Katedra netkaných textilií a nanovlákenných materiálů
Stereologie (Kvantitativní histologie)
[email protected] [email protected]
[email protected] [email protected]
Doporučená literatura
David Lukáš, Stereologie textilních materiálů, skripta TU Liberec, 1999 www.stereology.info J. C. Russ, R. T. Dehoff, Practical Stereology, Kluwer Academic, New York, 2000 L. Kubínová, J. Albrechtová, Stereology in Plant Anatomy, Charles University, Prague, 1999. Z. Tonar, Atlas kvantitavní histologie, LF UK, Plzeň
Dimenze prostoru Euklidovský n – dimenzionální prostor je metrický prostor kde každá dimenze prostoru musí být ortogonální (kolmá) na všechny zbývající dimenze. 0D: bod, číslo, počet (vesmírný prach) 1D: úsečka, přímka (délka) 2D: délka + šířka, plocha – snímek z mikroskopu 3D: objem, póry … 4D: Čtvrtá prostorová dimenze??? Fyzikálně čtvrtou dimenzí je čas (Teorie relativity, Einstein 1905)
??? Co je stereologie ??? Z řeckého stereos = pevný : „ prostorová interpretace řezů“ Interpretace tří-dimenzionálních struktur pomocí analýz dvou-dimenzionálních obrazů materiálů nebo tkání. Obecně: Stereologie je věda odhadující informace o vícedimenzionálních objektech z níže dimenzionálních vzorků. Stereologie je metoda, která uplatňuje náhodné systematecké vzorkování pro získání objektivních a kvantitativních dat
Příklady užití stereologie 1 Buněčná biologie Výpočet celkové délky vlásečnic v jednotce objemu biologické tkáně pomocí počítání množství jejich profilů na jednotku plochy v typickém histologickém řezu tkáně. Neurobiologie Počítání množství mozkových buněk v dané oblasti mozku. Medicína, histologie a embryologie Výpočet celkového objemu nádoru v dané oblasti. Populární věda pomocí stereologie zjistila, že plocha plic zabírá plochu rovnou rozloze tenisového hřiště. Patologie, anatomie …
Příklady užití stereologie 2 Geologie, Petrologie Výpočet objemového podílu krystalů v kamenech pomocí měření plošného zlomku na vybroušené části. Počítání plochy pórů v jednotce objemu například v keramice, pomocí měření obvodů pórů v daném plošném řezu a následnému vynásobení 4/π. Botanika, Ekologie, Metalurgie, Lesnictví … !!! Tkáňové inženýrství !!!
Historie Stereologie vychází z geometrie, jejíž poznatky aplikuje na analýzu vzorků rozmanitého původu, velikosti a vnitřní struktury. Základní problém bylo jak pomocí 2D řezů hodnotit 3D objekt Nutné zvládnutí různých mikroskopických technik pro zvládnutí sérií fyzických či optických řezů Šedesátá léta 20. století jsou považována za první dekádu moderní histologie a stereologie. Rozvoj elektronové mikroskopie a korigované optiky.
Pohled do dávné minulosti
Pozorování temných galaxií z raného vesmíru
Bonaventura Francesco Cavalieri (*1598 – ᵻ1647) Italský matematik, student G. Galilea, r. 1637 formuloval postup umožňující dostatečně přesný odhad středního objemu pomocí součtu ploch, která tělesa zaujímají na sérii ekvidistantních řezů Cavalieriho princip říká: Mají-li dvě tělesa stejnou základnu a stejný profil na řezech paralelních se základnami v téže výšce u obou těles, pak je objem těchto těles totožný
Použití Cavalieriho principu ukazuje hranice mezi nádorem a mozkouvou tkání
O. Sonmez, et.al. Journal of Clinical Neuroscience, Vol. 17, Issue 12, 2010.
Výpočet objemu koule (Cavalieriův princip) Mějme „náhradní těleso“, rotační válec s poloměrem podstavy r a výškou také r, ze kterého je vyjmut rotační kužel také s poloměrem podstavy r a výškou r. Lze nyní ukázat, že polokoule a "náhradní" těleso mají stejný objem. Představme si, že obě tělesa řízneme rovinou rovnoběžnou s podstavou tělěsa. V případě polokoule vznikne jako plocha řezu kružnice (zelená), v případě "náhradního" tělesa mezikruží (oranžové). Vzdálenost h roviny řezu od roviny podstavy je v každém případě hodnota mezi 0 a r.
Výpočet objemu koule (Cavalieriův princip) 2 Známe-li r a h, dokážeme obě plochy řezu vypočítat. Obsah zelené plochy řezu nejdříve vyjádříme S1 = s2π. Nyní si uvědomíme, že trojúhelník vpravo dole je pravoúhlý. Dosazením do Pythagorovy věty s2 + h2 = r2, dostáváme s2 = r2 h2. Z toho tedy plyne, že obsah zelené plochy je S1 = (r2 - h2) π. Ještě jednodušší je výpočet oranžově vyznačené plochy řezu: Vezme si obsah vnější kruhové plochy bez obsahu vnitřní kruhové plochy a tím dostaneme S2 = r2 π - h2 π = (r2 - h2) π. Obsahy obou ploch řezu se shodují a to pro každou hodnotu h mezi 0 a r. Podle Cavalieriho principu se musí tedy také shodovat i objemy obou těles - polokoule a "náhradního" tělesa. Vpolokoule = V"náhr." těleso = VVálec - VKužel = r2 π · r - (1/3) r2 π · r = (2/3) r3 π
Hrabě George-Louis Leclerc Buffon (*1707 – ᵻ1788) Francouzský matematik, přírodovědec a osvícenský spisovatel, dlouholetý ředitel pařížské botanické zahrady. Roku 1733 popsal tzv. problém „Buffonovy jehly“ v němž popisoval vztah mezi pravděpodobností vzniku průsečíku náhodně hozené jehly (hůlky) a systémem paralelních ekvidistantních spár v podlaze, na niž jehly dopadly, délkou jehel (hůlek) a rozestupem spár.
http://mathworld.wolfram.com/BuffonsNeedleProblem.html
ÚLOHA: Buffonova jehla
2l
2a
Jaká je pravděpodobnost, že vržená jehla dopadne na linkovaný papír tak, že překříží jednu s čar?
Úloha: Buffonova jehla 1 Předpokládáme, že l < a. Prostor všech možných jevů je popsán dvěmi proměn-nými – x a φ, kde x je vzdálenost středu jehly od nejbližší linky a φ je úhel, který jehla s linkou svírá. Je-li x > a, je jehla v dosahu další linky a jehla přes dvě spadnout nemůže, tedy
ϕ
x
x ∈ 0, a Úhel pak má smysl v intervalu
l
ϕ ∈ 0, π
Prostor všech možných jevů je tedy plocha :
M = 0, a × 0, π
a M 0
0
π
Úloha: Buffonova jehla 2
ϕ
x
Aby jehla překřížila linku, musí platit
l ⋅ sin ϕ ≥ x což geometricky vyjádřeno je
l
a
M A
Potřebujeme znát plochu pod křivou – a tu získáme integrací:
A= Z toho plyne
∫
π
0
l sin ϕ
0
0
x = l ⋅ sin ϕ
d ϕ = − l [cos ϕ ]0 = 2 l
A 2l p= = M a ⋅π
π
π
Cvičení Početní úloha Pomocí vztahu pro výpočet délky „Buffonovy jehly“ spočítejte hodnotu π. Postup: Narýsujte si rovnoběžné přímky se vzdáleností a. Poté použijte sirku/párátko o délce l (l
2l p= a ⋅π vypočítejte hodnotu π a porovnejte ji se skutečnou hodnotou.
Achille Ernest Oscar Joseph Delesse (*1817 – ᵻ1881) Francouzský geolog a mineralog roku 1847 popsal empirickou techniku pro odhad objemových frakcí minerálů v hornině na základě plošných podílů těchto minerálů na výbrusu horninou. V roce 1898 byl Delesseho přístup doplněn rovněž empirickým Rosiwalovým pravidlem usnadňujícím odhad plošných podílů pomocí praktičtějších podílů délkových.
Methods for estimation of profile area on random sections http://www.ibro.info/Pub/Pub_Main_Display.asp?LC_Docs_ID=3159
Příklad: počet neuronů v mozkové kůře člověka v miliardách (109) Meynert (1868) 0,6 Donaldson (1895) 1,2 Thompson (1899) 9,3 Berger (1821) 5,5 Von Economo (1926) 14,0 Agduhr (1931) 5,0 Shariff (1953) 6,9 Haug & Rebhan (1956) 16,5 Pakkenberg (1966) 2,6
Katedra netkaných textilií a nanovlákenných materiálů Druhá přednáška předmětu Stereologie a kvantitativní histologie
Unbiased stereology (Pokračování historického úvodu) Petr Mikeš, Jana Horáková, David Lukáš 2013
První dekáda stereologie (1961-1971) V šedesátých letech dochází k technologickému vývoji mikroskopie => biologové mohou poprvé vidět tkáně, buňky, cévy apod. s větší ostrostí a přesností. Tyto pokroky zahrnovaly možnosti cenově dostupné optiky s vysokým rozlišením pro světelnou mikroskopii, zdokonalení elektronové mikroskopie a metody přípravy vzorků. Tato technika umožňovala například určit jednotlivé proteiny v biologické tkáni (imunocytochemie). Jakmile lidé spatřili více objektů s většími detaily než kdykoliv před tím, začali si pokládat otázku:
??Kolik tam toho je??
Kolik tam toho je?? Aby si biologové odpověděli na tuto otázku zaměřili se na jednoduchý úkol: Získat 3-D informace o biologických objektech pomocí jejich 2-D řezů. Splnit tento úkol znamenalo vytvoření nových matematických metod, které položily základy nového oboru jménem STEREOLOGIE. Na mezinárodním kongresu stereologické společnosti (International Society for Stereological Conference ISS), která se pořádá každý rok, začali stereologové z různých vědních disciplín prezentovat a diskutovat jejich nové teorie, jak nejlépe tyto základní problémy vyřešit. Biologové na těchto setkáních zjistili, že jejich kolegové z jiných vědních disciplín vyvinuli praktické metody, které se mohou přímo uplatnit v jejich výzkumu.
Sedmdesátá léta dvacátého století (1961 – 1971) V tomto období přibývá stereologických prací. Vznikají nové časopisy jako Acta Stereologica a přibývají příspěvky v časopisech jako Journal of Microscopy, Microscopy Research and Technique apod. -Velké uplatnění nachází stereologie především v oblasti neurověd. -Další uplatnění je zejména v biologii (popis složitějších 3D objektů). -Postupné uplatňování stochastické (náhodné) geometrie a implementace teorie pravděpodobnosti. -Stereologické postupy na tomto základě využívají nevychýlené vzorkování (unbiased sampling).
Magnetická rezonance lidského srdce
Tomografický snímek lidského mozku
Unbiased stereology Tato technika dává vznik škálově univerzálnějším kvantifikačním technikám nezatíženým a priori předpoklady o povaze studovaného materiálu (assumption-free, model-free unbiased methods). Tento přístup je souborně nazýván Unbiased Stereology Tyto metody se vyznačují tím, že nárůstem počtu hodnocených vzorků ve studii klesá rozptyl výsledků kolem centrální tendence, která není od „skutečné“ hodnoty vychýlena. Stereologický bias: odchylka výsledků od skutečné hodnoty vzniklá vlivem systematické chyby.
Kvantifikace neuronů v šedé kůře mozkové pomocí Unbiased stereology. J. Hopkins University, Maryland, USA
Systematické chyby vznikaly především proto, že hodnotitelé často zobecňovali zkoumané objekty. Např. v biologických aplikacích často považovali buňky, popř. buněčná jádra za kulovité útvary, což ne vždy odpovídá skutečnosti. Proto byly výsledky přepočítávány s použitím různých korekčních faktorů apod. Součet těchto nepřesností poté vedl k již zmíněným systematickým chybám.
3T3 myší fibroblasty
Krevní buňky s rozdílnou strukturou buněčného jádra
Kombinace nevychýleného vzorkování (unbiased sampling) a nevychýlených geometrických sond
Kombinace těchto dvou metod byla následně použita pro kvantifikaci stereologických parametrů prvního řádu (počet, délka, plocha a objem) na anatomicky dobře definované oblasti tkáně. Tyto studie ukázaly prvně v historii, že je možné použití domněnky a přibližování se k volnému modelu pro kvantifikaci stereologických parametrů prvního řádu (viz. výše) bez potřeby dalších informací o velikosti, tvaru nebo orientaci spodních objektů.
Osmdesátá léta dvacatého století (1981 – 1991) Řešena jedna ze základních otázek stereologie: Problém spolehlivého a univerzálního počítání trojrozměrných objektů z dvojrozměrných řezů. Korpuskulární problém: Počet profilů v jednotce plochy histologického řezu neodpovídá počtu reálných trojrozměrných objektů v objemu tkáně S.D. Wicksell 1925. Různé objekty mají v závislosti na svém tvaru, velikosti a orientaci odlišnou pravděpodobnost výskytu v rovině řezu (Různé směry mají v daném řezu různou pravděpodobnost, že budou započítány). Řešení tohoto problému, které bylo poprvé publikováno v r. 1984, se nazývá princip disektoru. Corpuscule problem
Princip disektoru Řešení korpuskulárního problému bylo poprvé publikováno v Journal of Microscopy v roce 1984. Byla to první nestranná (unbiased) metoda pro odhad počtu objektů v daném objemu tkáně bez dalších předpokladů, modelů nebo korekčních faktorů. Disektor je 3-D sonda, která obsahuje dvě sériové sekce známé jako délkové části (výška disektoru) s rámečkem disektoru známé naskládané plochy v jedné sekci. V roce 1985 je publikována technika jiné stereologické objemové sondy tzv. „unbiased brick“, která slouží ke stejnému účelu jako disektor, ovšem postupuje podle odlišných pravidel.
Kombinace disektoru se systematickým vzorkováním přinesla techniku frakcionátoru.
Frakcionátor Metoda frakcionátoru (Dokonalejší počítání množství objektů eliminující potenciální ztrátu jednotlivých objektů v definované oblasti tkáně. Gundersen, 1986; West et al., 1991). Metody disektoru a frakcionátoru dávají spolehlivé odhady objektů ve známé oblasti pomocí opakovaného použití metody disektoru v systematicky-náhodných lokacích pomocí anatomicky definovaného objemu v dané oblasti.
Kombinace disektorového počítání s vysoce přesným systematickynáhodným vzorkováním umožnilo optimální efektivitu počítání. Ostatní techniky osmdesátých let zahrnovaly metody nevychýlených odhadů velikostí objektů za použití nukleátoru, rotátoru a point-san.
Začalo být tedy jasné, že nevychýlené odhady jakéhokoliv stereologického parametru vyžaduje výběr vhodné korekční sondy, takové která nevynechá žádný objekt zájmu. Pokud zahrneme, že dimenze zkoumaného parametru pomocí sondy, jenž má dostatečný počet dimenzí, musí být tedy celkový počet dimenzí minimálně 3 (dimenze parametru + dimenze sondy > 3)
Zahrnutí všech odchylek (variací) Biologové si uvědomili, že je nutné zahrnutí všech zdrojů chyb (variací) vycházejících z předpokladů a modelů. Všechny pozorované variace a jejich výsledky mohou být akurátně rozděleny do dvou nazávislých zdrojů: „bilogické“ variace (interindividual) a chyby vzorkování (intra-individual) Inter-individual (biologické variace) rozdíly vycházejí z biologické podstaty (evoluce, genotyp, enviromentální faktory atd.). Představují největší zdroj variací všech morfologických analýz biologických tkání. Snížení množství variací můžeme dosáhnout pomocí zpřesnění vzorkování. Tím však rostou nároky na celkovou analýzu. Proto může být důležité najít první a druhý zdroj celkových variací vycházející z hustoty vzorkování. Inta-individual (chyby vzorkování): snížení chyby vzorkování pomocí vzorkování více sekcí či více regionů s danými sekcemi je méně náročné na výpočet než vzorkování více individuálních částí. Pomocí rozdělení zjištěných variací do variací vycházejících z biologické podstaty a chyb vzorkování se bio-stereologové naučili navrhnout a optimalizovat schémata vzorkování s maximální efektivitou.
Do More, Less Well
Pro moderní stereologii je prioritou množství „práce“ které je třeba vynaložit pro dosažení nejlepšího výsledku odhadované hodnoty. V šedesátých letech dvacátého století například strávil jeden vědec dva roky počítáním 242 681 buněk v dané oblasti jedné strany mozku. Bylo tedy nutné hledat nové způsoby. Vznikají nové mezioborové směry spojením sil biologů, matematiků a statistiků pro hledání optimálního vzorkování tak, aby byla každá jednotka definovaná bez ohledu na strukturu organismu.
Do More, Less Well V praxi je vždy startovním bodem vymezení referenčního prostoru. Referenčním prostorem je například míněn objem tkáně obsahující zkoumané objekty, deset náhodně-systematických sekcí a kvantifikace parametru zájmu. Vše se musí opakovat na 2-3 objektech z každé skupiny. Z těchto výsledků může být pouze zlomek z celkových pozorovaných variací určen jako biologická a vzorkovací chyba. Když vzorkovací chyba dosáhne bodu klesající odezvy (tj. když další vzorkování sekcí a oblastí s individuálními případy pouze zmenšuje redukce v pozorovaných variacích), pak se více času a úsilí soustřeďuje na analýzu více jedinců z dané skupiny. Jakmile je reprezentativní počet jedinců analyzován (obvykle jich je 5 – 10 ve skupině), dávají výsledky obvykle akurátní, precizní a efektivní data pro statistické testování daného biologického problému. Tím může například být hodnocení statistické odlišnosti buněk mezi dvěma skupinami.
Švýcarský stereolog Prof. Ewald Weibel, pojmenoval tuto techniku 'Do More, Less Well’.
Čtvrtá dekáda moderní stereologie (1991-2001)
Moderní stereologie představila kompletně nová pravidla pro kvantifikaci biologických objektů v oblasti tkání. Mnoho biologů si tyto techniky osvojilo na čtyřdenním intenzivním mezinárodním workshopu, kterého se účastnili i Society For Neurosciences (USA), International Brain Research Organization a the ISS. Výsledkem tohoto setkání bylo, že počet publikací od roku 1960 intenzivně neustále exponenciálně roste.
Námitky k moderní stereologii 1 Námitky k novým metodám moderní stereologie byly vzneseny od zastánců klasického přístupu k biologii. První námitka vychází ze setrvačnosti tradičního přístupu. Vysoce uznávané články používaly starší předpoklady a modely přístupu k morfometrické analýze biologických tkání.
Morfometrie umožňuje kvantifikovat kvalitativní znaky terénních tvarů či jejich prvků a tím nabízí také možnosti exaktního vystižení jejich vzájemných vztahů. Prostorovou pozici tvarů lze vyjádřit souřadnicemi prostorové sítě (zeměpisná délka a šířka, nadmořská výška) v kombinaci údajů úhlových a metrických.
Rozdíl mezi rovinným a sféricky zakřiveným povrchem Země zdroj: http://gis.zcu.cz/studium/tka/autori.html
Námitky k moderní stereologii 2 Druhá námitka byla, že bez uvážení demonstrované přesnosti těchto nových přístupů oproti klasickým starším metodám je pro mnoho biologů stereologie příliš radikální. Skupina moderních stereologů v čele s profesory H. Gundersen (Dánsko), L. Cruz-Orive (Španělsko) a A. Baddeley (Austrálie) argumentovala, že starší vychýlené vzorkování a Euklidovsky založené předpoklady a modely (předpokládání buňky ve sféře apod.) mohou být zcela zavrhnuty. Jejich kritika byla založena na tom, že veškerý pokrok kolabuje na velké časové náročnosti dané analýzy kdy je třeba vše dělat krok po kroku na základě známých vědomostí. Jako odpověď na to stereologové prohlašovali, že předpoklady založené na Euklidovském přístupu se jednoduše nedají aplikovat na populace s náhodně vzorovanými biologickými objekty.
Námitky k moderní stereologii 3 Třetí námitka vycházela ze zmatku kolem termínu bias (předpojatost), který měl několik rozdílných pojetí. V hovorovém pojetí se bias odvolává na zaujatost nebo predispozice. Pro stereology to však znamená prezence systematické chyby v dané metodě. Když se daná metoda vyvaruje „bias“ ve formě špatných a ne-verifikovatelných předpokladů a modelů, rostoucí vzorkování referenčního prostoru pak zapříčiní, že střední odhady daného parametru směřují k pravé střední hodnotě dané populace. Mnoho bio-stereologů preferuje termín design-based stereology („stereologie na míru“) z důvodu vyhnutí se kontroverzního termínu „biasovaných“ vs „nebiasovaných“ dat. Bias definice: Je to jakýkoliv systematický proces prováděný studiem výsledků nekorektního odhadu měření dané události nebo měření jednotlivých propojení. Protože se jedná o systematický proces, ovlivní to odchylku od pravdivé hodnoty v předpovídatelném (ne náhodném) směru.
Stereologický bias a přesnost Bias odkazuje odchylku výsledku od očekávané nebo pravdivé hodnoty jako výsledek systematické chyby. Stereologický bias vychází ze špatných předpokladů, chybných modelů a špatných korekčních faktorů, které zaviňují morfometrické měření jako je množství, plocha objemu buněk divergující od pravdivé hodnoty neznámou a neměřitelnou hodnotou. S ohledem na zajištění neznámých zdrojů bias, které ovlivňují data, výsledky z nevzorkovaných metod se mohou shlukovat kolem skutečné nebo očekávané hodnoty, jak je ukázáno ve dvou horních terčích na obrázku.
Předpovídaná přesnost a přesnost pro biased a unbiased metody.
