Karakteristik Molekuler dan Patogenesitas Virus H5N1 clade asal Indonesia

Dharmayanti et al. Karakteristik molekuler dan patogenesitas virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia

Karakteristik Molekuler dan Patogenesitas Virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia Dharmayanti NLPI1, Hartawan R1, Hewajuli DA1, Hardiman1, Wibawa H2 Pudjiatmoko3 1

2

Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. RE Martadinata 30 Bogor 16114 E-mail: [email protected] Balai Besar Veteriner Wates Jogjakarta, Jl. Raya Yogya Wates Km. 27 PO Box 18 Wates 55602 3 Direktorat Jendral Peternakan, Kementerian Pertanian (Diterima 4 Maret 2013; disetujui 23 April 2013)

ABSTRACT Dharmayanti NLPI, Hartawan R, Hewajuli DA, Hardiman, Wibawa H, Pudjiatmoko. 2013. Molecular characteristic and pathogenicity of Indonesian H5N1 clade 2.3.2 viruses. JITV 18(2): 99-113. The outbreak of disease in late 2012 in Indonesia caused high duck mortality. The agent of the disease was identified as H5N1 clade 2.3.2. The disease caused economic loss to the Indonesian duck farmer. The clade 2.3.2 of H5N1 virus has not previously been identified, so this study was conducted to characterize 4 of H5N1 clade 2.3.2 viruses by DNA sequencing in eight genes segment virus namely HA, NA, NS, M, PB1, PB2, PA and NP. The pathogenicity test of clade 2.3.2 viruses in ducks was compared to clade 2.1.3 viruses which predominat circulating in Indonesia. Results of phylogenetic tree analysis showed that the four of clade 2.3.2 viruses isolated in 2012 was the new introduced virus from abroad. Further analysis showed eight genes were in one group with the clade 2.3.2 viruses, especially those from VietNam and did not belong to Indonesia viruses group. The pathogenicity test in ducks showed that virus H5N1 clade 2.3.2 and clade 2.1.3 have similar clinical symptoms and pathogenicity and cause death in 75% of ducks on days 3-6 after infection. Key Words: H5N1 Virus, Clade 2.3.2, Clade 2.1.3, Phylogenetic Tree, Pathogenecity ABSTRAK Dharmayanti NLPI, Hartawan R, Hewajuli DA, Hardiman, Wibawa H, Pudjiatmoko. 2013. Karakteristik Molekuler dan Patogenesitas Virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia. JITV 18(2): 99-113 Wabah kematian pada itik yang disebabkan oleh virus H5N1 clade 2.3.2 pada akhir tahun 2012 di Indonesia, menyebabkan kerugian ekonomis yang berarti bagi peternak itik. Virus H5N1 clade 2.3.2 ini diduga belum pernah diidentifikasi sebelumnya, sehingga pada penelitian ini akan dilakukan karakterisasi genetika dari empat virus H5N1 clade 2.3.2 dengan melakukan sekuensing DNA pada delapan gen yaitu HA, NA, NS, M, PB1, PB2, PA dan NP milik virus tersebut dan dilakukan uji patogenesitas virus pada itik di laboratorium berkeamanan tingkat tinggi Biosafety Level 3 (BSL-3) untuk mengetahui keganasan virus clade 2.3.2 dibandingkan dengan virus clade 2.1.3 yang predominan bersirkulasi di Indonesia. Hasil analisis pohon filogenetika memperlihatkan bahwa empat virus clade 2.3.2 yang diisolasi pada tahun 2012 merupakan introduksi virus dari luar negeri. Analisis selanjutnya memperlihatkan pada delapan gen berada dalam satu kelompok dengan virus kelompok clade 2.3.2 terutama yang berasal dari VietNam dan tidak berada dalam kelompok virus Indonesia. Uji patogenesitas pada itik menunjukkan bahwa virus H5N1 clade 2.3.2 dan clade 2.1.3 meimbulkan gejala klinis dan patogenesitas yang sama dan menimbulkan kematian pada 75% itik pada hari ke 3-6 setelah infeksi. Kata Kunci: Virus H5N1, Clade 2.3.2, Clade 2.1.3, Pohon Filogenetika, Patogenesitas

PENDAHULUAN Unggas air diketahui sebagai inang dari semua subtipe virus Influenza A, sehingga memberikan suatu resiko kesehatan yang sangat serius terhadap spesies hewan lain secara luas dan memungkinkan terjadinya genetic mixing. Meskipun beberapa subtipe virus Influenza A yang terdapat dalam tubuh inang alami bersifat tidak patogen atau tidak virulen tetapi keberadaannya menyebabkan inang alami tersebut menjadi reservoir AI (Webby et al. 2007; Hewajuli dan

Dharmayanti 2012). Selain itu, unggas air liar yang juga merupakan reservoir alami virus influenza tipe A dan berperan penting terhadap ekologi dan propagasi virus. Dari reservoir ini, virus influenza tipe A biasanya dapat ditularkan ke unggas lain, mamalia termasuk manusia dan dapat menyebabkan wabah penyakit yang sangat parah atau mematikan. Reservoir alami dan inang virus influenza A yang paling heterogen adalah unggas air terutama Anseriformes (itik, entok dan angsa) dan Charadriiformes (burung camar (laut), burung laut, burung liar) yang keberadaannya tersebar

99

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113

di dunia (Webster et al. 1992; Hewajuli dan Dharmayanti. 2012). Di Indonesia, pada bulan September-Nopember 2012 dilaporkan terjadinya kematian tinggi pada itik di daerah Jawa Tengah, Jawa Timur dan DI Yogyakarta dan penyebab wabah diidentifikasi sebagai virus AI subtipe H5N1 clade 2.3.2 (Wibawa et al. 2012). Virus ini sebelumnya belum pernah dilaporkan bersirkulasi di Indonesia, karena pre dominan virus H5N1 di Indonesia adalah virus H5N1 clade 2.1 yang terbagi menjadi clade 2.1.1; 2.1.2; 2.1.3 (WHO/OIE/FAO 2008). Belum banyak diketahui apakah virus ini berasal dari mutasi virus sebelumnya ataukah merupakan introduksi virus dari luar Indonesia. Di Indonesia bersirkulasinya virus AI H5N1 clade 2.3.2 masih menciptakan tanda tanya besar karena belum banyak diketahui karakter genetik dan fenotipik virus ini. Virus clade 2.3.2 telah dilaporkan bersirkulasi di beberapa negara seperti Vietnam, Bulgaria, China, India, Hongkong, Jepang, Korea, Laos, Nepal, Bangladesh, Nepal, Mongolia (Marinova-Petkova et al. 2012; Nagarajan et al. 2012; WHO 2012). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter genetik pada genom virus yaitu pada delapan gen virus dan biologi virus clade 2.3.2 yang bersirkulasi di Indonesia dibandingkan dengan clade 2.1.3. Dengan diketahuinya karakter virus tersebut, diharapkan dapat memberikan informasi karakter virus AI clade 2.3.2 Indonesia guna mengetahui kemungkinan terjadinya reassortant virus AI clade 2.3.2 dengan virus clade 2.1 atau virus influenza lainnya yang belum diketahui tingkat patogenisitasnya pada unggas ataupun manusia. Informasi ini diharapkan dapat untuk memprediksi dalam persiapan menghadapi pandemi flu burung yang kemungkinan dapat terjadi serta up date vaksin sesuai dengan virus yang bersirkulasi di lapang. MATERI DAN METODE Virus Empat virus yang digunakan pada penelitian ini yaitu virus yang diperoleh dari monitoring sirkulasi virus AI/H5N1 pada bulan November 2012 di pasar tradisional di Kabupaten Lamongan yaitu A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012 yang diisolasi dari mesin bubut ayam yang telah diperoleh pada penelitian sebelumnya (Dharmayanti dan Hartawan, 2012 data tidak diterbitkan) dan tiga virus AI H5N1 yang dikirim oleh Direktur Kesehatan Hewan – Direktorat Jendral Peternakan ke Bbalitvet pada bulan November 2012 untuk diidentifikasi lebih lanjut. Tiga virus tersebut adalah A/duck/Sukoharjo/BBVW-14289/2012, A/duck/Bantul/BBVW-1443-9/2012, dan A/duck/Sleman/BBVW-1463-10/2012.

100

Propagasi virus AI telur pada telur embrio bertunas spesific pathogen free Virus AI yang terdapat dalam cairan alantois diekstraksi RNAnya dengan menggunakan QIAmp RNA mini Kit (Qiagen). Hasil ekstraksi berupa RNA dijadikan templat untuk reaksi RT-PCR. Hasil RT-PCR yang positif teridentifikasi virus AI/H5N1 akan dilanjutkan dengan menanam spesimen tersebut pada telur embrio bertunas specific pathogen free umur 9-11 hari. Hasil positif adanya pertumbuhan virus pada telur SPF sel MDCK akan dilakukan identifikasi ulang dengan RT-PCR menggunakan primer spesifik H5 dan N1 (Lee et al. 2001; Wright et al. 1995). Jika hasil identifikasi ulang menunjukkan positif virus AI/H5N1 maka akan dilakukan sekuensing DNA untuk mengetahui karakter molekuler dari virus-virus tersebut. Sekuensing DNA dan analisisnya Isolat AI/H5N1 dari koleksi lapang ataupun isolat kiriman dari Direktur Kesehatan Hewan dilakukan sekuensing DNA. Sekuensing DNA akan dilakukan pada delapan gen virus AI/H5N1. Empat gen akan dilakukan sekensing lengkap sedangkan empat gen lainnya akan dilakukan sekuensing partial sesuai dengan target mutasi. Sekuensing dan strategi sekuensing DNA untuk gen HA, NS dan M dilakukan sesuai dengan Dharmayanti (2009); Hoffmann et al. (2001) dan Senne et al. (1996), untuk gen NA sesuai dengan Komadina (2008, komunikasi pribadi). Primer sekeunsing untuk gen PB1, PB2, NP dan PA didisain oleh Dharmayanti (2012, data tidak dipublikasi). Sekuensing DNA dilakukan dengan mesin Genetyx Analyzer 3130 (Applied Biosystems, USA). Hasil sekuensing akan diverifikasi dan dianalisis dengan software BioEdit, version 7 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit). Pohon filogenetika dikontruksi dengan neighbor-joining bootstrap analysis (1000 replicates) menggunakan the Kimura two-parameter model dalam MEGA, versi 4 (http://www.megasoftware.net). Uji patogenisitas pada Itik Itik sebelumya diperiksa terhadap adanya antibodi dan keberadaan virus AI/H5N1 sebelum digunakan. Jika diketahui secara antibodi dan PCR negatif maka hewan (ayam/itik) akan diadaptasi selama 3 hari di isolator lab BSL-3. Perlakuan itik dibagi menjadi empat kelompok yaitu (A) diinfeksi virus A/H5N1 clade 2.3.2., (b) clade 2.3.2. dan (c) clade 2.1.3 serta satu kelompok sebagai kelompok kontrol (Naive group).


Semua persiapan inokulasi virus di laboratorium BSL3. Setiap kelompok terdiri dari 4 ekor itik (3 ekor diinfeksi virus, 1 ekor sebagai infeksi kontak untuk mengetahui apakah virus dapat ditularkan ke itik lainnya) yang dipelihara di isolator BSL-3. Infeksi virus AI/H5N1 pada ayam disesuaikan dengan dosis 106EID50 intra nasal. Setiap hari dilakukan pengamatan terhadap gejala klinis dan dilakukan pengambilan trakea dan kloaka serta jika ada hewan yang mati akan dilakukan pengambilan organ (trakea, paru-paru, otak, dan usus) untuk direisolasi virus yan berada di organ itik yang diinfeksi virus H5N1. Pengambilan darah dilakukan pada 5 hari sebelum infeksi, dan hari ke- 2, 4, 6, 9, 11, 13, 14 setelah infeksi. Perlakuan hewan coba: Itik diberi pakan dan minum ad libitum, diberikan istirahat cukup, suhu nyaman untuk mencegah stress dan pada akhir percobaan jika ada yang belum mati, dibunuh sesuai kaidah/etika pada unggas. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium moduler Biosafety Level -3 (BSL 3) milik Balai Besar Penelitian Veteriner, Badan Pengembangan dan Pertanian, kementerian Pertanian pada awal bulan sampai dengan akhir bulan Desember 2012.

Substitusi sebuah asam amino pada protein hemaglutinin dapat mengubah spesifisitas pengikatan sialyl-linkage Neu5Ac2-3Gal (Ac2-3) menjadi Neu5Ac2-3Gal (Ac2-6) atau sebaliknya. Substitusi Ser205Tyr yang terletak pada antigenik D dari hemaglutinin virus H3 (jaraknya jauh dari reseptor binding site), menghasilkan perubahan spesifisitas pengikatan reseptor dari 2-3 ke 2-6. Perubahan Leu226Gln pada pocket receptor binding site juga mengubah spesifisitas pengikatan reseptor 2-6 ke 2-3. Perubahan ini sangat penting karena berpengaruh pada kemampuan infeksi virus pada inangnya. Virus clade 2.3.2 Indonesia mempunyai kesamaan nukleotida 97-98% dengan virus clade 2.3.2 VietNam dan 91-94% dengan virus Indonesia clade 2.1. Analisis phylogenetic gen HA (Gambar 1) memperlihatkan bahwa empat virus tidak berada dalam kelompok virus clade 2.1 namun dalam kelompok virus calde 2.3.2 yang mempunyai kedekatan genetik yang tinggi dengan virus clade 2.3.2 asal Viet Nam. Virus A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012 memperlihatkan satu kelompok dengan virus clade 2.3.2 lainnya termasuk yang berasal dari Indonesia. Jumlah tempat glikosilasi pada protein HA sebanyak 8 (data tidak ditunjukkan). Neuraminidase

HASIL PENELITIAN Identifikasi dengan RT-PCR subtipe H5N1 Hasil identifikasi dengan RT-PCR menggunakan primer H5 dan N1 memperlihatkan bahwa ke empat virus adalah virus H5N1. Selanjutnya dilakukan sekuensing DNA pada delapan gen yaitu HA, NA, NS1, M, PA, NP, PB1 dan PB2 empat virus yaitu A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012, A/duck/ Sukoharjo/BBVW-1428-9/2012, A/duck/Bantul/ BBVW-1443-9/2012), dan A/duck/Sleman/BBVW1463-10/2012. Karakter molekuler virus clade 2.3.2 Protein hemagglutinin (HA) Empat virus yang digunakan dalam penelitian ini pada analisis multiple sequence alignment asam amino protein hemagglutinin menunjukkan rangkaian multiple basic amino acid pada cleavage site gen HA yang sesuai dengan gambaran virus HPAI (Tabel 1). Selain itu, empat virus yang dianalisis pada penelitian ini masih mengenal avian receptor (α2,3) karena mempunyai residu asam amino glutamat pada posisi 222 (pada H3 pada posisi 226) dan glisin pada posisi 224 (posisi 228 pada virus H3) (Stevens et al. 2006).

Seperti halnya virus H5N1 asal Indonesia lainnya, empat virus yang digunakan dalam penelitian mempunyai 20-residue deletion pada stalk region (residu 48-68) (Tabel 1). Tempat glikosilasi pada regio stalk dari protein neuraminidase berperan dalam menjaga struktur tetramer dari protein (Luo et al. 1993). Semua virus pada penelitian ini tidak mempunyai tempat glikosilasi pada stalk protein neuraminidase karena delesi di daerah ini. Delesi pada daerah ini akan meningkatkan retensi virion pada membran plasma (Matrosovich et al. 1999). Non struktural protein Empat virus ini mempunyai 230 asam amino pada protein NS1 dan terdapat delesi pada posisi 80-84 (Tabel 1). PDZ binding motif mempunyai sekuen ESEV yang menunjukkan avian origin. C-terminal dari virus avian influenza protein NS1 memiliki urutan konsensus dari PDZ domain ligand (Obenauer et al. 2006). Motif yang dapat terikat ke PDZ mengandung protein yang terlibat dalam jalur sinyal selular inang. Virus influenza manusia memiliki berbagai motif seperti RSKV atau RSEV. Motif PDZ pada NS1 merupakan faktor virulensi baru dari virus influenza A (Jackson et al. 2008). Pada penelitian ini, empat dari enam virus yang digunakan mempunyai motif ESEV yang menunjukkan bahwa virus berasal dari spesies unggas.

101

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113

10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|..

A/Ck/East Java/Bl-Ipa/2003 A/Indonesia/5/2005 A/Indonesia/CDC597/2006 A/duck/Zhejiang/2248/2011 A/grey heron/Hong Kong/1046/20 A/duck/Vietnam/LBM140/2012 A/duck/Vietnam/LBM139/2012 A/duck/Vietnam/LBM136/2012 A/Indonesia/CDC610/2006 A/Indonesia/CDC1031/2007 A/Indonesia/CDC1047/2007 A/duck/Vietnam/OIE-2202/2012 A/chicken/Vietnam/OIE-2215/201 A/duck/Vietnam/27354/2009 A/Environment/East Java/LBMLM1 A/Duck/Sukoharjo/BBVW 14289/20 A/Duck/Bantul/BBVW 14439/2012 A/Duck/Sleman/BBVW 1463-10/201

EIIFLKICRPTRNEWECRCSDSSDPLVVAASIIGILHLILWILDRLFFKCIYRRLKYGLKRGPSTAGVPESMREEYR ................................................................KT........... ..............................N..................F........................... .................................................................E........... .................................................................E........... ............K....................................................E........... ............K....................................................E........... ............K....................................................E........... .......Y.........K.I......A......................F..............M............ .......Y.........K.I......A......................F.......D................... .......Y...........I......A...N..................F........................... ..........................I......................................E........... ..........................I......................................E........... ..........................I...N..................................E........... ..........................I.....S................................E........... ..........................I......................................E........... ..........................I.......................T..............E........... ..........................I......................................E...........

Gambar 1. Asam amino yang bertanggung jawab pada sensitivitas amantadin pada posisi 27 dan 31 (dalam kotak)

Tabel 1. Karakter genetik virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indononesia Asam amino Virus

HA

NA

NS1

222

224

20 stalk di 48-68

Env/East Java/LBM-LM13/12

Q

G

Ya

Ya

Duck/Sukoharjo/BBVW 14289/12

Q

G

Ya

Duck/Bantul/BBVW 14439/12

Q

G

Duck/Sleman/BBVW/ 146310/12

Q

G

M2

Delesi di 80-84 PDZ binding motif

PB2

27

31

274

ESEV

I

S

E

Ya

ESEV

I

S

E

nd

Ya

ESEV

I

S

E

Ya

Ya

ESEV

I

S

E

nd: tidak dikerjakan

M2 Protein Protein M2 bertanggung jawab terhadap sensitivitas amantadin. Substitusi 1 asam amino dari 5 asam amino (26, 27, 30, 31 dan 34) pada domain domain transmembran M2 menghasilkan hilangnya sensitivitas protein M2 terhadap amantadin (Hay et al.1986; Pinto et al. 1992). Virus yang digunakan pada penelitian ini menunjukkan residu pada posisi 26L, 27I, 30A dan 31S pada protein M2 sehingga kemungkinan virus baru masih sensitif terhadap amantadin. Sekuen asam amino ini serupa dengan sekuen asam amino virus H5N1 asal Viet Nam (Gambar 1 dan Tabel 1) Analisis filogenetika Untuk mengetahui kedekatan genetik virus baru dengan virus H5N1 lainnya, dilakukan analisis filogenetika pada gen HA, NA, NS1, M1, PA, PB1,

102

PB2 dan NP (Gambar 2-9). Analisis filogenetika memperlihatkan bahwa virus baru tidak berada dalam satu grup dengan virus H5N1 Indonesia dan virus baru dalam phylogenetic HA berada dalam kelompok clade 2.3.2. (Gambar 2). Hal yang sama terjadi pada pohon filogenetika gen lainnya, semua gen berada dalam satu kelompok dan berdekatan dengan virus asal VietNam, sehingga introduksi virus diduga berasal dari luar Indonesia. Gambar 2-9. Pohon filogenetika gen Hemagglutinin (HA) gene (Gambar 2), NA (Gambar 3), M1 (Gambar 4), NS1 (Gambar 5), NP (Gambar 6), PA (Gambar 7), PB1 (Gambar 8) dan PB2 (Gambar 9). Warna biru menunjukkan empat virus yang dikarakterisasi pada penelitian ini. Pohon filogenetika dikonstruksi dengan software MEGA version 4, menggunakan neighborjoining bootstrap analysis (1,000 replicates) Tamura- 2 Parameter model.


A/Chicken/West Java/PWTWIJ/2006 100

A/Ck/Jakarta/DKINurs/2007 A/Chicken/West Java/SMIPAT/2006

56

A/Muscovyduck/West Java/Bks3/2007 A/Indonesia/CDC1032/2007

99 99

A/Indonesia/CDC1047/2007

A/Muscovyduck/Jakarta/DKISum106/2006 A/Chicken/Indonesia/Bandung163149/2006

50 95

A/Ck/West Java/SmiAcul/2008

92 54

A/Muscovy Duck/Jakarta/HABWIN/2006

91

2.1.3

A/Chicken/Indonesia/Siak16312/2006 72

63

A/Muscovy Duck/Indonesia/Kedri163124/200 A/Chicken/Murao Jambi/BBPVII/2005

50 A/Indonesia/5/2005

78

A/Ck/West Java/SmiHay/2005 A/Indonesia/CDC7/2005

58

A/Chicken/Bandar Lampung/BBPVIII/2006

100

2.1

A/Chicken/Palembang/BPPVIII/2005

94 73

A/Ck/Inhu/BPPVRII/2007 81

84

A/Ck/Pessel/BPPVRII/2007

A/Muscovyduck/BgrCw/2005 A/Duck/Banten/PdglKas/2004 54

77

A/Muscovyduck/Jakarta/DKIUwit/2004 A/Indonesia/6/2005 A/Chicken/Deli Serdang/BPPV1/2005

84 89

A/Chicken/Karo/BBPVII/2006 A/Chicken/Padang/BBPVII/2006

97

2.1.2


100 100

A/Indonesia/CDC596/2006 A/Indonesia/CDC597/2006

A/Ck/West Java/1074/2003 A/chicken/Indonesia/11/2003

82

2.1.1

A/Chicken/West Java/HAMD/2006 A/chicken/Indonesia/7/2003

52

A/Ck/West Java/BLIPA/2003 68

A/Duck/Tabanan/BPPV1/2005

100

A/chicken/Yamaguchi/7/2004 A/crow/Kyoto/53/2004 A/whooper swan/Mongolia/244/2005

91

A/Egypt/3300-NAMRU3/2008 HA

100 75

2.2

2.2.1

A/Egypt/2321-NAMRU3/2007

A/Chicken/Yunnan/493/05 A/Anhui/1/2005 94

A/Muscovy duck/Vietnam/39/2007

2.3.4

A/chicken/Malaysia/5223/2007 99

A/Guangzhou/1/2006

76

A/chicken/Thailand/NP172/2006 A/duck/Guiyang/3242/2005

2.3.3

100 A/chicken/Guiyang/3055/2005 100

82

A/duck/Hunan/149/2005

2.3.1

A/duck/Hunan/127/2005 A/duck/Vietnam/568/2005 A/Duck/Sukoharjo/BBVW 14289/2012

68

A/Duck/Bantul/BBVW 14439/2012 A/Environment/East Java/LBMLM13/2012

100 100

A/duck/Vietnam/OIE-2202/2012

2.3

100 A/chicken/Vietnam/OIE-2215/2012 55 A/great blackheaded gull/Qinghai/3/2009 100

59

A/great black-headed gull/Qinghai/3/2009 A/great blackheaded gull/1/2009 A/environment/Chang Sha/1/2009

57 72

2.3.2

A/duck/Lao/463/2010 A/chicken/Nepal/253/2010

90

A/chicken/Nepal/5-1cl/2010 A/ruddy shelduck/Mongolia/X42/2009 A/bar-headed goose/Mongolia/X25/2009 A/duck/Hokkaido/WZ83/2010 99 65

A/mandarin duck/Korea/K10483/2010 A/mandarin duck/Nagasaki/4201A012/2011

A/quail/Vietnam/177/2004 99 53

A/Thailand/16/2004

1

A/Thailand/676/2005 A/Goose/Guangdong/1/96

70

A/migratory duck/Jiangxi/1657/2005

0.005

Gambar 2. Pohon filogenetika gen HA, root dengan menggunakan A/Goose/Guangdong/1/96. Isolat yang digunakan pada penelitian ini ditunjukkan dalam kotak

103

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113 A/Chicken/West Java/Bdg8/2010 A/Chicken/South Sumatera/Plbg/2010 A/Chicken/West Java/PwtD1039/2010 A/Duck/Banten/Tng11/2010

75

A/Ck/East Java/BwiI2/2010 A/Chicken/Jakarta/DKINurs/2007 98

A/Duck/Banten/Tng19/2010 A/Chicken/West Java/Cjr45/2010 A/Chicken/West Java/SmiHj18/2007

89

A/Chicken/West Java/SmiM1/2008

99 96 100

A/Chicken/West Java/SmiM6/2008

A/Muscovy duck/Jakarta/Sum106/2006 A/Chicken/West Java/SmiHay/2005 A/Chicken/Pessel/BPPVRII/2007

99 79

A/Chicken/Inhu/BPPVRII/2007 A/Mucsovy duck/West Java/Bks3/2007

74

99 89

94

A/Chicken/Banten/SrgFadh/2008 A/Chicken/West Java/SmiZae/2010 A/Chicken/West java/SmiEndl/2009

96

A/Chicken/West Java/SmiMgg/2009

67 100

A/Chicken/West Java/Smi-Amn1/2011 99

A/Chicken/West Java/Bgr-KB/2012 100

A/Chicken/West Java/Krw 54/2012

A/Chicken/West Java/1074/2003 A/Chicken/East Java/BLIPA/2003

67 59

A/Chicken/Jakarta/DKI31/2005 100

A/Thailand/16/2004 A/Thailand/676/2005

A/whooper swan/Mongolia/244/2005 A/Egypt/3300-NAMRU3/2008(NA)

100 86

A/Egypt/2321-NAMRU3/2007 A/grey heron/Hong Kong/1046/2008 A/G uangxi/1/2009 A/crested myna/Hong Kong/1178/2009

100

A/house crow/Hong Kong/7677/2008 82

100 A/duck/Vietnam/LBM133/2012 88

A/duck/Vietnam/LBM132/2012

52

A/Hubei/1/2010

53

A/chicken/Sagaing/295/2010 A/oriental magpie robin/Hong Kong/9298/2 87 77 98

A/Duck/Bantul/BBVW 14439/2012 A/Environment/East Java/LBMLM13/2012 A/duck/Vietnam/OIE-2202/2012 A/Duck/Sukoharjo/BBVW 14 289/2012

99

A/duck/Zhejiang/213/2011 A/muscovy duck/Vietnam/LBM66/2011

69

A/duck/Zhejiang/2242/2011 98

A/duck/Zhejiang/2243/2011

0.005

Gambar 3. Pohon filogenetika gen NA

104

Dharmayanti et al. Karakteristik molekuler dan patogenesitas virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia A/Ck/Banten/Srg-Fadh/2008 64

A/chicken/West Java/Bks12/2011

82

A/chicken/West Java/Bks9/2011 A/Ck/West Java/Smi-Acul/2008

73

A/bird/Bali1/2011

99

A/duck/Bali9/2011 A/Chicken/West Java/Krw54/2012

99 54

A/Chicken/Wesj Java/BgrKB/2012

98

A/Indonesia/CDC1031/2007 A/Indonesia/CDC938/2006 A/Indonesia/CDC887/2006 A/Indonesia/CDC1032/2007 A/Ck/West Java/Bks2/2007 A/Muscovyduck/West Java/Bks3/2007

61

A/Ck/Pessel/BPPVRII/2007 A/Ck/Inhu/BPPVRII/2007

97

A/Indonesia/245H/2005 A/Indonesia/292H/2006 A/Indonesia/CDC669/2006 60


63

A/Indonesia/542H/2006 A/Duck/Jakarta/DKI-Slmt306/2006 A/Muscovyduck/Jakarta/DKI-Sum106/2006 A/Ck/West Java/Smi-Hj18/2007 A/Ck/Jakarta/DKI-Nurs/2007 A/Bird cucak wilis/Jakarta/Walkot 1/2007 A/Indonesia/CDC1047/2007

59

A/Ck/Bengkulu/Bkl/2010 A/Indonesia/CDC1046/2007 A/Ck/South Sumatera/PlbgO/2010 A/Ck/West Java/Smi-Sud1/2007 A/Ck/West Java/SMI-M1/2008

53

A/Ck/West Java/SMI-M6/2008

84 95

A/Ck/West Java/SMI-Biot/2008

A/Muscovyduck/Bgr-Cw/2005 A/Ck/West Java/1074/2003 A/chicken/Yogjakarta/BBVet-IX/2004

73

A/quail/Yogjakarta/BBVet-IX/2004 A/chicken/Purworejo/BBVW/2005 A/Muscovyduck/Jakarta/DKI-Uwit/2004 A/Duck/Banten/Pdgl-Kas/2004 A/Ck/West Java/Smi-Hay/2005 A/Indonesia/CDC7/2005 A/Indonesia/160H/2005

87

A/Indonesia/CDC184/2005 A/Indonesia/7/2005 64

A/chicken/Magetan/BBVW/2005 A/chicken/Wajo/BBVM/2005 A/chicken/Gunung Kidal/BBVW/2005 A/duck/Parepare/BBVM/2005 94 85

A/Indonesia/569H/2006 A/Indonesia/CDC624/2006 A/Indonesia/CDC623/2006

56

A/Indonesia/CDC194P/2005 A/Indonesia/175H/2005 A/Indonesia/321H/2006 A/Indonesia/CDC370/2006 A/Indonesia/298H/2006 A/Indonesia/5/2005 A/Indonesia/341H/2006

64


A/turkey/Kedaton/BPPV3/2004

82

A/chicken/Pangkalpinang/BPPV3/2004 A/chicken/Kupang-3-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Indonesia/7/2003

66

A/quail/Tasikmalaya/BPPV4/2004 A/Ck/Indonesia/BL/2003 A/chicken/Kupang-2-NTT/BPPV6/2004 A/Ck/Indonesia/PA/2003 A/Ck/Indonesia/5/2004 A/Ck/Indonesia/2A/2003

65

A/Dk/Indonesia/MS/2004 A/chicken/Sragen/BPPV4/2003 A/chicken/Mangarai-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Wonosobo/BPPV4/2003 A/chicken/Pekalongan/BPPV4/2003 A/chicken/Ngawi/BPPV4/2004 A/Ck/East Java/Bl-IPA/2003 A/chicken/Indonesia/11/2003 A/Ck/Jakarta/DKI31/2005 A/chicken/Kupang-1-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Purwakarta/BBVet-IV/2004

53 97

A/chicken/Malang/BBVet-IV/2004 A/chicken/Salatiga/BBVet-I/2005 A/Indonesia/CDC596/2006 97


62

A/chicken/Deli Serdang/BPPVI/2005 A/chicken/Tarutung/BPPVI/2005

69 53

A/chicken/Simalanggang/BPPVI/2005 A/chicken/Dairi/BPPVI/2005 A/chicken/Tebing Tinggi/BPPVI/2005

A/Ck/Indonesia/4/2004 67 81

A/Thailand/1(KAN-1)/2004 A/dog/Thailand-Suphanburi/KU-08/04 A/chicken/Thailand/ICRC-213/2007

A/mallard/Vietnam/3/2003

51 72 66

A/chicken/Vietnam/4/2003 A/duck/Vietnam/317/2005 A/wild bird/Vietnam/434/2005 A/Vietnam/CL36/2004

68 54

A/quail/Vietnam/177/2004 A/goose/Vietnam/264/2004 A/chicken/Hebei/326/2005 A/Duck/Sukoharjo/BBVW1428-9/2012

90 100

A/Duck/Sleman/BBVW1463-10/2012 A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012

85 57

A/Duck/Bantul/BBVW1443-9/2012

A/chicken/Hebei/718/2001 A/chicken/Hebei/108/02 A/Goose/Guangdong/1/96 A/HongKong/483/97

0.01

Gambar 4. Pohon filogenetika gen M1

105

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113

A/chicken/West Java/Bks9/2011 99

A/chicken/West Java/Bks12/2011

93

A/Ck/Banten/SrgFadh/2008 A/bird/Bali1/2011

57

99 A/duck/Bali9/2011

A/Indonesia/CDC1031/2007 87

71 A/Indonesia/CDC523/2006

A/Indonesia/CDC887/2006 A/Indonesia/CDC634/2006 75 A/Ck/West Java/SmiHj18/2007

A/Ck/West Java/SmiSud1/2007 82

A/Ck/West Java/SMIM1/2008

95

A/Ck/West Java/SMIM6/2008

90 54

A/Ck/West Java/SMIBiot/2008

72

A/Indonesia/CDC292T/2005

50

A/Indonesia/CDC624/2006 A/Ck/West Java/SmiAcul/2008 A/Indonesia/195H/2005 89

A/Indonesia/7/2005 A/chicken/Wajo/BBVM/2005 A/Muscovyduck/BgrCw/2005 A/Ck/West Java/SmiHay/2005 A/Indonesia/175H/2005 A/Ck/West Java/1074/2003 A/Ck/Jakarta/DKI31/2005

66

A/Ck/West Java/BlIpa/2003 A/Indonesia/6/2005

94

84

A/chicken/Salatiga/BBVetI/2005 73

A/Ck/Indonesia/PA/2003 A/Duck/Banten/PdglKas/2004 A/Muscovyduck/Jakarta/DKIUwit/2004

98

A/chicken/Yogjakarta/BBVetIX/2004

68

A/chicken/Wonosobo/BPPV4/2003 A/Vietnam/UT30850/2005 61 A/grey heron/Hong Kong/1046/2008

A/Guangxi/1/2009 A/great egret/Hong Kong/807/2008 A/magpie robin/Hong Kong/1897/2008 99

A/grey heron/Hong Kong/3088/2007 A/magpie robin/Hong Kong/1097/2008 A/common buzzard/Hong Kong/9213/2007 A/muscovy duck/Vietnam/LBM66/2011

64 82

80

A/duck/Zhejiang/2248/2011 A/duck/Zhejiang/213/2011 90

96

A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012 A/Duck/Bantul/BBVW1443-9/2012

90 55

A/Duck/Sukoharjo/BBVW1428-9/2012 A/Duck/Sleman/BBVW1463-10/2012

0.005

Gambar 5. Pohon Filogenetika NS1

106


A/swine/North Sumatra/UT6034/2007 A/swine/Banten/UT6008/2007 A/swine/East Java/UT6012/2007 A/Indonesia/6/2005 A/quail/Yogjakarta/BBVet-IX/2004 A/Dk/Indonesia/MS/2004

51

A/chicken/Kulon Progo/BBVet-XII-2/2004 A/chicken/Jembrana/BPPV6/2004 A/chicken/Ngawi/BPPV4/2004 A/chicken/Bangli Bali/BBPV6-1/2004 A/quail/Boyolali/BPPV4/2004 A/Ck/Indonesia/5/2004 A/chicken/Mangarai-NTT/BPPV6/2004 A/quail/Tasikmalaya/BPPV4/2004 A/Ck/Indonesia/PA/2003 A/chicken/Kupang-3-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Bangli Bali/BPPV6-2/2004 A/chicken/Purworejo/BBVW/2005 A/Ck/Indonesia/BL/2003 A/chicken/Sragen/BPPV4/2003 A/chicken/Kupang-2-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Indonesia/3/2007 A/chicken/Kupang-1-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Kulon Progo/BBVW/2005 A/chicken/Pangkalpinang/BPPV3/2004 A/turkey/Kedaton/BPPV3/2004 A/Indonesia/CDC599N/2006 A/chicken/Tebing Tinggi/BPPVI/2005

52

59 A/chicken/Deli Serdang/BPPVI/2005

A/chicken/Pekalongan/BPPV4/2003 A/Indonesia/CDC1031/2007 A/Indonesia/CDC644/2006 A/Indonesia/CDC669/2006 88


51 85 86

A/Indonesia/286H/2006 A/Indonesia/CDC1047/2007

A/Indonesia/298H/2006 98 A/Indonesia/UT3006/2005 79 55

A/Indonesia/7/2005 A/Indonesia/5/2005 62 A/duck/Parepare/BBVM/2005

60

A/chicken/Wajo/BBVM/2005 64 A/chicken/East Java/UT6023/2006

A/chicken/East Java/UT6017/2006 A/swine/North Sumatra/UT6004/2006 A/chicken/Gunung Kidal/BBVW/2005 88 A/chicken/Magetan/BBVW/2005

A/chicken/Purwakarta/BBVet-IV/2004 64 A/chicken/Malang/BBVet-IV/2004

A/chicken/Egypt/Q1185/2010

71

A/chicken/Menofia/CAI36/2010

94

A/chicken/Giza/CAI24/2008 75

63 A/chicken/Qalubia/CAI19/2008

A/chicken/India/100071/2008 A/chicken/India/241272/2010

99

A/great black-headed gull/Qinghai/2/2007 A/Vietnam/CL2009/2005 A/chicken/Vietnam/159/2004 89

A/chicken/Vietnam/260/2004 A/Vietnam/CL119/2005 A/Vietnam/CL105/2005 A/duck/Vietnam/557/2005 A/quail/Vietnam/282/2005 A/chicken/Cambodia/083LC/2011 A/Cambodia/V0813302/2011

99

A/Cambodia/W0112303/2012 A/chicken/Shan/2626/2007 A/environment/Lao/964/2010 99 A/duck/Lao/962/2010

A/goose/Jiangsu/k0403/2010 A/common buzzard/Bulgaria/38WB/2010 99

A/chicken/Shimane/1/2010 86

69 A/hooded crane/Kagoshima/2/2010 96

A/chicken/Kagoshima/I-2/2011 A/whooper swan/Korea/Q28/2011

51

A/mandarin duck/Korea/Q525/2010 A/chicken/Chiba/2/2011 A/mandarin duck/Korea/Q2/2011 A/Duck/Bantul/BBVW 14439/2012 A/Environment/East Java/LBMLM13/2012

99 64 51 61

A/duck/Zhejiang/213/2011 A/Duck/Sukoharjo/BBVW 14289/2012 A/Duck/Sleman/BBVW 1463-10/2012

0.005

Gambar 6. Pohon Filogenetika gen NP

107

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113

72 A/ferret/Indonesia/5-F7/2005 87

A/Indonesia/5/2005 A/Indonesia/UT3006/2005

A/duck/Parepare/BBVM/2005 53

64 A/chicken/Wajo/BBVM/2005

A/chicken/Gunung Kidal/BBVW/2005 95 A/chicken/Magetan/BBVW/2005 63 A/quail/Yogjakarta/BBVet-IX/2004

A/chicken/Yogjakarta/BBVet-IX/2004 A/chicken/Salatiga/BBVet-I/2005 A/swine/Banten/UT3062/2005 99 A/swine/Banten/UT2071/2005

A/swine/East Java/UT6005/2006 A/swine/East Java/UT6003/2006 99

A/swine/South Kalimantan/UT6015/2006 A/swine/North Sumatra/UT6034/2007

62

A/chicken/Tarutung/BPPVI/2005 77 A/chicken/Simalanggang/BPPVI/2005

A/chicken/Dairi/BPPVI/2005 100

A/chicken/Purwakarta/BBVet-IV/2004 A/chicken/Kupang-3-NTT/BPPV6/2004 62 A/chicken/Bangli Bali/BPPV6-2/2004

A/chicken/Kulon Progo/BBVet-XII-1/2004 A/chicken/Korea/ISQ250/2008 79

A/chicken/Hunan/3/2007 A/chicken/Korea/Gimje/2008 95 A/duck/Zhejiang/213/2011

A/duck/Zhejiang/2248/2011 A/muscovy duck/Vietnam/LBM14/2011 A/grey heron/Hong Kong/1046/2008 A/Guangxi/1/2009 A/chicken/India/CL03485/2011 83 54

A/duck/India/02AF1/2011 A/chicken/India/CA0303/2011

83

A/chicken/Sagaing/295/2010 A/muscovy duck/Vietnam/LBM57/2011 A/duck/Vietnam/LBM139/2012 75 A/duck/Vietnam/LBM133/2012

A/duck/Vietnam/LBM140/2012 A/duck/Vietnam/LBM132/2012 61

A/Duck/Sleman/BBVW1463-10/2012 A/Duck/Sukoharjo/BBVW1428-9/2012

92

A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012 69


0.01

Gambar 7. Pohon filogenetika gen PA

108


98 A/chicken/Egypt/Q1011/2010 65

giA/chicken/Egypt/Q1185/2010

67 A/chicken/Sharkia/CAI38/2009 93

A/chicken/Menofia/CAI39/2010

95

A/chicken/Egypt/1/2008 A/chicken/India/81766/2008

A/duck/Parepare/BBVM/2005 A/swine/East Java/UT6010/2007 54

A/swine/North Sumatra/UT6004/2006 99

A/swine/East Java/UT6005/2006( 67

A/swine/Banten/UT6001/2006 A/Vietnam/CL119/2005 A/chicken/Vietnam/147/2004 87 A/wild bird/Vietnam/434/2005

A/chicken/Vietnam/398/2005 50

A/Vietnam/CL115/2005 A/Vietnam/CL2009/2005 A/Vietnam/CL17/2004 A/Vietnam/CL26/2004 A/chicken/Vietnam/52/2004 A/chicken/Purworejo/BBVW/2005 A/swine/East Java/UT6003/2006 A/swine/East Java/UT6012/2007 99 A/swine/North Sumatra/UT6034/2007a

A/swine/Banten/UT6008/2007 A/swine/Banten/UT3081/2005 94 A/swine/Banten/UT3063/2005

A/swine/Banten/UT2071/2005 A/swine/Banten/UT3062/2005 A/chicken/Malang/BBVet-IV/2004 A/chicken/Sragen/BPPV4/2003 A/chicken/Pangkalpinang/BPPV3/2004 A/quail/Tasikmalaya/BPPV4/2004 A/chicken/Dairi/BPPVI/2005 A/chicken/Ngawi/BPPV4/2004 A/chicken/Bangli Bali/BPPV6-2/2004 A/chicken/Kupang-2-NTT/BPPV6/2004 85

A/chicken/Mangarai-NTT/BPPV6/2004 A/chicken/Deli Serdang/BPPVI/2005 A/chicken/Tebing Tinggi/BPPVI/2005 A/chicken/Tarutung/BPPVI/2005 A/duck/Lao/975/2010 99

A/duck/Lao/968/2010 A/duck/Lao/961/2010 A/chicken/Miyazaki/M6/2011

61 61

A/chicken/Shimane/1/2010 A/whooper swan/Hamanaka/2011

90

A/hooded crane/Kagoshima/1/2010 68

67 A/hooded crane/Kagoshima/4612J001/2010 50 91 A/chicken/Yangon/254/2010

A/chicken/Yangon/182/2010 A/guinea fowl/Yangon/834/2007 A/muscovy duck/Vietnam/LBM14/2011 79

A/chicken/India/CL03485/2011 85 83 68

A/Duck/Sukoharjo/BBVW 14289/2012 A/Duck/Sleman/BBVW 1463-10/2012

95 69

A/Duck/Bantul/BBVW 14439/2012 A/Environment/East Java/LBM-LM13/2012

A/chicken/Kupang-1-NTT/BPPV6/2004 A/duck/Guangxi/GXd-5/2010 A/Hamburg/NY1580/2009

0.01

Gambar 8. Pohon filogenetika gen PB1

109

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113

67 A/chicken/Kupang-1-NTT/BPPV6/2004

A/chicken/Kulon Progo/BBVW/2005 A/Dk/Indonesia/MS/2004 A/Ck/Indonesia/5/2004 A/Ck/Indonesia/2A/2003

56

A/chicken/Bangli Bali/BPPV6-2/2004 A/Ck/Indonesia/BL/2003 A/chicken/Kulon Progo/BBVet-XII-1/2004 A/chicken/Indonesia/8/2003 A/chicken/Indonesia/7/2003 A/chicken/Indonesia/3/2007

85

A/chicken/Indonesia/9/2003 A/Ck/Indonesia/PA/2003 A/chicken/Salatiga/BBVet-I/2005 A/Indonesia/538H/2006 A/chicken/Deli Serdang/BPPVI/2005 95

A/chicken/Tebing Tinggi/BPPVI/2005 83

A/chicken/Simalanggang/BPPVI/2005 A/swine/East Java/UT6012/2007 98

A/Indonesia/6/2005

96

A/Indonesia/160H/2005 99 A/Indonesia/CDC1046/2007

A/Indonesia/CDC1047/2007 A/chicken/South Kalimantan/UT6029/2006

66

A/Indonesia/CDC699/2006 A/Indonesia/CDC624/2006 A/Indonesia/283H/2006 A/Indonesia/CDC329/2006 A/Indonesia/CDC887/2006 68

A/Indonesia/CDC1032/2007 A/Indonesia/CDC1031/2007 A/Indonesia/CDC390/2006 A/Indonesia/CDC370/2006 A/Indonesia/CDC759/2006

A/Indonesia/CDC835/2006 A/Indonesia/CDC739/2006 A/Indonesia/CDC836/2006

55

A/Indonesia/CDC940/2006 68 58

A/Thailand/NBL1/2006 A/Thailand/16/2004

A/chicken/Thailand/ICRC-7356/2010 A/Thailand/676/2005

99

A/chicken/Thailand/NS-339/2008

99

99 A/chicken/Thailand/PC-340/2008

A/Guizhou/1/2009

90

A/Hunan/1/2009 A/Guangdong/2/2006

99

A/Xinjiang/1/2009 A/Guangxi/1/2009

53

A/Hubei/1/2010

88


100

A/Environment/East Java/LM13/2012

99

A/Duck/Sukoharjo/BBVW1428-9/2012 78

A/Duck/Sleman/BBVW1463-10/2012

0.005

Gambar 9. Pohon filogenetika gen PB2

Uji patogenesitas virus AI subtipe H5N1 pada itik Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan keganasan/pathogenisitas virus clade 2.3.2 dan 2.1.3 pada itik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelompok itik yang diinfeksi oleh virus A/Duck/Sukoharjo/BBVW1428-9/2012 dan A/ Environment/LBM-LM13/2012, (clade 2.3.2) dan virus A/Chicken/West Java/Krw54/2012 (clade 2.1.3) menunjukkan gejala klinis yang sama yaitu lesu, lemah, muka bengkak (Gambar 10), perdarahan subkutan dan gejala tortikolis tidak terjadi pada semua itik. Virus

110

membunuh 50-75% itik. Kematian rata-rata terjadi pada hari ke-3 sampai ke-6 (Gambar 11 dan 12). Shedding virus tidak terjadi pada semua itik (Tabel 2), dari berbagai organ berhasil dideteksi adanya virus H5N1 ketika ditumbuhkan di telur embrio bertunas dan di RTPCR ulang (data tidak ditunjukkan). Titer antibodi terbentuk pada itik yang hidup sampai akhir penelitian yaitu berkisar antara 4-6 log 2 (Data tidak ditunjukkan). Sampai hari keempat belas sebagian itik masih tetap hidup baik yang diinfeksi oleh virus clade 2.3.2 dan virus clade 2.1.3 meskipun masih tampak sakit (Gambar 13). Sehingga patogenisitas virus clade 2.3.2 dan

Dharmayanti et al. Karakteristik molekuler dan patogenesitas virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia Tabel 2. Shedding virus kelompok itik yang diinfeksi virus H5N1 Shedding virus di kloaka (itik shedding/jumlah itik) Kelompok itik diinfeksi virus

h1

h2

h3

h4

h5

h6

h7

h8

h9

h 10

h 11

h 12

h13

h 17

Sukoharjo/BBVW-1428-9/1

0/4

0/4

0/4

0/4

2/3

2/3

0/3

0/1

0/1

0/1

0/1

0/1

0/1

0/1

LBM-LM13/12

0/4

2/2

2/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

Krw54/12

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

2/4

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

Kontrol

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

h1-h14: hari setelah infeksi

virus clade 2.1.3 dalam penelitian ini tidak menunjukkan perbedaan. Kedua virus bersifat patogen dan dapat menimbulkan kematian pada itik. Sehingga gejala klinis berupa tortikolis, lemah, lesu, muka bengkak dan terkadang tortikolis pada itik kemungkinan tidak selalu disebabkan oleh virus clade 2.3.2 karena clade 2.1.3 juga dapat menyebabkan hal yang sama. Meskipun virus clade 2.3.2 sekarang sedang aktif

Gambar 12. Itik yang diinfeksi virus clade 2.1.3 mengalami tortikolis mati pada hari keenam setelah infeksi

Gambar 10. Gejala muka bengkak terjadi pada itik 2 hari setelah infeksi

Gambar 13. Itik yang hidup pada hari ke-14 setelah infeksi

Gambar 11. Itik yang diinfeksi virus clade 2.3.2 mengalami tortikolis dan mati pada hari kelima setelah infeks

bersirkulasi di Indonesia, kewaspadaan terhadap virus clade 2.1.3 harus tetap ditingkatkan karena virus ini terbukti telah banyak menimbulkan kematian pada unggas dan manusia, sehingga dengan diidentifikasinya dua clade virus H5N1 di Indonesia memputuhkan perhatian yang serius karena virus ini bersifat patogen dan zoonosis.

111

JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113

PEMBAHASAN Sejak diidentifikasi di Indonesia pada akhir tahun 2012, virus H5N1 clade 2.3.2 banyak menimbulkan pertanyaan, bagaimanakan patogenisitasnya terhadap itik yang umumnya tahan dengan virus H5N1 dapat mati dan bagaimana cara penanggulangannya serta apakah vaksin yang beredar saat ini dapat digunakan untuk memvaksinasi itik. Pada penelitian ini telah dilakukan karakterisasi genetik virus clade 2.3.2 secara lengkap pada delapan gen dari virus AI. Delapan gen yang dianalisis memperlihatkan bahwa virus clade 2.3.2 merupakan introduksi dari luar Indonesia, sedangkan analisis protein memperlihatkan virus ini masih sensitif terhadap amantadin, berbeda dengan virus clade 2.1.3 yang telah lebih dari 60% resisten terhadap amantadin (Dharmayanti et al. 2010). Namun demikian pada penelitian Lee et al. (2008) clade 2.3.2 di Vietnam menunjukkan penurunan sensitivitas terhadap oseltamivir, meskipun tidak resisten terhadap amantadin. Jumlah tempat glikosilasi pada protein HA dan NA tidak mengalami kenaikan atapun penurunan, sama seperti sebagian besar profil virus H5N1 clade 2.1.3 asal Indonesia. PDZ binding motif pada protein NS1 memperlihatkan virus adalah avian origin karena mempunyai motif ESEV. Selain itu, pada protein NS1 juga mempunyai delesi di 80-84. Dari analisis tersebut, karakter virus clade 2.3.2 masih menunjukkan virus genotipe Z sama dengan virus clade 2.1 sebelumnya. Pada penelitian ini juga memperlihatkan patogensitas virus clade 2.3.2 dan clade 2.1.3 adalah sama karena dapat menyebabkan kematian itik pada 3-6 hari post infeksi, gejala klinis dan shedding virus juga tidak terdapat perbedaan antara virus AI clade 2.3.2 dengan clade 2.1.3. Namun yang menarik adalah itik yang hidup tidak ditemukan shedding virus dan ketika shedding tidak terdeteksi, titer antibodi mulai muncul, sehingga data ini kemungkinan dapat digunakan sebagai salah satu dasar program vaksinasi pada itik. Unggas air termasuk itik dilaporkan sebagian besar menunjukkan resistensi terhadap virus AI sehingga unggas air hanya sebagai reservoir AI tanpa menunjukkan gejala klinis penyakit AI yang jelas atau parah apabila terinfeksi AI. Pada wabah itik yang terjadi di Indonesia pada akhir tahun 2012 dan hasil uji patogenesitas pada penelitian ini memperlihatkan bahwa itik menunjukkan gejala klinis yang jelas dan menimbulkan kematian. Hal ini juga pernah dilaporkan oleh Capua et al (2001) bahwa virus HPAI dapat menimbulkan penyakit yang parah dengan gangguan syaraf sampai dengan kematian pada unggas air. Selain itu, penelitian yang dilakukan oleh Saito et al (2009) juga menunjukkan bahwa virus-virus H5N1 yang diisolasi dari kasus outbreak di Thailand tidak hanya mampu menyebabkan kematian pada ayam dan burung puyuh tetapi juga pada Anseriformes (itik) dengan

112

gejala klinis perdarahan pada paruh, depresi dan tortikolis sebelum kematian terjadi. KESIMPULAN Analisis filogenetika pada delapan gen genom virus memperlihatkan bahwa virus AI subtipe H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia pada bukan berasal dari kelompok virus Indonesia sehingga merupakan introduksi virus dari luar Indonesia. Virus H5N1 clade 2.3.2 mempunyai patogenesitas yang sama dengan virus H5N1 clade 2.1.3 karena mempunyai gejala klinis dan dapat membunuh itik dalam 3-6 hari setelah infeksi. Shedding virus pada itik yang diinfeksi virus clade 2.3.2 dan clade 2.1.3 ditemukan disemua organ namun shedding virus di kloaka hanya terdeteksi pada hari ke 6-7 setelah infeksi. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih kepada Kepala Badan Litbang Pertanian, Kementerian Pertanian atas dukungannya pada penelitian ini. Terima kasih kepada Drh Rahendra, Dinas Peternakan Kabupaten Lamongan atas bantuannya dilapangan dan kepada Bapak Nana Suryana, Teguh Suyatno dan Ace Endang atas bantuan teknisnya. Penelitian ini didanai oleh Badan Litbang Pertanian, Kementerian Pertanian. DAFTAR PUSTAKA Capua I, Mutinelli F. 2001. Mortality in Muscovy ducks (Cairina moschata) and domestic geese (Anser anservar domestica) associated with natural infection with a highly pathogenic avian influenza virus of H7N1 subtype. Avian Pathol. 30:179-183. Dharmayanti NLPI. 2009. Perubahan genom dan karakter virus avian influenza subtipe H5N1 pada unggas di Indonesia (disertasi S3). [Jakarta (Indones)]: Universitas Indonesia. Dharmayanti NLPI, Ibrahim F, Soebandrio A. 2010. Amantadine resistant of Indonesian influenza H5N1 subtype virus during 2003-2008. Microbiol Indones. 5:11-16. Hay AJ, Zambon MC, Wolstenholme AJ, Skehel JJ, Smith MH.1986. Molecular basis of resistance of influenza A viruses to amantadine. J Antimicrob Chemother; (8 (suppl B): 19-29. Hewajuli DA, Dharmayanti NLPI. 2012. Hubungan AI dan unggas air dalam menciptakan keragaman genetik serta peran unggas air sebagai reservoir pada penyebaran virus AI. Wartazoa. 22:12-23. Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster, RG, Perez DR. 2001. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch Virol. 146:2275-2289.

Dharmayanti et al. Karakteristik molekuler dan patogenesitas virus H5N1 clade 2.3.2 asal Indonesia Jackson D, Hossain MJ, Hickman D, Perez DR, Lamb RA. 2008. A new influenza virus virulence determinant: the NS1 protein four C-terminal residues modulate pathogenicity. Proc Natl Acad Sci. 105:4381-4386. Le MTQ, Wertheim HFL, Nguyen HD, Taylor W, Hoang PVM, Vuong CD, Nguyen HL, Nguyen K, Nguyen HH, Nguyen TQ, TV, Van TD, Ngoc BT, Bui TN, Nguyen, BG, Nguyen LT, Luong S.T., Phan PH, Pham HV, Nguyen, T, Fox A, Nguyen CV, Do HQ, Crusat M, Farrar J, Nguyen HT, de Jong MD, Horb P. 2008. Influenza A H5N1 Clade 2.3.4 virus with a different antiviral susceptibility profile replaced Clade 1 Virus in Humans in Northern Vietnam PLoS ONE. Vol. 3. Issue 10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Influenza+ A+H5N1+Clade+2.3.4+virus+with+a+different+antivir al+susceptibility+profile+replaced+Clade+1+. Lee MS, Chang PC, Shien JH, Cheng MC, Shieh HP. 2001. Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR. J Virol Methods. 97:1322. (Tidak ada dalam teks) Luo G, Chung J, Palese P. 1993. Alterations of the stalk of the influenza virus neuraminidase: Deletions and insertions. Virus Res. 29. 141-153. Nagarajan S, Tosh C, Smith DK, Peiris JSM, Murugkar HV, Sridevi R, Kumar M, Katare M, Jain R, Syed Z, Behera P, Cheung CL, Khandia R, Tripathi S, Guan Y, Dubey S.C. 2012. Avian influenza (H5N1) virus of clade 2.3.2 in domestic poultry in India. PLoS ONE. Vol. 7 Issue 2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 22363750. Marinova-Petkova A, Georgiev G, Seiler P, Darnell S, Franks J, Krauss S, Ewbby RJ, Webster RG. 2012. Spread of influenza virus A (H5N1) clade 2.3.2.1 to Bulgaria in common Buzzards. Emerg Infect Dis. 18. 10:15961602. Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, Webster R. 1999. The surface glycoprotein of H5 influenza viruses isolated from human, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties. J Virol. 73:1146-115. Obenauer JC, Denson J, Mehta PK, Su X, Mukatira S, Finkelstein DB, Xu X, Wang J, Ma J, Fan Y, Rakestraw KM, Webster RG, Hoffmann E, Krauss S, Zheng J, Zhang Z, Naeve CW. 2006. Large-scale sequence analysis of avian influenza isolates. Science. 311:15761580.

Pinto LH, Holsinger LJ, Lamb RA. 1992. Influenza virus M2 protein has ion chennel activity. Cell. 69.517-28. Saito T, Watanabe C, Takemae N, Chaisingh A, Uchida Y, Buranathai C, Suzuki H, Okamatsu M, Imada T, Parchariyanon S, Traiwanatam N, Yamaguchi S. 2009. Pathogenicity of highly pathogenic avian influenza viruses of H5N1 subtype isolated in Thailand for different poultry species. Vet Microbiol. 133:65-74. Senne DA, Panigrahy B, Kawaoka Y, Pearson JE, Suss J, Lipkind M, Kida H, Webster RG. 1996. Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses : amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential. Avian Dis. 40. 425-437. Stevens A, Blixt O, Tumpey TM, Taubenberger JK, Paulson JC, Wilson IA. 2006. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus. Science. 312:404-410. Webby RJ, Webster RG, Richt JA. 2007. Influenza viruses in animal wildlife Populations. Curr Top Microbiol Immunol. 315:67-83. Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka, Y. 1992. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol Rev. 56:152-179. Wibawa H, Prijono WB, Dharmayanti NLPI, Irianingsih SH, Miswati Y, Rohmah A, Andesyha E, Romlah, Daulay RSD, Safitria K. 2012. Investigasi wabah penyakit pada itik di Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Timur: Identifikasi sebuah clade baru virus avian influenza subtipe H5N1 di Indonesia. Bul Lab Vet. 12:2-9. Wright KE, Wilson GAR, Novosad D, Dimock C, Tan D, Weber JM. 1995. Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR. J Clinical Microbiology. 33:1180-1184. WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group. 2008. Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) [conference summary].http://www.who.int/influenza/gisrs_laborator y/h5n1_nomenclature/en. WHO 2012. Influenza at the human-animal interface. Summary and assessment as of 4 June 2012. http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/I nfluenza_Summary_IRA_HA_interface_04June12.pdf.

113

Karakteristik Molekuler dan Patogenesitas Virus H5N1 clade asal Indonesia

Recommend Documents