih
Sosrosoedirdjo mengandung
(1983), sejumlah
lipase yang dihasilkan
Alcaligenes,
Chromobacterium,
Arthrobacter,
Serratia,
Vibrio,
karbohidrat 67-69%, lemak 0,2-0,3%, dan
Aeromonas, dan Staphyloccus (Jospeh et al.,
protein 1,4-1,7%. Melihat sejumlah kandungan
2007).
nutrisinya yang cukup banyak, maka dedak dan
Lipase
yang oleh
dihasilkan
beberapa
faktor,
bakteri
onggok masih dapat dimanfaatkan sebagai
dipengaruhi
salah
medium pertumbuhan bagi bakteri.
satunya adalah lama waktu inkubasi. Lama
Lemak adalah energi cadangan kedua
waktu inkubasi mempengaruhi jumlah lipase
setelah karbohidrat. Azospirillum sp. JG3 akan
yang dihasilkan. Kemampuan bakteri dalam
menggunakan sumber karbon C yang berasal
menghasilkan lipase telah ditemukan dengan
dari lemak setelah kebutuhan sumber karbon
lama waktu inkubasi dari beberapa jam sampai
yang berasal dari kelompok karbohidrat dalam
beberapa hari. Pabai et al. (1996) dan Dong et
dedak
Lemak
al. (1999) melaporkan bahwa Pseudomonas
dihidrolisis oleh lipase menghasilkan asam
spp., P. fragi, dan P. fluorescens BW 96CC
lemak dan gliserol. Oedjijono dkk. (2003)
mampu menghasilkan lipase hingga mencapai
menyatakan
JG3
maksimum setelah inkubasi antara 72 dan 96
mampu tumbuh pada medium campuran dedak
jam. Menurut Mahadik et al. (2002), aktivitas
dan onggok yang mengandung lemak sampai 8
lipase Aspergillus niger maksimum
minggu, sehingga bakteri ini diduga mampu
waktu inkubasi 5 hari. Lima et al. (2005)
menghasilkan lipase.
melaporkan
dan
onggok
bahwa
telah
habis.
Azospirillum
sp.
Lipase dapat dihasilkan dari tanaman, hewan, manusia, yeast, jamur, dan bakteri. Salah
bahwa
jamur
pada
Penicillium
aurantiogriseum menghasilkan lipase setelah inkubasi 48 dan 72 jam.
3 Penelitian ini dilakukan bertujuan untuk
Fakultas
Biologi
Universitas
mengetahui kemampuan Azospirillum sp. JG3
Soedirman Purwokerto.
dalam menghasilkan lipase, pengaruh waktu
3. Metode Penelitian
inkubasi
berbeda
terhadap
kemampaun
Pengujian
kualitatif
Jenderal
kemampuan
Azospirillum sp. JG3 dalam menghasilkan
Azospirillum sp. JG3 dalam menghasilkan
lipase, dan waktu inkubasi yang diperlukan oleh
lipase dilakukan secara deskripsi analisis
Azospirillum sp. JG3 dalam menghasilkan lipase
dengan metode Kauker and Jaeger (1987),
tertinggi pada medium campuran dedak dan
pengujian secara kuantitatif aktivitas lipase
onggok.
Azospirillum sp. JG3 dengan metode titrasi
II. MATERI DAN METODE PENELITIAN
asam
1. Materi Penelitian
Azospirillum sp. JG3 dalam menghasilkan
Peralatan
yang
digunakan
dalam
basa.
Percobaan
kemampuan
lipase secara kuantitatif dilakukan secara
penelitian ini adalah petri dish, pipet ukur, pipet
eksperimental
tetes, mikropipet, lampu spirtus, erlenmeyer,
Lengkap (RAL). Perlakuan yang diujicobakan
jarum inokulasi, drugalsky, tabung reaksi, gelas
adalah tujuh macam lama waktu inkubasi (H)
piala, autoklaf, hot plate stirrer, mikroskop, pH
dari 0, 24, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam, dan
meter,
shaker
dengan
Rancangan
Acak
incubator,
wrapping,
masing-masing perlakuan diulang sebanyak 4
mikrometer,
refrigator,
(empat) kali. Variabel bebas yang diamati
freezer, sentrifuse, statif, mikroburet, dan
adalah lama waktu inkubasi, dan variabel
Biological Safety Cabinet (BSC)/Laminar Air
tergantungnya
Flow (LAF).
Azospirillum sp. JG3. Parameter utama yang
haemocytometer,
adalah
aktivitas
lipase
Bahan yang digunakan dalam penelitian
diukur adalah jumlah produk asam lemak yang
ini adalah isolat Azospirillum sp. JG3, medium
dihasilkan per menit, parameter pendukung
Caceres, medium Nutrient Agar (NA), medium
adalah jumlah populasi sel dan pH medium.
Pepton Yeast Extract (PYE), medium Nutrient
3.1. Cara Kerja
Broth
3.1.1. Persiapan percobaan
(NB),
medium
Nitrogen
Free
Bromthymolblue (NFB), medium Rhodamine B,
Persiapan sterilisasi
spirtus, lysol, minyak imersi, olive oil bermerek
autoklaf, pembuatan medium Pepton Yeast
Bertolli, gom arab, onggok dan dedak.
Extract (PYE), medium Caceres, medium semi
2. Waktu dan Lokasi Penelitian
padat Nitrogen Free Bromthymolblue (NFB),
Desember 2007 – Juli 2008 di Laboratorium Mikrobiologi dan di Laboratorium Lingkungan
dan
bahan
mencakup:
NaOH 0,05 N, indikator PP, alkohol 70 %,
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
alat
percobaan
menggunakan
medium produksi lipase (campuran dedak dan onggok), dan medium Rhodamine B.
4 3.1.2. Uji kemurnian isolat Azospirillum sp. JG3 Isolat Azospirillum sp. JG3 ditumbuhkan pada medium Caceres dan diinkubasi pada suhu o
30 C selama 2x24 jam. Koloni Azospirillum sp. JG3 pada medium Caceres berwarna merah muda sampai merah tua. Bakteri ini dibuat kultur tunggal pada petri dish yang berisi medium Caceres dan diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 30oC. Pengamatan kemurnian isolat Azospirillum sp. JG3 juga dilakukan dengan mengamati morfologi koloni, bentuk sel,
pada shaker incubator berkecepatan 125 rpm pada suhu 300C pada perlakuan 0, 24, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam. Pengukuran pH dan penghitungan
populasi
perlakuan
sel
pada
dihitung
Haemocytometer
setiap
menggunakan
sebelum
masing-masing
kultur disentrifuse. Kultur pada masing-masing perlakuan
kemudian
disentrifuse
dengan
kecepatan 5.000 rpm selama 30 menit untuk memperoleh ekstrak kasar lipase. 3.1.5. Pengukuran aktivitas Azospirillum sp. JG3
lipase
pewarnaan Gram, katalase, pertumbuhan pada
Uji aktivitas lipase dilakukan dengan
medium semi padat Nitrogen free bromthymol
substrat olive oil bermerek Bertolli dalam
Blue (NfB) dan motilitas.
bentuk emulsi. Sebanyak 5 ml emulsi sebagai
3.1.3. Uji kualitatif produksi Azospirillum sp. JG3 Kemampuan dalam
menghasilkan
lipase
lipase
secara
kualitatif dilakukan dengan menginokulasikan isolat Azospirillum sp. JG3 pada medium Rhodamine B (Kouker and Jaeger, 1987). Biakan setelah diinkubasi 2x24 jam pada o
temperatur 30 C, diirradiasi menggunakan sinar UV pada panjang gelombang 366 nm. Kontrol negatif digunakan E. coli. Hasil uji positif tampak pemendaran warna orange pada koloni Azospirillum sp. JG3, sedangkan hasil negatif tidak memendarkan warna orange. 3.1.4. Produksi ekstrak Azospirillum sp. JG3
lipase
dimasukkan
dalam
erlenmeyer
menggunakan mikropipet, diinkubasi selama 5
Azospirillum sp. JG3 enzim
sampel
menit pada suhu 35oC kemudian ditambah ekstrak kasar enzim sebanyak 400 µl dan sebagai kontrol hanya berisi 5 ml emulsi. Kontrol
dan
campuran
emulsi
enzim
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 35oC. Sebelum dititrasi, ke dalam kontrol ditambah ekstrak kasar enzim sebanyak 400 µl agar volumenya sama dengan sampel. Kontrol selanjutnya ditambah 1 tetes indikator PP dan dititrasi menggunakan NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan setelah tepat terjadi perubahan warna merah muda dan tidak kembali ke warna
kasar
Inokulum Azospirillum sp. JG3 sebanyak 3% v/v diinokulasikan ke dalam 200 ml medium campuran dedak dan onggok (3:2). Medium yang telah diberi inokulum kemudian diinkubasi
semula. Ke dalam sampel juga ditambah 1 tetes indikator PP, dan dititrasi menggunakan NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan setelah tepat terjadi perubahan warna merah muda dan tidak kembali ke warna semula.
Aktivitas lipase
5 dinyatakan
dalam
unit
aktvitas
dengan
membran
sel
(Bastarrachea
et
al.,1988;
perhitungan 1 ml NaOH 0,05 N (setelah
Hammar et al., 1995). Sel Azospirillum sp. JG3
dikurangi volume yang dibutuhkan kontrol)
berbentuk batang, hasil pewarnaan Gram
yang dibutuhkan untuk mencapai titik ekivalen
menunjukkan bahwa bakteri ini termasuk
sebanding dengan 100 unit aktivitas.
bakteri Gram negatif. Sel Azospirillum sp. JG3
4. Metode Analisis
menghasilkan gas O2 setelah koloni ditetesi
Data
yang
diperoleh
dianalisis
reagen
H2O2.
Petunjuk
ini
memastikan
menggunakan pendekatan kinetika pertumbuhan
Azospirillum sp. JG3 termasuk bakteri yang
mikroba untuk menganalisis hubungan antara
bersifat katalase positif. Hasil ini sesuai dengan
pertumbuhan Azospirillum sp. JG3 dengan
pernyataan
lipase yang dihasilkan dan Uji F. Adapun model
Azospirillum sp. bersifat katalase positif.
Holt
et
al.
(1994)
bahwa
mikroba
Pengujian kemurnian juga dilakukan
menggunakan metode dari Judoamidjojo et al.
dengan menumbuhkan Azospirillum sp. JG3
(1990); Mangunwijaya dan Suryani (1994);
pada medium semi padat Nitrogen Free
Waites et al. (2001).
Bromthymolblue (NFB). Hasil menunjukkan
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
bahwa isolat Azospirillum sp. JG3 positif motil
matematis
kinetika
pertumbuhan
isolat
ditandai dengan terbentuknya cincin seperti
Azospirillum sp. JG3 pada medium Caceres
kabut putih di bawah permukaan medium
menunjukkan bahwa bentuk koloninya bulat
setelah inkubasi 4 hari. Caceres (1982)
tidak teratur, berwarna merah muda, elevasi
melaporkan bahwa pembentukan cincin seperti
rata, permukaan halus mengkilap dengan bagian
kabut putih di bawah permukaan medium semi
tepi rata (Gambar 3.1).
padat NFB menunjukkan bahwa Azospirillum
Hasil
pemurnian
kembali
sp. bersifat motil. Uji kualitatif lipase pada medium Tween (80) dengan indikator Rhodamine B dilakukan terhadap Azospirillum sp JG3. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa Azospirillum Gambar 3.1. Koloni Azospirillum sp. JG3 pada medium Caceres
sp JG3 positif lipase ditunjukkan adanya pemendaran pada koloni berwarna orange pada
Berdasarkan Gambar 3.1 di atas, warna
saat diirradiasi di bawah sinar UV panjang
merah muda pada koloni bakteri ini disebabkan
gelombang 366 nm, dan E.coli sebagai
oleh Congo Red dalam medium Caceres yang
pembanding
terserap ke dalam sel melalui difusi sederhana
(Gambar 3.3).
dan
berikatan
dengan
komponen
protein
menunjukkan
hasil
negatif
6 transien intermediet tetrahedral, esterifikasi kovalen intermediet, dan pelepasan produk berupa asam lemak dan gliserol. Produksi lipase dari Azospirillum sp. (a) (b) Gambar 3.3. Pemendaran warna orange pada koloni (a) Azospirillum sp. JG3 dan (b) E.coli Berdasarkan uji kualitatif Azospirillum sp. JG3 positif menghasilkan lipase, maka lipid yang terdapat dalam medium dihidrolisis oleh lipase menjadi asam lemak dan gliserol. Asam lemak ini masuk ke dalam sel bakteri melalui proses difusi terbantu. Proses ini difasilitasi oleh protein pembawa. Indikator warna Rhodamine B masuk ke dalam sel melalui difusi sederhana (Rani et al., 2005). Asam lemak di dalam sel selanjutnya berikatan dengan Rhodamine B sehingga membentuk ikatan komplek. Menurut Kouker and Jaeger (1987), pembentukan ikatan
JG3 diperoleh dengan menumbuhkannya pada medium
campuran
dedak
dan
onggok,
sedangkan aktivitas lipase yang dihasilkan Azospirillum sp. JG3 diketahui
dengan
mengukur produk asam lemak yang dihasilkan. Produk
asam
lemak
ini
diukur
menggunakan metode titrasi asam basa dengan NaOH
0,05
N
sebagai
titer
dan
Phenolphthalein (PP) sebagai indikator warna (Kiran et al., 2000; Cihangir and Sarikaya, 2004; Rejeb et al., 2004). Hasil titrasi menunjukkan bahwa aktivitas lipase yang dihasilkan bakteri ini diperoleh nilai yang berbeda pada setiap waktu inkubasi (Gambar 3.4).
komplek ini terjadi karena reaksi antara kationik pada Rhodamine B dengan ion uranil dari asam lemak, sehingga koloni Azospirillum sp. JG3 memendarkan warna orange saat diirradiasi di bawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm. Lipase
dalam
menghidrolisis
lipid
berikatan dengan karboksil ester. Sisi aktif lipase yang bertanggung jawab adalah serin, histidin, dan aspartat. Jaeger et al. (1999) melaporkan bahwa mekanisme hidrolisis lipid oleh lipase terjadi dalam empat tahap, yaitu pengikatan lipid oleh residu histidin dan penyerangan oleh residu serin, pembentukan
Gambar 3.4. Histogram hasil pengukuran aktivitas lipase Azospirillum sp. JG3 pada waktu inkubasi berbeda Berdasarkan Gambar 3.4, aktivitas lipase Azospirillum sp. JG3 mulai muncul pada waktu inkubasi 48 jam sebesar 0,057 U/menit, dan pada waktu inkubasi 72 jam terjadi peningkatan 4 kali lipat yaitu sebesar 0,257 U/menit. Aktivitas lipase tertinggi didapatkan
7 pada waktu inkubasi 96 jam sebesar 0,266 U/menit. Hasil Sidik Ragam dari nilai rata-rata lipase yang dihasilkan oleh Azospirillum sp. JG3 menunjukkan bahwa pengaruh perlakuan lama waktu inkubasi berbeda sangat nyata (P<0,01) terhadap aktivitas lipase Azospirillum sp. JG3
Gambar 3.5. Hubungan antara jumlah populasi sel dan aktivitas lipase yang dihasilkan oleh Azospirillum sp. JG3
(Tabel 3.1)
Berdasarkan Gambar
Tabel 3.1. Hasil sidik ragam dari nilai ratarata aktivitas lipase Azospirillum sp. JG3 SK
DB
Perlk
6
Galat
21
Total
27
JK
0,373 606 0,014 490 0,388 096
KT
0,0622 68 0,0006 90
F Hit.
F Tabel
90,24**
3.5
di atas,
jumlah populasi sel pada waktu inkubasi 24 jam mulai mengalami peningkatan yaitu
5%
1%
sebanyak 1,05. 109 sel/ml, dan jumlah populasi
2,57
3,81
sel tertinggi dicapai pada waktu inkubasi 48 jam, yaitu sebanyak 3,06. 109 sel/ml, dan waktu inkubasi 72 jam jumlah populasi sel
Keterangan : ** = berbeda sangat nyata (α = 0,01) * = berbeda nyata (α = 0,05)
Berdasarkan Tabel 3.1, nilai F hitung
mengalami
penurunan.
Aktivitas
lipase
diketahui mulai terdeteksi pada waktu inkubasi 48 jam yaitu sebesar 0,057 U/menit pada saat
lebih besar daripada F tabel maka setiap waktu
populasi
inkubasi berpengaruh sangat nyata terhadap
Peningkatan aktivitas lipase mulai muncul
aktivitas lipase Azospirillum sp. JG3, sehingga
pada waktu 72 jam sebesar 0,257 U/menit, dan
hipotesis
waktu
mencapai jumlah tertinggi pada waktu inkubasi
inkubasi berbeda berpengaruh terhadap aktivitas
96 jam yaitu sebesar 0,266 U/menit. Terjadinya
lipase diterima. Hasil berbeda sangat nyata ini
peningkatan aktivitas lipase oleh Azospirillum
diduga
dihasilkan
sp. JG3 diduga karena pada waktu inkubasi 72
Azospirillum sp. JG3 pada setiap waktu inkubasi
jam dan 96 jam terjadi akumulasi asam lemak.
mengalami peningkatan cukup signifikan.
Lipase adalah enzim ekstrasel yang bersifat
yang
karena
menyatakan
lipase
bahwa
yang
sel
mengalami
peningkatan.
Jumlah populasi sel Azospirillum sp.
inducibel, artinya selama substrat lemak dalam
JG3 tertinggi didapatkan pada waktu inkubasi
medium tersebut masih ada, maka akan terus
48 jam. Hubungan antara jumlah populasi sel
dihidrolisis menjadi asam lemak. Akumulasi
dan aktivitas lipase yang dihasilkan oleh
asam
Azospirillum sp. JG3 dapat dilihat pada Gambar
pertumbuhan Azospirillum sp. JG3. dan dapat
3.5.
mengakibatkan kematian. Sellars and Babel (1985)
lemak
ini
melaporkan
diduga
bahwa
menghambat
pertumbuhan
Streptococcus lactis dihambat oleh adanya
8 akumulasi asam lemak pada susu basi. Cingahir
onggok mempengaruhi aktivitas lipase yang
dan
bahwa
dihasilkan Azospirillum sp. JG3. Aktivitas
produksi lipase dari jamur Aspergillus niger
lipase bakteri ini mulai meningkat pada waktu
tertinggi pada waktu inkubasi 96 jam, meskipun
inkubasi 72 jam. Ginalska et al. (2007)
populasi sel mengalami peningkatan tertinggi
melaporkan bahwa semakin tinggi sumber
pada waktu inkubasi 72 jam, setelah itu populasi
karbon dari karbohidrat yang terdapat pada
sel mengalami fase stasioner.
medium produksi lipase, maka aktivitas lipase
Sarikaya
Populasi
(2003)
sel
melaporkan
Azospirillum
sp.
JG3
semakin menurun. Immanuael et al. (2008)
tertinggi didapatkan pada waktu inkubasi 48 jam
menyatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi
dan setelah itu turun. Hal ini diduga karena
amilum yang ditambahkan pada medium
kompleknya kandungan nutrisi yang terdapat
produksi lipase bakteri Serratea rubiadea,
dalam medium produksi lipase yaitu campuran
aktivitas lipase semakin menurun.
dedak dan onggok. Analisis proksimat medium
Hubungan
antara
aktivitas
lipase
campuran tersebut menunjukkan bahwa lemak
Azospirillum sp. JG3 dengan derajat keasaman
yang terkandung di dalamnya adalah 14,211%
(pH) medium menghasilkan nilai yang berbeda
berat kering dan protein 6,640% berat kering,
pada setiap waktu inkubasi, yaitu cenderung
dan berat sisanya 79,149% berat kering adalah
berbanding terbalik antara aktivitas lipase
karbohidrat, serat kasar dan abu.
dengan pH medium (Gambar 3.6).
Karbohidrat merupakan sumber energi pertama bagi Azospirillum sp. JG3 sebelum menggunakan lemak, sehingga pada waktu inkubasi 24 jam aktivitas lipase belum muncul. Selama waktu inkubasi 24 jam bakteri ini diduga
masih
memanfaatkan
karbohidrat
sebagai sumber energi utama. Mudrikasih Azospirillum sp.
Gambar 3.6. Aktivitas lipase Azospirillum sp. JG3 terhadap pH medium
mampu menghidrolisis amilum dalam medium
Hasil pengamatan nilai pH medium
(2008) menyatakan bahwa
campuran dedak dan onggok oleh enzim amilase yang dikeluarkan, dan Halsall and Gibson (1985)
melaporkan
bahwa
Azospirillum
brasillense mampu menghidrolisis selulosa oleh sumber
inkubasi, pH semakin menurun. Pada waktu inkubasi 0 jam nilai pH medium sebesar 6,8, dan pada 48 jam pH 4,4. Nilai pH medium mengalami kenaikan kembali pada waktu
enzim selulase yang dikeluarkan. Keberadaan
menunjukkan bahwa semakin lama waktu
karbon
dari
karbohidrat pada medium campuran dedak dan
inkubasi 72 jam yaitu sebesar 6,3 sedangkan pada waktu inkubasi 96, 120, dan 144 jam
9 mengalami penurunan. Terjadinya penurunan
(Ginalska et al., 2007). Fadiloglu and Erkmen
pH medium pada waktu inkubasi 24 jam diduga
(2002) melaporkan bahwa produksi lipase oleh
oleh pembentukan asam organik. Aggarwal
Candida rugosa ditemukan meningkat saat
(2006) melaporkan bahwa degradasi kelompok
dalam medium produksi ditambah sumber
karbohidrat
nitrogen.
seperti
amilum
oleh
bakteri
Lactobacillus selain menghasilkan asam laktat juga menghasilkan asam organik.
IV. KESIMPULAN Azospirillum
Pada waktu inkubasi 48 jam, nilai pH
sp.
JG3
mampu
menghasilkan lipase, dengan pengaruh waktu
medium mengalami penurunan 3 kali lipat
inkubasi
dibandingkan waktu inkubasi 0 jam dan pada
dihasilkan berbeda sangat nyata, dan waktu
waktu inkubasi tersebut aktivitas lipase yang
inkubasi yang dibutuhkan untuk menghasilkan
dihasilkan oleh Azospirillum sp. JG3 mulai
lipase tertinggi oleh Azospirillum sp. JG3 pada
muncul. Terjadinya penurunan pH hingga 3 kali
medium campuran dedak dan onggok adalah
lipat selain disebabkan oleh pembentukan asam
96 jam dengan aktivitas sebesar 0,266 U/menit.
organik
aktivtas
lipase
yang
juga diduga disebabkan oleh asam
lemak yang dihasilkan dari hidrolisis lemak oleh lipase yang dihasilkan Azospirillum sp. JG3. Pada waktu inkubasi 72 jam,
nilai pH
mengalami peningkatan menjadi 6,3. Hal ini seiring dengan peningkatan aktivitas lipase yang dihasilkan Azospillum sp. JG3 sebesar 0,257 U/menit. Terjadinya peningkatan nilai pH diduga disebabkan oleh adanya amoniak (NH3) yang terbentuk dari hasil fiksasi nitrogen (N2). Azospirillum
sp.
kekurangan
oksigen,
nitrogenase
untuk
JG3
di akan
mengikat
bawah
kondisi
mengeluarkan nitrogen
dan
membentuk menjadi amoniak (Halsall and Gibson, 1985). Amoniak yang terbentuk inilah yang diduga menjadikan pH medium produksi lipase Azospirillum sp. JG3 meningkat kembali. Mikroorganisme umumnya memproduksi lipase tinggi
terhadap
ketika
sumber
nitrogen
digunakan
UCAPAN TERIMA KASIH Thanks to: Drs. Oedjijono, M.Sc, Puji Lestari, S.Si. M.Si, Drs. Slamet Priyanto, MS., Dra. P. Maria Hendrati, M.Si, Dra. Dyah Fitri K., MP., Sri Lestari, M.Si, Dr. Hendro Pramono, Dra. Dini Ryandini, M.Si, dan Joseph D Schrag. DAFTAR REFERENSI Aggarwal, S. 2006. Isolation and Characterization of Starch Degrading Lactic Acid Bacteria. Dissertation. Department of Biotechnology and Env. Sciences Thapar Institute of Engg. & Technology. Deemed university, Enggland. Akbari, Gh. A., S. M Arab, H. A Alikhani, I. Allahdadi and M.H. Arzanesh. 2007. Isolation and selection of indigenous Azospirillum spp. and IAA of Superior strain on wheat roots. World Journal of Agricultural Sciences, 3: 523-529. Bastarrachea, F., M. Zamudio, and R. Rivas. 1988. Non encapsulated mutans of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum, Can. J. Microbiol., 34: 24-29
10 Caceres, E. A.R. 1982. Improved medium for isolation of Azospirillum spp. Applied and Environmental Microbiology, 44: 990-991. Cingahir, N and E. Sarikaya. 2004. Investigation of lipase production by a new isolate of Aspergillus sp.. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20: 193197. Dong, H., S. Gao, S. Han, and S. Cao. 1999. Purification and characterization of a Pseudomonas sp. lipase and its properties in non-aqueous medium. Appl. Microbiol Biotechnol., 30: 251– 256. Eckert, B.O.B. Weber, G. Kirchhof, A. Halbritter,M Stoffels1 and A.Hartmann. 2001. Azospirillum doebereinerae sp. nov., A nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 17–26. Fadiloglu, S and O. Erkmen. 2002. Effect of carbon and nitrogen sources on lipase production by Candida rugosa. Trukish J. Eng. Env. Sci., 26: 249-254. Ginalska, G., Hee-Yeon CHO, Nam-Seok CHO, R. Bancerz, T. Kornilowicz, A. Leonowicz, S.J. Shin, and S. OGHA. 2007. Effect of culture conditions on growth and lipase production by a newly isolat strain, Geotrichum –like R59 (Basidiomycetes). J. Fac. Agr, Kyushu Univ., 52 : 29-34. Gupta, R., N. Gupta, and P. Rathi. 2004. Bacterial Lipases: An Overview of Production, Purification and Biochemical Properties. Appl Microbiol Biotechnol, 64: 763 – 781. Halsall, D.M. And A.H. Gibson. 1985. Cellulose decomposition and associated nitrogen fixation by mixed culture of Cellulomonas gelida and Azospirillum spesies or Bacillus macerans. Applied and Environmental Microbiology, 50: 1021-1026. Hammar, M., A. Arnqvist, Z. Bian, A. Olsen, and S. Normark. 1995. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin and congo red
binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol., 18 : 661670. Immanuel, G., P. Esakkiraj, A. Jebadhas, P. Iyapparaj and A. Palavesam. 2008. Investigation of lipase production by milk isolate Serratia rubidaea. Food Technol Biotechnol., 46 : 60–65. Hastuti, R.D., dan L. Gunarto. 1993. Interaksi pemberian N dan inokulasi Azospirillum terhadap pertumbuhan tanaman jagung. Risalah Hasil Penelitian Tanaman Pangan, 3 : 1619. Holt, J. G., N.R. Kieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology; Nith Edition. Lippincott Williams and Willeins, America. Jaeger, K. E., S. Ransac, B. W. Dijkstra, C. Colson, M. Vanheuvel, and O. Misset. 1994. Bacterial lipases. Fems Microbiol Rev., 15 : 29-63. Jaeger, K. E., B. W. Dijkstra, and M.T. Reetz. 1999. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three dimensional structures, and biotechnological aplications of lipases. Annual Review of Microbiology, 53 : 315-351. Joseph, B., P.W. Ramteke1, G. Thomas, and N. Shrivastava1. 2007. Standard review cold-active microbial lipases: a versatile tool for industrial applications. Biotechnology and Molecular Biology Review, 2 : 039048. Judoamidjojo, M., M.A. Darwis dan E.G. Said. 1990. Teknologi Fermentasi. Rajawali, Jakarta. Kammimura, E.S.O. Mendreta, H.H, G. Pastore and Mangeri. 1999. Production of Lipase from Geotricum sp. and Adsorption Studies of Affinity Resin. Departement of food Enginering. Steite of University Companies, Brazil. Kiran, K.R., S.H. Krishna, C.V.S. Babu, N.G. Karanth and Divakar. 2000. An esterification mehtod for determination of lipase activity. Biotechnology Letters, 22: 1511-1514.
11 Kosugi, Y., H. Tanaka and N. Tomizuka. 1990. Continuous hydrolysis of oil by immobilized lipase in a counter current reactor. Biotechnol. & Bioengin, 36: 617-622. Kouker, G and K Jaeger. 1987. Specific and sensitif plate assay for bacterial lipases. Applied and Environmental Microbiology, 53: 211-213. Leow, T. C., R.N.Z.R.A. Rahman, M. Basri, and A.B. Saleh. 2004. High level expression of thermostable lipase from Geobacillus sp. Strain T1. Biosci. Biotechnol. Biochem, 68: 96 –103. Lima, V.M.G., N. Krieger, M. I. M. Sarquis, D.A. Mitchell, L.P. Ramos and J.D. Fontana. Effect of nitrogen and carbon sources on lipase production by Penicillium aurantiogriseum. Food Techol. Biotechnol, 41: 105-110. Lydia, I. 2004. Kemampuan Bakteri Penambat Nitrogen Azospirillum spp. yang DiIsolasi dari Beberapa Akar Tanaman dalam Meningkatkan Pertumbuhan Tanaman Jagung. Skripsi S1, Tidak Dipublikasikan. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto. Mahadik, N.D., U.S. Puntabekar, K.B. Bastawde, J.M Khire and Gokhale. 2002. Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid state fermentation. Process Biochemistry, 38: 715-721. Mangunwidjaja, D. dan A. Suryani. 1994. Teknologi Bioproses. Swadaya, Jakarta. Mehnaz, S., B. Weselowski and G. Lazarovites. 2007. Azospirillum canadense sp. nov., A nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57: 620-624. Mudrikasih, D. K. 2008. Kemampaun Azospirillum sp. dalam Menghasilkan Amilase pada Medium Onggok dan Dedak dengan Waktu Inkubasi Berbeda. Skripsi. Tidak Dipublikasilan. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Nadiyah, Krisbiyanto dan A. Azizah. 2005. Kemampuan bakteri Acetobacter xylinum mengubah karbohidrat pada
limbah padi (Bekatul) menjadi selulosa. Bioscience, 2: 37-47. Oedjijono, D. Ryandini, I.D.S.A.P. Permiarti. 2003. Formulasi Biofertilizer dari Kultur Campuran Bakteri Pemfiksasi Nirtogen dan Pelarut Fosfat pada Medium Onggok dan Dedak. Laporan penelitian (tidak dipublikasikan). Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto. Pabai, F, S. Kermasha and A. Morin. 1996. Use of continuous culture to screen for lipase producing microorganisms and interesterification of butter fat by lipase isolates. Can J. Microbiol., 42: 446– 452. Paul, E., D. Mulard, P. Blanc, J. Fages, G. Goma, and A. Pareilleux.1990. Effects of Partial O2 Pressure, Partial CO2 Pressure, and Agitation on Growth Kinetics of Azospirillum lipoferum under Fermentor Conditions. Applied and Environmental Microbiology, 56: 3235-3239. Peng, G, H. Wang, G. Zhang, W. Hou, Y. Liu, E. T. Wang and Z. Tan. 2006. Azospirillum sp. Nov., A group diazotrohps isolated from tropical molasses grass. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology, 56: 1263-1271. Putranto, R. A.,D. Santoso, T. Panji, Suharyanto dan A. Budiani. 2007. Karakterisasi gen penyandi lipase dari kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera. Menara Perkebunan, 74, 23-32. Rani, S. A. B. Pitts, and P.S. Stewart. 2005. Rapid diffusion of fluorescent tracers into Staphylococcus epidermidis biofilms visualized by time lapse microscopy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49 : 728–732. Rejeb, I.B., J.B Hamida & M. Gargouri. 2004. Couple-enzyme system for the determination of lipase activity. Biotechnology Letters, 26: 1273-1276. Rusdiana. 2004. Metabolisme Asam Lemak. Fakultas Kedokteran. USU, Sumatera Utara. Salomon, S. 2003. A Secreted lipase as a virulence factor of Fusarium
12 graminearum. Hamburg, Dept Molecular phytopatolog and Genetic. Univ. of Hamburg.19 p. Saribay, G. F. 2003. Growth and Nitrogen Fixation Dynamics of Azotobacter chroococcum in Nitrogen Free and OMW Containing Medium. Thesis. The Midle East Technical University, USA. Schrag, J.D., Y. Li, M. Cygler, D. Lang, T. Burgdorf, H.J. Hecht, R. Schmid, D. Schomburg, T.J. Rydel, J.D. Oliver, L.C. Strickland, C.M. Dunaway, S.B Larson, J. Day and A. Mc-Pherson. 1997. The open conformation of a Pseudomonas lipase. Structure, 5 : 1872002. Sellars, R.L. and F.J. Babel. 1985. Cultures far the manufacture of dairy products, p. 162. Chp. Hansens's Lab. Inc. Milmankee, Wisconsin. Schmidt-Dannert, C.M. Luisa Rua, R.D. Schmid. 1997. Two novel lipases from the thermophile Bacillus thermocatenulatus: Screening, purification, cloning, over expression and properties. Methods Enzymol., 284: 194–219. Sharma, R., S.K. Soni, R.M. Vohra, R.S. Jolly, L.K. Gupta, J.K. Gupta. 2002. Production of extracellular alkaline lipase from a Bacillus sp. RSJ1 and its application in ester hydrolysis. Ind J. Microbiol, 42: 49–54. Soebardjo, B.J, Maryanto, Karsini, Suyata dan N. Diastuti. 1997. Pengembangan potensi bakteri bongkrek Pseudomonas cocovenenans X-128 untuk produksi gliserol, asam laktat, gliserol dan lipase. Jurnal Agrin., UNSOED, Purwokerto. Sosrosoedirdjo, R.S. 1983. Bercocok Tanam Ubi Kayu. Yasagama, Jakarta. Suhendra, L., Tranggono dan C. Hidayat. 2004. Aktifitas hidrolisis dan esterifikasi lipase ekstrak kecambah biji wijen (Sesamun indicum). Prossiding Seminar Nasional Kongres PATPI, Jakarta. 17-18 Desember 2004. Suzuki, T., Y. Mushiga, T. Yamane and S. Shimizu. 1988. Mass production of lipase by fed batch culture of
Pseudomonas fluorescens. Appl. Microbiol.Technol, 27: 417-422. Waites, M. J., N.L. Morgan, J.S. Rockey and G. Hington. 2001. Industrial Microbiology. Blackwell Science, Inc. USA. Yatim, W. 2003. Kamus Biologi. Yayasan Obor Indonesia, Jakarta.
