KARLOVA UNIVERZITA V PRAZE 1.LÉKAŘSKÁ FAKULTA DIZERTAČNÍ PRÁCE

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

KARLOVA UNIVERZITA V PRAZE 1.LÉKAŘSKÁ FAKULTA

DIZERTAČNÍ PRÁCE

Obsah

Strana 2

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Praha 2008

MUDr. Ivan Matia

KARLOVA UNIVERZITA V PRAZE 1. LÉKAŘSKÁ FAKULTA a INSTITUT KLINICKÉ A EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY

DIZERTAČNÍ PRÁCE

Téma:

Čerstvý tepenný allograft v cévní chirurgii – ovlivnění rejekce v experimentu

Doktorand:

MUDr. Ivan Matia

Studijní program:

Postgraduální doktorské studium v biomedicíně

Oborová rada:

10 - Experimentální chirurgie

Fakulta:

1.lékařská fakulta Karlovy univerzity

Školící pracoviště:

Klinika transplantační chirurgie Vídeňská 1958/9, 140 21 Praha 4

Školitel:

Obsah

Prof. MUDr. Miloš Adamec, CSc.

Strana 3

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Praha, 01.06.2008

OBSAH OBSAH................................................................................................................2 PODĚKOVÁNÍ.....................................................................................................4 1 ÚVOD................................................................................................................5 1.1 Umělé cévní protézy................................................................................5 1.2 Tepenné štěpy.........................................................................................5 1.3 Imunogenicita tepenných štěpů...............................................................6 1.4 Imunosuprese po transplantaci tepny v klinické praxi.............................9 1.5 FK506 (tacrolimus)................................................................................10 1.6 Klinické použití tepenných štěpů ve světě.............................................10 1.7 Klinické použití tepenných štěpů v České republice..............................11 2 CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE...........................................................................13 2.1 Hypotéza...............................................................................................13 3 MATERIÁL A METODY.................................................................................14 3.1 Uspořádání experimentu.......................................................................14 3.2 Zvířata...................................................................................................14 3.3 Operační postup....................................................................................15 3.4 Protokol imunosuprese..........................................................................15 3.5 Histologické vyšetření............................................................................16 3.5.1 Imunohistochemické vyšetření.....................................................16 3.5.2 Detekce CD4+, CD8+ buněk a buněk s von Willebrandovým faktorem................................................................................................17 3.5.3 Detekce imunoglobulinů...............................................................17 3.5.4 Detekce RT1.Bu pozitivních buněk...............................................17 3.6 Statistické metody.................................................................................18 4 VÝSLEDKY.....................................................................................................22 4.1 Zvířata...................................................................................................22 4.2 Imunosuprese........................................................................................22

Obsah

Strana 4

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

4.3 Tunica intima.........................................................................................22 4.4 Tunica media.........................................................................................23 4.5 Tunica adventitia...................................................................................24 5 DISKUZE........................................................................................................32 6 ZÁVĚR............................................................................................................35 7 POUŽITÁ LITERATURA................................................................................36 8 VLASTNÍ PUBLIKAČNÍ AKTIVITA................................................................42 9 SEZNAM PŘÍLOH..........................................................................................54 10 PŘÍLOHA A..................................................................................................55 Matia I, Lodererova A, Adamec M. Delayed administration of FK 506 is sufficient to suppress acute rejection changes after aortal transplantation in rats. Transpl Int 2007;20:371-380. 11 PŘÍLOHA B..................................................................................................63 Matia I, Havlíčková J, Baláž P, Adamec M. Transplantace břišní aorty. In: Baláž P, Mergental H a spol. Transplantace v experimentu. Praha: Galén, 2006. 12 PŘÍLOHA C..................................................................................................69 Matia I, Adamec M, Varga M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Aortoiliac reconstruction with allograft and kidney transplantation as a one-stage procedure: long term results. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35:353-357. 13 PŘÍLOHA D..................................................................................................76 Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Fresh arterial grafts as conduits for vascular reconstructions in transplanted patients. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006;32:549-56. 14 PŘÍLOHA E..................................................................................................85 Adamec M, Matia I, Janoušek L, Froněk J, Bachleda P, Lácha J, Viklický O. Renal transplantation in patients with abdominal aortic aneurysm – a new surgical approach. Transpl Int 2004;17:647-650. 15 PŘÍLOHA F...................................................................................................91 Matia I, Adamec M, Froněk J, Tošenovský P, Janoušek L, Baláž P, Langer D, Lipár K, Lácha J. Ischémie tlustého střeva po současné transplantaci

Obsah

Strana 5

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

ledviny a náhradě výdutě břišní aorty čerstvým tepenným štěpem. Rozhl Chir 2004;83:121-127.

Obsah

Strana 6

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PODĚKOVÁNÍ Chtěl bych se poděkovat všem, kteří mi pomohli na mé cestě, zvláště pak: Prof. MUDr. Milošovi Adamcovi, CSc., mému školiteli, který mi zcela nečekaně ještě v průběhu studia medicíny v Košicích navrhl možnost věnovat se doktorskému studiu na Klinice transplantační chirurgie v IKEM a který mi následně poskytl odbornou pomoc a dostatek času i prostoru rozpracovat navrženou problematiku a uskutečnit všechny potřebné experimenty. Kromě této odborné stránky se mu ale chci poděkovat zejména za tu lidskou, která mi pomohla, když jsem to opravdu potřeboval. RNDr. Mariánovi Sabolovi, CSc., mému školiteli ještě z časů pregraduálních studií, který mě naučil základům vědecké a laboratorní práce a ukázal mi, jak je v této práci potřebná vytrvalost, důslednost a cílevědomost. RNDr.

Aleně

Lodererové,

CSc.,

která

mi

pomohla

s

přípravou

imunohistochemických preparátů a nevzdala to i když to někdy šlo velmi ztěžka. MUDr. Luďkovi Voskovi, který mi pomohl orientovat se v histologickém obraze hodnocených preparátů a poskytl mi celé zařízení své pracovny, i když to vypadalo, že se tam už víc sklíček nevejde. Tuto práci bych rád věnoval celé mé rodině a zejména mé snoubence Aďke, které opustila jistotu domova a odešla se mnou před šesti lety do nejistoty Prahy...

Poděkování

Strana 7

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

1 ÚVOD 1.1 Umělé cévní protézy Hlavním stimulem pro rozvoj cévní chirurgie v polovině 20.století bylo vyvinutí umělé cévní protézy.1,2 Cévní protézy jsou v současnosti s úspěchem používané zejména v rekonstrukční chirurgii břišní aorty, pánevních a stehenních tepen. Dle anatomických a hemodynamických podmínek se jejich průchodnost po pěti letech pohybuje v rozmezí od 89 do 92% pro aortoilické rekonstrukce3 a 38 až 68% pro infrainguinální rekonstrukce.4,5,6 Nejzávažnější komplikací použití cévních protéz je jejich infekce. Vyskytuje se sice jen v 1 až 6% případů, ale její následky jsou často katastrofické. Infekce protézy je spojena s 50% rizikem amputace a s až 70% rizikem úmrtí.7 Léčba těchto devastujících stavů spočívá kromě důsledné antibiotické terapie v částečném nebo úplném odstranění infikované protézy s důkladným odstraněním všech infikovaných tkání. Výkon je pak nutné doplnit novou anatomickou (in situ) nebo extraanatomickou rekonstrukcí cévního řečiště.7,8 Hlavní výhodou in situ rekonstrukce je obnovení anatomického krevního řečiště a eliminace rizika roztržení podvázané aorty.9,10 In situ rekonstrukce v oblasti původní infekce si ale vyžaduje materiál odolný vůči bakteriální kolonizaci. Tyto podmínky splňují tepenné štěpy.10 1.2 Tepenné štěpy Tepenné štěpy jsou spojeny s počátky cévní chirurgie. Používal je i jeden ze zakladatelů experimentální a cévní chirurgie Alexis Carrel v pokusech s cévním stehem.11 V roce 1912 obdržel Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu právě za práce týkající se transplantací a cévního stehu. V klinické praxi se tepenné štěpy objevily po druhé světové válce, kdy byly použity jako materiál k náhradě cévního řečiště.12 Alogenní tepna byla použita i při první úspěšné

Úvod

Strana 8

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

resekci a náhradě výdutě břišní aorty, kterou provedl v roce 1951 v Paříži Charles Dubost.13 Postupně se tepenné štěpy rozšířily jako náhrada při rekonstrukční cévní chirurgii v Evropě i Spojených státech amerických.14 Dlouhodobé výsledky jejich použití však byly zklamáním. U většiny implantovaných tepen došlo k uzávěru nebo dilataci s následnou rupturou. V největších publikovaných souborech takto léčených pacientů (245 pacientů15 a 150 pacientů16) byla 5-letá průchodnost aortoilických štěpů 56 resp. 40% a femoropopliteálních jen 26 resp. 7%. Část tepenných štěpů musela být dokonce pro výduť resekována a nahrazená cévní protézou.16 Vysvětlení těchto špatných výsledků se logicky hledalo v imunogenicitě štěpů a rejekci hostitele, které vedly k poškození tepenné stěny. Renesanci zájmu o tepenné štěpy v 80. a 90. letech minulého století způsobily paradoxně právě komplikace použití umělých cévních protéz - jejích infekce.17,18 Tepenné štěpy jsou vůči infekci výrazně odolnější a mohou se tak použít jako cévní náhrada i v místě odstraněné infikované cévní protézy. Četné experimentální studie tuto vlastnost tepenných štěpů následně skutečně potvrdily.19,20 Mechanizmus této rezistence spočívá pravděpodobně zejména v biologických vlastnostech tepenné stěny podporujících účinek antibiotik a umožňujících průběh přirozených obranných mechanizmů hostitele.10 Výraznou odolnost tepenného štěpu vůči infekci jsme pozorovali i u jednoho z našich pacientů po současné transplantaci ledviny a resekci břišní aorty, u kterého došlo k ischemickému poškození střeva s rozvojem sterkorální peritonitídy (příloha F). 1.3 Imunogenicita tepenných štěpů S rozvojem transplantační medicíny v posledních 30 letech probíhal i výzkum v oblasti rejekce. Právě model transplantace tepen u zvířat přinesl řadu poznatků o rejekci parenchymatozních orgánů.21 Na tepenné štěpy se tak již hledí jako na tkáň vyvolávající silnou imunitní odpověď.22 Jejich imunogenicita je podmíněná zejména expresí antigenů hlavního histokompatibilního systému I. třídy (MHC I) buňkami hladkého svalstva ve stěně štěpů.23,24

Úvod

Strana 9

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Iniciální fáze imunitní odpovědi na štěp je celulární (lymfotoxická) a endotelové buňky štěpu jsou prvním cílem imunitního systému hostitele. První poškození endotelových buněk se objevuje mezi pátým a sedmým dnem po implantaci, kdy jsou pozorovány první známky nekrózy buněk a počínající adheze makrofágů.24 Dárcovské endotelové buňky štěpu zcela mizí mezi 15. a 21. dnem po transplantaci.25 Od 18. dne po transplantaci se na povrchu neointimální vrstvy začínají objevovat endotelové buňky hostitele, které postupně vytvoří souvislou vrstvu, pokrývající luminální povrch neointimy. Proces bývá ukončen mezi 28. a 70.dnem po transplantaci.25 Proces denudace a re-endotelizace intimální vrstvy tepenného štěpu v alogenných endotelových

podmínkách buněk

probíhá

vzniká

na

ve

dvou

základě

krocích.

První

poškození

ischemicko-reperfuzního

a

mechanického poškození tepenných štěpů v průběhu odběru, konzervace a transplantace. Nejedná se tedy o imunologické poškození a v prvním týdnu po transplantaci se endotelová vrstva regeneruje z přeživších endotelových buněk dárcovského původu. V průběhu druhého a třetího týdne se ale objevuje imunologické poškození endotelových buněk, které způsobuje nekrózu dárcovských buněk. Následuje druhá re-endotelizace, která je ale již příjemcovského původu.24 V

podmínkách

dostatečné

imunosuprese

však

dochází

jen

k

neimunologickému poškození ve včasné fáze po transplantaci. Re-endotelizace z přeživších buněk dárce tak není zastavena imunologickou reakcí hostitele a pokračuje až do úplného pokrytí luminálního povrchu endotelem dárce.25 V případě přerušení podávání imunosuprese pak dochází k masivní adhezí leukocytů a k imunologickému poškození endotelových buněk s následnou tvorbou intimální proliferace. Tento proces se objeví ve druhém týdnu po vysazení imunosuprese.25 V procesu intimální proliferace tepenných alloštěpů dochází k výrazné subendoteliální invazí makrofágů s následnou tvorbou růstových faktorů, jako je nekrotizující faktor alfa (TNF-alfa), interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6) a zejména destičkový růstový faktor (PDGF-A) a transformující růstový faktor (TGF-beta).24 Právě TGF-beta je důležitým cytokinem zúčastněným ve

Úvod

Strana 10

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

fibrogenezi a jeho uvolňování vede k trvalým fibrotickým změnám v poškozené oblasti.26 Neointimální vrstva tepenných alloštěpů je tvořená velkým množstvím alfa1-actin pozitivních, desmin-pozitivních a vimentin-pozitivních myofibroblastů, makrofágů a lymfocytů.24 Proces intimální proliferace dosahuje největšího rozsahu mezi 60. a 70. dnem po transplantaci. V této fázi dochází k postupné stabilizaci intimální vrstvy zvýšením obsahu alfa1-actin pozitivních, desminpozitiních

a

vimentin-pozitivních

hladkosvalových

buněk

produkujících

extracelulární matrix s výrazným snížením počtu zánětlivých buněk.24 Hladkosvalové buňky v tunica intima tepenných aloštěpů jsou po endotelových buňkách dalším cílem imunitní reakce hostitele. Výsledkem rejekce je ireverzibilní poškození a nekróza těchto buněk.24 První známky poškození se v této vrstvě objevují kolem osmého dne po transplantaci a v průběhu dalších 3 týdnů dojde k úplnému vymizení svalových buněk. Charakteristickým

znakem

rejekce

svalové

vrstvy

je

přítomnost

minimálního počtu invadujících zánětlivých buněk, co je ve zjevném kontrastu s výraznou zánětlivou infiltrací tunica intima a tunica adventitia.24 Typickým jevem pro mediální vrstvu je ale výrazná depozice imunoglobulinů, která se objevuje mezi 5. a 15. dnem po transplantaci. Přesný mechanizmus poškození svalových buněk zatím není znám. Charakteristickým obrazem rejekce v tunica adventitia tepenných štěpů je intenzivní intersticiální infiltrace mononukleárnimi buňkami vytvářejícími prstence v okolí vasa vasorum, která se objevuje mezi 5. a 18. dnem po transplantaci. V průběhu dalších týdnů dochází k pomalému poklesu buněčné infiltrace.

Intenzita této infiltrace je v

kontrastu

s

nízkou buněčnou

imunogenicitou tunica adventitia, která v normálních podmínkách obsahuje jen fibroblasty.24 Mezi infiltraci tunica adventitia imunokompetentními buňkami příjemce a přítomnosti svalových buněk dárce v tunica media existuje úzká chronologická korelace. Po vymizení svalových buněk a tím i aloantigenů na jejich povrchu dochází k výrazné potlačení zánětlivé reakce v tunica adventitia i tunica intima.24

Úvod

Strana 11

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Po šesti měsících až 1 roce po transplantaci je tepenná stěna zjizvená, tvořená fibrotickou tunica adventitia, acelulární tunica media a neointimou. Ta je bez zánětlivé infiltrace a je tvořená jen hladkosvalovými buňkami spolu s kolagenem. Pokrytá je jednou vrstvou endotelových buněk příjemcovskéhu původu.24 V klinickém obraze se výše popsané rejekční změny projeví buď jako aneuryzmatická dilatace s rizikem ruptury štěpu nebo jako trombóza a okluze štěpu s rizikem rozvoje kritické ischemie postižené končetiny.16,8 Projevem imunitní reakce hostitele proti antigenům tepenného štěpu je i vzestup protilátek proti hlavnímu histokompatibilnímu systému (anti-MHC protilátek) v krvi příjemce.22 V poslední době se ukazuje, že právě přítomnost a koncentrace těchto anti-MHC protilátek je dobrým indikátorem závažnosti rejekčních změn.27 1.4 Imunosuprese po transplantaci tepny v klinické praxi S poznatky o rejekčních změnách v cévní stěně a jejich negativních důsledcích na funkci tepenných rekonstrukcí se začala na části pracovišť používat po implantaci tepenných štěpů imunosupresivní terapie. Publikovány byly protokoly s použitím jednoho typu imunosupresiva22 i protokoly s použitím kombinace 3 imunosupresiv obdobně jako po transplantaci ledviny.28 Nejběžněji je ale používán cyklosporín A (CyA).29,30,22 Ve všech případech použití je imunosuprese podávána pacientům od prvního dne po implantaci tepenného štěpu. V experimentu i klinické praxi však bylo prokázáno, že CyA indukuje produkci TGF-beta a zvyšuje expresi a vazbu na receptor TGF-beta, což přispívá

k

fibrotizaci

tkáně.31,32

Dalším

nežádoucím

účinkem

léčby

cyklosporinem je jeho negativní vliv na endotelové buňky.33 Oba tyto nežádoucí účinky CyA jsou nevýhodou jeho použití v rekonstrukční cévní chirurgii. Poškození endotelové vrstvy se projevuje zvýšenou tendencí ke vzniku trombóz a fibrotizace cévní stěny štěpů má negativní vliv na hemodynamické poměry v cévním řečišti.

Úvod

Strana 12

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

1.5 FK506 (tacrolimus) Atraktivní alternativou použití CyA v cévní chirurgii je tacrolimus (FK506). FK506 je moderní imunosupresivní přípravek na bázi makrolidových antibiotik, izolovaný v roce 1984 z hub rodu Streptomyces tsukubaensis. Používá se v klinické praxi zejména po transplantaci ledvin a jater. Spolu s CyA patří do skupiny kalcineurínových inhibitorů.34 Váže se na buňky imunitního systému a zabraňuje

jejich

aktivaci

cestou

inhibice

fosfatázové

aktivity

enzymu

calcineurinu se selektivním účinkem na T lymfocyty a jejich proliferaci, přičemž v důsledku této inhibice vzniká velký pentamerický komplex zahrnující tacrolimus, tacrolimové vazebné proteiny FKBP (tzv. imunofilinový protein), calmodulin a calcineuriny A a B. Jedním z jeho hlavních účinků je inhibice časné fáze aktivace T lymfocytů závislé na interleukínu 2 (IL-2).35 Po transplantaci ledvin snižuje imunosupresivní protokol s FK506 ve srovnání s CyA významně riziko selhání štěpů ledvin bez zvýšení nežádoucích účinků dlouhodobé imunosuprese.36 FK506 interferuje také s TGF-beta v cévní stěně kompetitivní

vazbou

a

tím

snižuje

ve

srovnání

s

CyA

fibrotizaci

transplantovaných tkání.37 FK506 není po transplantaci tepen v klinické praxi používán. V experimentálních studiích, kdy byl podáván časně po tepenné transplantaci u potkanů, byl schopen zabránit imunologickému poškození tepenné stěny.25 1.6 Klinické použití tepenných štěpů ve světě Od znovuzavedení použití čerstvých tepenných štěpů do klinické praxe v léčbě těžkých infekcí cévních protéz Dr. Kieferem z Paříže v druhé polovině 80. let 20. století17 publikovaly největší soubory takto léčených pacientů pracoviště ve Francii8, Švýcarsku38, Belgii39 a Itálii18. Nejrozsáhlejší práce amerických autorů týkající se této problematiky, která popisuje výsledky 31 center používajících tepenné štěpy v této indikaci od roku 1999 byla publikována v roku 2002 a zahrnovala 56 pacientů.40

Úvod

Strana 13

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Vzhledem k pokroku v oblasti kryokonzervace a tkáňového bankovnictví jsou od počátku 90 let minulého století dostupné i kryokonzervované tepenné štěpy. Jejich největší výhodou ve srovnání s čerstvými štěpy je možnost jejich dlouhodobého skladování v tkáňových bankách. Nevýhodou je ale jejich vysoká cena. Imunogenicita tepenných štěpů je kryokonzervací ovlivněná jen minimálně a experimentální práce potvrzují, že buňky kryokonzervovaných štěpů vyvolávají imunitní odpověď příjemce obdobně jako štěpy čerstvé.41,42,43 Část pracovišť ve světě, která začala používat tepenné štěpy v léčbě infekce protézy

však

z

legislativních

i

praktických

důvodů

přešla

k

použití

kryokonzervovaných štěpů.8,18 1.7 Klinické použití tepenných štěpů v České republice Práce zabývající se tepennými štěpy v České republice zatím publikovala 2 pracoviště – Cévní oddělení Nemocnice na Homolce a Klinika transplantační chirurgie Institutu klinické a experimentální medicíny (IKEM). Štádler a spol.

29

publikovali použití čerstvých tepenných štěpů v léčbě

pacientů s infekci cévní protézy nebo s kritickou ischemii dolních končetin v případě nepřítomnosti jiného vhodného materiálu k cévní rekonstrukci. V IKEM používáme, i vzhledem k tomu, že Klinika transplantační chirurgie je součástí transplantcentra s relativně vysokou odběrovou aktivitou, čerstvé tepenné štěpy i v dalších indikacích. Kromě léčby infekcí cévní protézy jsme použili tepny jako materiál pro cévní rekonstrukci v léčbě mykotické (tzn primárně infikované) výdutě břišní aorty, dále léčbě ischemické choroby dolních končetin u pacientů s transplantovaným orgánem, a k cévní rekonstrukci v aortoilické oblasti současně s transplantací ledviny.44,45,46 (Příloha C, D, E) Tepny určené k implantaci odebíráme v rámci multiorgánového odběru se zachováním shody v ABO systému mezi příjemcem a dárcem. Tepny jsou skladovány stejně jako ostatní odebrané orgány v perfuzním a konzervačním roztoku při teplotě 4˚C. Maximální doba studené ischemie je 36 hodin. Vzhledem k tomu, že implantaci tepny považujeme za výkon srovnatelný s orgánovou transplantací, podáváme pacientům k zajištění dlouhodobé

Úvod

Strana 14

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

průchodnosti tepenných štěpů imunosupresi. Snažíme se při tom ale o její rozumné použití a modifikaci v jednotlivých indikacích tak, aby jsme minimalizovali její nežádoucí účinky. V této práci se věnujeme právě možnosti její modifikace u pacientů s infekcí cévní protézy léčených transplantaci čerstvých tepenných štěpů.

Úvod

Strana 15

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

2 CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE V případě resekce infikované protézy a následné náhradě tepenným štěpem je riziko použití imunosuprese v časném pooperačním období značné a některé pracoviště jí nepoužívají vůbec. Pacienti jsou většinou v těžkém stavu v důsledku přetrvávající infekce, často s poruchou hojení rány. V terapii jsou použitá širokospektrální antibiotika. Vzhledem k poznatkům z experimentálních studií zabývajícími se časovým průběhem rejekčních pochodů po transplantaci čerstvých tepenných štěpů u potkanů, jsme se rozhodli testovat hypotézu o možném opožděném podávání imunosuprese a jejím vlivu na rejekční pochody po transplantaci. Jako optimální časový úsek, kdy je ještě bezpečné imunosupresi nepodávat, jsme určili 7 dní po implantaci štěpu. 2.1 Hypotéza Podávání imunosuprese pomocí FK506 až od sedmého dne po transplantaci bude dostatečné k potlačení akutních rejekčních změn v cévní stěně po transplantaci subrenální břišní aorty mezi kmeny potkanů BrownNorway (dárci) a Lewis (příjemci)

Cíle

Strana 16

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

3 MATERIÁL A METODY 3.1 Uspořádání experimentu Štěpy subrenální břišní aorty konzervované 25 hodin v roztoku histidintryptofan-ketoglutarat (Custodiol®, Dr. Franz Köhler Chemie GmbH) při teplotě 4 °C jsme transplantovali mezi kmeny potkanů Brown-Norway (dárce) a Lewis (příjemce). FK506 (0.2 mg/kg/den) jsme podávali intramuskulárně od 7. do 30. dne po transplantaci (skupina D). Izogenní potkani (skupina A), alogenní potkani bez podávaní FK506 (skupina B) a alogenní potkani, kterým jsme podávali FK506 od 1. dne po transplantaci jsme použili jako kontrolní skupiny (obrázek 1, 2, tabulka 1). Štěpy břišní aorty ve všech skupinách jsme explantovali a připravili k histologickému a imunohistochemickému zpracování 7. a 30. den po transplantaci. Ve vzorcích jsme hodnotili intenzitu proliferace tunica intima, šířku svalové vrstvy, přítomnost imunoglobulinů v tunica media a přítomnost a počet CD4 a CD8 pozitivních buněk v tunica adventitia. Zároveň jsme hodnotili přítomnost příjemcovských (Lewis) buněk exprimujících MHC antigeny II. třídy v jednotlivých vrstvách štěpu dárce (obrázek 3). 3.2 Zvířata Samce potkanů kmene Lewis (LEW) (RT1l) o váze 240 až 380 g (291.6±32.1 g) (N = 48) jsme užili jako příjemce alogenních nebo syngenních štěpů břišní aorty. Samce potkanů kmene Brown-Norway (BN) (RT1n) o váze 220 až 320 g (264.2±28.5 g) (N = 20) jsme užili jako dárce alogenních štěpů. Samce potkanů kmene Lewis (LEW) (RT1l) o váze 280 až 320 g (305±19,1 g) (N=4) jsme užili jako dárce syngenních štěpů (tabulka 1). K experimentu jsme použili zvířata dodané z chovní stanice Charles River v Německu. Každé zvíře bylo v průběhu celého pokusu drženo v samostatné kleci. V průběhu experimentu jsme dodržovali principy práce s laboratorními zvířaty (pravidla National Institute of Health).

Materiál a metody

Strana 17

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

3.3 Operační postup Dárce štěpů aorty jsme před výkonem uvedli do celkové anestézie pomocí intramuskulárně aplikované směsi ketaminu v dávce 100 mg/kg (Narkamon®, Spofa) a xylazinu v dávce 10 mg/kg (Rometar®, Spofa). Po laparotomii a preparaci aorty v subrenálním úseku jsme po aplikaci heparinu (100 IU/kg) přes dolní dutou žílu odebrali 2-2,5 cm dlouhý segment břišní aorty. Štěp jsme propláchli 2 ml konzervačního roztoku histidin-tryptofan-ketoglutarat (Custodiol®, Dr. Franz Köhler Chemie GmbH) s obsahem heparinu (100 IU/ml) a následně rozdělili na 2 stejně dlouhé poloviny, které jsme použili u dvou příjemců. Oba štěpy byly konzervovány samostatně v 10 ml roztoku Custodiol® při teplotě 4 ºC bez přidání antibiotik. Průměrný čas studené ischemie štěpů (CIT) v rámci celého pokusu byl 25 hodin. Z každého štěpu aorty jsme na konci konzervace odebrali malou část k histologickému zpracování. Příjemce štěpů aorty jsme před výkonem uvedli do celkové anestezie pomocí intramuskulárně aplikované směsi sufentanilu v dávce 20 μg/kg (Sufenta®, Janssen Pharmaceutica Inc.) a azaperonu v dávce 1 mg/kg (Stresnil®, Janssen Pharmaceutica Inc.). Štěpy aorty jsme po laparotomii transplantovali ortotopicky do subrenálního úseku břišní aorty příjemce (obrázek 4,5,6, příloha B). V pooperačním a celém sledovaném období jsme příjemcům nepodávali žádné antiagregační ani antikoagulační přípravky. Štepy aorty jsme explantovali po střední laparotomii u anestezovaných zvířat 7. nebo 30. den po transplantaci. Zvířata byla následně usmrcena letální dávkou tiopentalu (Thiopental®, Spofa Czech Rep) aplikovaného do dolní duté žíly. 3.4 Protokol imunosuprese Imunosupresivum FK506 (Prograf®, Astellas Pharma Inc.) rozpuštěný ve fyziologickém

roztoku

jsme

příjemcům

aortálních

štěpů

aplikovali

intramuskulárně v jedné denní dávce o koncentraci 0,2 mg/kg. Příjemci štěpů byly dle pooperačního imunosupresivního protokolu rozdělena do čtyřech

Materiál a metody

Strana 18

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

experimentálních skupin (A,B,C,D) (tabulka 1). Hladiny FK506 7. nebo 30. den po

transplantaci

jsme

stanovovali

za

použití

homogenní

enzymové

imunoanalýzy soupravou Emit® 2000 Tacrolimus assai firmy Dade Behring. Krev k vyšetření jsme získávali z dolní duté žíly u před odběrem štěpů aorty. 3.5 Histologické vyšetření Odebrané štěpy aorty jsme fixovali v 10 % formolu. Ze štěpů jsme připravili 5 μm tlusté parafínové řezy, které jsme následně barvili hematoxilineozinem a barvením na elastické vlákna dle Van Giesona. Řezy k hodnocení jsme odebírali ze střední části štěpů, aby jsme předešli hodnocení části cévní stěny s možnou reakcí na šicí materiál. Všechny řezy jsme ofotografovali za pomoci digitálního fotoaparátu Olympus Cammedia C-5050 připevněného na mikroskop Olympus BX51 při 400-násobném zvětšení. Snímky jsme převedli bez komprese do formátu TIFF. K jejich hodnocení jsme použili originální softvér Olympus DP-Soft Verze 3.2. Šířku tunica intima (od povrchu buněk endotelu po vnitřní hranici mediální vrstvy stěny aorty) a šířku tunica media (ohraničenou vnější a vnitřní elastickou membránou) jsme měřili v 10 náhodných lokalizacích v každém řezu. Průměrnou hodnotu a standardní odchylku (průměr±SD) jsme stanovili pro každou aortu i experimentální skupinu zvlášť. 3.5.1 Imunohistochemické vyšetření Tkáně pro průkaz antigenů jsme odebírali, stejně jako v případě klasické histologie, ze střední části štěpů. Po odběru jsme aorty vložili do malých plastikových boxů (Tissue Tek©, Cryomold, Sakura, Japonsko) a zalili do média (Tissue Tek© O.C.D.Compound, Sakura, Japonsko). Následně jsme vzorky zmrazili za použití 2-metylbutanu (Fluka, Chemika, Švýcarsko) a tekutého dusíku. Do doby, než jsme provedli imunohistochemickou detekci antigenů, byli vzorky skladovány při teplotě -80ºC. K imunohistochemické analýze jsme použili protilátky uvedené v tabulce 2.

Materiál a metody

Strana 19

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

3.5.2 Detekce CD4+, CD8+ pozitivních buněk a buněk s von Willebrandovým faktorem Detekci jsme prováděli na řezech 8 µm silných dvoustupňovou nepřímou technikou s použitím imunoenzymového polymeru. Řezy jsme fixovali v chlazeném acetonu 10 minut. Po usušení a oplachu v 0.2 % roztoku Triton X 100 a fosfátovém fyziologickém roztoku, jsme vzorky inkubovali 60 minut s primární protilátkou. Po inhibici endogenní peroxidázy v 0.3% H2O2 v 70% methanolu (30 minut), jsme vzorky inkubovali 30 minut se sekundární protilátkou (imunoenzymový polymer Histofine® Simple Stain Rat MAX PO, Nichirei, Japonsko). Následně jsme na vzorek 5 minut aplikovali

3,3

diaminobenzidin (Dako Liquid DAB + Substrate-Chromogen, Dako, Dánsko), kontrastně dobarvili Harrisovým hematoxylinem a zamontovali do Entellanu (Merck, Německo). Vzorky s průkazem CD4+ a CD8+ buněk jsme hodnotili naslepo bez znalosti o příslušnosti vzorku ke skupině. Buňky jsme počítali v 5-ti zorných polích při 1000-násobném zvětšení. K analýze jsme použili vždy průměrný počet buněk ze všech 5-ti polí. 3.5.3 Detekce imunoglobulinů Detekci jsme prováděli na 8 µm silných řezech za použití přímé imunofluorescenční techniky. Po usušení řezů a oplachu ve fosfátovém fyziologickém pufru, jsme vzorky usušili na vzduchu a inkubovali 30 minut s protilátkou

značenou

zamontovali

do

fluoresceinem

glycerinu

a

(FITC).

okamžitě

Po

hodnotili

oplachu pod

jsme

vzorky

fluorescenčním

mikroskopem. 3.5.4 Detekce RT1.Bu pozitivních buněk Detekci jsme jsme prováděli na 8 µm silných řezech za použití třístupňové nepřímé techniky. Řezy jsme fixovali v chlazeném acetonu 10

Materiál a metody

Strana 20

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

minut. Po usušení a oplachu v 0.2 % roztoku Triton X 100 a fosfátovém fyziologickém roztoku, jsme blokovali endogenní biotin s použitím Biotin blocking system (Dako, Dánsko). Vzorky jsme následně inkubovali s 10% koňským sérem a poté 60 minut s primární protilátkou. Po inhibici endogenní peroxidázy v 0.3% H2O2 v 70% methanolu (30 minut), jsme na vzorky aplikovali biotinylovanou koňskou anti-myší protilátku (Vector Lab, Burlingame, UK). Následně jsme vzorky inkubovali s R.T.U. Vectastain Elite ABC Reagent (Vector Lab, Burlingame, UK) a dál jsme aplikovali 3,3 diaminobenzidin (Dako Liquid DAB + Substrate-Chromogen Dako) na 5 minut, kontrastně dobarvili a zalili do Entellanu (Merck, Německo). 3.6 Statistické metody K statistickému zpracování dat a porovnání šířky tunica intima a media štěpů a počtů lymfocytů v tunica adventitia mezi jednotlivými skupinami jsme použili test ANOVA, s následným použitím testu Tukey HSD Multiple Comparisons test. Ke srovnání koncentrace FK506 mezi skupinami jsme užili test dle Kruskal-Wallise.

Materiál a metody

Strana 21

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Obrázek 1 - Základní rozdělení experimentálních skupin

Obrázek 2 - Schéma podávání FK506 v jednotlivých skupinách POD – pooperační den

Obrázek 3 - Schéma zkoumaných parametrů rejekce a odběrů hladin FK506 v experimentu POD – pooperační den Materiál a metody

Strana 22

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Tabulka 1 - Základní charakteristiky jednotlivých skupin CIT – čas studené ischemie v hodinách, BN – kmen Brown-Norway, LEW – kmen Lewis, Počet zvířat – zvířata, která dokončila experiment

Počet zvířat Skupina

CIT (hod)

Imunosuprese Den 7

Den 30

A

LEW-LEW

27.1±9.5

bez

4

4

B

BN- LEW

27.1±11.2

bez

6

8

C

BN-LEW

24.4±2.1

FK506 den 1-30

6

5

D

BN-LEW

24.1±3.2

FK506 den 7-30

6

6

Tabulka 2 - Základní charakteristiky protilátek Protilátky použité při imunohistochemickém vyšetření v jednotlivých skupinách. u

RT1.B – buňky MHC II. třídy u kmene Lewis, FITC – fluorescein isothiocyanát

Specificita protilátky

Buněčný klon

Detekční systém

Původ

Výrobce

Ředení

zajíc

DakoCytomation

5000x

Histofine

10x

FITC

Von Willebrandův faktor Chemicon Imunoglobulíny

ovce International Cymbus

CD4+ buňky

myš

800x

W3/25

Histofine

500x

OX-8

Histofine

50x

MRC-OX3

Vector

Biotechnology Cymbus CD8+ buňky

myš Biotechnology

u

RT1.B

Materiál a metody

myš

Cedar Lane

Strana 23

MUDr. Ivan Matia

Obrázek 4 - Pohled na operační sál

Dizertační práce

Obrázek 5 - Pohled na operační stůl

Obrázek 6 - Pohled do operačního pole při transplantaci štěpu aorty Štěp aorty dárce jsme vložili mezi distální a proximální pahýl aorty příjemce. Oba pahýly jsme fixovali ve stabilní poloze za pomoci aproximátora (6a). Následně jsme fixovali všechny 4 cípy štěpu a jednotlivými stehy jsme šili přední polovinu horní i dolní anastomózy (6b). Po otočení svorek aproximátoru o 180° jsme pokračovali v šití zadní strany obou anastomóz jednotlivými stehy (6c). Po derotaci a puštění svorek aproximátoru a hemostáze operačního pole jsme vizuálně hodnotili průtok distálně od transplantovaného štěpu (6d). Zvětšení 12x

Materiál a metody

Strana 24

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

4 VÝSLEDKY 4.1 Zvířata V průběhu vlastního experimentu jsme úspěšně transplantovali 48 štěpů břišní aorty. Dvě zvířata ze skupiny B zemřela v průběhu sledování. Jedno v důsledku krvácení z anastomózy, druhé v důsledku stenózy anastomózy. Jedno zvíře ze skupiny C zemřelo v důsledku předávkování při odběru krevních vzorků. U všech zvířat ve všech experimentálních skupinách jsme pozorovali pokles hmotnosti ve srovnaní s předoperačními hodnotami první týden po operaci s následným vzestupem v dalším sledovaném období (graf 1). 4.2 Imunosuprese Průměrná hodnota koncentrace FK506 v celém experimentu byla 5.0±0.7 ng/ml. Jednotlivé skupiny se mezi sebou statisticky nelišily (graf 2). V průběhu experimentu jsme u zvířat nezaznamenali žádné nežádoucí účinky použití FK506.

4.3 Tunica intima Průměrná doba studené ischemie štěpů aorty v průběhu experimentu byla 25.8±8.0 hodin bez statistických rozdílů mezi skupinami. Žádné výrazné změny v histologickém obrazu stěny aorty jsme po tomto časovém úseku nezaznamenali. Vnitřní lumen tepen byl pokryt buňkami endotelu (obrázek 7, 8). Sedmý den po transplantaci jsme u všech experimentálních skupin pozorovali mírné nesouvislé zhrubnutí tunica intima. Endotelové buňky byly obklopeny malými shluky mononukleárních buněk (obrázek 9). Nejvyšší stupeň adheze leukocytů jsme pozorovali u alogenních zvířat bez imunosuprese. Průměrná hodnota šířky tunica intima byla v této skupině 20.3±15.0 μm (tabulka 3, graf 3).

Výsledky

Strana 25

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Proces proliferace tunica intima pokračoval dál mezi sedmým a třicátým dnem ve všech skupinách. Třicátý den jsme ale nezaznamenali mezi syngenní skupinou A a alogenními skupinami s podáváním imunosuprese od prvního (skupina C) nebo od sedmého dne (skupina D) žádné statisticky významné rozdíly v šířce tunica intima. Intimální proliferace u alogenních zvířat bez imunosuprese byla statisticky vyšší ve srovnání se všemi ostatními skupinami (tabulka 4, graf 3, obrázek 10). Luminální povrch proliferované intimální vrstvy byl 30. den pokryt vrstvou endotelových buněk ve všech experimentálních skupinách (obrázek 11). Příjemcovské MHC buňky II. třídy v neointimě štěpů odebraných potkanům Brown-Norway jsme detekovali 30. den jen v alogenní skupině bez imunosuprese (skupina B). 4.4 Tunica media Sedmý den po transplantaci jsme nezaznamenali morfologické známky poškození svalové vrstvy ani depozici imunoglobulinů v žádné experimentální skupině. Rozdíly v šířce mediální vrstvy transplantovaných štěpů mezi jednotlivými skupinami byly statisticky nevýznamné. Opožděné podávání FK506 nemělo negativní vliv na změny šířky mediální vrstvy 30. den po transplantaci. Šířka svalové vrstvy v skupině D byla srovnatelná se syngenní skupinou A i s alogenní skupinou s podáváním FK506 od 1. dne po transplantaci. Histologický nález v skupinách A, C a D po 30 dnech byl srovnatelný s nálezem ze 7.dne po transplantaci. Šířka mediální vrstvy v alogenní skupině B 30.den po transplantaci byla ale ve srovnání s ostatními skupinami statisticky menší. Nekrózy a degenerativní změny hladkosvalových buněk jsme pozorovali ve většině vzorek štěpů aorty. Největší degenerativní změny mediální vrstvy jsme pozorovali v oblastech, které korelovaly s oblastmi největší intimální reakce. V skupině zvířat s podáváním FK506 od sedmého pooperačního dne jsme ve vzorcích stěny aorty odebraných 30. den po transplantaci nepozorovali depozice IgG, stejně jako v syngenní a alogenní skupině s podáváním FK506

Výsledky

Strana 26

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

od 1. dne po transplantaci. Imunofluorescencí jsme dokázali přítomnost granulárních depozitů IgG 30.den po transplantaci jen v alogenní skupině bez imunosuprese (obrázek 12). Oblasti s vysokou pozitivitou IgG korelovaly s oblastmi největších degenerativních změn mediální vrstvy. 4.5 Tunica adventitia Ve všech skupinách jsme 7. den po transplantaci pozorovali infiltraci intersticia v tunica adventitia mononukleárními buňkami (obrázek 13). Nejvyšší stupeň infiltrace buňkami CD4+ jsme pozorovali v alogenní skupině bez imunosuprese (skupina B). V alogenní skupině C jsme zaznamenali nižší stupeň infiltrace než v syngenní skupině A. Obdobný obraz jsme pozorovali i při hodnocení infiltrace adventiciální vrstvy CD8+ buňkami (graf 4, graf 5). Rozdíl mezi syngenní skupinou A a alogenní imnosuprimovanou skupinou C pozorovaný při hodnocení infiltrace adventicie CD4+ buňkami jsme ale u buněk CD8+ nepozorovali. Oba imunosupresivní protokoly vedly 30. den po transplantaci k potlačení infiltrace tunica adventitia CD4+ i CD8+ buňkami. Intenzita infiltrace byla dokonce nižší i ve srovnání se syngenní skupinou A. Ve vrstvě tunica adventitia alogenních štěpů bez imunosuprese (skupina B) jsme pozorovali statisticky vyšší infiltraci CD4+ i CD8+ buňkami ve srovnání se skupinami A, C a D. Největší koncentrace těchto buněk jsme pozorovali v místech bezprostředně sousedících s mediální vrstvou stěny aorty, a to zejména v místech nejrozsáhlejších degenerativních změn svalové vrstvy.

Výsledky

Strana 27

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Graf 1 - Hmotnost zvířat v jednotlivých skupinách v pooperačním období Ztráta hmotnosti v průběhu prvního týdne po operaci byla nasledována jejím nárůstem od 7. pooperačního dne ve všech experimentálních skupinách.

Graf 2 - Koncentrace imunosuprese Průměrné koncentrace FK506 v skupině C stanovované 7. a 30. pooperační den (5.4±1.0 ng/ml, 4.7±0.5 ng/ml) se statisticky nelišily od koncentrací stanovených 30. pooperační den v skupině D (4.9±0.6 ng/ml).

Výsledky

Strana 28

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Graf 3 - Šířka tunica intima Rozsah intimální proliferace 30. den po transplantaci v obou alogenních skupinách s imunosupresi (skupina C, D) byl srovnatelný s intimální proliferaci v syngenní skupině A. Šířka intimy 30.pooperační den v alogenní skupině B byla statisticky větší (P < .05) ve srovnání se všemi ostatními skupinami (skupina A, C, D).

Graf 4 – Infiltrace tunica adventitia CD4+ buňkami Rozsah infiltrace tunica adventitia 30 den po transplantaci byl v obou imunosuprimovaných skupinách (C,D) srovnatelný s isogenní skupinou A. V alogenní skupině bez imunosuprese (skupina B) byla infiltrace této vrstvy signifikantně vyšší (P < .05) ve srovnání se všemi ostatními skupinami.

Výsledky

Strana 29

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Graf 5 – Infiltrace tunica adventitia CD8+ buňkami Rozsah infiltrace tunica adventitia 30. den po transplantaci byl v obou imunosuprimovaných skupinách (C,D) srovnatelný s isogenní skupinou A. V alogenní skupině bez imunosuprese (skupina B) byla infiltrace této vrstvy signifikantně vyšší (P < .05) ve srovnání se všemi ostatními skupinami.

Výsledky

Strana 30

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Obrázek 7 - Histologické vyšetření

Obrázek 8 - Imunohistochemické

štěpu břišní aorty po 25 hodinách

vyšetření štěpu břišní aorty po 25

studené ischemie

hodinách studené ischemie

Zobrazena endotelová vrstva na povrchu

Zobrazena souvislá endotelová vrstva na

tepny. Světelná mikroskopie, barvení

povrchu tepny (hnědé buňky). Světelná

hematoxilín-eozín, zvětšení 400x.

mikroskopie, protilátka proti vonWillebrandovmu faktoru, zvětšení 400x.

Obrázek 9 - Histologické vyšetření

Obrázek 10 - Histologické vyšetření

alogenního štěpu břišní aorty 7. den

alogenního štěpu břišní aorty 30. den

po transplantaci v skupině bez

po transplantaci v skupině bez

imunosuprese (skupina B)

imunosuprese (skupina B)

Zobrazené zhrubnutí tunica intima

Zobrazené výrazné zhrubnutí tunica

způsobené shluky mononukleárních

intima v důsledku intimální proliferace,

buněk. Světelná mikroskopie, barvení

způsobené rejekčními mechanismy.

hematoxilín-eozín, zvětšení 400x.

Světelná mikroskopie, barvení hematoxilín-eozín, zvětšení 400x.

Výsledky

Strana 31

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Obrázek 11 - Imunohistochemické vyšetření štěpů břišní aorty 30. den po transplantaci Souvislou endotelovou vrstvu pokrývající neointimu (hnědé buňky) jsme pozorovali v syngenní skupině A (11a), v alogenní skupině D s podáváním imunosuprese od 7. pooperačního dne (11b), i v alogenní skupině B bez imunosuprese (11c).Imunitní reakce v této skupině způsobila výraznou intimální proliferaci (11c) ve srovnání s ostatními skupinami.Světelná mikroskopie, protilátka proti von-Willebrandovmu faktoru, zvětšení 400x. I – tunica intima, M – tunica media, A – tunica adventitia

Obrázek 12 - Imunohistochemické vyšetření štěpů břišní aorty potkanů 30. den po transplantaci Ve svalové vrstvě potkanů skupiny D jsme nedetekovali žádné imunoglobulíny třídy G (12a). Pro rejekční změny štěpů aorty v alogenní skupině bez imunosuprese byly charakteristické fokální depozity imunoglobulinů ve svalové vrstvě související s masívní intimální reakci (12b). Imunofluorescenční mikroskopie, protilátky proti imunoglobulinům třídy G, zvětšení 100x. L – lumen aorty, I – tunica intima, M – tunica media, A – tunica adventitia

Výsledky

Strana 32

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Obrázek 13 - Imunohistochemické vyšetření štěpů břišní aorty potkanů skupiny D (a, b, c) a skupiny B (d, e, f) Imunosupresivní vliv FK506 podávaného až od 7.pooperačního dne se projevil i ve výrazném +

+

potlačení infiltrace neointimální i adventitiální vrstvy CD4 (a) a CD8 (b) buňkami ve srovnání s alogenní skupinou bez imunosuprese (d, e). Protilátku proti Lewis MHC antigenům II.třídy jsme použili k zjištění původu invadujících buněk (c, f). Masivní neointimální i adventiciální infiltraci imunitními buňkami příjemce jsme pozorovali u alogeních potkanů bez imunosuprese v skupině B (f) na rozdíl od alogenních potkanů, kterým jsme FK506 podávali až od 7. pooperačního dne (c). Pozitivní buňky jsou hnědě zabarvené. Světelná mikroskopie, protilátky proti CD4 a CD8 antigenům a protilátka proti Lewis MHC antigenům II.třídy, zvětšení 400x. I – tunica intima, M – tunica media, A – tunica adventitia

Výsledky

Strana 33

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Tabulka 3 - Sledované parametre poškození stěny aorty 7.den po transplantaci * Hodnoty v skupině D 7.den po transplantaci jsou identické s hodnotami v alogenní skupině bez imunosuprese (skupina B). **

Šířka intimy a medie je uvedená v μm

***

Počet CD4 a CD8 pozitivních buněk v jednom zorném poli při zvětšení 1000x. **

**

Intima Skupina

Imunosuprese

Den

A

ne

B

ne

C *

D

***

Media

Šířka

Endotel

7

10.6±5.2

7

20.3±15.0

FK506 den 1-30

7

FK506 den 7-30

7

Adventitia

Šířka

IgG

CD4+

CD8+

-

77.5±9.3

-

21.4±7.5

3.0±2.8

-

75.2±10.6

-

32.6±8.8

8.7±7.4

14.3±5.1

-

81.2±14.2

-

15.0±4.9

3.9±3.2

20.3±15.0

-

75.2±10.6

-

32.6±8.8

8.7±7.4

Tabulka 4 - Účinek opožděného podávání FK506 na základní charakteristiky poškození stěny aorty 30 dní po transplantaci *

Šířka intimy a medie je uvedená v μm

**

Počet CD4 a CD8 pozitivních buněk v jednom zorném poli při zvětšení 1000x

#

P < .05 *

*

Intima

**

Media

Adventitia

Skupina

Imunosuprese

Den

Šířka

Endotel

Šířka

IgG

CD4+

CD8+

A

no

30

35.5±23.4

+

80.2±14.2

-

25.3±8.8

9.6±7.1

B

no

30

121.6±33.2

+

61.3±11.1

+

108.8±24.0

59.8±12.2

C

FK506 den 1-30

30

41.0±19.2

+

73.5±11.8

-

23.8±9.3

6.0±5.0

D

FK506 den 7-30

30

40.5±23.6

+

82.9±13.7

-

23.7±6.5

8.3±4.5

Výsledky

#

#

#

Strana 34

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

5 DISKUZE

Výsledky

naší

experimentální

studie

dokazují,

že

podávání

imunosuprese pomocí FK506 až od sedmého dne po transplantaci subrenální břišní aorty mezi potkany kmene Brown-Norway a Lewis bylo dostatečné k potlačení akutních rejekčních změn v histologickém obrazu 30 dní po operaci ve všech základních vrstvách tepenné stěny. Proces rejekce v podmínkách alogenní transplantace bez imunosuprese vedl naopak měsíc po operaci k histologickému obrazu hyperplazie tunica intima, nekrózy tunica media a výrazné zánětlivé infiltrace tunica adventitia. Sedmý den po transplantaci jsme pozorovali známky denudace endotelu s adhezí leukocytů v syngenní i alogenní experimentální skupině, bez ohledu nato jestli imunosuprese byla nebo nebyla podávaná. Toto pozorování je ve shodě s poznatkem, že k aktivaci endotelových buněk a intimální reakci dochází v důsledku ischemicko-reperfúzniho poškození tepenných štěpů.47 Průměrná doba studené ischemie byla v našem experimentu 25 hodin. Tento časový interval jsme zvolili s ohledem na klinické podmínky transplantace tepenných štěpů, kdy se doba studené ischemie pohybuje kolem 30 hodin. Intenzita této fáze intimálni reakce a následně i intenzita rejekce je přímo závislá na závažnosti

ischemicko-reperfuzního

poškození,

které

se

zvyšuje

s

prodlužujícím se časem ischemie.48 Kromě délky ischemie mají na závažnost poškození endotelové vrstvy vliv i vlastnosti roztoku, ve kterém jsou tepny skladovány.49 Roztok HTK (histidin-tryptofan-ketoglutarat), který jsme v naší práci použili, je běžně používán ke konzervaci orgánů v klinické praxi i experimentálních studiích.50 Proces masivní adheze leukocytů a neointimální proliferace pokračoval mezi 7. a 30. dnem jen v alogenní skupině bez imunosuprese. FK506 dokázal potlačit toto sekundární poškození endotelových buněk, které je způsobeno imunitní reakci příjemce v důsledku přítomnosti aloantigenů buněk dárcovské tepny. Toto poškození se normálně objevuje mezi 14. a 21. dnem po transplantaci.51,25 Z naší práce je zjevné, že FK506 je schopen potlačit toto

Diskuze

Strana 35

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

sekundární poškození endotelových buněk i když je podáván až od sedmého dne po transplantaci. Ve všech experimentálních skupinách byla tunica intima 30.den po transplantaci pokrytá souvislou vrstvou endotelových buněk. Námi použité metody neumožnily zjistit dárcovský nebo příjemcovský původ těchto endotelových

buněk.

Nicméně,

předpokládáme,

že

plnou

regeneraci

endotelových buněk dárcovského původu, tak jak to bylo popsáno v jiných experimentech25,47 umožnilo i opožděné podávání FK506. Dostatečnou imunosupresi imunitního systému příjemce i přes opožděné podávání FK506 potvrzuje i nepřítomnost infiltrace příjemcovských MHC buněk II. třídy v neointimě tepenných štěpů 30. den po transplantaci. Opožděné podávání FK506 bylo dostatečné i k potlačení depozice imunoglobulinů třídy G v tunica media štěpů aorty a nekrózy této vrstvy. Táto vrstva je považována za cíl opožděné odpovědi imunitního systému příjemce. I v našem experimentu jsme pozorovali známky rejekce této vrstvy jen v alogenní skupině bez imunosuprese a to až po osmém dni po transplantaci. Charakteristickým znakem rejekce tunica media je nepřítomnost zánětlivých buněk v této cévní vrstvě.24 V literatuře se uvádí několik možných mechanizmů jak k poškození a nekróze svalových buněk dochází. Je možné, že extenzivní infiltrace tunica adventitia imunokompetentními buňkami příjemce a nedostatek vasa vasorum způsobuje poruchu výživy této vrstvy.47 Další možnosti je apoptóza hladkosvalových buněk způsobená nadbytkem induktorů apoptózy uvolněných z aktivovaných CD8 lymfocytů.52 Uvažuje se i o poškození hladkosvalových buněk zprostředkované imunoglobuliny mechanizmem, který je ale odlišný od nekrózy způsobené aktivaci komplementu.24 V našem experimentu FK506 i přes opožděné podávání inhiboval proces zánětlivé reakce a infiltrace tunica media CD4 a CD8 lymfocyty. Tento charakteristický znak akutní rejekce popisovaný v jiných studiích jsme pozorovali 30. den po transplantaci jen v alogenní skupině bez imunosuprese.52 Nejdůležitější roli v imunitní reakci v tunica adventitia mají právě CD8 lymfocyty. První známky infiltrace jsou pozorovány kolem 5. dne a dosahují svého vrcholu kolem 18. dne po transplantaci.24 Následně dochází k poškození

Diskuze

Strana 36

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

hladkosvalových buněk.52 Azuma a spol. ve své práci popisují masivní infiltraci tunica

adventitia

tepenných

štěpů

2

týdny

po

přerušení

podávání

imunosuprese.25 Některé práce dokonce naznačují, že poškození buněk v tunica media a intimální proliferace jsou procesy, které jsou regulovány zcela nezávisle.52,53 Imunosupresivum FK506 inhibuje kromě tvorby interleukínu 2 v Tlymfocytech, i produkci dalších solubilních mediátorů včetně interleukínů 3, 4 a 5, tumor nekrotizujícího faktoru alfa a faktoru stimulujícího makrofágy a granulocyty.54 Almawi a spol. ve své práci dokázali, že antiproliferativní působení FK506 se děje dvojím účinkem. Jednak inhibicí dostupnosti cytokínů a jednak inhibicí účinku těchto cytokínů na cílových buňkách.55 V experimentu byl pozorován i umocňující účinek FK506 na apoptózu T-lymfocytů.54 Předpokládáme, že se na potlačení rejekce v cévní stěně pomocí FK506 uplatnila jak suprese CD8 lymfocytů, tak inhibice tvorby a účinků růstových faktorů. První mechanismus se projevil v supresi nekrózy hladkosvalových buněk. Druhý mechanizmus v inhibici intimální proliferace. Potlačení rejekčních změn bylo dostatečné i v případě, že jsme FK506 podávali až od sedmého dne po transplantaci.

Diskuze

Strana 37

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

6 ZÁVĚR

Antigenicita tepenných alograftů vyvolávající imunitní odpověď v těle příjemce po jejich implantaci s následným poškozením jejích funkce byla opakovaně dokumentována v experimentálních i klinických studiích. Proces rejekce byl v experimentu potlačen užitím různých typů a kombinací imunosupresivních léků. I přes to není použití imunosuprese po transplantaci tepen a žil k zlepšení jejich průchodnosti v léčbě kritické ischemie v klinické praxi běžné. Ještě větší polemiku vyvolává použití imunosuprese u pacientů s infekcí cévní protézy léčených transplantací tepen a to zejména v perioperačním a časném pooperačním období. V naší experimentální práci jsme se pokusili ověřit modifikaci imunosupresivního protokolu právě u těchto vysoce rizikových pacientů. Transplantaci předpokládáme,

tepen že

považujeme imunosuprese

za je

orgánovou nutná

k

transplantaci

udržení

a

dlouhodobé

průchodnosti rekonstrukcí u těchto pacientů. Na druhé straně je ale zřejmé, že v časném pooperačním období po odstranění infikované cévní protézy je pacient dál ohrožen infekcí. V tomto období není imunosuprese imunitního systému výhodná, protože negativně ovlivňuje proces eradikace infekce. Protokol s podáváním imunosuprese u pacientů po transplantaci tepny v indikaci léčby infekce cévní protézy až od sedmého pooperačního dne se jeví jako ideální kompromis. Imunitní systém není časně po implantaci inhibován a může se tak kromě antibiotické terapie podílet na eradikaci infekce. Na druhou stranu je suprimován právě v době, kdy začíná rozeznávat antigeny dárcovské tepny. Tím nedochází k rozvoji akutní rejekce a poškození vlastností tepenné stěny, které výrazně zvyšuje riziko trombózy a uzávěru nebo dilatace a ruptury čerstvých tepenných štěpů.

Závěr

Strana 38

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

7 POUŽITÁ LITERATURA 1.

De Bakey ME, Stanley E, Crawford ES. Vascular prostheses. Transplant Bull 1957; 4(1):2-4.

2.

Crawford ES, De Bakey ME, Cooley DA. Clinical use of synthetic arterial substitutes in three hundred seventeen patients. AMA Arch Surg 1958; 76(2):261-70.

3.

Prager M, Polterauer P, Bohmig HJ, et al. Collagen versus gelatin-coated Dacron versus stretch polytetrafluoroethylene in abdominal aortic bifurcation graft surgery: results of a seven-year prospective, randomized multicenter trial. Surgery 2001; 130(3):408-14.

4.

AbuRahma AF, Robinson PA, Holt SM. Prospective controlled study of polytetrafluoroethylene versus saphenous vein in claudicant patients with bilateral

above

knee

femoropopliteal

bypasses.

Surgery

1999;

126(4):594-601; discussion 601-2. 5.

Johnson

WC,

Lee

KK.

A

comparative

evaluation

of

polytetrafluoroethylene, umbilical vein, and saphenous vein bypass grafts for

femoral-popliteal

above-knee

revascularization:

a

prospective

randomized Department of Veterans Affairs cooperative study. J Vasc Surg 2000; 32(2):268-77. 6.

Klinkert

P,

Schepers

A,

Burger

DH,

et

al.

Vein

versus

polytetrafluoroethylene in above-knee femoropopliteal bypass grafting: five-year results of a randomized controlled trial. J Vasc Surg 2003; 37(1):149-55. 7.

Hannon RJ, Wolfe JH, Mansfield AO. Aortic prosthetic infection: 50 patients treated by radical or local surgery. Br J Surg 1996; 83(5):654-8.

8.

Kieffer E, Gomes D, Chiche L, et al. Allograft replacement for infrarenal aortic graft infection: early and late results in 179 patients. J Vasc Surg 2004; 39(5):1009-17.

9.

Kieffer E, Bahnini A, Koskas F, et al. In situ allograft replacement of infected infrarenal aortic prosthetic grafts: results in forty-three patients. J Vasc Surg 1993; 17(2):349-55; discussion 355-6.

Použitá literatura

Strana 39

MUDr. Ivan Matia

10.

Dizertační práce

Camiade C, Goldschmidt P, Koskas F, et al. Optimization of the resistance of arterial allografts to infection: comparative study with synthetic prostheses. Ann Vasc Surg 2001; 15(2):186-96.

11.

Carrel A. Ultimate results of aortic transplantation. J Exp Med 1912; 15:389-398.

12.

Gross RE, Bill AH, Jr., Peirce EC, Jr. Methods for preservation and transplantation of arterial grafts; observations on arterial grafts in dogs; report of transplantation of preserved arterial grafts in nine human cases. Surg Gynecol Obstet 1949; 88(6):689-701.

13.

Dubost C, Allary M, Oeconomos N. Resection of an aneurysm of the abdominal aorta: reestablishment of the continuity by a preserved human arterial graft, with result after five months. AMA Arch Surg 1952; 64(3):405-8.

14.

Szilagyi DE, Mc DR, Smith RF, Whitcomb JG. Biologic fate of human arterial homografts. AMA Arch Surg 1957; 75(4):506-27; discussion 5279.

15.

Meade JW, Linton RR, Darling RC, Menendez CV. Arterial homografts. A long-term clinical follow-up. Arch Surg 1966; 93(3):392-9.

16.

Szilagyi DE, Rodriguez FJ, Smith RF, Elliott JP. Late fate of arterial allografts. Observations 6 to 15 years after implantation. Arch Surg 1970; 101(6):721-33.

17.

Bahnini A, Ruotolo C, Koskas F, Kieffer E. In situ fresh allograft replacement of an infected aortic prosthetic graft: eighteen months' follow-up. J Vasc Surg 1991; 14(1):98-102.

18.

Chiesa R, Astore D, Piccolo G, et al. Fresh and cryopreserved arterial homografts in the treatment of prosthetic graft infections: experience of the Italian Collaborative Vascular Homograft Group. Ann Vasc Surg 1998; 12(5):457-62.

19.

Knosalla C, Goeau-Brissonniere O, Leflon V, et al. Treatment of vascular graft infection by in situ replacement with cryopreserved aortic allografts: an experimental study. J Vasc Surg 1998; 27(4):689-98.

Použitá literatura

Strana 40

MUDr. Ivan Matia

20.

Dizertační práce

Litzler PY, Thomas P, Danielou E, et al. Bacterial resistance of refrigerated and cryopreserved aortic allografts in an experimental virulent infection model. J Vasc Surg 1999; 29(6):1090-6.

21.

Mennander A, Tiisala S, Halttunen J, et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb 1991; 11(3):671-80.

22.

Mirelli M, Stella A, Faggioli GL, et al. Immune response following fresh arterial homograft replacement for aortoiliac graft infection. Eur J Vasc Endovasc Surg 1999; 18(5):424-9.

23.

Lopez-Cepero M, Sanders CE, Buggs J, Bowers V. Sensitization of renal transplant candidates by cryopreserved cadaveric venous or arterial allografts. Transplantation 2002; 73(5):817-9.

24.

Plissonnier D, Nochy D, Poncet P, et al. Sequential immunological targeting of chronic experimental arterial allograft. Transplantation 1995; 60(5):414-24.

25.

Azuma N, Sasajima T, Kubo Y. Immunosuppression with FK506 in rat arterial allografts: fate of allogeneic endothelial cells. J Vasc Surg 1999; 29(4):694-702.

26.

Nikol S, Isner J, Pickering J, et al. Expression of transforming growth factor-beta 1 is increased in human vascular restenosis lesions. J Clin Invest 1992; 90(4):1582-92.

27.

Costa AN, Scolari MP, Iannelli S, et al. The presence of posttransplant HLA-specific IgG antibodies detected by enzyme-linked immunosorbent assay correlates with specific rejection pathologies. Transplantation 1997; 63(1):167-9.

28.

Prager M, Holzenbein T, Aslim E, et al. Fresh arterial homograft transplantation: a novel concept for critical limb ischaemia. Eur J Vasc Endovasc Surg 2002; 24(4):314-21.

29.

Stadler P, Sebesta P, Klika T, et al. [Allografts in the vascular surgery]. Rozhl Chir 2005; 84(7):350-5.

Použitá literatura

Strana 41

MUDr. Ivan Matia

30.

Dizertační práce

Pupka A, Skora J, Janczak D, et al. [Immunosuppression in the treatment of vascular prosthesis infection with arterial transplantation]. Pol Merkur Lekarski 2004; 16(91):8-11.

31.

Khanna A, Kapur S, Sharma V, et al. In vivo hyperexpression of transforming growth factor-beta1 in mice: stimulation by cyclosporine. Transplantation 1997; 63(7):1037-9.

32.

Shin GT, Khanna A, Sharma VK, et al. In vivo hyperexpression of transforming growth factor-beta 1 in humans: stimulation by cyclosporine. Transplant Proc 1997; 29(1-2):284.

33.

Zoja C, Furci L, Ghilardi F, et al. Cyclosporin-induced endothelial cell injury. Lab Invest 1986; 55(4):455-62.

34.

Dumont FJ. FK506, an immunosuppressant targeting calcineurin function. Curr Med Chem 2000; 7(7):731-48.

35.

Faivre L, Saoudi S, Astier A, et al. FK 506 dose in transplantation: from theory to practice. Transplant Proc 2001; 33(4):2594-7.

36.

Vincenti F, Jensik SC, Filo RS, et al. A long-term comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine in kidney transplantation: evidence for improved allograft survival at five years. Transplantation 2002; 73(5):775-82.

37.

Wang T, Donahoe PK, Zervos AS. Specific interaction of type I receptors of the TGF-beta family with the immunophilin FKBP-12. Science 1994; 265(5172):674-6.

38.

Vogt PR, Brunner-LaRocca HP, Lachat M, et al. Technical details with the use of cryopreserved arterial allografts for aortic infection: influence on early and midterm mortality. J Vasc Surg 2002; 35(1):80-6.

39.

Verhelst R, Lacroix V, Vraux H, et al. Use of cryopreserved arterial homografts for management of infected prosthetic grafts: a multicentric study. Ann Vasc Surg 2000; 14(6):602-7.

40.

Noel AA, Gloviczki P, Cherry KJ, Jr., et al. Abdominal aortic reconstruction in infected fields: early results of the United States cryopreserved aortic allograft registry. J Vasc Surg 2002; 35(5):847-52.

Použitá literatura

Strana 42

MUDr. Ivan Matia

41.

Dizertační práce

Cochran P, Kunzelman K. Cryopreservation does not alter antigenic expression of aortic allografts. J Surg Res 1989; 46:597-599.

42.

Moriyama S, Utoh J, Sun LB, et al. Antigenicity of cryopreserved arterial allografts: comparison with fresh and glutaraldehyde treated grafts. Asaio J 2001; 47(3):202-5.

43.

Salomon RN, Friedman GB, Callow AD, et al. Cryopreserved aortic homografts contain viable smooth muscle cells capable of expressing transplantation antigens. J Thorac Cardiovasc Surg 1993; 106(6):117380.

44.

Adamec M, Matia I, Janousek L, et al. Renal transplantation in patients with abdominal aortic aneurysm--a new surgical approach. Transpl Int 2004; 17(10):647-50.

45.

Matia I, Adamec M, Janousek L, et al. Fresh arterial grafts as conduits for vascular reconstructions in transplanted patients. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006; 32(5):549-56.

46.

Matia I, Adamec M, Varga M, et al. Aortoiliac reconstruction with allograft and kidney transplantation as a one-stage procedure: long term results. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35(3):353-7.

47.

Hillebrands JL, Klatter FA, van den Hurk BM, et al. Origin of neointimal endothelium and alpha-actin-positive smooth muscle cells in transplant arteriosclerosis. J Clin Invest 2001; 107(11):1411-22.

48.

Knight RJ, Dikman S, Liu H, Martinelli GP. Cold ischemic injury accelerates the progression to chronic rejection in a rat cardiac allograft model. Transplantation 1997; 64(8):1102-7.

49.

Vischjager M, Van Gulik TM, Pfaffendorf M, et al. Morphology and function of dog arterial grafts preserved in UW-solution. Eur J Vasc Endovasc Surg 1995; 10(4):431-9.

50.

Balaz P, Matia I, Jackanin S, et al. Preservation injury of jejunal grafts and its modulation by custodiol and university of wisconsin perfusion solutions in wistar rats. Eur Surg Res 2004; 36(4):192-7.

Použitá literatura

Strana 43

MUDr. Ivan Matia

51.

Dizertační práce

Gohra H, McDonald TO, Verrier ED, Aziz S. Endothelial loss and regeneration in a model of transplant arteriosclerosis. Transplantation 1995; 60(1):96-102.

52.

Legare JF, Issekutz T, Lee TD, Hirsch G. CD8+ T lymphocytes mediate destruction of the vascular media in a model of chronic rejection. Am J Pathol 2000; 157(3):859-65.

53.

Mennander A, Paavonen T, Hayry P. Intimal thickening and medial necrosis in allograft arteriosclerosis (chronic rejection) are independently regulated. Arterioscler Thromb 1993; 13(7):1019-25.

54.

Hashimoto

Y,

Matsuoka

N,

Kawakami

A,

et

al.

Novel

immunosuppressive effect of FK506 by augmentation of T cell apoptosis. Clin Exp Immunol 2001; 125(1):19-24. 55.

Almawi WY, Assi JW, Chudzik DM, et al. Inhibition of cytokine production and cytokine-stimulated T-cell activation by FK506 (tacrolimus)1. Cell Transplant 2001; 10(7):615-23.

Použitá literatura

Strana 44

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

8 VLASTNÍ PUBLIKAČNÍ AKTIVITA

8.1 Publikace týkající se tématu dizertační práce

8.1.1 Články v odborných časopisech s IF

1.

Matia I, Adamec M, Varga M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Aortoiliac reconstruction with allograft and kidney transplantation as a one-stage procedure: long term results. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35:353357. IF 2,156 (r. 2006)

2.

Matia I, Lodererova A, Adamec M. Delayed administration of FK 506 is sufficient to suppress acute rejection changes after aortal transplantation in rats. Transpl Int 2007;20:371-380. IF 2,146 (r. 2006)

3.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Fresh arterial grafts as conduits for vascular reconstructions in transplanted patients. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006;32:549-56. IF 2,156 (r. 2006)

4.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Fresh arterial grafts as conduits for vascular reconstructions in transplanted patients (EJVESJVS abstracts). J Vasc Surg 2006;44:1023. IF 3,311 (r. 2006)

5.

Adamec M, Matia I, Janoušek L, Froněk J, Bachleda P, Lácha J, Viklický O. Renal transplantation in patients with abdominal aortic aneurysm – a new surgical approach. Transpl Int 2004;17:647-650. IF 1,295 (r. 2004)

8.1.2 Články v odborných časopisech bez IF

1.

Matia I, Adamec M, Froněk J, Tošenovský P, Janoušek L, Baláž P, Langer D, Lipár K, Lácha J. Ischémie tlustého střeva po současné transplantaci ledviny a náhradě výdutě břišní aorty čerstvým tepenným štěpem. Rozhl Chir 2004;83:121-127.

Vlastní publikace

Strana 45

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

8.1.3 Kapitoly v monografiích

1.

Matia I, Havlíčková J, Baláž P, Adamec M. Transplantace břišní aorty. In: Baláž P, Mergental H a spol. Transplantace v experimentu. Praha: Galén, 2006. Kapitola 2.5, s. 101-105.ISBN 8072623664

8.2 Publikace bez vztahu k tématu dizertační práce

8.2.1 Články v odborných časopisech s IF

1.

Matia I, Janoušek L, Marada T, Adamec M. Cold-stored venous allografts in the treatment of critical limb ischaemia. Eur J Vasc Endovasc Surg 2007;34:424-31. IF 2,156 (r. 2006)

2.

Matia I, Janoušek L, Marada T, Adamec M. Cold-stored venous allografts in the treatment of critical limb ischaemia (Selected Abstracts from the October Issue of the European Journal of Vascular and Endovascular Surgery). J Vasc Surg 2007;46:826. IF 3,311 (r. 2006)

3

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Rybárová E, Kron I, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Preservation injury of jejunal grafts and its modulation by Custodiol and University of Wisconsin perfusion solutions in Wistar rats. Eur Surg Res 2004;36:192-197. IF 0,750 (r. 2004)

4.

Janoušek L, Adamec M, Saudek F, Kožnárova R, Bouček P, Lipár K, Tošenovský P, Matia I. Modulating amylase and lipase secretion in the pancreatic graft by somatostatin administration: preliminary results of a prospective, randomized trial. Transpl Proc 2004;36:1099-1100. IF 0,511 (r. 2004)

Vlastní publikace

Strana 46

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

8.2.2 Články v odborných časopisech bez IF

1.

Rokošný S, Kišš J, Wohlfahrt P, Baláž P, Matia I, Stefan T, Pomfy M. Využitie peritoneálneho štepu ako cievnej náhrady v experimente. Rozhl Chir 2005;84:228-232.

2.

Matia I, Baláž P, Jackanin S, Rybárová E, Kron I, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Serotonin levels in the small bowel mucosa as a marker of ischemic injury during small bowel preservation. Ann Transplant 2004;9:48-51.

3.

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Morphological changes of small bowel graft in Wistar rats after preservation injury. Brat Lek Listy 2004;105:62-64.

4.

Janoušek

L,

Adamec

M,

Matia

I,

Lipár

K,

Tošenovský

P.

Revaskularizace končetiny u diabetiků pomocí allogenní v. saphena magna. Suppl 1 Bulletin HPB, 2004;12:54-55. 5.

Baláž P, Matia I, Kišš J, Jackanin S, Rokošný S, Wohlfahrt P, Pingorová S, Pomfy M. Histologické zmeny v stene jejuna po jeho autotransplantácii u psa. Rozhl Chir 2004;83:246-250.

6.

Baláž P, Kudla M, Matia I, Froněk J, Ryska M. Model of small bowel transplantation with systematic venous drainage in rats. Ann Transplant 2003;8:36-38.

7.

Rokošný S, Kišš J, Baláž P, Matia I, Jackanin S, Wohlfahrt P, Pingorová S, Pomfy M. Technika heterotopickej autotransplantácie tenkého čreva u psa. Bulletin HPB 2002;10:89-92.

8.

Baláž P, Jackanin S, Jakubík P, Matia I. Experimentálne ovplyvnenie prezervačno reperfúzneho poškodenia pri autotransplantácii obličky. Bulletin HPB 2000;8:136-139.

9.

Jackanin S, Baláž P, Jakubík P, Matia I. Autotransplantácia sleziny po traumatickom poškodení. Bulletin HPB 1999;7:14-18.

Vlastní publikace

Strana 47

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

8.2.3 Kapitoly v monografiích

1.

Matia I, Sabol M, Molčanyi M. Autotransplantace slezinné tkáně. In: Baláž P, Mergental H a spol. Transplantace v experimentu. Praha: Galén, 2006. Kapitola 3.3, s. 133-137.ISBN 8072623664

2.

Baláž P, Kudla M, Matia I. Transplantace tenkého střeva. In: Baláž P, Mergental H a spol. Transplantace v experimentu. Praha: Galén, 2006. Kapitola 2.4, s. 95-100.ISBN 8072623664

8.3 Přednášky a postery týkající se tématu dizertační práce

8.3.1 S abstraktem

1.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Simultaneous kidney transplantation and aortoiliac reconstruction. 8th European Transplant Fellow Workshop, 19.-21.10.2007, Oslo, Norway In: 8th European Transplant Fellow Workshop Programme and Abstract book. p. 38, abstr. no. 14.

2.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Aortoiliac reconstruction and kidney transplantation performed as one-stage procedure: long term results. XXI Annual Meeting of the European Society for Vascular Surgery, 20.-23.9.2007, Madrid, Spain In: 21st Annual Meeting of the European Society for Vascular Surgery. Salisbury: Salisbury Printing, 2007, p. 101, abstr. no.25.

3.

Matia I, Janoušek L, Adamec M, Lipár K. Imunosupresivní léčba po cévních

rekonstrukcích

allogenním

štěpem

-

naše

klinické

a

experimentální zkušenosti. II. Sjezd České společnosti kardiovaskulární chirurgie, 30.11.-1.12.2006, Brno, Česká republika In: 2. sjezd České společnosti kardiovaskulární chirurgie. Sborník abstrakt. B.m. : b.n., 2006, b.s., č.abstr. 20 (Angiochirurgická sekce).

Vlastní publikace

Strana 48

MUDr. Ivan Matia

4.

Dizertační práce

Matia I, Lodererova A, Adamec M. Vliv opožděného podávání FK 506 na rejekční změny v cévní steně – experimentální studie. I.československý transplantační kongres, 16.-18.11.2006, Brno, Česká republika In: 1. československý transplantační kongres. Sborník abstrakt s programem. B.m.: b.n., 2006, s. nestr., č. abstr. U30. ISSN/ISBN 80-239-8022-X.

5.

Matia I, Lodererova A, Adamec M. Delayed administration of FK 506 is sufficient

to

suppress acute

rejection changes

after rat

aortal

transplantation. XX Annual Meeting of the European Society for Vascular Surgery, 21.-24.9.2006, Prague, Czech Republic In: 20th Annual Meeting of the European Society for Vascular Surgery. Salisbury : Salisbury Printing, 2006, p. 121, abstr. no.P9. 6.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Naše zkušenosti s využitím čerstvých tepenných allograftů k cévní rekonstrukci u pacientů po transplantaci orgánů. I.multidisciplinární sympozium euroregionu Nisa s mezinárodní účastí Inter-Angio-2005, 12.-14.10.2005, Liberec, Česká republika In: 2. multidisciplinární symposium Euroregionu Nisa s mezinárodní účastí. Sborník abstrakt. s. 14.

7.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Baláž P, Lipár K, Lácha J, Viklický O. Fresh arterial transplantation in experiment and clinical practice. XXXth Angiological days 2005 with international participation, 24.-26.2.2005, Praha, Česká republika. XXXth Angiological days 2005 with international participation

Abstracts.

In:

Central

European

Vascular

Journal.

Phlebomedica, 2005, roč. 4, č. 1, s. 32. 8.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Baláž P, Lipár K, Lácha J., Viklický O. Osud nemocných s transplantovanou tepnou. I.sjezd České společnosti kardiovaskulární chirurgie, 11.-12.11.2004, Brno, Česká republika In: 1.sjezd České společnosti kardiovaskulární chirurgie. Sborník abstrakt. B.m. : b.n., 2004, s. 110, č.abstr. 28.

9.

Adamec M, Matia I, Janoušek L, Tošenovský P, Froněk J, Bachleda P, Lácha J, Viklický O. Renal transplantation in patients with abdominal aortic aneurysm - new surgical approach. 11th Congress of the European Society for Organ Transplantation and 13th ETCO Congress. 20.-

Vlastní publikace

Strana 49

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

24.9.2003, Venice, Italy. In:11th Congress of the European Society for Organ Transplantation and 13th ETCO Congress. Abstract book. abstr. no. 339. 10.

Adamec M, Matia I, Janoušek L, Tošenovský P, Lipár K. Fresh arterial allograft - present state. Tradiční angiologické dny. 3.-5.4.2003, Praha, Česká republika. In: Praktická flebologie. Phlebomedica, 2003, roč. 12, č. 4, s. 113-114. ISSN/ISBN 1210-3411.

8.3.2 Bez abstraktu 1.

Matia I, Adamec M, Janoušek L, Baláž P, Lipár K, Lácha J. Aortic replacement

with

arterial

allograft

and

simultaneous

kidney

transplantation - our experience. 8th Slovak Congress of Vascular Surgery. 27.-28.5.2004, Bratislava, Slovenská republika 8.7 Přednášky a postery bez vztahu k tématu dizertační práce

8.7.1 S abstraktem

1.

Marada T, Matia I, Janoušek L, Adamec M. Venous allografts as conduits for vascular reconstructions. 8th European Transplant Fellow Workshop, 19.–21.10.2007, Oslo, Norway In: 8th European Transplant Fellow Workshop Programme and Abstract book. s. 36, č. abstr. 13.

2.

Matia I, Janoušek L, Adamec M, Pavlova Y, Slavčev A. The influence of FK 506 on donor-specific immune response following clod-stored venous allografts transplantation in patients with critical limb ischemia. 13th Congress of the European Society for Organ Transplantation. 15th Congress of the European Transplant Coordinators Organization. 29.09. - 03.10.2007. Prague, Czech Republic In: Transplant international. 2007, vol. 20, no. suppl. 2, p. 128, abstr. no. P136 ISSN/ISBN 0934-0874.

Vlastní publikace

Strana 50

MUDr. Ivan Matia

3.

Dizertační práce

Matia I, Janoušek L, Marada T, Adamec M. Cold-stored venous allografts in the treatment of critical limb ischaemia. XXXIIth Angiological days 2007 with international participation, 22.-24.2.2007, Praha, Česká republika XXXII Angiological days 2007 with international participation Abstracts. In: Central European Vascular Journal. Phlebomedica, 2007, roč.6, č. 1, s. 29-30.

4.

Marada T, Matia I, Janoušek L, Adamec M, Lipár K. Allogenní žíla v léčbě kritické ischémie dolních končetin. II. Sjezd České společnosti kardiovaskulární chirurgie, 30.11.-1.12.2006, Brno, Česká republika In: 2. sjezd České společnosti kardiovaskulární chirurgie. Sborník abstrakt. B.m. : b.n., 2006, b.s., č.abstr. 19 (Angiochirurgická sekce).

5.

Marada T, Matia I, Janoušek L, Adamec M, Lipár K. Pětileté zkušenosti s použitím allogénní žíly k léčbě ICHDK. II.multidisciplinární sympozium euroregionu Nisa s mezinárodní účastí Inter-Angio-2005, 12.-14.10.2005, Liberec, Česká republika In: 2. multidisciplinární symposium Euroregionu Nisa s mezinárodní účastí Sborník abstrakt. s. 9

6.

Baláž P, Kudla M, Matia I. Preservation injury of jejunal grafts and its modulation by Custodiol (HTK) and University of Wisconsin (UW) perfusion solutions in Wistar rats. IX International small bowel transplantation symposium. 30.6.-2.7.2005, Brussels, Belgium In: 9th International Small Bowel Transplantation Symposium. Final Program and Abstract Book. Brussels : Intestinal Transplantation Association, 2005, p. 113, abstr. no. P 56.

7.

Janoušek L, Kožnárova M, Adamec M, Lipár K, Matia I. Modulating amylase and lipase secretion in the pancreatic graft by somatostatine administration - a prospective randomized trial.The International Pancreas and Islet Transplant Association (IPITA) - 10th Meeting, 4.7.5.2005, Geneva, Switzerland In: 10th World Congress of the International Pancreas and Islet Transplant Association. Abstract Book. B.m. : b.n., 2005, p. 72-73, abstr. no. PS-022.

8.

Baláž P, Kudla M, Matia I, Adamec M. Experimentální transplantace tenkého střeva - naše zkušenosti. 11.symposium o morfologii a funkci

Vlastní publikace

Strana 51

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

střeva. 28.-30.4.2005, Staré Splavy, Česká republika. In: 11.symposium o morfologii a funkci střeva. Praha : Česká gastroenterologická společnost ČLS JEP, 2005, s. 14. 9.

Baláž P, Kudla M, Oliverius M, Matia I, Adamec M, Pomfy M. Experimentální transplantace

tenkého

střeva -

naše

zkušenosti.

6.kongres České transplantační společnosti, 14.-16.10.2004, Praha, Česká republika.In: 6.kongres České transplantační společnosti. 1st Joint Meeting of the Czech and American Transplant Societies. Praha : Česká transplantační společnost, 2004, s. 26, č.abstr. O 34. ISSN/ISBN 80-2393771-5. 10.

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Rokošný S, Kišš J, Wohlfahrt P, Pomfy M. Experimental small bowel autotransplantation - a histological study. 42nd Congress

of

the

Slovak

Anatomical

Society

with

International

participation, 28.-30.6.2004, Košice, Slovenská republika. In: 42nd Congress

of

the

Slovak

Anatomical

Society

with

International

Participation. Programme and Abstracts. Edičné stredisko UPJŠ, 2004, s. 1, č. abstr. ISBN 80-7097-554-7. 11.

Wohlfahrt P, Leško D, Pingorová S, Toth Š, Pomfy M, Baláž P, Matia I, Rokošny S. Reconstruction of the venous wall using peritoneal tubules. 42nd Congress of the Slovak Anatomical Society with International participation, 28.-30.6.2004, Košice, Slovenská republika. In: 42nd Congress

of

the

Slovak

Anatomical

Society

with

International

Participation. Programme and Abstracts. Edičné stredisko UPJŠ, 2004, s. 98, č. abstr. P 61 ISBN 80-7097-554-7. 12.

Wohlfahrt P, Rokošný S, Kišš J, Leško D, Tóth Š, Baláž P, Matia I, Tošenovský P, Rojtáš M, Pomfy M. Endothelisation and trombogenicity of parietal peritoneum in the venous system of a dog. 42nd Congress of the Slovak Anatomical Society with International Participation. 28.30.6.2004, Košice, Slovenská republika. In: 42nd Congress of the Slovak Anatomical Society with International Participation. Programme and Abstracts. Edičné stredisko UPJŠ, 2004, s. 99, č. abstr. P 60 ISBN 807097-554-7.

Vlastní publikace

Strana 52

MUDr. Ivan Matia

13.

Dizertační práce

Matia I, Baláž P, Froněk J, Ryska M, Jackanin S, Pomfy M. Ischemické poškodenie jejunálnych štepov a jeho ovplyvnenie perfúznymi roztokmi HTK a UW u potkanov kmeňa Wistar. 4. Slovenský transplantačný kongres s medzinárodnou účasťou, 22.-24.5.2003, Banská Bystrica, Slovenská

republika.

In:

4.slovenský

transplantačný

kongres

s

medzinárodnou účaťou. Abstrakty. s. 65. 14.

Froněk J, Baláž P, Matia I, Ryska M. Serotonin jako možný parametr hodnocení míry konzervačního poškození štěpu tenkého střeva. V. konference Transplantace orgánů a tkání, 14.–15.10.2002, Brno, Česká republika In: Transplantace orgánů a tkání : sborník abstrakt. Praha : Česká transplantační společnost, 2002, s. 33.

15.

Baláž P, Froněk J, Matia I, Jackanin S, Ryska M. Morfologický obraz konzervačního

poškození

štěpu

tenkého

střeva.

V.

konference

Transplantace orgánů a tkání, 14.–15.10.2002, Brno, Česká republika. In: Transplantace orgánů a tkání : sborník abstrakt. Praha : Česká transplantační společnost, 2002, s. 83.

8.7.2 Bez abstraktu

1.

Wohlfahrt P, Rokošny S, Kišš J, Leško D, Toth Š, Baláž P, Matia I, Tošenovský P, Rojtáš M. Endothelisation and trombogenicity of parietal peritoneum in the venous system of a dog. 14th European students´ conference for medical students and young doctors, 4.-9.10.2003, Berlin, Germany.

2.

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Kišš J, Rokošný S, Wohlfahrt P, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Preservation injury of jejunal grafts in rats. A study of Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate (HTK) and University of Wisconsin (UW) preservation solutions. 13th European students´ conference for medical students and young doctors, 29.10.-2.11.2002, Berlin, Germany

3.

Jackanin S, Baláž P, Matia I. Preservation injury of jejunal grafts in rats. A study of Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate (HTK) and University of

Vlastní publikace

Strana 53

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

Wisconsin (UW) preservation solutions. 12th European students´ conference for medical students and young doctors, 21.–25.10.2001, Berlin, Germany. 4.

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Rokošný S, Kišš J. Influence of L-arginine on preservation-reperfusion injury by small bowel autotransplantation in dogs. 12th European students´ conference for medical students and young doctors, 21.–25.10.2001, Berlin, Germany.

5.

Baláž P, Jackanin S, Jakubík P, Matia I. The experimental influence on the preservation-reperfusion injury in autotransplanted kidneys. 11th European students´ conference for medical students and young doctors, 22.-26.11.2000, Berlin, Germany.

6.

Jackanin S, Baláž P, Jakubík P, Matia I. Spleen saving surgery after trauma injury: prevention of bacterial infection in dogs. 10th European students´ conference for medical students and young doctors, 20.– 23.10.1999, Berlin, Germany.

8.8 Citační ohlas

8.8.1 Na články týkající se tématu dizertační práce

Adamec M, Matia I, Janoušek L, Froněk J, Bachleda P, Lácha J, Viklický O. Renal transplantation in patients with abdominal aortic aneurysm – a new surgical approach. Transpl Int 2004;17:647-650. 1.

Shrestha B, McKane W, Raftery A. Renal transplantation after endovascular repair of abdominal aortic aneurysm.Transpl Proc 2007; 39:1670–1672. IF 0,962 (r. 2006)

2.

Tsilimparis N, Alevizakos P, Yousefi S, et al. Endovascular therapy of an abdominal aortic aneurysm in a renal transplant recipient. Zentralblatt fur chirurgie 2007;132:220-225.

Vlastní publikace

Strana 54

MUDr. Ivan Matia

3.

Dizertační práce

Cellarier D, Guichard G, Loock PY, Bernardini S, Chabannes E, Bittard H, Kleinclauss F. Vascular prostheses and renal transplantation | [Prothèses vasculaires et transplantations rénales]. Progres en Urologie 2006;16:554-558.

8.8.2 Na články bez vztahu k tématu dizertační práce

Matia I, Baláž P, Jackanin S, Rybárová E, Kron I, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Serotonin levels in the small bowel mucosa as a marker of ischemic injury during small bowel preservation. Ann Transplant 2004;9:48-51. 1.

Bertoni S, Ghizzardi P, Cattaruzza F, Ballabeni V, Impicciatore M, Tognolini M, Lagrasta CA, Barocelli E. Evidence for the involvement of 5HT2A receptors in mild mesenteric ischemia/reperfusion dysfunctions in mice. Pharmacol Res 2007;56:550-555. IF 2,421 (r. 2006)

2.

Zuo XL, Li YQ, Yang XZ, Guo M., Guo YT, Lu XF, Li JM, Desmond PV. Plasma

and

gastric

mucosal

5-hydroxytryptamine

concentrations

following cold water intake in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. J Gastroenterol Hepatol 2007 22:2330-2337. IF 1,785 (r. 2006) 3.

Bennett MI, Livingstone HJ, Costello P, Allen KR, Degg TJ. Symptom scores, serotonin and 5-hydroxyindole acetic acid levels in cancer patients with and without bowel obstruction. Palliative Med 2007;21:157159. IF 1,939 (r. 2006)

4.

Froněk J, Živný P, Vávrová J, Ryska M. Preservation injury of the small bowel graft in rats. Eur Surg 2006;38: 439-444.

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Morphological changes of small bowel graft in Wistar rats after preservation injury. Brat Lek Listy 2004;105:62-64.

Vlastní publikace

Strana 55

MUDr. Ivan Matia

1.

Dizertační práce

Wei L, Hata K, Doorschodt BM, Buttner R, Minor T, Tolba RH. Experimental small bowel preservation using Polysol: A new alternative to University

of Wisconsin

solution, Celsior and

histidine-trytophan-

ketoglutarate solution? World J Gastroenterol 2007;13:3684-3691. 2.

Froněk J, Živný P, Vávrová J, Ryska M. Preservation injury of the small bowel graft in rats. Eur Surg 2006;38: 439-444.

Baláž P, Matia I, Jackanin S, Rybárová E, Kron I, Pomfy M, Froněk J, Ryska M. Preservation injury of jejunal grafts and its modulation by Custodiol and University of Wisconsin perfusion solutions in Wistar rats. Eur Surg Res 2004;36:192-197. 1.

Froněk J, Živný P, Vávrová J, Ryska M. Preservation injury of the small bowel graft in rats. Eur Surg 2006;38: 439-444.

Baláž P, Kudla M, Matia I, Froněk J, Ryska M. Model of small bowel transplantation with systematic venous drainage in rats. Ann Transplant 2003;8:36-38. 1.

Froněk J, Živný P, Vávrová J, Ryska M. Preservation injury of the small bowel graft in rats. Eur Surg 2006;38: 439-444.

Jackanin S, Baláž P, Jakubík P, Matia I. Splenic autotransplantation after traumatic injury. Bulletin HPB 1999;7:14-18. 1.

Molcanyi M, Neugebauer E, Schafer U. Zellbiologie in der Chirurgie. In: Krukemeyer MG, Spiegel HU. Chirurgische Forschung. Thieme, Stuttgart - New York 2006. ISBN 3131336617

Vlastní publikace

Strana 56

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

9 SEZNAM PŘÍLOH Příloha A Matia I, Lodererova A, Adamec M. Delayed administration of FK 506 is sufficient to suppress acute rejection changes after aortal transplantation in rats. Transpl Int 2007;20:371-380. IF 2,146 (r. 2006) Příloha B Matia I, Havlíčková J, Baláž P, Adamec M. Transplantace břišní aorty. In: Baláž P., Mergental H. a spol. Transplantace v experimentu. Praha: Galén, 2006. Kapitola 2.5, s. 101-105. ISBN 8072623664 Příloha C Matia I, Adamec M, Varga M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Aortoiliac reconstruction with allograft and kidney transplantation as a one-stage procedure: long term results. Eur J Vasc Endovasc Surg 2008; 35:353-357. IF 2,156 (r. 2006) Příloha D Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O. Fresh arterial grafts as conduits for vascular reconstructions in transplanted patients. Eur J Vasc Endovasc Surg 2006;32:549-56. IF 2,156 (r. 2006) Příloha E Adamec M, Matia I, Janoušek L, Froněk J, Bachleda P, Lácha J, Viklický O. Renal transplantation in patients with abdominal aortic aneurysm – a new surgical approach. Transpl Int 2004;17:647-650. IF 1,295 (r. 2004) Příloha F Matia I, Adamec M, Froněk J, Tošenovský P, Janoušek L, Baláž P, Langer D, Lipár K, Lácha J. Ischémie tlustého střeva po současné transplantaci ledviny a náhradě výdutě břišní aorty čerstvým tepenným štěpem. Rozhl Chir 2004;83:121-127.

Seznam příloh

Strana 57

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PŘÍLOHA A

DELAYED ADMINISTRATION OF FK 506 IS SUFFICIENT TO SUPPRESS ACUTE REJECTION CHANGES AFTER AORTAL TRANSPLANTATION IN RATS Matia I, Lodererova A, Adamec M TRANSPLANT INTERNATIONAL 2007;20:371-380

Transplant International: Official journal of the European Society for Organ Transplantation, the European Liver and Intestine Transplant Association and the German Transplantation Society Edited by: Ferdinand Mühlbacher and Thomas Wekerle ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2006: 30/138 (Surgery); 11/19 (Transplantation) Impact Factor: 2.146

Strana 55

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PŘÍLOHA B

TRANSPLANTACE BŘIŠNÍ AORTY Matia I, Havlíčková J, Baláž P, Adamec M IN: BALÁŽ P, MERGENTAL H A SPOL. TRANSPLANTACE V EXPERIMENTU. PRAHA: GALÉN, 2006. KAPITOLA 2.5, S. 101-105. ISBN 8072623664

Strana 63

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PŘÍLOHA C

AORTOILIAC RECONSTRUCTION WITH ALLOGRAFT AND KIDNEY TRANSPLANTATION AS A ONE-STAGE PROCEDURE: LONG TERM RESULTS Matia I, Adamec M, Varga M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O EUROPEAN JOURNAL OF VASCULAR AND ENDOVASCULAR SURGERY 2008;35:353-357

European Journal of Vascular and Endovascular Surgery is the Official journal of the European Society for Vascular Surgery Edited by: P.G. Cao ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2006: 28/139 (Surgery); 28/51 (Peripheral Vascular Disease) Impact Factor: 2.156

Strana 69

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PŘÍLOHA D

FRESH ARTERIAL GRAFTS AS CONDUITS FOR VASCULAR RECONSTRUCTIONS IN TRANSPLANTED PATIENTS Matia I, Adamec M, Janoušek L, Lipár K, Viklický O EUROPEAN JOURNAL OF VASCULAR AND ENDOVASCULAR SURGERY 2006;32:549-556.

European Journal of Vascular and Endovascular Surgery is the Official journal of the European Society for Vascular Surgery Edited by: P.G. Cao ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2006: 28/139 (Surgery); 28/51 (Peripheral Vascular Disease) Impact Factor: 2.156

Strana 76

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PŘÍLOHA E

RENAL TRANSPLANTATION IN PATIENTS WITH ABDOMINAL AORTIC ANEURYSM – A NEW SURGICAL APPROACH Adamec M, Matia I, Janoušek L, Froněk J, Bachleda P, Lácha J, Viklický O TRANSPLANT INTERNATIONAL 2004;17:647-650.

Transplant International: Official journal of the European Society for Organ Transplantation, the European Liver and Intestine Transplant Association and the German Transplantation Society Edited by: Ferdinand Mühlbacher and Thomas Wekerle ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2006: 30/138 (Surgery); 11/19 (Transplantation) Impact Factor: 2.146

Strana 85

MUDr. Ivan Matia

Dizertační práce

PŘÍLOHA F

ISCHÉMIE TLUSTÉHO STŘEVA PO SOUČASNÉ TRANSPLANTACI LEDVINY A NÁHRADĚ VÝDUTĚ BŘIŠNÍ AORTY ČERSTVÝM TEPENNÝM ŠTĚPEM Matia I, Adamec M, Froněk J, Tošenovský P, Janoušek L, Baláž P, Langer D, Lipár K, Lácha J ROZHLEDY V CHIRURGII 2004;83:121-127

Rozhledy v Chirurgii: Celostátní odborný časopis České chirurgické společnosti a Slovenskej chirurgickej spoločnosti Vedoucí redaktor: Prof. MUDr. Miloš Hájek, DrSc.

Strana 85