KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOFLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK TEMPE BERBAHAN BAKU BUNCIS (Phaseolus vulgaris) DAN KECIPIR (Psophocarpus tetragonolobus)
TESIS Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Magister Sains Program Studi Biosains
oleh SRI WAHYUNI S 900208023
PROGRAM PASCA SARJANA BIOSAINS UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010
KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOFLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK TEMPE BERBAHAN BAKU BUNCIS (Phaseolus vulgaris) DAN KECIPIR (Psophocarpus tetragonolobus)
Disusun oleh
Nama
: Sri Wahyuni
Nim
: S 900208023
Telah disetujui oleh Tim Pembimbing
Dosen Pembimbing
Nama
Tanda tangan
Tanggal
Pembimbing I
Prof. Ir. Sri Handajani, M.S.,Ph.D .......................... ........ 2010 NIP: 19470729 197612 2 001
Pembimbing II
Dr. Artini Pangastuti, M.Si NIP: 19750531 200003 2 001
.......................... ......... 2010
Mengetahui Ketua Program Studi Biosains
Dr. Sugiyarto, M.Si NIP. 19670430 199203 1.002
ii
KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOFLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK TEMPE BERBAHAN BAKU BUNCIS (Phaseolus vulgaris ) DAN KECIPIR (Psophocarpus tetragonolobus)
TESIS Oleh Sri Wahyuni S 900208023 Telah dipertahankan di depan penguji Dinyatakan telah memenuhi syarat pada tanggal, 25 Januari 2010 Jabatan
Nama
Tanda tangan
Tanggal
Ketua
Dr. Sugiyarto, M.Si NIP. 19670430 199203 1 002
.....................
.......... 2010
Sekretaris
Dr. Edwi Mahajoeno, M.Si NIP. 19601025 199702 1 001
.....................
.......... 2010
Anggota Penguji
Prof. Ir. Sri Handajani, M.S.,Ph.D NIP. 19470729 197612 2 001
..…………….
...…… 2010
Dr. Artini Pangastuti, M.Si NIP.19750531 200003 2 001
………………
……… 2010
Mengetahui Direktur Program Pascasarjana UNS
Ketua Program Studi Biosains
Prof.Drs. Suranto,M.Sc.,PhD NIP.19570820 198503 1 004
Dr. Sugiyarto, M.Si NIP.19670430 199203 1 002
iii
PERNYATAAN ORISINALITAS TESIS Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa : 1. Tesis dengan judul : “Karakterisasi senyawa bioaktif isoflavon dan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak tempe berbahan baku Buncis (Phaseolus vulgaris) dan Kecipir (Psophocarpus tetragonolobus)” ini merupakan sebagian karya penelitian dari Prof. Ir. Sri Handayani, M.S. dan Sri Retno Dwi Ariani, M.Si dan tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis dikutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah tesis ini dapat dibuktikan terdapat unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis beserta gelar MAGISTER saya dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku (UU No. 20 Tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70).
Surakarta, Januari 2010 Mahasiswa
Sri Wahyuni S 900208023
iv
KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOFLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK TEMPE BERBAHAN BAKU BUNCIS (Phaseolus vulgaris) DAN KECIPIR (Psopocarpus tetragonolobus ) Sri Wahyuni, Sri Handajani, Artini Pangastuti Program Studi Magister Biosains, PPS-UNS Surakarta ABSTRAK Biji buncis dan kecipir yang tergolong leguminoceae berpotensi sebagai sumber antioksidan alami. Penelitian ini bertujuan mengetahui kandungan isoflavon aglikon dan membandingkan aktivitas antioksidan pada buncis, kecipir, kedelai kuning dengan antioksidan alami maupun antioksidan BHT (Butyl Hidroksi Toluena). Metode untuk ekstraksi isoflavon dengan maserasi, identifikasi isoflavon dengan HPLC, uji aktivitas antioksidan dengan DPPH. Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan fermentasi dan penghitungan aktivitas antioksidan dianalisis dengan General Linear model-Univariete, untuk membandingkan tingkat aktivitas antioksidannya dianalisis dengan Compare Means-One Way Annova, menggunakan program SPSS version 15. Hasil penelitian menunjukkan bahwa biji kedelai kuning, buncis dan kecipir mentah memiliki total isoflavon masing-masing sebanyak (0,18%), (0,15%), dan (0,21%). Pada kedelai kuning mentah tidak ditemukan isoflavon factor-2, tetapi buncis dan kecipir mentah ditemukan sebanyak (0,006%) dan (0,001%). Pada hasil fermentasi buncis, kecipir, kedelai kuning ditemukan jenis isoflavon factor-2, daidzein, glisitein, genistein. Hasil uji aktivitas antioksidan, berurutan dari tinggi ke rendah adalah tempe kecipir 0-hr (85,19%), tempe kedelai 3-hr (81,43%), BHT (81,15%), α-tokoferol (76,41%), vitamin C (75,62%), tempe buncis 0-hr (52,95%) dan β-karoten (43,25%). Aktivitas antioksidan pada tempe kecipir 0-hr signifikan lebih besar dari kedelai kuning fermentasi 3-hr maupun BHT, berarti kecipir berpotensi sebagai sumber antioksidan yang prospektif untuk digunakan sebagai pengganti kedelai kuning dan BHT. Aktifitas antioksidan pada buncis signifikan lebih rendah dari antioksidan BHT, α-tokoferol, vitamin C tetapi masih lebih tinggi dari antioksidan β-karoten.
Kata kunci : Buncis, Kecipir, Fermentasi, Isoflavon, Aktivitas antioksidan
v
THE CHARACTERIZATION OF THE BIOACTIVE COMPOUNDS OF ISOFLAVONE AND THE TEST OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF EXTRACT THE OF TEMPEH MADE OF POLE BEAN (Phaseolus vulgaris) AND WINGED BEAN (Psopocarpus tetragonolobus)
Sri Wahyuni, Sri Handajani, Artini Pangastuti Program Study of Biosains, Post Graduate Program, Sebelas Maret University Surakarta
ABSTRACT Pole bean and Winged bean belong to leguminoceae which have a potential as natural antioksidan resource. The aims of the research at finding out the content of the isoflavone aglikon compounds and comparing the antioxidant activity of the pole bean, winged bean, and yellow soybean with both the natural antioxidant and BHT antioxidant. The methods used to extract the isoflavone compounds were maceration, identification of isoflavone by using HPLC, and test of antioxidant activity was done with DPPH. To know the difference between fermentation treatment and the measurement of antioksidan activity which was analized by General Linear Model-Univariete, to compare the level of antioxidant activity which was analized by Compare Means-One Way Annova using the program of SPSS version 15. The results of the research show that the whole soybean, pole bean, and winged bean seed had the total contents of the isoflavone compounds of 0.18%, 0.15%, and 0.21% respectively. The isoflavone of factor-2 was not found in the yellow soybean, but it was found in the pole bean (0.006%) and in the winged bean (0.001%). In the fermentation result of pole bean, winged bean and yellow soybean was I found kind of the isoflavone compounds of factor-2, daidzein, glisitein and genistein. The results of the antioxidant activity test show that the antioxidant activity from the highest to the lowest was owned by winged bean tempeh in the 0-day fermentation (85.19%), soybean tempeh in the 3-day fermentation (81.43%), BHT (81.15%), α-tocoferol (76.41%), vitamin C (75.62%), pole bean tempeh in the 0-day fermentation (52.95%), and ß-carotene (43.25%). Antioxidant activity in the winged bean tempeh in the 0-day fermentation was higher than and really different from the yellow soybean in the 3-day fermentation and BHT, meaning that the winged bean had the potential to be the antioxidant resource which was prospective to be used as a substitute for the soybean and BHT. The antioxidant activity of the pole bean was lower than that of BHT, α-tocoferol, and vitamin C, but was higher than that of ß-carotene. Keywords: Pole bean, winged bean, fermentation, isoflavone, antioxidant activity
vi
PERSEMBAHAN
Karya ilmiah ini kupersembahkan kepada
Keluarga besarku, Suamiku, dan anakku yang tercinta
“Harta yang paling menguntungkan ialah sabar Teman yang paling setia adalah amal Pengawal pribadi yang paling waspada adalah diam Bahasa yang paling manis adalah senyum dan ibadah yang paling indah tentunya khusyuk” (Harun Yahya)
vii
KATA PENGANTAR Segala puji bagi Allah Tuhan semesta alam, tiada daya dan upaya kecuali kekuatan dari Allah SWT. Berkat limpahan rahmat dan hidayah-Nya, penulis dapat menyelesaikan tugas akhir berupa tesis dengan judul “Karakterisasi Senyawa Bioaktif Isoflavon dan Uji Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Etanol Tempe Berbahan Baku Buncis (Phaseolus vulgaris) dan Kecipir (Psopocarpus tetragonolobus)”, merupakan bagian dari penelitian yang
dilaksanakan oleh
Prof. Dr. Ir. Sri Handajani, MS. dan Dra. Retno Dwi Ariani, M.Si. Di dalam tulisan ini, disajikan pokok-pokok bahasan yang meliputi ekstraksi isoflavon dari biji buncis dan kecipir beserta produk fermentasinya, identifikasi isoflavon aglikon (faktor-2, daidzein, glisitein, genistein) dan uji aktivitas antioksidan. Nilai penting penelitian ini adalah mengetahui kandungan isoflavon dan aktivitas antioksidan pada buncis dan kecipir dengan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, 4 hari) serta mengetahui tingkat aktivitas antioksidatifnya bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dari kedelai dan produk fermentasinya serta beberapa antioksidan alami (α-tokoferol, β-karoten, vitamin C) maupun antioksidan sintetis BHT. Dari hasil penelitian ditemukan bahwa kecipir memiliki tingkat aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dan signifikan bila dibanding dengan antioksidan sintetis BHT, sehingga kecipir dapat digunakan sebagai sumber antioksidan alami yang bagus dan aman. Pengembangan penelitian ini ke arah pembuatan senyawa antioksidan untuk pengawet alami dari bahan yang murah dan melimpah serta dapat dimanfaatkan sebagai food suplemen yang memiliki banyak khasiat pendukung kesehatan.
viii
Penulis menyadari dengan sepenuh hati adanya kekurangan dan keterbatasan, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi yang membutuhkan.
Surakarta, 30 Desember 2009 Penulis
ix
UCAPAN TERIMA KASIH Assalamu’alaikum Warahmatullahi wabarakatuh. Segala puji bagi Allah Tuhan semesta alam, tiada daya dan upaya kecuali kekuatan dari Allah SWT, atas berkah dan inayah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul “Karakterisasi Senyawa Bioaktif Isoflavon dan Uji Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Tempe Berbahan Baku Buncis (Phaseolus vulgaris) dan Kecipir (Psophocarpus tetragonolobus)”. Pada kesempatan ini, penulis tidak lupa mengucapkan terima kasih kepada : 1.
Direktur Program Pascasarjana Universitas Sebelas Maret Surakarta, Bapak Prof. Suranto, MSc.,Ph.D sebagai Pembimbing Akademik yang telah memberikan semua fasilitas dan dorongan semangat selama penulis mengikuti pendidikan di Program Pascasarjana, Prodi Biosains UNS Surakarta.
2.
Prof. Ir. Sri Handajani, M.S.,Ph.D selaku Pembimbing I yang senantiasa memberikan dorongan moril dan fasilitas serta pengarahan dan bimbingan selama menyelesaikan tesis ini.
3.
Dr. Artini Pangastuti, M.Si selaku Pembimbing II yang selalu memotivasi dan memberi arahan serta bimbingan pada saat menulis dan menyelesaikan tesis.
4.
Dra. Retno Dwi Ariani, M.Si atas semua bimbingan dan pengarahannya dalam pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis.
5.
Dr. Sugiyarto, M.Si, selaku dosen penguji yang dengan kesabarannya memberikan bimbingan dan dorongan moril sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan dan ujian tesis dengan lancar.
x
6.
Dr. Edwi Mahajoeno, M.Si atas semua masukan dan bimbingan serta arahannya selama ujian komprehensif sehingga penulisan tesis ini menjadi lebih berkualitas.
7.
Ketua Laboratorium Pusat MIPA UNS beserta jajarannya, terima kasih atas dukungan dan kerjasamanya sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dengan lancar.
8.
Ketua Laboratorium Kimia, FKIP UNS beserta jajarannya yang telah member kan fasilitas sehingga penelitian ini dapat terlaksana.
9.
Bapak Poyo, Laboran di Laboratorium Kimia organik Fakultas MIPA UGM yang telah membantu, memberi fasilitas dan mendukung pelaksanaan penelitian ini, semoga dibalas oleh Alloh SWT.
10. Saudari Wiji Hastuti, Yani, Yuli di FKIP UNS yang telah sangat membantu terlaksananya penelitian ini. 11. Saudari
Rini, Heni, Yurina yang merupakan teman seperjuangan dalam
suka dan duka, terima kasih atas kerjasama dan dukungannya selama tesis ini diawali dan diakhiri sampai dinyatakan lulus. 12. Sadara M. Rosyid beserta seluruh jajaran staf administrasi Program Pascasarjana
UNS
Surakarta
yang
dengan
tulus
telah
membantu
memperlancar sarana administrasi penulis selama belajar di Program S2 Biosains. 13. Mbah Wagiyem, perajin dan pembuat tempe yang telah membimbing dan membantu kami dalam proses pembuatan tempe sampai didapatkan tempe yang memenuhi syarat untuk penelitian. 14. Anakku Tia dan Ida yang telah membantu kelancaran penulisa tesis ini.
xi
15. Suamiku, cinta dan kasih sayang serta motivasimu telah menyemangati aku dalam menyelesaikan studi di Prodi Biosains, UNS Surakarta. 16. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, yang telah memberikan bantuan baik moril maupun materiil sehingga penulis dapat menyelesaikan studi S2. Penulis tidak dapat membalas semua kebaikan dan segala bantuan yang telah diberikan, semoga Alloh SWT mencatat amal kebaikan saudara/i dan membalas semua dengan kasih sayang-Nya yang lebih besar lagi. Wassalamu’alaikum Warahmatullahi wa barakatuh.
Surakarta,
Desember 2009
Penulis
Sri Wahyuni
xii
DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING...................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI ............................................................. iii PERNYATAAN ORISINILITAS TESIS............................................................. iv ABSTRAK ....................................................................................................... v ABSTRACT ..................................................................................................... vi HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................................... vii KATA PENGANTAR........................................................................................ viii UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................... x DAFTAR ISI…………………………………………………………………………..xiii DAFTAR TABEL……………………………………………………………………..xvi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xvii DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xix BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................ 1 A. Latar Belakang .................................................................................... 1 B. Perumusan Masalah ........................................................................... 4 C. Tujuan Penelitian ................................................................................ 5 D. Manfaat Penelitian ............................................................................... 6 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 7 A. Tinjauan Pustaka ................................................................................ 7 1. Leguminoceae .............................................................................. 7 a. Kecipir ( Psophocarpus tetragonolobus ) ................................. 8 b. Buncis ( Phaseolus vulgaris ) .................................................. 10 2. Tempe ........................................................................................... 12
xiii
a. Tempe Kedelai ........................................................................ 13 b. Tempe Non Kedelai ................................................................. 13 c. Proses Pembuatan Tempe ...................................................... 14 1. Perendaman ...................................................................... 14 2. Pencucian .......................................................................... 15 3. Pengupasan ...................................................................... 16 4. Pemasakan ....................................................................... 16 5. Penirisan dan Pendinginan ................................................ 16 6. Penambahan Inokulum ...................................................... 17 7. Pemeraman ...................................................................... 17 d. Proses Fermentasi .................................................................. 18 e. Rhizopus oligosporus .............................................................. 19 3. Isoflavon ....................................................................................... 20 3.1. Isoflavon Pada Kedelai ......................................................... 22 3.2. Isoflavon Pada Tempe Kedelai ............................................. 23 3.3. Metabolisme Isoflavon Pada Proses Pengolahan Kedelai Menjadi Tempe ..................................................................... 26 3.4. Manfaat Senyawa Isoflavon Pada Tempe Kedelai ................ 28 4. Antioksidan ................................................................................... 29 4.1. Pengertian Antioksidan ......................................................... 29 4.2. Antioksidan Sintetik .............................................................. 32 4.3. Antioksidan Alami.................................................................. 32 4.3.a. Antioksidan Pada Kedelai ............................................ 33 4.3.b. Antioksidan Pada Tempe Kedelai ................................ 34 B. Kerangka Berpikir ................................................................................ 34 C. Hipotesis ............................................................................................. 35 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................. 36 A. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................. 36 B. Alat dan Bahan ................................................................................... 36 C. Prosedur Penelitian ............................................................................. 37 1. Pembuatan Tempe Kedelai ........................................................... 37 a. Pemilihan Biji Kedelai .............................................................. 37
xiv
b. Perendaman ............................................................................ 38 c. Pengupasan ............................................................................ 38 d. Pengukusan ............................................................................ 38 e. Penambahan Inokulum ............................................................ 38 f.
Pengemasan ........................................................................... 39
g. Fermentasi .............................................................................. 39 2. Pembuatan Tempe Berbahan Baku Biji Buncis dan Kecipir .......... 39 3. Mengekstraksi Isoflavon dengan Metode Maserasi ....................... 40 4. Identifikasi Isoflavon ...................................................................... 40 5. Uji Aktivitas Antioksidan ................................................................ 41 a. Pembuatan Larutan DPPH ........................................................ 41 b. Pembuatan Larutan Sampel ...................................................... 42 c. Pengukuran Kadar Antioksidan ................................................. 42 D. Teknik Analisa Data ............................................................................ 43 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 44 A. Hasil Fermentasi Kedelai, Buncis dan Kecipir ..................................... 44 B. Hasil Ekstraksi Senyawa Isoflavon ...................................................... 46 C. Hasil Identifikasi Isoflavon dengan menggunakan Metode HPLC .................................................................................................. 50 D. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan ............................................................. 60 BAB V. PENUTUP ......................................................................................... 67 A. Kesimpulan ......................................................................................... 67 B. Saran ................................................................................................. 68 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 69
xv
DAFTAR TABEL Tabel 1. Komposisi Asam Amino Biji Kecipir ................................................... 10 Tabel 2. Struktur Daidzin, Genistin, Glisitin...................................................... 23 Tabel 3. Potensi Pemanfaatan Senyawa Isoflavonoid ..................................... 34 Tabel 4. Konsentrasi Isoflavon Pada Legume dan Produk Tempenya dengan Variasi Lama Waktu Fermentasi (g/100 g sampel)............................. 53 Tabel 5. Kandungan Isoflavon Total (g) dan Aktivitas Antioksidan (%) pada Kedelai Kuning, Buncis, Kecipir, dengan Variasi Lama Fermentasi (hr) ......................................................................... 61 Tabel 6. Perbandingan Aktivitas Antioksidan Alami,Sintesis dan Legume (%). 65
xvi
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Tanaman Kecipir ........................................................................... 9 Gambar 2. Polong Kecipir muda ..................................................................... 9 Gambar 3. Biji Kecipir ..................................................................................... 9 Gambar 4. Tanaman Buncis ........................................................................... 12 Gambar 5. Polong Buncis muda...................................................................... 12 Gambar 6. Biji Buncis...................................................................................... 12 Gambar 7. Rhizopus sp................................................................................... 20 Gambar 8. Hubungan antara metabolit primer dan metabolit sekunder........... 22 Gambar 9. Struktur dan sifat kimia Daidzein ................................................... 25 Gambar 10.Struktur dan sifat kimia Genistein.................................................. 25 Gambar 11. Struktur dan sifat kimia Glisitein................................................... 25 Gambar 12. Struktur dan sifat kimia Faktor- 2 ................................................. 26 Gambar 13.Reaksi Hidrolisis Glikosida Isoflavon menjadi Aglikon Isoflavon.... 27 Gambar 14. Massa Hasil Ekstraksi Biji Kedelai Kuning dan Produk Fermentasinya ........................................................................... 48 Gambar 15. Massa Hasil Ekstraksi Biji Buncis dan Produk Fermentasinya ..... 48 Gambar 16. Massa Hasil Ekstraksi Biji Kecipir dan Produk Fermentasinya ..... 48 Gambar 17. Grafik Kandungan Isoflavon Faktor -2 pada Kedelai, Buncis dan Kecipir ..................................................................... 57 Gambar 18. Grafik Kandungan Isoflavon Daidzein pada Kedelai, Buncis dan Kecipir ..................................................................... 57 Gambar 19. Grafik Kandungan Isoflavon Glisitein pada Kedelai, Buncis dan Kecipir ...................................................................... 57
xvii
Gambar 20. Grafik Kandungan Isoflavon Genistein pada Kedelai, Buncis dan Kecipir ..................................................................... 57 Gambar 21. Grafik Perbandingan Aktivitas Antioksidan Alami, Sintesis dan legume ........................................................................................ 64
xviii
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Mekanisme Kerja Pembuatan Tempe Kedelai ..................................... 74 2. Mekanisme Pembuatan Tempe berbahan Buncis dan Kecipir ............ 75 3. Mekanisme Ekstraksi Isoflavon dengan Metode Maserasi .................. 76 4. Identifikasi Isoflavon dengan Metode HPLC......................................... 77 5. a. Pembuatan Larutan DPPH............................................................... 78 b. Pembuatan Larutan Sampel dan Uji Aktivitas Antioksidannya.......... 79 6. Hasil Pengukuran dan Perhitungan besarnya Aktivitas Antioksidan dari kedelai, buncis,, kecipir, antioksidan alami (α-tokoferol, β-karoten, serta vitamin C) dan antioksidan sintetis BHT ...................................... 80 7. Hasil Pengamatan Biji Kedelai Kuning dan produk Tempenya............. 81 8. Hasil Pengamatan Biji Buncis dan poduk Tempenya ........................... 82 9. Hasil Pengamatan Biji Kecipir dan produk Tempenya.......................... 83 10. Hasil Ekstraksi Senyawa Isoflavon dari Kedelai, Buncis, Kecipir beserta produk Tempenya ................................................................................ 84 11. Analisis Statistik SPSS dua faktor........................................................ 85 12. Aktivitas Antioksidan (%) pada Kedelai, Buncis, dan Kecipir dengan Variasi Lama Waktu Fermentasi .......................................................... 88 13. Perbandingan Aktivitas Antioksidan alami, Sintetik, dan Legume........ 88 14. Surat Pernyataan dan Publikasi Tesis.................................................. 89 15. Biodata Mahasiswa.............................................................................. 90
xix
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Tempe kedelai dikonsumsi oleh berbagai lapisan masyarakat, berbagai umur dan berbagai status ekonomi serta sering dijumpai sebagai makanan dalam menu sehari-hari, baik sebagai lauk pauk maupun sebagai makanan camilan. Bahan baku untuk pembuatan tempe kedelai masih sangat tergantung dari pasokan impor, sehingga harganya sering fluktuatif dan menjadi mahal. Hasil penelitian Handajani et al., (1991), menyatakan bahwa Indonesia mempunyai banyak jenis legume yang beberapa diantaranya belum dimanfaatkan secara optimal. Salah satu jenis legume yang cocok dibudidayakan di Indonesia dan dapat berfungsi sebagai bahan pangan tetapi produk olahannya masih jarang dikonsumsi yaitu buncis (Phaseolus vulgaris) dan kecipir (Psophocarpus tetragonolobus).
Dalam rangka pengembangan senyawa antioksidan alami
khususnya isoflavon, maka perlu dilakukan penelitian tentang optimasi produksi senyawa antioksidan dari buncis dan kecipir dengan produk tempenya serta karakterisasi kandungan isoflavonnya.
Buncis dan kecipir sebagai alternatif
obyek penelitian sumber isoflavon, karena isoflavon merupakan metabolit sekunder yang banyak disintesis oleh tanaman, terutama dari kelompok leguminoceae (Anderson, 1997). Oleh karena itu, buncis (P. vulgaris) dan kecipir (P. tetragonolobus) yang merupakan dua spesies dari familia leguminoceae, dimungkinkan juga mengandung senyawa bioaktif isoflavon seperti yang dijumpai pada kedelai. Selama ini tempe kedelai yang dikonsumsi oleh masyarakat adalah tempe hasil fermentasi kedelai selama 36 – 48 jam. Lama waktu fermentasi
xx
tersebut merupakan lama waktu fermentasi kedelai untuk menghasilkan tempe optimum dari sisi cita rasa untuk dikonsumsi, tetapi lama waktu fermentasi optimum untuk menghasilkan ekstrak antioksidan khususnya senyawa isoflavon yang maksimum, belum diketahui. Dalam rangka pengembangan produk tempe tersier, misalnya produk isoflavon dari tempe untuk pengawet alami, maka perlu dilakukan penelitian tentang optimasi produksi isoflavon. Dalam penelitian ini akan difokuskan pada optimasi produksi senyawa antioksidan khususnya senyawa bioaktif isoflavon dengan variasi lama waktu fermentasi
pada biji
kedelai dan produk tempenya, maupun pada biji buncis dan biji kecipir beserta produk tempenya. Penelitian ini menggunakan sampel tempe berbahan baku buncis dan kecipir, karena buncis (P.vulgaris) dan kecipir (P. tetragonolobus) tergolong spesies dari famili leguminoceae seperti halnya kedelai, dan sudah diketahui dengan positif bahwa tempe yang berbahan baku kedelai ternyata mengandung senyawa bioaktif isoflavon aglikon yaitu faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein ( Pawiroharsono, 1995). Menurut hasil penelitian (Gyorgy et al., 1964 dalam Ariani 2009) dilaporkan bahwa isoflavon faktor-2 hanya dijumpai pada kedelai rendam yang difermentasi oleh Rhizopus sp. Isoflavon yang ditemukan dalam biji dorman adalah daidzin, glisitin, dan genistin yang tergolong bentuk isoflavon glikosida. Senyawa faktor-2 tidak dijumpai pada kedelai yang tidak difermentasi oleh kapang (Laksani, 2003), oleh karena itu agar diperoleh senyawa faktor-2 harus membuat biji-biji legum menjadi tempe, melalui proses fermentasi oleh kapang jenis Rhizopus sp. Faktor-2 mempunyai aktivitas antioksidan dan antihemolisis yang lebih baik dari daidzein dan genistein. Selain itu, telah
xxi
ditemukan bahwa senyawa isoflavon faktor-2 lebih aktif 10 kali lipat dari senyawa karboksi kroman (Pawiroharsono, 1995). Studi epidemiologi di Jepang menemukan bahwa konsumsi isoflavon bermanfaat mengurangi konsentrasi kolesterol serum pada hiperkolesterolemia, sehingga dapat menurunkan insiden kanker payudara (Aldercreutsz, 1998). Isoflavon juga memiliki khasiat farmakologi, sifat fisiologis aktif dari senyawa isoflavon antara lain antifungi, antioksidan, antihemolisis dan antikanker. Isoflavon adalah salah satu jenis fitoestrogen, merupakan suatu zat yang memiliki khasiat mirip estrogen dan berasal dari tumbuhan. Pentingnya manfaat isoflavon bagi kesehatan manusia, mendorong peneliti untuk melakukan studi kandungan isoflavon pada tempe yang berbahan baku buncis (P. vulgaris) dan kecipir (P. tetragonolobus) yang banyak terdapat dilingkungan sekitar kita. Salah satu aktivitas fisiologis yang menonjol dari isoflavon daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2 adalah aktivitas antioksidan. Pada umumnya, antioksidan yang digunakan sebagai pengawet pada bahan makanan adalah antioksidan sintetik seperti Butylated Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluene (BHT), Propyl Gallat (PG) dan Etylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA).
Pemanfaatan zat antioksidatif sintetik dapat
menimbulkan gangguan kesehatan bagi konsumen antara lain gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus dan keracunan (Chang et al.,1977 dalam Suryo dan Tohari, 1995). Untuk itu perlu dicari alternatif lain untuk mengatasi permasalahan tersebut. Salah satu cara adalah dengan mengganti pemanfaatan antioksidan sintetik dengan antioksidan alami.
Mengingat adanya kandungan isoflavon
dalam kedelai yang dapat berfungsi sebagai antioksidan, maka tempe berbahan baku dari leguminoceae dapat direferensikan sebagai bahan baku sumber
xxii
antioksidan alami. Dengan demikian isoflavon dari tempe berbahan baku legume selain berkhasiat sebagai antioksidan juga mempunyai khasiat farmakologis seperti yang sudah diuraikan diatas. Untuk memperoleh zat antioksidan alami, dapat dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut organik seperti, heksana, benzena, etil eter, kloroform, etanol atau metanol. Metanol 90 % merupakan pelarut optimum untuk mengekstrak isoflavon dari kedelai, namun penggunaanya untuk skala komersial masih perlu dikaji lebih lanjut karena bersifat toksik. Penelitian dengan menggunakan pelarut etanol 70% untuk ekstraksi diharapkan dapat mengganti metanol untuk menghasilkan ekstrak antioksidan alami secara komersial, karena kepolaran etanol mendekati metanol dan relatif tidak beracun (Kudou et al., 1991, Susanto et al.,1998 dalam Ariani, 2009).
Untuk selanjutnya pada
penelitian ini juga akan difokuskan pada ekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol 70%. Berdasarkan
uraian
diatas,
maka
dilakukan
penelitian
tentang
karakterisasi senyawa isoflavon dan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak tempe berbahan baku
buncis (Phaseolus vulgaris) dan kecipir (Psophocarpus
tetragonolobus). B. Perumusan Masalah Dari uraian latar belakang di atas, permasalahan dapat dirumuskan sebagai berikut : 1.
Isoflavon jenis apa sajakah yang terkandung dalam biji buncis dan biji kecipir beserta produk fermentasinya yang dibuat dengan lama waktu fermentasi 0,1, 2, 3, dan 4 hari.
xxiii
2.
Berapa lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak etanol tempe buncis dan kecipir, yang mengandung isoflavon aglikon (Faktor-2, daidzein, glisitein, genistein) dengan aktivitas antioksidan maksimum ?
3.
Bagaimana potensi biji buncis dan kecipir serta produk fermentasinya sebagai sumber antioksidan alami khususnya isoflavon, bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dari kedelai dan produk fermentasinya serta beberapa antioksidan alami ( α-tokoferol, β-karoten, vitamin C ) maupun antioksidan sintetis (Butyl Hidroksi Toluena / BHT) dengan metode DPPH.
C. Tujuan Penelitian Adapun tujuan dari penelitian yang dilakukan adalah : 1. Mengetahui jenis Isoflavon aglikon yang terkandung dalam biji buncis dan kecipir beserta produk fermentasinya berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari ). 2. Mengetahui lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak etanol tempe buncis dan kecipir yang mengandung isoflavon aglikon, dengan aktivitas antioksidan yang maksimum. 3. Mengetahui potensi biji buncis dan kecipir serta produk fermentasinya sebagai sumber antioksidan alami khususnya isoflavon bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dari kedelai dan produk fermentasinya serta beberapa antioksidan alami (α-tokoferol, β-karoten, vitamin C) maupun antioksidan sintetis Butylat Hidroksitoluena (BHT) dengan metode DPPH.
xxiv
D. Manfaat Penelitian Adapun manfaat dari penelitian yang dilakukan adalah : a. Dapat memberikan informasi pada masyarakat mengenai kandungan isoflavon faktor-2, daidzein, glisitein, genistein, serta aktivitas antioksidatif dari biji buncis dan kecipir beserta produk fermentasinya b. Mengetahui sejauh mana manfaat biji buncis dan kecipir beserta produk fermentasinya sebagai sumber antioksidan alami khususnya senyawa bioaktif isoflavon. c. Diharapkan dapat dijadikan referensi bagi penelitian selanjutnya, untuk mencari dan menentukan macam senyawa yang berguna sebagai antioksidan (selain senyawa isoflavon), yang terkandung di dalam biji buncis dan biji kecipir.
xxv
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Tinjauan Pustaka A.1. Leguminoceae Legume (kacang polong) adalah jenis tanaman dikotil dan merupakan tanaman setahun berumur pendek yang memiliki bunga kupu-kupu, tumbuh merambat sebagai tanaman semak. Di lingkungan kita, legume sebagian besar dibudidayakan untuk dimanfaatkan sebagai sayuran (misalnya buncis dan kecipir) atau untuk diambil bijinya (misalnya kedelai, kacang hijau, kacang tanah). Koro merupakan salah satu jenis legum yang dapat tumbuh di tanah yang kurang subur dan kering. Selain untuk dimanfaatkan bijinya, tujuan penanaman koro adalah sebagai tanaman pelindung dan pupuk hijau (Kanetro dan Hastuti, 2006). Koro-koroan merupakan salah satu jenis legum lokal yang memiliki beragam varietas dan biasa digunakan sebagai bahan baku pengganti kedelai dalam pembuatan tempe.
Kandungan gizi koro tidak kalah dengan kedelai yaitu
karbohidrat dan protein yang cukup tinggi serta kandungan lemak yang rendah. Dalam Kanetro dan Hastuti (2006) disebutkan bahwa senyawa antigizi
yang
sering terdapat pada legum antara lain enzim lipoksigenase, tripsin inhibitor, asam fitat, oligosakarida, senyawa glikosida dan sianida. Pengolahan koro pada umunya diawali dengan perendaman untuk menghilangkan sianida, karena kadar sianida pada koro reltif tinggi.
Setelah perendaman, biasanya diikuti dengan
pemasakan dan pengupasan kulit, karena kandungan karbohidarat yang tinggi menyebabkan koro memiliki tekstur yang keras sehingga pemasakan dilakukan agar teksturnya menjadi lunak (Handajani dan Atmaka, 1993).
xxvi
Selain bersifat sebagai senyawa antinutrisi, fitat memiliki peranan dalam kesehatan yang dianggap positif yaitu sebagai antioksidan yang dapat menangkal adanya radikal bebas maupun senyawa non radikal yang dapat menimbulkan oksidasi pada biomolekuler seperti protein, karbohidrat dan lipida (Anonim, 2007). Anggota famili leguminoceae (polongan) diantaranya adalah : a. Kecipir atau Winged Beans (Psophocarpus tetragonolobus ) Kedudukan tanaman kecipir dalam klasifikasi ilmiah ( taksonomi tumbuhan) sebagai berikut: Kingdom
: Plantae
Divisio
: Magnoliophyta
Classis
: Magnoliopsida
Ordo
: Fabales
Famili
: Fabaceae
Sub famili
: Faboideae
Genus
: Psophocarpus
Species
: Psophocarpus tetragonolobus Sumber : (Heyne, 1987 ).
Tanaman kecipir tumbuh subur didaerah tropis basah dengan curah hujan lebih besar dari 1600 m di atas permukaan laut. Tanah-tanah yang baik untuk kecipir adalah tanah dengan bahan organik yang rendah, berpasir atau lempung. Tanaman kecipir tahan terhadap kekeringan. Kecipir disebut juga kacang botol (Malaysia), sirahu avarai (Thailand), dragon bean (Vietnam), jaat (Sunda) dan sigarillas (Tagalog) termasuk tanaman setahun, mempunyai keunggulan dibandingkan
dengan
kedelai,
karena
xxvii
seluruh
bagian
tanaman
dapat
dimanfaatkan. Daun, buah dan umbi kecipir memiliki kadar protein yang tinggi, bahkan rata-rata melampaui kadar protein biji-bijian atau umbi-umbian lainnya sepert beras, ubi jalar, ketela pohon dan kentang. Dibawah ini disajikan gambar tanaman, buah, dan biji kecipir yang biasa dijumpai dalam kehidupan sehari-hari.
Gambar 1. Tanaman Kecipir
Gambar 2. Polong Kecipir muda
Gambar 3. Biji-biji Kecipir Buah kecipir berbentuk persegi empat siku yang masing-masing segi bersayap dan bergelombang. Panjang polong antara 6-20 cm dan bijinya putih, kuning hitam, sawo matang atau coklat muda. Berat bijinya rata-rata 30-64 gr tiap 100 butir (Handajani, 1992 ). Biji tanaman kecipir mengandung protein, lemak yang cukup tinggi, setara dengan kedelai (Salunkhe and Kadam, 1990). Kadar mineral dalam bentuk zat kapur, fosfor dan zat besinya juga lebih unggul.
Selain itu, biji kecipir juga
mengandung sejumlah asam amino esensial dan asam lemak esensial, setara dengan kedelai atau kacang tanah (Handayani, 1993 ). Komposisi asam amino
xxviii
dari biji kecipir hampir sama dengan biji kedelai. Secara lengkap kandungan asam amino yang menyusun protein dalam kecipir dapat dilihat pada tabel berikut : Tabel 1. Komposisi asam amino biji kecipir (%) Jenis Asam Kandungan ( % ) Jenis Asam Amino Amino
Kandungan ( % )
Alanin
296
Tirosin
281
Arginin
283
Isoleusin
263
Asam aspartat
751
Leusin
506
Asam glutamat
1080
Lisin
488
Glisin
268
Methionin
58
Histidin
176
Fenil alanin
321
Prolin
449
Threonin
294
Serin
360
Valin
265
Tryptophan
104
Sistein
54
Sumber : (Haryoto, 1996). Biji kecipir belum dimanfaatkan secara optimal, karena memiliki bau langu yang kuat dan kulit biji yang keras (Kanetro, 2001). Kulit biji yang keras menyebabkan daya serap air sangat rendah sehingga membutuhkan waktu yang lama dalam pengolahannya.
b. Buncis ( Phaseolus vulgaris ) Buncis adalah sayuran dari genus Phaseolus yang paling dikenal. Umumnya sistem perakaran berbagai jenis buncis tidak ekstensif, percabangan lateralnya dangkal. Daun buncis beranak daun tiga dan menyirip.
Bunga
berukuran besar, berwarna putih, merah jambu atau ungu. Bunganya sempurna memiliki 10 benangsari, 9 diantaranya menyatu berbentuk tabung yang
xxix
melingkupi batang, buah panjang. Bunga menyerbuk sendiri dan umumnya jarang terjadi persilangan . Kedudukan tanaman buncis dalam klasifikasi ilmiah (taksonomi tumbuhan) sebagai berikut: Kingdom
: Plantae
Divisio
: Magnoliophyta
Classis
: Magnoliopsida
Ordo
: Fabales
Famili
: Fabaceae
Sub famili
: Faboideae
Genus
: Phaseolus
Species
: Phaseolus vulgaris
Sumber: ( Heyne, 1987 ) Panjang polong berkisar 8 hingga 20 cm atau lebih, dengan lebar 1 cm. Ketika biji telah matang sempurna, polong akan membelah terbuka. Sebagian polong buncis tidak berbulu, sedikit diantaranya berbulu halus.
Buncis tidak
memiliki kelopak daun yang persisten sebagaimana yang dimiliki kapri (Heyne, 1987 ). Sebagian besar kultivar buncis berbiji 3 hingga 5. Tipe buncis bijian atau buncis segar cenderung berbiji banyak. Panjang biji berkisar 5 mm hingga 20 mm dan bobot biji tunggal kultivar berkisar dari 0,15 hingga lebih dari 0,80 gram. Biji dapat berbentuk bundar, ovoid, lonjong dan seperti ginjal. Warna kulit biji sangat khas menurut kultivarnya, dan dapat muncul dalam berbagai macam warna dan kombinasi warna (Rubatzky and Yamaguchi, 1998).
xxx
Dibawah ini disajikan gambar tanaman, buah polong muda, dan biji buncis yang sering dijumpai dilingkungan sekitar kita.
Gambar 4. Tanaman Buncis
Gambar 5. Polong Buncis
Gambar 6. Biji Buncis
A.2. Tempe Tempe secara luas dikenal sebagai makanan khas Indonesia, dikonsumsi oleh semua lapisan masyarakat dan sangat digemari oleh masyarakat Jawa. Ada berbagai macam tempe di Indonesia seperti misalnya tempe gembus dibuat dari ampas tahu, tempe lamtoro dibuat dari biji lamtoro, tempe benguk dibuat dari biji koro benguk, tempe bongkrek dibuat dari ampas kelapa, tempe gude dibuat
xxxi
dari kacang gude dan tempe kedelai dibuat dari kedelai. Dari beberapa jenis tempe tersebut yang paling banyak digemari masyarakat adalah tempe kedelai. Tempe dibuat dengan proses fermentasi kedelai dengan kapang jenis Rhizopus sp. Tempe bermutu tinggi bila kacang terlekat dengan jalinan miselium putih. Jika proses fermentasi dibiarkan terlalu lama, spora hitam terbentuk di permukaan. Spora tersebut tidak berbahaya namun mempengaruhi kenampakan dan penerimaan konsumen. 2.a. Tempe Kedelai Tempe kedelai tergolong sebagai makanan hasil fermentasi oleh jamur jenis Rhizopus sp. dan merupakan produk fermentasi yang amat dikenal oleh masyarakat. Tempe kedelai berpotensi untuk digunakan melawan radikal bebas, sehingga dapat menghambat proses penuaan dan mencegah terjadinya penyakit degeneratif (aterosklerosis, jantung koroner, diabetes melitus, kanker). Selain itu tempe juga mengandung zat antibakteri penyebab diare, penurun kolesterol darah, hipertensi, dan penyakit degeneratif lainnya (Astuti , 1995 ). Komposisi gizi tempe baik kadar protein, lemak, dan karbohidratnya tidak banyak berubah dibandingkan dengan kedelai. Namun, karena adanya enzim pencerna yang dihasilkan oleh kapang tempe, maka protein, lemak, dan karbohidrat pada tempe menjadi lebih mudah dicerna di dalam tubuh dibandingkan yang terdapat dalam kedelai. 2.b. Tempe Non Kedelai Selain tempe berbahan dasar kacang kedelai, terdapat pula berbagai jenis makanan berbahan bukan kedelai yang juga disebut tempe. Terdapat dua golongan besar tempe menurut bahan dasarnya, yaitu tempe berbahan dasar legume dan tempe berbahan dasar non-legume .
xxxii
Dalam pembuatan tempe buncis dan kecipir, biji direndam dalam air bersih dan dilakukan penggantian air rendaman setiap 8 jam sekali (9 kali diganti airnya selama 3 x 24 jam) perendaman, agar kandungan HCN dapat dihilangkan. Setelah selesai perendaman, kemudian kulit biji dikupas, dan direbus dengan air selama satu jam, kemudian ditiriskan dan didinginkan. Proses selanjutnya, termasuk jenis ragi yang digunakan relatif sama dengan pembuatan tempe kedelai. Tempe berbahan dasar non-legume mencakup tempe bongkrek dari bungkil kacang atau ampas kelapa, yang terkenal didaerah Banyumas, dan tempe jamur merang terbuat dari jamur merang (Astawan, 2003). 2.c. Proses Pembuatan Tempe 1. Perendaman Perendaman merupakan tahap awal dan penting dalam pembuatan tempe secara tradisional. Menurut Kasmidjo (1990), perendaman bertujuan memberikan kesempatan kepada biji untuk menyerap air (hidrasi) sehingga biji menjadi lebih lunak dan dapat menurunkan pH, karena terjadi pengasaman yang disebabkan oleh proses fermentasi oleh bakteri dan mikroorganisme lain yang berada dalam air rendaman. Pada kacang-kacangan, secara umum dilakukan perendaman sebelum proses pengolahan.
Perendaman ini berfungsi untuk melunakkan biji,
mengurangi bau langu dari biji yang diolah serta mereduksi lendir dan kotoran yang menempel pada keping biji (Atikoh dan Supriyanti, 1997). Pengasaman terjadi karena pertumbuhan bakteri penghasil asam laktat diantaranya Lactobacillus sp. Pertumbuhan bakteri yang baik ditandai oleh bau kecut dan busa pada permukaan rendaman kedelai. Bila pertumbuhan bakteri kurang, sehingga pH yang diperlukan tidak tercapai, rendaman kedelai perlu
xxxiii
ditambah bahan pengasaman. Asam laktat merupakan pilihan pertama sebagai bahan pengasaman. Jika tidak mungkin memperoleh asam laktat, asam cuka dapat digunakan (Suwahyono, 1989 ) Penggunaan bahan pengasaman menjadi keharusan pada cara cepat pembuatan tempe, yang cocok sebagai cara industri.
Pada cara cepat
perendaman cukup 2-3 jam. Pada cara tradisional perendaman berlangsung 20-30 jam karena bakteri perlu waktu panjang untuk tumbuh dan menghasilkan asam. Menurut Kasmidjo (1990), bakteri pembentuk asam yang banyak tumbuh pada proses perendaman kedelai sebagian besar adalah golongan termobakteri yang mempunyai suhu optimum 40 – 45 C, antara lain Bacillus sp, Lactobacillus sp, Streptococcus thermopilus dan Enterobacteriaceae. Sehingga dengan lebih banyaknya bakteri pembentuk asam yang tumbuh pada suhu tersebut, maka semakin banyak asam laktat yang terbentuk. Besarnya pH berkorelasi dengan kandungan asam laktat, semakin tinggi kandungan asam laktat maka semakin rendah nilai pH nya. 2. Pencucian Pencucian
ini
dimaksudkan
untuk
menghilangkan
kotoran
dan
mengurangi mikroorganisme lain yang tumbuh selama perendaman, juga untuk membuang kelebihan asam dan lendir yang terproduksi.
Pencucian harus
dilakukan sampai keping biji kedelai tidak licin lagi oleh lendir dan kedelai tidak terlalu asam. Lendir dan bakteri apabila tidak tercuci bersih akan mengganggu pertumbuhan kapang Rhizopus sp. dan dapat menyebabkan kegagalan produksi (Atikoh dan Supriyanti, 1997 )
xxxiv
3. Pengupasan Setelah proses hidrasi, dilakukan pengupasan yaitu melepaskan kulit ari dari keping biji kedelai. Proses ini harus dilakukan agar terjadi penetrasi asam dan miselium kapang ke dalam keping biji.
Miselium kapang tidak dapat
menembus lapisan kulit ari kedelai karena zat tanduk (kitin) yang terkandung dalam kulit, sehingga bila kulit tidak terlepas dari keping kedelai, produk tempe yang dihasilkan tidak atau kurang kompak. 4. Pemasakan Proses pemasakan dapat dilakukan dengan cara merebus atau mengukus. Proses pemasakan dilakukan selain untuk melunakkan kedelai, juga sebagai proses sterilisasi untuk mematikan bakteri-bakteri yang tumbuh selama proses perendaman. Keuntungan melalui proses ini adalah tempe akan lebih tahan lama, tidak berasa asam dan tidak pernah berlendir (Susanto et al., 1998). Menurut Suwaryono dan Ismeini (1988) proses pengukusan dilakukan setelah air mendidih. Pada pengukusan, kerusakan biji terjadi lebih lambat karena biji tidak berinteraksi secara langsung dengan air panas, namun melalui uap air panas sehingga pada proses ini suhu yang digunakan dibawah atau sama dengan 100 o C. 5. Penirisan dan Pendinginan Proses penirisan dilakukan, untuk menghilangkan air yang menempel pada biji kedelai. Menurut Kasmidjo (1990), tidak adanya air pada biji kedelai akan menghambat pertumbuhan bakteri dan mempercepat pertumbuhan kapang. Sedangkan proses pendinginan dilakukan setelah pemasakan, untuk menghilangkan air yang menempel pada keping biji dan juga untuk mengkondisi suhu agar sesuai untuk pertumbuhan kapang.
xxxv
6. Penambahan Inokulum Secara tradisisonal inokulum tempe disebut ragi tempe atau bibit tempe. Ragi adalah sumber mikrobia yang digunakan dalam proses fermentasi. Bibit tempe sebenarnya spora kapang. Jumlah spora pada satu unit ukuran inokulum, gram atau sendok, dapat diubah dengan memperbanyak bahan pembawa berupa campuran spora kapang dengan tepung beras, tepung singkong atau tepung terigu. Jumlah bahan pembawa yang lebih baik memudahkan penyebaran spora yang merata, lebih menjamin pertumbuhan yang baik. Inokulum
yang
dibuat
dalam
keadaan
terbuka
ke
lingkungan
memungkinkan untuk dimasuki mikrooraganisme lain, seperti bakteri, dan khamir. Mikroorganisme tersebut dapat menimbulkan perubahan-perubahan disaat proses fermentasi sehingga dihasilkan zat-zat berbeda (Judoamidjojo et al.,1992). Perubahan yang terjadi selama proses fermentasi ditimbulkan oleh enzim-enzim yang dihasilkan kapang yaitu pengurai protein, karbohidrat, dan asam lemak. Inokulum merupakan bahan yang paling penting pada pembuatan tempe, karena sebagai pembawa kapang yang akan melakukan proses fermentasi. Setiap jenis kapang mempunyai kemampuan yang berbeda dalam hal pertumbuhan, pembentukan enzim dan senyawa-senyawa yang bermanfaat bagi kesehatan. 7. Pemeraman Keping-keping biji kedelai yang sudah dicampur dengan inokulum diperam dalam kemasan pada suhu kamar (29ºC-31ºC). Kemasan diperlukan karena kapang hanya memerlukan sedikit oksigen untuk tumbuh. Kemasan juga berguna untuk mengkondisikan suhu agar selalu sesuai untuk pertumbuhan kapang, bahan pengemas menggunakan daun pisang.
xxxvi
d. Proses Fermentasi Ariani dan Hastuti (2009) melaporkan, selama fermentasi terjadi perubahan bau dan rasa karena adanya aktivitas enzim. Selama fermentasi, miselia jamur yang berwarna putih akan menyelubungi permukaan tempe, dan mengeluarkan enzim protease, lipase dan amilase ke lingkungan sekitarnya. Enzim-enzim tersebut dapat memecah komponen dalam bahan yaitu protein, lemak dan karbohidrat menjadi bahan yang lebih sederhana. Aktivitas mikroorganisme didalam proses pembuatan tempe secara tradisional, dapat dibedakan menjadi 2 tahapan proses yaitu : 1) Proses Fermentasi Awal (Fermentasi I) Proses perendaman selama 12 jam dilakukan terhadap biji-biji yang telah disortir dan kemudian dikupas kulitnya, kemudian direndam kembali selama 12 jam, pada suhu kamar (27-300C), dengan menggunakan air tanah (sumur). Pada proses ini terjadi proses fermentasi awal oleh bakteri pembentuk asamasam organik. Tujuan utama proses ini adalah untuk pengasaman kedelai. Untuk maksud pengasaman ini, maka pada proses perendaman dilakukan inokulasi bakteri pembentuk asam yaitu dengan menambahkan air kedalam rendaman dari proses perendaman sebelumnya, sehingga tahapan ini disebut
proses
fermentasi
proses
awal
(fermentasi
I).
Pada
biji
buncis
dan
kecipir
perendamannya lebih lama yaitu 3 x24 jam, karena kulit biji kecipir itu keras sedangkan buncis sangat berwarna biru air rendamannya sehingga untuk membeningkan air rendaman diperlukan waktu yang lebih lama. 2) Proses Fermentasi Utama (Fermentasi II) Mikroorganisme yang berperan utama didalam pembuatan tempe adalah kapang Rhizopus sp. Aktivitas fisiologis kapang pada proses fermentasi tempe
xxxvii
dimulai sejak diinokulasinya inokulum (ragi tempe) pada bahan yang telah siap difermentasikan yaitu biji kedelai, biji buncis dan kecipir masak yang telah dikuliti dan ditiriskan. Spora kapang tersebut mulai tumbuh berkecambah dengan membentuk benang-benang hifa yang makin
memanjang membalut dan
menembus biji kedelai. Apabila benang-benang tersebut telah sedemikian padat, maka terbentuklah tempe yang kompak, putih dan dengan aroma khas tempe. Secara keseluruhan tahapan ini disebut sebagai proses fermentasi II, dan berlangsung disaat pemeraman. e. Rhizopus sp. / kapang tempe Mikroorganisme yang berperan utama didalam pembuatan tempe, salah satunya adalah kapang Rhizopus sp. Sebagai contoh inokulum dalam bentuk tepung dan diproduksi skala pabrik oleh Puslitbang Kimia Terapan-LIPI Bandung, menggunakan Rhizopus oligosporus (Lindajati, 1985). Didalam klasifikasi, kapang ini digolongkan ke dalam genus Rhizopus, familia Mucoraceae, ordo Mucorales, subklas Zygomicotina, dan klasis zygomycetes (Hesseltine, 1985). Kapang yang tergolong dalam genus Rhizopus dicirikan berupa sel vegetatif yang berupa benang dan disebut hifa/misellium yang membentuk stolon-stolon (semacam ruas/buku) yang dilengkapi dengan rhizoid (mirip akar) yang tumbuh bercabang-cabang masuk kedalam subtrat. Pada tempat tumbuhnya rhizoid, terdapat sporangiospora yang tumbuh mengarah keudara (berlawanan arah dengan rhizoid), dan dari tempat inilah terbentuk spora. Dibawah ini disajikan gambar Rhizopus sp.
xxxviii
Gambar 7. Rhizopus sp. Rhizopus sp. sebagai kapang pemeran utama yang telah terbukti dapat memfermentasikan kedelai dan membentuk tempe secara sempurna. Waktu yang dibutuhkan sampai terbentuk tempe secara sempurna memerlukan waktu 24-36 jam. Selama proses fermentasi berlangsung, kedelai berubah menjadi tempe dan perubahan tersebut pada dasarnya dapat dibedakan sebagai perubahan secara fisik dan secara kimia. Perubahan sifat fisik tempe dibandingkan dengan kedelai antara lain, bertekstur kompak, warna putih dengan aroma khas tempe. Perubahan secara kimia ditandai dengan terjadinya hidrolisa senyawa-senyawa komplek (protein, karbohidrat, lemak, ikatan glikosida) menjadi senyawa yang lebih sederhana dan mudah dicerna (Astuti, 1995). A.3. Isoflavon Flavonoid merupakan kelompok fenol dengan sebuah cincin aromatik dan satu atau lebih gugus hidroksil yang tersebar di alam. Senyawa fenol cenderung larut dalam air karena paling sering dijumpai bergabung dengan gula
xxxix
berupa glikosida dan biasanya terdapat dalam rongga sel. Flavonoid merupakan kelompok molekul organik yang tersebar di hampir seluruh bagian tanaman. Kurang lebih dua ribu jenis golongan flavonoid tersebar di alam (Goldberg,1996). Penyebaran jenis flavonoid terbanyak dijumpai pada angiospermeae (tumbuhan berbiji tertutup),
dan flavonoid mempunyai potensi sebagai
antioksidan (Goldberg, 1996). Isoflavon adalah salah satu senyawa yang termasuk dalam golongan flavonoid dan merupakan salah satu hasil metabolit sekunder. Metabolit sekunder merupakan senyawa-senyawa yang terdapat pada spesies tertentu dan sangat khas untuk setiap spesies. Metabolit sekunder berperan
untuk
kelangsungan
hidup
suatu
spesies
dalam
perjuangan
menghadapi keadaan darurat dan untuk bertahan hidup (Judoamidjojo et al., 1992). Senyawa metabolit sekunder terbentuk pada saat tidak ada pertumbuhan sel yang dikarenakan keterbatasan nutrien zat gizi dalam medium sehingga merangsang dihasilkannya enzim-enzim yang berperan dalam pembentukan metabolit
sekunder
dengan
memanfaatkan
metabolit
primer
untuk
mempertahankan kelangsungan hidupnya. Polisakarida, protein, lemak dan asam nukleat merupakan penyusun utama dari makhluk hidup, karena itu disebut metabolit primer. Proses metabolisme merupakan keseluruhan proses sintetis dan perombakan zat-zat yang dilakukan oleh makhluk hidup untuk kelangsungan hidupnya. Metabolit primer dari semua organisme sama meskipun sangat berbeda genetiknya. Dibawah ini disajikan skema hubungan antara metabolit primer dan metabolit sekunder yang disintesis oleh tumbuhan :
xl
Metabolisme Primer
Metabolit Sentral
Polisakarida
Metabolit Sekunder Glikosida
Glukosa
Pentosa Tetrosa
Polisakarida
Asam amino aromatik
Fenilpropanoid Alkaloid
Protein Asam amino alifatik
Tritosa
Lemak
Asam asetat
Asam Nukleat
Asam mevalonat Siklus Krebs Asam - asam
Poliketida
Terpena Karotenoid
Tetrapirol
Gambar 8. Hubungan antara metabolit primer dan metabolit sekunder, (Muhanifa, 2000 dalam Ariani dan Hastuti, 2009)
3.1. Isoflavon Pada Kedelai Mengingat berbagai potensi kedelai sebagai sumber gizi dan senyawa aktif serta prospeknya untuk dikembangkannya produk-produk baru, kedelai banyak disebut sebagai “The golden bean, the miracle bean, food for the future”. Isoflavon yang dominan pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida, sedangkan yang dominan pada produk kedelai yang sudah mengalami fermentasi adalah aglukan (Coward et al., 1993). Bentuk senyawa glikosida dipertahankan oleh tanaman sebagai bentuk inaktif sehingga disimpan oleh tanaman dalam keadaan yang stabil.
xli
Bentuk aktif glikosida adalah aglikon, yang dihasilkan dari pelepasan glukosa dari ikatan glikosida (Anderson and Carner, 1997). Isoflavon pada kedelai terdapat dalam empat bentuk, yaitu dalam bentuk aglikon (Faktor-2, daidzein, genistein, dan glisitein); dalam bentuk glikosida (daidzin, genistin dan glisitin); dalam bentuk asetilglikosida dan malonilglikosida (Wang and Murphy, 1994). Struktur kimia senyawa isoflavon glikosida (daidzin, genistin dan glisitin) terlihat pada tabel 2. dihalaman berikutnya : Tabel 2. Struktur Daidzin, Genistin dan Glisitin Nama Senyawa
Struktur
Genistin
CH 2 OH H H OH OH H
Glisitin
O O
O H
OH
OH
OH
CH 2 OH O O H H OH H OH H OH
Daidzin CH2OH H
H OH
O
O
O
H 3 CO O OH
O
O H O
OH
H
OH
OH
3.2. Isoflavon Pada Tempe Kedelai Kedelai mengalami berbagai perubahan pada proses pembuatan untuk dijadikan tempe, baik melalui proses fisik maupun proses enzimatik yang
xlii
dikarenakan oleh aktivitas mikroorganisme. Keterlibatan mikroorganisme pada proses
pembuatan
tempe
terutama
terjadi
pada
proses
perendaman,
dikarenakan oleh bakteri-bakteri pembentuk asam dan proses fermentasi oleh kapang khususnya Rhizopus oligosporus. Sebagai akibat perubahan-perubahan tersebut tempe menjadi lebih enak, lebih bergizi, dan lebih mudah dicerna. Salah satu faktor penting dalam perubahan tersebut adalah terbebasnya senyawasenyawa isoflavon dalam bentuk bebas (aglikon), dan teristemewa hadirnya Faktor-2 yang terdapat pada tempe tetapi tidak terdapat pada kedelai, ternyata berpotensi tinggi (dibanding dengan jenis isoflavon yang lainnya) sebagai antioksidan (Gyorgy et al., 1964). Faktor-2 (6,7,4' tri-hidroksi isoflavon) merupakan senyawa yang sangat menarik perhatian, karena senyawa ini terbentuk selama proses fermentasi oleh aktivitas mikroorganisme. Senyawa ini mula-mula ditemukan oleh Gyorgy (1964) pada ekstrak tepung tempe, yang merupakan senyawa konjugat/terikat dengan senyawa karbohidrat melalui ikatan glikosida. Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses nonfermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglikon yang lebih tinggi aktivitasnya. Senyawa aglikon tersebut adalah genistein, daidzein, glisitein dan faktor-2 (Purwoko et al., 2001). Struktur dan sifat kimia daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2 ditampilkan pada gambar 9, 10, 11 dan 12 dihalaman berikut:
xliii
HO
O
O OH
Daidzein
Nama Kimia
: Daidzein, 7,4’-dihidroksi isoflavon
Rumus Molekul : C15H10O4
Kelarutan: Tidak larut dalam air
Gambar 9. Struktur dan Sifat Kimia Daidzein
HO
O
OH
O OH
Genistein
Nama Kimia
: Genistein, 5,7,4’-trihidroksi isoflavon
Rumus Molekul : C15H10O5 Kelarutan
: Larut dalam metanol dan etanol sukar larut dalam air
Gambar 10. Struktur dan Sifat Kimia Genistein
HO
O
H3CO O OH
Glisitein
Nama Kimia
: Glisitein, 6-metoksi-7,4’-dihidroksi isoflavon
Rumus Molekul : C16H12O5 Kelarutan
: Tidak larut dalam air
Gambar 11. Struktur dan Sifat Kimia Glisitein
xliv
O
HO
HO O OH
Faktor II
Nama Kimia
: Faktor-2 , 6,7,4’-trihidroksi isoflavon
Rumus Molekul : C15H10O5 Kelarutan
: Tidak larut dalam air
Gambar 12. Struktur dan Sifat Kimia faktor-2 3.3.Metabolisme Isoflavon pada Proses Pengolahan Kedelai menjadi Tempe Senyawa isoflavon merupakan salah satu komponen yang juga mengalami metabolisme. Senyawa isoflavon ini pada kedelai berbentuk senyawa konjugat dengan senyawa gula melalui ikatan -O- glikosidik.
Selama proses
fermentasi, akan berlangsung proses hidrolisis, sehingga dibebaskan senyawa gula dan isoflavon aglukan. Senyawa isoflavon aglukan ini dapat mengalami transformasi lebih lanjut membentuk senyawa transforman baru.
Hasil
transformasi lebih lanjut dari senyawa aglukan ini justru menghasilkan senyawasenyawa yang mempunyai aktivitas biologi lebih tinggi.
Selama proses
pengolahan, baik melalui fermentasi maupun proses non-fermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglukan yang lebih tinggi aktivitasnya. Hal ini terlihat pada faktor-2, yang mempunyai aktivitas antioksidan dan antihemolisis lebih baik dari daidzein dan genistein. Selain itu, telah ditemukan bahwa senyawa isoflavon faktor-2 lebih aktif 10 kali lipat dari senyawa karboksikroman (Pawiroharsono, 1995). Faktor-2 dipandang sebagai senyawa yang sangat prospektif sebagai senyawa antioksidan (10 kali aktivitas dari vitamin A atau karboksi kroman dan
xlv
sekitar 3 kali dari senyawa isoflavon aglukan lainnya pada tempe) serta berkhasiat antihemolisis. Reaksi hidrolisis glikosida isoflavon menjadi aglikon isoflavon ditampilkan pada gambar 13 dibawah ini :
O
CH20H H
H HO
HO
O
O H
H
b - Glukosidase O
OH H
OH
OH
+
+ H2 O
H
OH
Daidzein
CH2OH
O
HO
O
HH O OH H OH H OH
O
O
OH
+ OH
+ H2O
CH2OH O
O
b -glukosidase
H3CO
+ H2O
O
HO
OH
+
H3CO O
Glukosa
H
H HO
O H
OH OH
Glisitein
OH
CH2 OH OH
O
OH
Glisitin
CH2OH O OH H H HO H H
Genistein
O
H OH H OH H OH
O OH
Genistin
OH
Glukosa
b -glukosidase OH
O H
H HO
OH
O
Daidzin
H
CHOH OH 2
O
H
OH
Glukosa
Gambar 13. Reaksi Hidrolisis Glikosida Isoflavon menjadi Aglikon Isoflavon
Purwoko et al., (1993) dalam Restuhadi (2001), menyatakan bahwa 99% isoflavon glikosida yang terdapat pada biji kedelai, selama proses perendaman, dapat terhidrolisis menjadi aglikon isoflavon dan glukosa. Pada proses fermentasi kedelai rendam dengan kapang Rhizopus oligosporus, daidzein dan genistein dapat mengalami proses hidroksilasi sehingga menjadi senyawa yang memilik
xlvi
aktivitas fisiologis tinggi dan disebut faktor-2. Senyawa isoflavon faktor-2 ini tidak dijumpai pada kedelai yang tidak difermentasi (Trilaksani, 2003). 3.4. Manfaat Senyawa Isoflavon dari Tempe Kedelai Isoflavon pada tempe dapat mencegah aktivitas sel menjadi sel kanker, tetapi juga dapat memperbaiki metabolisme hormon steroid, menurunkan kolesterol dan trigleserida, serta melindungi sel-sel hati dari paparan senyawa beracun. Selain itu isoflavon juga dapat berfungsi untuk memperlancar sirkulasi darah. Isoflavon mempunyai beberapa efek posifif, diantaranya
adalah
antiadrenalin, yang membuat jantung bekerja lebih santai, di samping antiperadangan serta mencegah ketidak teraturan denyut jantung. Khususnya isoflavon pada tempe yang aktif sebagai antioksidan, yaitu factor-2 terbukti berpotensi sebagai anti-kontriksi pembuluh darah (konsentrasi 5 µg/ml) dan juga berpotensi menghambat pembentukan LDL (low density lipoprotein). Dengan demikian, isoflavon dapat mengurangi terjadinya arteriosclerosis pada pembuluh darah (Zilliken, 1987). Isoflavon mempunyai struktur kimia hamper sama dengan estrogen sehingga disebut fitoestrogen (Pakasi, 2000 dalam Iswandari, 2006) Hasil olahan kedelai lain seperti minyak kedelai, juga dapat menangkal kolesterol. Menurut Zilliken (1987), faktor-2 merupakan senyawa isoflavon yang paling besar pengaruhnya. Karena itulah isoflavon menumbuhkan harapan cerah pada pencegahan dan penurunan kejadian penyakit jantung. Manfaat senyawa Isoflavon dibidang kesehatan diantaranya adalah sebagai antikanker/antitumor, antivirus, antikolesterol, mencegah jantung koroner, mencegah osteoporosis dan membantu terapi hormon estrogen (Pawiroharsono, 1998).
xlvii
A.4. ANTIOKSIDAN 4.1. Pengertian Tentang Antioksidan Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat, dan mencegah proses oksidasi. Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi oksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid, protein dan karbohidrat, dalam proses metabolisme yang berlangsung dalam tubuh (Winarsi, 2004). Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat. Keseimbangan oksidan dan antioksidan sangat penting, karena berkaitan dengan berfungsinya sistem imunitas tubuh. Defisiensi antioksidan yang berupa vitamin C, vitamin E, Se, Zn dan glutation, dalam derajat ringan hingga berat, sangat berpengaruh terhadap respon imunitas (Meydani, et al., 1995) Radikal bebas adalah suatu molekul yang mempunyai satu elektron atau lebih yang tidak berpasangan pada orbital luarnya. Adanya elektron yang tidak berpasangan, menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron dari molekul yang berada disekitarnya, ia sangat reaktif dan merusak jaringan (Soeatmaji, 1998). Radikal bebas merupakan molekul yang kehilangan elektron, sehingga molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari molekul sel lain. Radikal bebas dapat dihasilkan dari hasil metabolisme tubuh dan faktor eksternal seperti asap rokok, hasil penyinaran UV, zat kimiawi dalam makanan dan polutan lain. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas bersifat kronis, yaitu dibutuhkan waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut menjadi nyata. Radikal bebas sangat reaktif karena kehilangan satu atau lebih
xlviii
elektron yang bermuatan listrik, dan untuk mengembalikan keseimbangannya maka radikal bebas berusaha mendapatkan elektron dari molekul lain atau melepas elektron yang tidak berpasangan tersebut. Radikal bebas dalam jumlah berlebih di dalam tubuh sangat berbahaya karena menyebabkan kerusakan sel, asam nukleat, protein dan jaringan lemak. Radikal bebas terbentuk di dalam tubuh akibat produk sampingan proses metabolisme ataupun karena tubuh terpapar radikal bebas melalui pernapasan. Di dalam tubuh terdapat mekanisme antioksidan atau antiradikal bebas secara endogenik. Tetapi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih maka dibutuhkan antioksidan yang berasal dari sumber alami atau sintetik dari luar tubuh. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektronnya kepada radikal bebas sehingga dapat menghentikan kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Antioksidan dapat berasal dari dalam tubuh dan luar tubuh.
Didalam
tubuh kita memiliki sistem enzym antioksidan yang bekerja secara simultan memetabolisme radikal bebas sehingga tidak meninggalkan kerusakan pada jaringan (Hodgson and Levi, 2000). Sementara itu jenis antioksidan yang lainnya berasal dari luar tubuh, yaitu yang berasal dari makanan, atau komponen bahan makanan (fitokimia) seperti fenol, atau alkaloid (Schultze et al., 1984). Menurut Winarsi (2007), secara umum antioksidan dikelompokkan menjadi dua, yaitu antioksidan enzimatis dan non-enzimatis. Antioksidan enzimatis misalnya enzim superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase. Antioksidan non-enzimatis meliputi antioksidan larut dalam lemak (tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon dan bilirubin) dan antioksidan larut dalam air (vitamin C, asam urat, protein pengikat logam dan protein pengikat heme).
xlix
Senyawa antioksidan memiliki peran yang sangat penting dalam kesehatan.
Berbagai bukti ilmiah menunjukkan bahwa senyawa antioksidan
mengurangi resiko terhadap penyakit kronis, seperti kanker dan penyakit jantung koroner (Amrun et al., 2007). Reaksi oksidasi lemak yang terjadi pada makanan atau bahan makanan berlemak dapat dihambat dengan pemberian zat antioksidan. Pada umumnya zat antioksidan yang digunakan adalah zat antioksidan
sintetik
seperti
Butylated
Hydroxyanisole
(BHA),
Butylated
Hydroxytoluene (BHT), Propyl Gallat (PG) dan Etylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA). Sementara itu penggunaan zat antioksidan sintetik tertentu misalnya BHT dapat menimbulkan akibat buruk terhadap kesehatan konsumen seperti gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus dan keracunan. Salah satu usaha untuk mengatasi masalah tersebut adalah mengganti zat antioksidan sintetik dengan zat antioksidan alami. Zat antioksidan alami dapat diperoleh dari ekstrak bagian-bagian tanaman tertentu terutama yang banyak mengandung senyawasenyawa flavonoid yang tersusun dari gugus-gugus fenol (Suryo dan Tohari, 1995). Perkembangan pengetahuan menunjukkan adanya hubungan antara kimiawi radikal dengan keterlibatannya pada proses biologi normal ataupun pada beberapa penyakit yang dihubungkan dengan ketuaan. Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksidasi molekul lain. Tubuh tidak mempunyai sistem pertahanan antioksidatif yang berlebihan, sehingga jika terjadi paparan radikal bebas yang berlebihan, tubuh membutuhkan antioksidan eksogen. Kekhawatiran terhadap efek samping penggunaan antioksidan sintetik, maka antioksidan alami menjadi alternatip yang terpilih. Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan oleh oksigen
l
reaktif, menghambat penyakit degeneratif serta mampu menghambat peroksidasi lipid pada makanan. Beberapa tahun terkhir terjadi peningkatan minat untuk mendapatkan antioksidan alami. Jenis penggolongan antioksidan yang lain adalah berdasarkan sumber diperolehnya senyawa tersebut.
Penggolongan ini ada dua yaitu antioksidan
sintetik dan antioksidan alami. 4.2. Antioksidan sintetik Antioksidan sintetik efektif dalam mencegah ketengikan pada minyak dan bahan pangan berlemak (Purwoko 2001 dalam Meyri, 2003). Contoh antioksidan sintetik adalah BHA, BHT, propil galat dan EDTA. Menurut Chang et al. (1977), penggunaan BHT pada tikus percobaan dapat menyebabkan kerusakan organ tubuh seperti paru-paru dan organ pencernaan. oleh karena itu penggunaan food additive (bahan tambahan pada makanan) lebih baik dibatasi. Penggunaan
antioksidan
tidak
boleh
berlebihan
karena
aktivitas
antioksidan akan hilang pada konsentrasi yang tinggi dan mungkin akan menjadi prooksidan. Penggunaan antioksidan berlebihan akan menyebabkan senyawa lebih bersifat sebagai akselerator daripada inhibitor dalam oksidasi lemak. Dalam keadaan berlebih, antioksidan akan meningkatkan dekomposisi oksidasi lemak dan pembentukan produk radikal. 4.3. Antioksidan Alami Merupakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke bahan makanan.
Kebanyakan senyawa antioksidan yang
diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan.
li
4.3.a. Antioksidan Pada Kedelai Salah satu senyawa
dari tumbuhan yang memiliki kemampuan
bioaktivitas sebagai antioksidan adalah isoflavon.
Isoflavon sebagai hasil
metabolit sekunder, banyak disintesa oleh tanaman angiospermae dan banyak terdapat pada kelompok leguminoceae, khususnya pada tanaman kedelai. Pada tanaman kedelai, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada biji kedelai bagian hipokotil dan kotiledon (Anderson, 1997). Pawiroharsono (1995) melaporkan bahwa kandungan isoflavon pada kedelai berkisar 2-4 mg/g. Senyawa isoflavon pada kedelai, umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan glikosida. Jenis senyawa tersebut diantaranya adalah genistin, daidzin, dan glisitin. Bentuk senyawa demikiaan ini mempunyai aktivitas fisiologis kecil, apabila melalui proses pengolahan (baik melalui proses fermentasi maupun non fermentasi), senyawa isoflavon
dapat
mengalami
transformasi
terutama
melalui
proses
hidrolisis,sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglikon yang lebih tinggi aktivitas fisiologisnya. Selain isoflavon, asam fitat yang terkandung pada kelompok tanaman leguminoceae, juga memiliki efek antioksidan. Asam fitat merupakan bentuk penyimpanan fosfor terbesar pada tanaman sereal dan leguminosa. Menurut Nuraida dan Yasni (1998) dinyatakan bahwa produk olahan kedelai tanpa fermentasi, masih mengandung asam fitat tetapi fermentasi Rhizopus pada kedelai dapat menghilangkan asam fitat, sehingga tempe tidak mengandung asam fitat.
lii
4.3.b. Antioksidan Pada Tempe Kedelai Dalam tempe kedelai terdapat empat jenis isoflavon yang mempunyai khasiat antioksidan, yaitu daidzein, glisitein, dan genistein serta faktor-2. Selain itu, isoflavon juga berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai obat. Pada tabel berikut, disajikan beberapa potensi pemanfaatan isoflavon yang diperoleh dari hasil penelitian. Tabel 3. Potensi Pemanfaatan Senyawa Isoflavonoid No 1 2
Isoflavon Daidzein,Genistein Glisitein, Faktor-2 Faktor-2
Bioaktivitas Antioksidan, Antikanker Antioksidan, Anrikanker Antioksidan, Antiinflamasi Antikontriksi, Antikanker
Referensi Gyorgy et al.(1964) Kramer, et al (1984) Zilliken (1987)
3 4
Faktor – 2 Glisitein
Antiheimolitic Antialergi
Murata, Jha (1985) Jha ( 1985 )
5
Daidzein,Genistein
Estrogenik
Oilis (1962 ) Snyder dan Kwon ( 1987)
Sumber : Pawiro Harsono ( 1998 )
B. Kerangka Berpikir Senyawa isoflavon banyak ditemukan pada semua jenis tanaman, dan dari berbagai hasil penelitian melaporkan bahwa tanaman leguminoceae /kacang polong
mempunyai kandungan isoflavon yang lebih tinggi bila dibandingkan
dengan jenis tanaman bukan leguminoceae. Buncis dan Kecipir merupakan dua spesies dari keluarga leguminoceae, diduga bahwa buncis dan kecipir juga memiliki kandungan isoflavon yang tinggi. Peneliti menggunakan kedelai kuning sebagai kontrol pembanding, karena kedelai sudah diketahui dari berbagai penelitian ilmiah sebagai sumber isoflavon yang dikenal oleh masyarakat luas. Seberapa banyakkah kandungan isoflavon yang dimiliki oleh buncis dan kecipir, serta bagaimanakah kemampuan aktivitas antioksidatifnya akan diketahui dari
liii
hasil penelitian ini. Lebih tinggi ataukah lebih rendah kandungan isoflavonnya bila dibanding dengan senyawa antioksidan yang sudah dikenal oleh masyarakat seperti vitamin C, alfatokoferol, betakaroten maupun BHT.
C.Hipotesis 1. Biji buncis dan kecipir hasil fermentasi 0, 1, 2, 3, 4 hari, mengandung senyawa isoflavon yang bervariasi. 2. Kandungan isoflavon yang tinggi, memiliki kemampuan sebagai antioksidan yang bagus (optimum).
liv
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian tentang Karakterisasi Senyawa Bioaktif Isoflavon dan Uji Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Tempe Berbahan Baku Buncis dan Kecipir, dilakukan dengan metode eksperimental laboratorium yang berlangsung dari bulan Februari 2009 sampai bulan Juli 2009. Penelitian ini dilakukan di: a. Laboratorium Program Kimia FKIP UNS b. Sub Laboratorium Biologi Pusat MIPA UNS c. Laboratorium Kimia Organik Fakultas MIPA UGM B. Alat dan Bahan Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : a.
Alat untuk uji HPLC ( Perkin Elmer LC 295)
b.
Alat untuk uji Aktivitas Antioksidan ( Spektrofotometer UV – VIS )
c.
Blender (National)
d.
Pipet mikro ( Master Pet )
e.
Spatula
f.
Gelas Erlenmeyer, Bekerglas, Petridish, Corong kaca, gelas arloji, pengaduk, dan botol-botol vial.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari : a. Kedelai kuning dari Madura, buncis dan kecipir dari Ndarjo Wonogiri b. Etanol 95 % , Metanol p.a ( Merck ) c. Standar Genistein ( Sigma Chemical Co ) d. Standart Daidzein ( Sigma Chemical Co )
lv
e. Standar Glisitein ( Sigma Chemical Co ) f. Standar Faktor-2 ( Sigma Chemical Co ) g. DPPH, BHT, Betakaroten, Alfatokoferol, Vitamin C (Sigma Chemical Co) h. Metanol gradient grade for liquid chromatography ( Merck ) i. Aluminium foil, kertas saring, dan akuades
C. Prosedure Penelitian 1. Pembuatan Tempe Kedelai Tempe kedelai dibuat dari biji kedelai sebanyak 0,5 kg dan diinokulasi dengan 0,5 gram inokulum tempe. Sebelum diinokulasi, biji kedelai disortir agar didapatkan kedelai dengan kualitas yang bagus. Biji kedelai kemudian direndam selama 24 jam, kemudian kulit biji dikupas secara manual dengan menggunakan tangan. Proses perendaman ini selain untuk menghilangkan bau langu pada kedelai juga untuk melunakkan biji, sehingga diperoleh kedelai kupas yang bersih dari kulit. Kemudian kedelai kupas dikukus 30 menit dan untuk selanjutnya diproses lebih lanjut dengan cara difermentasikan dengan ragi tempe dan menghasilkan tempe kedelai. Tahapan dalam pembuatan tempe kedelai dijelaskan dalam uraian berikut : a. Pemilihan Biji Kedelai Biji kedelai yang akan dibuat tempe perlu dipilih agar diperoleh bahan dasar tempe yang berkualitas baik, sehingga tempe yang dihasilkan juga baik. Biji kedelai yang digunakan adalah biji kedelai yang bentuknya utuh, bernas, berwarna kuning bersih dan tidak terdapat cacat pada seluruh permukaannya seperti bekas hama, lubang-lubang, dan berkerut kulitnya.
lvi
b. Perendaman Biji kedelai yang telah dipilih selanjutnya direndam dalam air biasa selama 24 jam. Air diganti setiap 6 jam sekali untuk menghindari bau yang tidak enak selama proses perendaman. Perendaman merupakan salah satu cara dalam
persiapan
bahan,
yaitu
menyiapkan
kedelai
kupas
sebelum
difermentasikan. c. Pengupasan Selama perendaman, biji kedelai dikupas kulitnya menggunakan tangan untuk menjamin kebersihan dan
kedelai tidak rusak. Biji kedelai yang telah
dihilangkan kulit arinya (kedelai kupas), selanjutnya dikukus. d. Pengukusan Biji kedelai yang telah dikupas selanjutnya dikukus menggunakan dandang tertutup selama 30 menit. Pengukusan merupakan salah satu cara persiapan bahan, sebelum difermentasi menjadi tempe. Proses pengukusan ini juga merupakan proses untuk menambah kadar air pada biji kedelai, sehingga kelembabannya
memenuhi
syarat
untuk
pertumbuhan
jamur
Rhizopus
oligosporus. Hasil dari pengukusan ini adalah kedelai kukus yang sedikit lunak dan lebih besar ukuran bijinya. e. Penambahan inokulum (ragi tempe) Setelah sampel dalam keadaan tidak terlalu basah, ditaburi ragi atau inokulum sebanyak 0,5 gram untuk 500 gram sampel kedelai. Inokulum yang digunakan adalah Rhizopus sp. produk LIPI dengan merk RAPRIMA Inokulum tempe yang digunakan berupa serbuk halus berwarna putih kekuningan dan tidak berbau. Sebelum ditambahkan inokulum, kedelai hasil pengukusan diangin-anginkan terlebih dahulu untuk mengurangi kadar air
lvii
berlebih pada kedelai. Pencampuran dilakukan dengan diaduk perlahan-lahan secara merata agar jamur tumbuh pada permukaan biji-biji kedelai secara optimum, sehingga diperoleh tempe yang teksturnya kompak dan merata. f. Pengemasan Kedelai yang telah diinokulasi selanjutnya dikemas menggunakan daun pisang. Pengemasan bertujuan untuk mencegah kontaminasi bahan lain atau mikrobia yang dapat mengganggu pertumbuhan jamur pada proses fermentasi tempe. g. Fermentasi Kedelai yang telah diinokulasi dan dikemas, selanjutnya difermentasi selama 0, 1, 2, 3 dan 4 hari. Fermentasi 0 hari merupakan kedelai kukus yang setelah diinokulasi dengan ragi namun tidak difermentasikan lebih lanjut. Fermentasi bertujuan
memberi
kesempatan pada jamur untuk melanjutkan
pertumbuhan. Mekanisme kerja pembuatan tempe kedelai dapat dilihat pada lampiran 1. 2. Pembuatan Tempe berbahan biji Buncis dan biji Kecipir Tempe dari bahan buncis dan kecipir, dibuat dari biji buncis dan biji kecipir sebanyak masing-masing 0,5 kg dan diinokulasi dengan 0,5 gram inokulum tempe. Sebelum diinokulasi, biji buncis dan biji kecipir disortir agar didapatkan biji dengan kualitas yang bagus. Biji buncis maupun biji kecipir kemudian direndam selama 3x24 jam, sambil dikupas kulitnya dan diganti air perendamnya sampai tidak berwarna biru (air perendamnya bening). Tujuan dari perendaman adalah untuk menghilangkan bau langu dan menghilangkan zat sianida yang terdapat pada biji buncis dan kecipir. Setelah selesai perendaman dan pengupasan akan dihasilkan biji buncis dan biji kecipir kupas, kemudian dikukus 60 menit, sehingga
lviii
dihasilkan biji kupas yang sudah masak sekaligus relatif steril, untuk selanjutnya diproses lebih lanjut secara fermentasi dengan variasi lama fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari) dan akhirnya dihasilkan tempe. Fermentasi 0 hari adalah biji legum buncis dan kecipir yang sudah di inokulasi dengan ragi, tetapi tidak difermentasikan lebih lanjut. Bagan alir pembuatan tempe berbahan buncis dan kecipir ada pada lampiran 2. 3. Mengekstraksi Isoflavon dengan Metode Maserasi Untuk mengisolasi isoflavon, dapat diuraikan sebagai berikut : Sebanyak 100 g sampel diblender hingga terbentuk bubur, kemudian dimaserasi dalam 250 ml etanol 70 % selama 24 jam, kemudian disaring dan filtratnya ditampung. Residu ditambah dengan 100 ml etanol 70 %, kemudian dimaserasi selama 24 jam, kemudian disaring dan filtratnya ditampung. Residu kedua ditambah dengan 100 ml etanol 70 %. Filtrat hasil maserasi kemudian dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental di oven selama 30 menit dengan suhu 50oC sehingga diperoleh massa hasil ekstraksi, kemudian diidentifikasi isoflavonnya dengan metode HPLC. Mekanisme Isolasi Isoflavon dengan metode maserasi dapat dilihat pada lampiran 3. 4. Identifikasi Isoflavon Adapun mekanisme kerja untuk mengidentifikasi isoflavon dari hasil ekstraksi dengan etanol dari bahan baku legum, dapat diuraikan sebagai berikut : Identifikasi isoflavon dengan menggunakan
metode HPLC dilakukan
dengan pengkondisian instrumen HPLC dan pembuatan larutan sampel. Larutan sampel dibuat dengan mengambil 1 mg massa hasil masing dilarutkan dalam etanol 10 mL.
lix
ekstraksi lalu masing-
Larutan kemudian disentrifuge lalu
diambil 20 µL dengan alat injeksi. Selanjutnya sampel diinjeksikan ke dalam HPLC setelah pengkondisian HPLC selesai. Menganalisa kromatogram HPLC dengan menggunakan pembanding kromatogram isoflavon standar yang terdiri dari daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2.
Adapun kondisi HPLC adalah
sebagai berikut: a. Panjang Kolom
: 10 cm
b. Jenis Kolom
: Lichrosper (R) 100 RP-18 (non polar)
c. Fase Gerak
: metanol : asam asetat 0,02 ( 57,5% ; 42,5%)
d. Volume Injeksi
: 20 µL
e. Detektor
: sinar UV pada panjang gelombang 265 nm
f.
: suhu kamar
Suhu Oven
Mekanisme kerja untuk mengidentifikasi Isoflavon dengan metode HPLC dapat dilihat pada lampiran 4. 5. Uji Aktivitas Antioksidan a. Pembuatan larutan DPPH dengan cara menimbang kristal sebanyak 7,88 mg DPPH dan dilarutkan dalam metanol 100 mL sehingga diperoleh konsentrasi 0,2 mM sebagai larutan kontrol. Pengukuran absorbansi larutan DPPH dilakukan dengan memipet 600 µL pelarut (metanol) ke dalam kuvet dan ditambahkan larutan DPPH sampai volume 3 mL, kemudian ditutup dan dikocok sampai homogen warnanya. Selanjutnya membuat spektra sinar tampak pada panjang gelombang (λ) 400-600 nm dan mencatat absorbannya pada puncak panjang gelombang 517nm sebagai absorban kontrol. Untuk menganalisis adanya senyawa antioksidan dari hasil ekstraksi kedelai kuning Madura, buncis dan kecipir Wonogiri menggunakan metode DPPH. Prosedur yang dikerjakan untuk uji aktivitas antioksidan meliputi :
lx
b. Pembuatan Larutan Sampel, dengan cara menimbang ekstrak sebanyak 2 mg dan melarutkan ke dalam etanol 4 mL untuk membuat larutan uji dengan konsentrasi 100 ppm. Kemudian pengukuran antioksidan bahan uji digunakan metode yang sama, dimana 600 µL pelarut diganti dengan 600 µL larutan uji (sampel). Selanjutnya membuat spektra sinar tampak pada panjang gelombang (λ) 400-600 nm dan mencatat absorbannya pada puncak panjang gelombang mendekati 517nm sebagai absorban sampel. c. Pengukuran Kadar Antioksidan Aktivitas
antiradikal
dihitung
dengan
metode
DPPH
dimana
sampel
direaksikan dengan larutan DPPH. Aktivitas antiradikal diperlihatkan pada sistem yang warnanya berubah dari ungu menjadi kekuningan. Perubahan warna larutan menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH dan dapat diukur dengan perbedaan absorbansi yang dihasilkan pada sampel dibandingkan dengan kontrol.
Aktivitas antiradikal dinyatakan
dalam bentuk persen penangkapan radikal DPPH dan dihitung dengan persamaan ( Yen dan Chen, 1995 dalam Ariani dan Hastuti, 2009). absorbansi sampel % aktivitas antioksidan = ( 1 -
) x 100% absorbansi kontrol
Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas atau antioksidan, sedangkan nilai 100% berarti peredaman total dan pengujian perlu dilanjutkan dengan pengenceran larutan uji untuk melihat batas konsentrasi aktivitasnya.
Mekanisme pembuatan larutan DPPH dan pembuatan larutan
sampel serta uji aktivitas antioksidannya, dapat dilihat pada lampiran 5a. dan 5b.
lxi
E. Teknik Analisa Data Isoflavon yang diperoleh dari hasil ekstraksi, dianalisa jenis-jenis isoflavonnya dengan metode HPLC dengan menggunakan standar isoflavon genistein, daidzein, glisitein dan faktor-2 sebagai pembanding. Instrumen HPLC akan memberikan puncak-puncak kromatogram untuk masing-masing jenis isoflavon. Untuk mengetahui jenis isoflavon dalam sampel, dilakukan dengan membandingkan tr (waktu retensi) dari sampel dengan tr (waktu retensi) standar yang telah diketahui. Dengan membandingkan luas puncak kromatogram sampel dengan luas puncak kromatogram standar, akan diketahui kadar setiap jenis isoflavon dalam sampel. Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan fermentasi pada kedelai, buncis,
dan
antioksidannya,
kecipir
dengan
pengukuran
dan
penghitungan
aktivitas
dianalisa dengan menggunakan program SPSS version 15,
analisa data berupa General Linear Model-Univariete. Untuk membandingkan aktivitas antioksidan pada legum (kedelai, buncis,kecipir) dengan antioksidan alami (α-tokoferol, β-karoten, dan vitamin C) serta
BHT, dianalisa dengan
Compare Means – One Way Annova menggunakan program SPSS version 15.
lxii
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Dalam bab ini, hasil yang di peroleh dari penelitian yang dilakukan akan di tabulasikan dan disertai dengan pembahasan. Urutan hasil penelitian dan pembahasannya akan disusun sebagai berikut : A. Hasil Fermentasi Kedelai, Buncis dan Kecipir Dari fermentasi yang dilakukan pada biji-biji leguminoceae (kedelai, buncis, dan kecipir) dapat diamati bahwa pertumbuhan miselium kapang yang paling optimum untuk ketiga jenis legum adalah fermentasi hari ke 2 dan ke 3. Pada fermentasi hari pertama, pertumbuhan miselium belum banyak dan belum merata, sedangkan fermentasi hari keempat sudah over fermented sehingga kelihatan warnanya berubah dari putih menjadi kuning kecoklatan, kepadatannya menurun dan disertai munculnya aroma amonia (sengak). Dari hasil fermentasi hari ke 2 dan ke 3, tekstur tempe padat dan pertumbuhan miseliumnya paling banyak dan tebal, diduga kandungan senyawa isoflavonnya paling optimum (terutama faktor-2), bila hasil fermentasinya paling optimum diharapkan kandungan isoflavonnya
juga
optimum, menurut hasil
penelitian (Gyorgy et al., 1964) dilaporkan bahwa isofdlavon faktor-2 hanya dijumpai pada kedelai rendam dan hasil fermentasi oleh kapang Rhizopus sp . Fermentasi hari ke 0, merupakan biji legume yang telah mengalami proses perendaman sampai pengukusan dan penambahan inokulum, namun tidak
difermentasikan
lebih
lanjut
(berarti
tidak
muncul
miselium)..
Pada dasarnya, fermentasi hari ke 0 sebenarnya sudah terjadi proses fermentasi awal yang berlangsung di saat perendaman biji, sehingga dimungkinkan telah terjadi perubahan melalui proses hidrolisis senyawa glikosida isoflavon menjadi
lxiii
aglikon isoflavon. Pada proses perendaman juga terjadi proses pembentukan senyawa asam organik yang dilakukan oleh bakteri pembentuk asam, seperti Lactobacillus sp., Streptococcus thermopillus yang ditandai munculnya lendir dan busa serta aroma kecut/asam pada air rendamannya (Kasmidjo, 1990). Fermentasi hari ke 1, sudah muncul miselium berupa serabut-serabut halus tetapi belum tebal dan perlekatan miselium dengan biji-biji belum merata. Selama fermentasi tempe, hifa Rhizopus sp. menembus biji-biji yang keras dan mengambil makanan dari dalam biji tersebut untuk pertumbuhannya. Mula-mula hifa hanya menyebabkan lunaknya biji dengan dorongan mekanis akibat pertumbuhannya, selanjutnya akan diikuti dengan berlangsungnya proses perombakan secara enzimatis. Perubahan kimiawi dalam biji terjadi oleh aktivitas enzim ekstraseluler yang dilepaskan oleh ujung-ujung miselia, antara lain enzim lipase, fitase, proteolitik dan, enzim β-glukosidase (Kasmidjo, 1990; Suwaryono dan Ismeini, 1998). Fermentasi hari ke 4, miselium mulai berkurang yang ditandai dengan perubahan warna dari putih menjadi kuning kecoklatan serta kepadatannya berkurang, walaupun produk fermentasinya bila di iris tidak remuk (pecah), berarti masih ada sisa-sisa miselium kapang di dalam tempe yang melekat pada biji-biji, diperkirakan kandungan isoflavonnya juga mulai berkurang karena berlangsung juga proses penguraian oleh bakteri yang ditandai oleh munculnya bau busuk dan aroma amoniak. Aktivitas enzim lipase akan mendegradasi lemak dalam kedelai menjadi asam-asam lemak yang akan digunakan sebagai sumber energi untuk pertumbuhan Rhizopus sp, sedangkan aktivitas oleh proteolitik dapat merombak protein kedelai menjadi asam amino sebagai sumber nitrogen, kemudian asam amino ini akan masuk kedalam metabolisme intra sel dan
lxiv
akhirnya melepaskan amoniak keluar dari sel. Akumulasi amoniak yang dilepaskan
selama
fermentasi
tempe
dapat
meningkatkan
nilai
pH.
Seiring dengan telah terurainya senyawa yang terkandung dalam kedelai secara keseluruhan oleh aktivitas berbagai enzim yang dihasilkan oleh Rhizopus, maka aktivitas pertumbuhan pun mulai berkurang. Nilai pH yang semakin meningkat akan menghambat pertumbuhan Rhizopus, karena sudah tidak cocok dengan lingkungannya. Peningkatan nilai pH dan penurunan aktivitas pertumbuhan Rhizopus akan membuka kesempatan bagi bakteri penyebab kebusukan untuk tumbuh dan berkembang biak, karena bakteri pembusuk pada tempe dapat hidup pada nilai pH 6-10, diantaranya adalah Bacillus sp. (Suwahyono,1989; Kasmidjo, 1990). Aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri pembusuk akan semakin melunakkan tempe dan menghasilkan banyak akumulasi amoniak dan menimbulkan bau busuk dan sengak.
Untuk lebih
jelasnya, karakterisasi biji legume mentah dan hasil fermentasinya dapat dilihat pada lampiran 7, 8, dan 9.
B. Hasil Ekstraksi Senyawa Isoflavon Ekstraksi isoflavon dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Etanol 70% diketahui mampu mengekstrak isoflavon secara optimal (Kudou et al., 1991).
Etanol merupakan salah satu pelarut optimum
untuk mengekstrak isoflavon dari kedelai, tetapi penggunaanya untuk skala komersial masih dikaji lebih lanjut karena bersifat toksik (Susanto et al.,1998). Dalam penelitian ini menggunakan pelarut etanol karena selain kepolarannya mendekati metanol, etanol juga relatif tidak beracun. Proses penyiapan bahan adalah dengan memotong tempe kedelai hasil fermentasi 1, 2, 3 dan 4 hari dalam ukuran yang tipis, kemudian diblender hingga berbentuk bubur tempe.
lxv
Khusus untuk tempe fermentasi 0 hari, langsung diblender setelah penambahan inokulum. Pembuatan bubur tempe bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga diharapkan senyawa isoflavon yang terekstrak akan semakin banyak karena interaksi antara pelarut dengan bahan yang akan diekstrak semakin tinggi. Bahan mentah dimaserasi dalam pelarut etanol selama 24 jam, selanjutnya filtrat dipisahkan dari residu untuk diproses lebih lanjut menjadi ekstrak yang murni. Pada penelitian ini, maserasi dilakukan dalam pelarut etanol 70%. Etanol merupakan pelarut yang sesuai untuk mengekstrak senyawasenyawa organik (Susanto, 1998). Dari proses maserasi dan penyaringan diperoleh hasil berupa filtrat, kemudian filtrat tersebut diuapkan dengan rotary vacum evaporator pada suhu 500 C sampai didapatkan ekstrak yang pekat atau hampir semua etanol teruapkan.
Pada saat merotari dengan rotary vacum
evaporator menggunakan suhu 500 C, dikarenakan etanol yang digunakan untuk maserasi memiliki titik didih 800 C, sehingga untuk menguapkan etanol secara perlahan-lahan dipanaskan secara tidak langsung (labu ekstrak berputar dipermukaan air dengan suhu dibawah 800 C) agar senyawa-senyawa dalam hasil ekstraksi tidak mengalami kerusakan tetapi etanolnya dapat menguap. Isoflavon diketahui memiliki titik didih diatas 2000C (Ariani dan Hastuti, 2009) sehingga pemanasan dengan suhu 500C tentu tidak akan merusakkan senyawa isoflavon yang terkandung dalam ekstrak. Ekstrak tersebut selanjutnya disimpan dalam oven dengan suhu 500 C untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa. Hasilnya adalah massa hasil ekstraksi seperti yang tercantum dalam gambar grafik berikut ini :
lxvi
Gambar 14. massa hasil ekstraksi biji kedelai kuning dan produk fermentasinya
Gambar 15. massa hasil ekstraksi biji buncis dan produk fermentasinya
Gambar 16. massa hasil ekstraksi biji kecipir dan produk fermentasinya
lxvii
Dari
gambar
diatas
dapat
ditunjukkan,
bahwa
ekstraksi
yang
menghasilkan massa ekstraks dari masing-masing legume (kedelai, buncis dan kecipir) mentah beserta
produk fermentasinya ternyata bervariasi, walaupun
ketiganya tergolong kelompok leguminoceae, Massa hasil ekstraksi yang diperoleh dari biji buncis dan kecipir mentah ternyata lebih banyak daripada produk fermentasinya kecuali pada kedelai. Massa hasil ekstraksi dari biji mentah, terbanyak berasal dari biji kecipir yaitu (3,910 g), kemudian biji kedelai kuning madura (3,422 g) dan paling sedikit diperoleh dari biji buncis sebanyak 2,550 g dari 100 gram sampel yang di ekstraksi. Massa hasil ekstraksi yang diperoleh dari produk fermentasi, jumlah tertinggi pada tempe kedelai dan tempe buncis 4hari, masing-masing (5,192 g) dan (1,241 g), sedangkan tempe kecipir menghasilkan ekstrak tertinggi pada fermentasi 3hari yaitu sebanyak 3,310 g dari setiap 100 g sampel. Hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedelai, buncis dan kecipir beserta produk tempenya ternyata bervariasi, dimungkinkan karena varietasnya, sifat keras atau lunaknya biji, kandungan zat yang ada dalam biji dan kepadatan komponen zat yang ada didalam biji-biji tersebut, juga berbeda walaupun termasuk dalam famili yang sama. Hasil pertanian selalu dipengaruhi oleh faktorfaktor lingkungan seperti tanah tempat tumbuhnya, musim tanamnya, cara pengelolaan tanaman dan pengelolaan hasil panennya. Senyawa yang terekstraksi oleh etanol tentulah senyawa-senyawa yang kepolarannya sama dengan etanol, diantaranya adalah protein, lemak, alkaloid dan yang akan diambil dari sampel penelitian ini adalah isoflavon. Hasil Ekstraksi dari kedelai kuning, buncis, kecipir, beserta produk tempenya dapat dilihat pada lampiran 10.
lxviii
Massa hasil ekstraksi yang diperoleh dari biji buncis dan kecipir mentah berwarna hitam pekat, karena masih banyak mengandung senyawa sianida sedangkan massa hasil ekstraksi dari biji kedelai mentah berwarna coklat tua , kemungkinan kandungan sianidanya relatif lebih sedikit dan akan hilang pada saat dilakukan perendaman dan pengukusan. Proses perendaman dalam air (apalagi air panas) dan perlakuan fermentasi dapat menurunkan kandungan sianida dan asam fitat, karena terjadi hidrolisis asam fitat menjadi inositol dan asam fosfat oleh enzim fitase yang diaktifkan selama perendaman dan fermentasi. Hasil penelitian Samson et al., 1987; Koswara, 1995; Pramita 2008), melaporkan adanya Lactobacillus casei, Streptococcus jaecium, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloaceae, Bacillus brevis dan Bacillus pumilus dalam air rendaman kedelai. Dilaporkan juga bahwa bakteri jenis Bacillus sp mempunyai aktivitas enzim fitase, yang dapat menguraikan asam fitat menjadi inositol dan asam fosfat, sedangkan senyawa HCN dalam biji dapat terhidrolisis disaat perendaman menjadi ion H+ dan CN - . C.Hasil Identifikasi Isoflavon dengan menggunakan Metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Analisis dengan HPLC bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan senyawa isoflavon faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein dalam sampel biji mentah, tempe kedelai, tempe buncis dan tempe kecipir pada variasi lama waktu fermentasi ( 0, 1, 2, 3, dan 4 hari ). Seperti metode kromatografi yang lain, analisis HPLC dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dari senyawa isoflavon standar dengan waktu retensi dari masing-masing sampel. Adanya puncak-puncak yang memiliki waktu retensi relatif sama dengan senyawa isoflavon daidzein, glisitein, genistein dan faktor-2 standar menunjukkan bahwa dalam sampel tersebut terdapat kandungan isoflavon
lxix
daidzein, glisitein, genistein dan faktor-2. Penentuan waktu retensi senyawa daidzein, glisitein, genistein maupun faktor-2 standar, dilakukan pada hari yang sama dengan penentuan waktu retensi dari masing-masing sampel, agar diperoleh kondisi yang sama. Analisis kuantitatif senyawa isoflavon dilakukan dengan cara menghitung luas kromatogram. Konsentrasi senyawa isoflavon faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein dapat diketahui, dengan mengalikan % luas masing-masing senyawa isoflavon dalam kromatogram dengan massa hasil ekstraksi
yang
dihasilkan. Identifikasi isoflavon yang dilakukan pada massa hasil ekstraksi biji kedelai kuning mentah, tidak ditemukan isoflavon faktor-2 tetapi ditemukan daidzein, glisitein, dan genistein, sedangkan dari hasil fermentasinya ditemukan faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein. Identifikasi isoflavon pada massa hasil ekstraksi biji buncis mentah, ditemukan faktor-2, daidzein dan glisitein, sedangkan dari hasil fermentasinya ditemukan faktor-2, daidzein, glisitein, dan genistein. Identifikasi isoflavon pada kecipir mentah ditemukan faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein, sedangkan pada hasil fermentasi kecipir diketahui bahwa isoflavon faktor-2, daidzein, glisitein, dan genistein ditemukan pada hasil fermentasi 0, 2, 3, dan 4 hari, sedangkan pada hasil fermentasi 1 hari tidak ditemukan genistein. Menurut hasil penelitian (Trilaksani, 2003) dilaporkan bahwa isoflavon faktor-2 tidak diketemukan pada biji
kedelai yang tidak
difermentasi, tetapi dari hasil identifikasi penulis di dapatkan bahwa faktor-2 dapat ditemukan pada biji yang belum difermentasi oleh kapang Rhizopus sp. tetapi jumlahnya sangat sedikit (biji kecipir: 0,001g/100 g sampel dan biji buncis:0,006 g/100 g sampel).
lxx
Walaupun belum mengalami fermentasi yang utama (menggunakan inokulum Rhizopus sp), tetapi bila biji itu mengandung air disaat dorman dimungkinkan ada proses hidrolisis dari senyawa glikosida menjadi aglikon yang dilakukan oleh enzim β-glikosidase dalam biji. Dalam kondisi dorman, biji mengandung senyawa glikosida (daidzin, genistin, dan glisitin) dapat terhidrolisis menjadi senyawa isoflavon dalam bentuk aglikon (daidzein, genistein, glisitein, dan faktor-2) serta glukosa oleh enzim ß-glikosidase yang ada dalam biji mentah. Hidrolisis mudah terjadi karena faktor air dan suasana asam, bila waktu penyimpanan biji ada kelembaban dalam waktu yang relatif lama (misalnya disimpan dalam plastik atau disimpan di tempat tertutup) berarti ada faktor air / kelembaban yang dapat mendorong bekerjanya enzim. Selain oleh faktor air, keasaman (pH) 5, merupakan pH optimum bagi enzim ß-glikosidase untuk beraktivitas (Iswandari, 2006). Genistein (bentuk aglikon) pada biji buncis mentah tidak ditemukan, kemungkinan memang tidak terkandung dalam bijinya (yang ada dalam bentuk glikosida), tetapi pada hasil fermentasinya dapat ditemukan, diduga karena adanya aktivitas kapang Rhizopus.
Dalam proses perendaman dan fermentasi
dengan Rhizopus akan dihasilkan enzim ß-glikosidase yang berperan mengubah isoflavon dari bentuk glikosida menjadi bentuk aglikonnya (Koswara,1995). Pada proses perendaman dan fermentasi terjadi pembebasan senyawa aglikon dengan pola yang identik yaitu terlepasnya glukosa dan aglikon isoflavon dari ikatan glikosida, namun demikian pembebasan senyawa aglikon selama proses fermentasi tempe lebih besar bila dibandingkan dengan proses perendaman (Pawiroharsono,1995). Untuk mengetahui konsentrasi kandungan isoflavon, dilakukan perhitungan dengan cara mengalikan besarnya luas % pada
lxxi
kromatogram HPLC dengan massa hasil ekstraksi yang diperoleh. Dibawah ini disajikan tabulasi data konsentrasi isoflavon dari ekstrak etanol kedelai, buncis, dan kecipir mentah beserta produk tempenya. Tabel 4. Konsentrasi Isoflavon pada legume dan produk tempenya dengan variasi lama waktu fermentasi (g / 100 g sampel ) Sampel Legume
Kedelai Kuning Madura
Jenis Isoflavon
0
1
2
3
4
-
0,001
0,083
0,064
0,025
0,058
Daidzein
0,034
0,075
0,442
0,586
0,499
0,632
Glisitein
0,009
0,013
0,085
0,306
0,091
0,232
Genistein
0,136
0,106
0,677
0,856
0,568
0,755
0,179
0,195
1,287
1,812
1,183
1,677
Faktor-2
0,006
0,010
0,016
0,013
0,003
0,003
Daidzein
0,010
0,008
0,011
0,007
0,002
0,003
Glisitein
0,132
0,039
0,008
0,015
0,001
0,002
-
0,026
0,009
0,010
0,016
0,005
0,148
0,084 0,044
0,045
0,022 0,012
Faktor-2
0,001
0,005
0,098
0,001
0,011
0,005
Daidzein
0,145
0,023
0,068
0,007
0,008
0,018
Glisitein
0,008
0,071
0,048
0,228
0,034
0,036
Genistein
0,059
0,095
-
0,131
0,010
0,069
Total
0,212
0,194
0,215
0,367
0,062
0,128
Genistein
Total Kecipir Wonogiri
Fermentasi (hari)
Faktor-2
Total Buncis Wonogiri
Biji Mentah
Dari tabel diatas,dapat ditunjukkan bahwa isoflavon total pada kecipir mentah (0,212 g) ternyata lebih tinggi dari kedelai mentah (0,179 g) dan buncis mentah (0,148 g). Kandungan isoflavon total pada produk fermentasi kedelai
lxxii
dan kecipir yang tertinggi, diperoleh dari fermentasi 2 hari masing-masing (1,812g) dan (0,367g), sedangkan untuk produk fermentasi buncis yang tertinggi diperoleh dari fermentasil 0 hari (0,084 g). Dari 100 g sampel yang digunakan, kandungan isoflavon Faktor-2 yang terbanyak pada kedelai, buncis dan kecipir diperoleh dari fermentasi 1 hari, dan kadar yang dimiliki oleh kecipir (0,098g) sedikit lebih tinggi dari kedelai (0,083g), dan yang paling rendah dijumpai pada buncis (0,016g). Isoflavon Daidzein yang terbanyak pada buncis dan kecipir diperoleh dari fermentasi 1 hari, sedangkan pada kedelai kuning diperoleh dari fermentasi 4 hari. Jumlah daidzein pada kedelai (0,632g) jauh lebih banyak dari yang dimiliki oleh kecipir (0,068g) dan buncis (0,011g).
Isoflavon Glisitein dan Genistein tertinggi pada kedelai dan
kecipir, diperoleh dari fermentasi 2 hari, sedangkan pada buncis diperoleh dari hasil fermentasi 0 hari. Kandungan glisitein pada kedelai (0,036g) lebih tinggi dari kecipir (0,228g) dan buncis (0,039g) dari 100 gr sampel.
Kandungan
genistein pada kedelai (0,856 g), lebih tinggi dari kecipir (0,131 g) dan buncis (0,026 g) dari 100 g sampel, ini berarti pola kecenderungan kandungan isoflavon aglikon pada kedelai dan kecipir hampir sama, hal ini sesuai dengan laporan penelitian Handajani et al., 1983 bahwa kedelai dan kecipir memiliki kandungan senyawa yang hampir sama untuk protein, lemak, karbohidrat, mineral-mineral serta asam aminonya. Dari uraian diatas dapat disimpulkan bahwa kandungan jenis isoflavon pada tempe buncis dan tempe kecipir sama dengan tempe kedelai kuning, terutama hasil fermentasi 0,1,2,3 dan 4 hari, namun kadar isoflavonnya berbeda. Dengan demikian buncis dan kecipir dapat dimanfaatkan sebagai pengganti kedelai yang merupakan sumber isoflavon berkhasiat antioksidan.
lxxiii
Perendaman untuk buncis dan kecipir lebih lama, sehingga pada fermentasi 1 hari sudah ditemukan isoflavon aglikon walaupun aktivitas dan populasi Rhizopus sp belum optimum, diduga aglikon isoflavon sudah terbentuk disaat perendaman. Untuk kedelai ditemukan isoflavon aglikon tertinggi pada fermentasi 4 hari yaitu dalam kondisi over fermented dan sudah terjadi proses pembusukan oleh bakteri-bakteri pembusuk. Dengan demikian, isoflavon aglikon yang ditemukan pada biji dan hasil fermentasinya, dikarenakan oleh aktivitas mikoorganisme disaat perendaman dan pembusukan, serta aktivitas kapang Rhizopus sp, disaat proses pembentukan tempe. Dari uraian diatas dapat disimpulkan bahwa kandungan isoflavon total pada biji kecipir mentah ternyata lebih tinggi dari biji kedelai mentah , dan yang paling sedikit ditemukan pada biji buncis mentah untuk setiap 100 g sampel yang digunakan. Yang dimaksud dengan fermentasi hari ke-0 dalam penelitian ini adalah biji yang sudah direndam selama 3x24 jam, kemudian dipanaskan (dikukus), selanjutnya ditiriskan dan didinginkan, barulah diberi inokulum. Walaupun Rhizopus belum beraktivitas, tetapi disaat perendaman sudah terjadi fermentasi awal yang dilakukan oleh bakteri dari golongan termobakteri seperti Lactobacillus sp, Streptococcus thermopillus dan Enterobacteriaceae yang merupakan bakteri pembentuk asam yang banyak tumbuh pada proses perendaman (Kasmidjo,1990), padahal perendaman untuk biji buncis dilakukan selama 3x24 jam, berarti isoflavon aglikon yang terbentuk diduga berasal dari proses hidrolisis yang dibantu oleh bakteri yang tumbuh dalam air rendaman. Dari data yang diperoleh dapat diartikan bahwa kedelai kuning dan kecipir produk fermentasi, ternyata menghasilkan jenis isoflavon yang sama, tetapi kwantitasnya berbeda. Dalam penelitian ini menggunakan pembanding legume
lxxiv
kedelai, karena sudah diketahui adanya kandungan isoflavon didalam biji kedelai dan produk fermentasinya. Beberapa penelitian melaporkan bahwa kandungan isoflavon pada kacang-kacangan dipengaruhi oleh varietas, waktu panen dan lokasi penanaman (Mazur et al.,1998), waktu tanam (Aussenac et al.,1998), dan kondisi iklim (Tsukamoto et al., 1995). Kondisi pertumbuhan, varietas, lokasi, dan waktu tanam membedakan jumlah senyawa isoflavon (Harbone, 1996). Senyawa isoflavon merupakan senyawa metabolit sekunder yang banyak disintesa oleh tanaman angiospermae (tumbuhan berbiji tertutup). Oleh karena itu, tanaman berbiji merupakan sumber senyawa isoflavon alami disekitar kita. Dari berbagai tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada kelompok tanaman leguminoceae dan tidak terdapat pada organisme seperti bakteri, alga, jamur dan lumut (Markham, 1998). Senyawa metabolit sekunder terbentuk pada saat tidak ada pertumbuhan sel yang dikarenakan keterbatasan nutrient zat gizi dalam medium sehingga merangsang dihasilkannya enzim-enzim yang berperan dalam pembentukan metabolit sekunder dengan memanfaatkan metabolit primer untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya. Polisakarida, protein, lemak dan asam nukleat merupakan penyusun utama dari makhluk hidup, karena itu disebut metabolit primer. Banyaknya kandungan jenis isoflavon pada kedelai kuning, buncis dan kecipir mentah dan produk fermentasi 0, 1, 2, 3, dan 4 hari disajikan pada gambar 16, 17, 18, 19 berikut ini:
lxxv
Gambar 17. Kandungan Isoflavon Faktor-2 pada kedelai kuning, buncis, kecipir.
Gambar 18.Kandungan Isoflavon Daidzein pada kedelai kuning , buncis, kecipir.
Gambar 19. Kandungan Isoflavon Glisitein pada kedelai kuning, buncis, kecipir.
Gambar 20. Kandungan Isoflavon Genistein pada kedelai kuning, buncis, kecipir
lxxvi
Kandungan isoflavon faktor-2 pada kedelai, buncis, dan kecipir hasil fermentasi memiliki kecenderungan hampir sama (kadar tertinggi ditunjukkan dari tempe hasil fermentasi 1 hari), tetapi jumlah faktor-2 dari ketiga legum tersebut secara keseluruhan lebih sedikit bila dibandingkan dengan kandungan daidzein, glisitein dan genistein (Gambar 17 ). Pada kedelai kuning, kandungan isoflavon faktor-2 akan menurun secara landai dan naik kembali pada fermentasi 4 hari. Pada kecipir, terjadi penurunan kandungan isoflavon faktor-2 secara tajam pada fermentasi 2 hari, sedangkan pada buncis ada kenaikan dan penurunan relatif sedikit sehingga garis grafiknya tampak landai. Kadar isoflavon faktor-2 pada ketiga legume relatif sedikit dan naik turun dengan pola yang berbeda karena tempe yang dibuat menggunakan cara tradisional serta penyimpanan dialam terbuka
dan tidak menggunakan inkubator sehingga kontaminasi mikroflora
sangat mungkin terjadi dengan kontaminan yang bervariasi. Kandungan daidzein pada kedelai hasil fermentasi ternyata jauh lebih tinggi bila dibandingkan dengan buncis dan kecipir. Kadar tertinggi pada kedelai diperoleh pada hasil fermentasi 4 hari (Gambar 18). Kadar daidzein yang rendah pada buncis dan kecipir dapat terjadi diduga karena banyaknya senyawa yang terbuang dari buncis dan kecipir disaat proses perendaman (direndam selama 3x24 jam dengan penggantian air setiap 8 jam). Proses perendaman yang lama dimungkinkan terjadi reaksi hidrolisis, yang dilakukan oleh mikroorganisme yang ada diair rendaman dengan dihasilkannya enzim β-glikosidase, sehingga akan terbentuk isoflavon aglikon. Penggantian air rendaman sebanyak 9 kali, memungkinkan terbuangnya
banyak
senyawa
hasil
hidrolisis,
akibatnya
kandungan isoflavon pada buncis dan kecipir hasil fermentasi lebih sedikit bila dibanding kedelai kuning (lama perendaman kedelai kuning 1x24 jam).
lxxvii
Kandungan glisitein dan genistein pada kedelai dan kecipir jauh lebih tinggi bila dibandingkan dengan buncis, tetapi jumlah terbanyaknya memiliki pola yang sama yaitu pada hasil fermentasi 2 hari. Pada buncis mentah ternyata mengandung glisitein yang lebih tinggi daripada hasil fermentasinya, tetapi isoflavon genistein pada buncis mentah tidak ditemukan (Gambar 19 dan 20), diduga senyawa yang ada pada biji mentah masih dalam bentuk glikosida yaitu glisitin. Dari hasil perbandingan ke-empat gambar diatas dapat disimpulkan bahwa kadar isoflavon aglikon (faktor-2, daidzein, genistein dan glisitein) pada buncis dan kecipir lebih rendah bila dibandingkan dengan kedelai kuning, walaupun ketiganya termasuk dalam famili yang sama. Karena berbeda spesies, sehingga masing-masing bijinya memiliki karakter dan kandungan senyawa isoflavon yang tidak sama (Harbone,1996). Selain berbeda spesies, perendaman yang lebih lama pada biji buncis dan kecipir diduga mengakibatkan hilangnya senyawa hasil hidrolisis terutama disaat penggantian air rendaman. Isoflavon faktor-2 pada kedelai kuning tanpa fermentasi tidak ditemukan, hal itu sesuai dengan hasil penelitian Gyorgy et al., 1964; Trilaksani, 2003; Ariani dan Hastuti, 2009), tetapi dari hasil penelitian penulis didapatkan isoflavon faktor-2 dari biji buncis dan kecipir tanpa fermentasi, walaupun kadarnya sangat sedikit (kecipir : 0,001g dan buncis : 0,006 g) dari100 gram sampel. Hal tersebut dapat terjadi diduga ada proses pembentukan isoflavon faktor-2 disaat biji dorman dalam penyimpanan. Bila penyimpanan biji dalam tempat yang tertutup atau berada dalam plastik, maka akan muncul kelembaban dan memungkinkan tumbuhnya mikroorganisme yang akan mendorong terjadnyai proses hidrolisisi, dengan menghasilkan enzim β-glikosidase untuk memecah glikosida dalam biji menjadi senyawa aglikon.
lxxviii
D. Hasil Uji aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidatif dilakukan dengan
metode DPPH melalui
pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Uji aktivitas antioksidan dari penelitian ini terdiri dari biji mentah kedelai kuning beserta produk tempenya, biji buncis mentah beserta produk tempenya serta biji kecipir mentah dan produk tempenya. Metode yang dipilih untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah metode DPPH karena sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Metode aktivitas antiradikal bebas DPPH (2,2 difenil 1 picril hidrazil) merupakan metode terpilih untuk menapis aktivitas antioksidan bahan alam (Molyneux, 2004; Luo et al., 2002; Santosa et al., 1998 dalam Amrun dan Umayah, 2007). Senyawa antioksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH melalui mekanisme donasi atom hidrogen dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke warna kuning. Perhitungan persentase (%) peredaman DPPH oleh massa hasil ekstraksi biji kedelai kuning, buncis, dan kecipir beserta produk fermentasinya ditampilkan pada lampiran 9. Hasil identifikasi isoflavon dan uji aktivitas antioksidan dari sampel biji kedelai, buncis dan kecipir beserta hasil fermentasi 0, 1, 2, 3 dan 4 hari terangkum dalam tabel dibawah ini.
lxxix
Tabel 5. Kandungan Isoflavon Total ( g ) dan Aktivitas Antioksidan ( % ) pada Kedelai Kuning, Buncis, Kecipir, dengan Variasi Lama Fermentasi ( hari )
Sampel
Kedelai Kuning
Buncis
Kecipir
Kadar Isoflavon dan aktivitas Antioksidan Isoflavon total ( g ) Aktivitas Antioksidan (%) Isoflavon total ( g ) Aktivitas Antioksidan (%) Isoflavon total ( g ) Aktivitas Antioksidan (%)
Lama Fermentasi
Biji Mentah
0 Hari
1 Hari
2 Hari
3 Hari
4 Hari
0,179
0,195
1,287
1,812
1,183
1,677
67,453e 75,683ef 76,310f 76,056ef 81,430g 77,140f 0,148
0,084
0,044
0,045
0,022
0,012
52,813b
52,956b
39,536a
41,366a
0,212
0,194
0,215
0,367
0,062
0,128
70,826d
85,196h
76,923f
84,926h
76,973f
73,893e
51,893b 51,186b
Keterangan: angka yang diikuti oleh superskrip yang sama, menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95% (α =0,05)
Pada kedelai kuning dan kecipir, isoflavon total terbanyak ditunjukkan oleh hasil fermentasi 2-hari, tetapi aktivitas antioksidan tertinggi pada kedelai kuning dan kecipir masing-masing ditemukan pada hasil fermentasi 3-hari dan 0-hari. Isoflavon total tertinggi pada buncis ditunjukkan oleh biji mentah dan aktivitas antioksidan tertinggi ditemukan pada hasil fermentasi 0-hari. Dari data tersebut, bila dihubungkan antara aktivitas antioksidan dengan kandungan isoflavon totalnya dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan yang tinggi tidak selalu dikarenakan oleh adanya kandungan isoflavon yang banyak. Pada buncis dan kecipir ditemukan aktivitas antioksidan yang tertinggi pada hasil fermentasi 0-hari, tetapi tidak lazim orang mengkonsumsi tempe yang belum jadi (belum muncul miselium) sehingga walaupun aktivitas antioksidannya paling tinggi namun tidak layak dikonsumsi untuk sumber antioksidan. Pada hasil fermentasi
lxxx
kecipir 2-hari diketahui aktivitas antioksidannya juga tinggi (84,926%), sehingga tempe hasil fermentasi 2-hari dapat dikonsumsi oleh manusia sebagai sumber antioksidan. Dari analisis statistik Program SPSS, dapatlah disimpulkan bahwa aktivitas antioksidatif pada kedelai dan kecipir hasil fermentasi, ternyata lebih tinggi dari kedelai dan kecipir tanpa fermentasi (mentah). Dari tabel diatas dapat diketahui juga bahwa, besarnya aktivitas antioksidan pada kedelai hasil fermentasi 1-hari tidak berbeda nyata dengan fermentasi 4-hari, hasil fermentasi 0-hari
tidak berbeda nyata dengan fermentasi 2-hari, tetapi berbeda nyata
dengan hasil fermentasi 3-hari. Besarnya aktivitas antioksidan pada buncis, hasil fermentasi 0-hari, 3-hari, 4-hari tidak berbeda nyata dengan buncis tanpa fermentasi. Pada kecipir tanpa fermentasi berbeda nyata dengan hasil fermentasinya, tetapi hasil fermentasi 0-hari dan 2-hari serta fermentasi 1-hari dan 3-hari tidak signifikan. Aktivitas antioksidatif pada tempe buncis yang paling tinggi adalah hasil fermentasi 0-hari (±52,96%), kemudian 3-hari (±51,89%), 4-hari (±51,19%), 2-hari (±41,37%) dan yang terendah adalah hasil fermentasi 1-hari yaitu sebesar (±39,54%) ; sedangkan aktivitas antioksidatif untuk tempe kecipir yang paling tinggi adalah hasil fermentasi 0-hari yaitu (±85,20); kemudian 2-hari (±84,93%); 3-hari (±76,97%); 1-hari (±76,92%) dan yang paling rendah adalah hasil fermentasi 4-hari (±73,89%). Dari hasil penelitian yang di uraikan diatas, dapatlah ditarik kesimpulan bahwa tingkat aktivitas antioksidatif dari biji kecipir mentah dan hasil fermentasinya ternyata tergolong tinggi, yaitu berkisar antara ±73,89 % sampai dengan ±85,20%. Untuk kedelai kuning, tingkat aktivitas antioksidatifnya berkisar antara ±68,64% sampai dengan ± 81,43 %, berarti lebih rendah dari kecipir dan
lxxxi
produk fermentasinya. Tingkat aktivitas antioksidatif dari biji buncis dan produk fermentasinya ternyata lebih rendah (±39,54% s/d ±52,96% ) bila dibanding dengan kedelai kuning. Pada kecipir mentah maupun hasil fermentasinya memiliki kandungan isoflavon yang relatif rendah bila dibandingkan dengan kedelai kuning, tetapi aktivitas antioksidannya tinggi. Ini dapat diartikan bahwa, walaupun senyawa isoflavon pada kecipir mempunyai kemampuan sebagai antioksidan, tetapi senyawa antioksidan itu tidak hanya isoflavon, dimungkinkan di dalam kecipir terdapat senyawa-senyawa flavonoid dan alkaloid lain (selain isoflavon) tetapi juga memiliki kemampuan sebagai antioksidan, bahkan telah lama diyakini oleh sebagian masyarakat kita bahwa kecipir (baik biji maupun buahnya) memiliki khasiat obat. Dari uraian diatas dapat disimpulkan bahwa, aktivitas antioksidan yang tinggi tidak selalu dikarenakan oleh kadar isoflavon yang tinggi, dan total isoflavon terbanyak tidak secara otomatis memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Proses yang terjadi selama pengolahan biji legume menjadi tempe adalah adanya reaksi hidrolisis yang berlangsung disaat perendaman biji bahan baku, proses fermentasi Rhizopus disaat inokulum bekerja pada substrat, proses pembusukan oleh bakteri yang terjadi pada tempe over fermented, hasil fermentasi 4 hari. Pada tempe buncis dan kecipir, aktivitas antioksidan yang maksimum diperoleh dari hasil fermentasi 0-hari, dimungkinkan karena perendaman pada biji buncis dan kecipir dilakukan selama 3 x 24 jam sehingga pada perendaman yang lama tersebut akan terjadi proses hidrolisis yang lebih besar bila dibanding dengan kedelai kuning (lama perendaman hanya 24 jam). Enzim β-glikosidase yang dihasilkan oleh mikroorganisme disaat proses perendaman, akan
lxxxii
melakukan pemecahan senyawa glikosida dalam biji menjadi aglikon dan glukosa dan dapat berlangsung lebih dominan. Kecipir hasil fermentasi 0hari diperoleh kadar isoflavon sebanyak ±0,194g/100g sampel dan kadar isoflavon tertinggi diperoleh setelah berlangsung proses fermentasi 2 hari ±0,367 g/100 g sampel, ini berarti selama Rhizopus bekerja pada substrat akan dihasilkan enzim β-glikosidase yang akan memecah glikosida menjadi aglikonnya sehingga akan menambah jumlah senyawa isoflavon aglikon. Pada hasil fermentasi 4-hari sudah mulai terjadi pembusukan pada tempe yang ditandai dengan munculnya aroma busuk dan amonia yang menyengat, dikarenakan adanya aktivitas mikroorganisme. Aktivitas antioksidatif dari biji
kedelai kuning, buncis, dan kecipir bila
dibandingkan dengan aktivitas antioksidan α-tokoferol, ß-karoten, vitamin C, maupun BHT (Butyl Hidroksitoluena) yang merupakan antioksidan sintetis, dapat dicermati pada gambar grafik berikut ini :
Gambar 21. Perbandingan aktivitas antioksidan alami, sintetis dan legume
lxxxiii
Bila dibandingkan dengan antioksidan alami (α-tokoferol, ß-karoten dan vitamin C) ternyata aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh kecipir dan produk tempenya jauh lebih tinggi. Aktivitas antioksidatif β-karoten sebesar ± 43,25%; vitamin C (± 75,62%), α-tokoferol (76,41 %), BHT (81,15%) dan kedelai (81,43%), sedangkan kecipir fermentasi 0 hari tingkat antioksidatifnya mencapai (± 85,19%). Selain itu, aktivitas antioksidatif pada kecipir hasil fermentasi 2 hari (± 84,93%), juga lebih tinggi dari pengawet sintetis BHT. Dengan demikian, kecipir dan hasil fermentasinya dapat digunakan sebagai sumber antioksidan alami yang prospektif, karena keberadaannya melimpah di Indonesia. Aktivitas antioksidatif pada buncis fermentasi 0 hari sebesar ± 52,95%, berarti masih lebih tinggi dari β-karoten tetapi lebih rendah dari antioksidan BHT, vitamin C dan α-tokoferol. Dengan demikian, buncis dan produk tempenya tidak dapat digunakan sebagai pengganti BHT. Untuk mengetahui perbandingan aktivitas antioksidan pada buncis, kecipir, dan kedelai dengan antioksidan alami yang sudah ada (α-tokoferol, vitamin C dan β-karoten) serta antioksidan sintetis dapat disajikan dalam tabel dibawah ini: Tabel 6. Perbandingan Aktivitas Antioksidan Alami, Sintetis dan Legum (%) Sampel
Aktivitas Antioksidan
Betakaroten
43,2533
a
Tempe buncis (0 hari)
52,9567
b
Vitamin C
75,6200
c
Alfatokoferol
76,4100
c
BHT
81,1567
d
Tempe kedelai kuning (3 hari)
81,4300
d
Tempe kecipir (0 hari)
85,1967
e
Keterangan: Angka yang diikuti oleh superskrip yang sama, tidak menunjukkan beda nyata pada taraf kepercayaan 95% (α : 0,05)
lxxxiv
Aktivitas antioksidan dari kecipir bila dibandingkan dengan antioksidan alami (vitamin C, ß-karoten, α-tokoferol), dan BHT ternyata menunjukkan perbedaan yang signifikan dan lebih besar, sedangkan
aktivitas antioksidatif
pada buncis walaupun lebih rendah secara nyata dengan BHT tetapi lebih tinggi bila dibanding dengan β-karoten, sehingga legum Kecipir dapat digunakan sebagai pengganti BHT tetapi legum Buncis
tidak dapat digunakan sebagai
pengganti BHT. Penggunaan pengawet sintetis BHT dalam skala luas dimasyarakat dapat menimbulkan dampak buruk bagi kesehatan, seperti gangguan fungsi hati, paruparu, mukosa usus bahkan bersifat meracuni (Suryo dan Tohari, 1995), oleh karena itulah maka legume kecipir sangatlah potensial untuk dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami yang dapat digunakan untuk pengawet alami. Kedelai digunakan sebagai pembanding, dengan pertimbangan bahwa kedelai dan produk tempenya secara paten dan positif telah diketahui memiliki manfaat sebagai antioksidan alami dan sumber isoflavon yang sudah tidak diragukan, yang diperoleh dari beberapa hasil penelitian (Astuti, 1995 dan Pawiroharsono, 1995). Buncis sebagai jenis legume , walaupun kemampuan antioksidannya rendah tetapi masih dapat dimanfaatkan sebagai sumber isoflavon yang berkhasiat, sekaligus sebagai bahan pangan sumber protein dan mineral yang potensial bagi pemenuhan gizi masyarakat. Hasil pengukuran dan perhitungan besarnya aktivitas antioksidan dari kedelai, buncis, kecipir dan antioksidan alami (α-tokoferol, β-karoten, vitamin C) serta antioksidan sintetik BHT dapat dilihat pada lampiran 6.
lxxxv
BAB V PENUTUP A. Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disusun kesimpulan sebagai berikut : 1. Kecipir, Buncis dan produk fermentasinya memiliki potensi sebagai sumber antioksidan alami yang prospektif dan mengandung senyawa isoflavon faktor-2, daidzein, glisitein dan genistein. Total isoflavon terbanyak pada kedelai dan kecipir ditemukan pada hasil fermentasi 2-hari, sedangkan pada buncis ditemukan pada hasil fermentasi 0-hari 2. Lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak yang mengandung isoflavon dengan aktivitas antioksidan maksimum pada tempe kedelai kuning ditemukan pada hasil fermentasi 3-hari (sebesar 81,43 %) dan tempe koro buncis serta koro kecipir ditemukan pada hasil fermentasi 0-hari, masing-masing 52,95 % dan 85,19 %. 3. Aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh kecipir dapat digunakan sebagai pengganti BHT, kedelai kuning, α-tokoferol, β-karoten maupun vitamin C, sedangkan aktivitas antioksidan pada buncis hanya dapat menggantikan β-karoten .
lxxxvi
B.Saran Dari hasil penelitian yang diperoleh, penulis memberikan saran sebagai berikut : 1. Perlu dilakukan penelitian secara in vivo mengenai manfaat senyawa bioaktif yang terdapat dalam kecipir, maupun penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa-senyawa lain (selain isoflavon) yang terkandung dalam kecipir dan berpotensi sebagai antioksidan. 2. Senyawa bioaktif isoflavon dari buncis dan kecipir dapat dimanfaatkan sebagai food suplement dan sebagai pengawet alami. 3. Biji kecipir dan produk fermentasinya dengan Rhizopus sp. dapat disosialisasikan kepada masyarakat untuk dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami.
lxxxvii
DAFTAR PUSTAKA
Aldercreutz H. 1998. Epidemiology of phytoestrogens. Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 12: 605-623 Amrun,H; Umiyah dan Umayah E.U. 2007. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Beberapa Varian Buah Kenitu (Chrysopylum cainito L) dari Daerah Jember.. Jurusan Biologi Universitas Jember. Anderson JJB, Carner SC. 1997. The effect of phytoestrogens on bone. Nutr.Res. 17: 1617-1623. Ariani,S.R.D. dan Hastuti W. 2009. Analisis Isoflavon dan Uji Aktivitas Antioksidan pada Tempe dengan Variasi Lama Waktu Fermentasi dan Metode Ekstraksi. FKIP UNS Surakarta. Astawan M. 2004. Sehat Bersama Aneka Serat Pangan Alami. Tiga Serangkai. Solo Astuti, Mary. 1995. Tempe dan Antioksidan Prospek Pencegahan Penyakit Degeneratif. Yayasan Tempe Indonesia. Atikoh dan Supriyanti.1997. Perlakuan Perendaman, Pengukusan, Prebusan serta Kombinasinya terhadap Kandungan asam Fitat dan anti Kemotripsin pada Kacang Tholo dan Gude. Skripsi S1. UGM. Yogyakarta. Aussenac T, Lacombe S, Dayde J. 1998. Quantification of isoflavones by capillary zone electrophoresis in soybean seeds : effects of variety and environment. Am. J. Clin. Nutr. (68):1480-1485. Barz, W. and Papendorf. 1991. Metabolism of isoflavones and formation of factor-2 by tempeh producing microorganism.Tempeh Workshop, Cologne. 20 May 1991. Barz, W., Heskamp, Klus,K.,Rehms, H and Steinkamp,R. Recent Aspect of Protein, Phytate and Isoflavone Metabolism by Microorganisms Isolated from Tempe Fermentation. Tempe Workshop. Jakarta. 15 February 1993. Chang, S.S., Bostric-Matijasevic, O.A.L. Hsieh and C.L. Huang, 1977. Natural Antioxidants from Rosemary and Sage. J.Food Sci.42:574 Coward L, Barnes NC, Setchell KDR, Barnes S. 1993. Genistein, daidzein, and their ß-glycoside conjugates: antitumor isoflavones in soybean food from American and Asian diets. J. Agric. Food Chem. 41: 1967.
lxxxviii
Dian Sri Pramita. 2008. Pengaruh Teknik Pemanasan Terhadap Kadar Asam Fitat dan Aktivitas Antioksidan Koro Benguk (Mucuna pruriens), Koro Glinding (Phaseolus lunatus), dan Koro Pedang (Canavalia ensiformis ). Skripsi. Fakultas Pertanian UNS. Surakarta. Fujimaki. 1968. Fundamental Investigation of Proteolytic Enzim Aplication to Soybean Protein Inrelation Flavour. Tokyo University. Tokyo. Goldberg I. 1996. Functional Foods : Designer nutraceuticals. London : Chapman & Halll, Inc.
foods,
pharmafoods,
Gyorgy P, Murata K, Ikehata H. 1964. Antioxidant isolated from fermented soybeans (tempeh). Nature, 203 (4947), 870-871. Handajani S dan Bukle. 1991. Characteristic of Winged Bean (Psopocarpus tetragonolobus) seed. PhD Thesis, Universitas of New South Wales, Kensington, Australia. Handajani S dan Windi Atmaka. 1993. Analisa Sifat Phisis-khemis Beberapa Biji Kacang-kacangan, Kekerasan, Kualitas Tanak, Protein, dan Kandungan Mineralnya. Lembaga Penelitian UNS. Surakarta. Handajani S, Supriyono, Triharjanto, Marwanti S, Astuti D, Pujiasmanto B. 1996. Pengembangan Budidaya dan Pengolahan Hasil Kacang-kacangan Sebagai Usaha Produktif Wanita Di Lahan Kering Daerah Tangkapan Hujan Waduk Kedung Ombo. Lembaga Penelitian UNS. Surakarta. Harborne JB. 1996. The Flavonoid : Advances in research since 1986. London : Chapman & Hall, Inc. Hery Winarsi. 2007. Antioksidan Alami & Radikal Bebas. Kanisius, Yogyakarta. Hesseltine, C.W. 1985. Genus Rhizopus and Tempeh Microorganisms. Asian Symposium Non-Salted Soybean Fermentation. Tsukuba, Japan. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia (Jilid 3). Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan. Departemen Kehutanan, Jakarta : Yayasan Sarana Wana Jaya. Terjemahan dari : De Nuttige Planten Van Indonesie. Hidayati WB. 2003. Peran Isoflavon Untuk Kesehatan Reproduksi Wanita. Cermin Dunia Kedokteran 139 : 49-50. Hodgson, E and P.E.Levi. 2000. A Textbook of Modern Toxicology. Elsevier, New York. Iswandari R. 2006. Studi Kandungan Isoflavon Pada Kacang Hijau. IPB. Bogor.
lxxxix
Judoamidjojo M, Darwis AA, Gumbira. 1992. Teknologi Fermentasi. Jakarta : Rajawali Press. Kanetro B, Hastuti S. 2006. Ragam Produk Olahan Kacang-Kacangan. Universitas Wangsa Manggala Press. Yogyakarta. Kasmidjo, R.B. 1990. Tempe: Mikrobiologi dan Biokimia, Pengolahan Serta Pemanfaatannya. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. UGM Yogyakarta. Koswara, S. 2006. Isoflavon, Senyawa Multi Manfaat Dalam Kedelai. Ebookpangan.com, Bogor. Kudou.S, Y.Fleury, D.Welti, D.Magnolato, K.Kitamura and K.Okubo. 1991. Malonyl Isoflavone Glycosides in Soybeans Seed (Glycine max Merril). Agric. Biol. Chem. 55: 2227-2233. Lindajati, T. 1985. Large Scale Tempe Inoculum Production. Asian Symposium on Non salted Soybeans Fermentation, Tsukuba, Japan, July 14-16, 1985. Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung : Penerbit ITB.
Mazur WM, Duke JA, Wahala K, Rasku S, Adlercreutz H. 1998. Isoflavonoids and lignans in legumes : nutritional and health aspects in humans. J Nutr Biochem 9: 193-200. Messina MJ. 1991. The role of soy products in reducing risk of cancer. Journal NCL. 83(3) : 541-546. Meydani, S.N, D. Wu, Santos, Hayek. 1995. Antioxidants and Immune Response in Aged Persons. Clinical Nutrition. 62 (6):1462-1476. Meyri Sulasmi. 2003. Aktifitas Antioksidatif Ekstrak Tempe Hasil Fermentasi Rhizopus oryzae Terhadap Oksidasi Minyak Kedelai. Skripsi. FMIPA. UNS Surakarta. Nuraida, L. dan S. Yasni. 1998. Kajian Gizi Produk Olahan Kedelai. Prosiding Seminar Pengembangan Pengolahan dan Penggunaan Kedelai selain Tempe. Kerjasama Pusat Studi Pangan dan Gizi-IPB dengan American Soybean Association. Bogor. Pawiroharsono S. 1995. Metabolisme Isoflavon dan Faktor 2 (6,7,4’ trihidroksi isoflavon) pada Proses Pembuatan Tempe. Makalah Simposium Nasional Pengembangan Tempe dalam Industri Pangan Modern, Yogyakarta, 15-16 April.
xc
Pawiroharsono, S.1998. Benarkah Tempe Sebagai Anti Kanker. Jurnal Kedokteran dan Farmasi MEDIKA. 12: 815-817 Pratt, D.E. and B.J.F. Hudson. 1990. Natural Antioxidans not Exploited Comercially. Didalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. Elsevier Applied Science. London. Purwoko, T; S.Pawiroharsono dan I.Ginandjar. 2001. Biotransformasi Isoflavon oleh Rhizopus oryzae UICC 524. BioSMART, 3(2), 36-39. Restuhadi, F. 2001. Studi Pendahuluan Biokonversi Isoflavon Pada Proses Fermentasi Kedelai Menggunakan Rhizopus sp. Tesis. Bandung. Magister Kimia ITB. Rubatzky V.E, Yamaguchi M.1998. Sayuran Dunia : Prinsip, Produksi dan Gizi Jilid II. (diterjemahkan oleh Catur Herison). ITB Bandung. Salunkhe D. K., and Kadam S.S. 1990. Handbook of world food legumes : Nutritional chemistry, processing tecknology, and utilization. Vol.1. CRC Press, Boca Raton, FL. Schultze, J.E. 1984. R. Hansel and V.E. Tayler. Rational Phytotherapy A Physician’s Guide to Herbal Medicine. Springer Verlag, Heidelberg. Setchell KDR, Aedin C. 1999. Dietary Isoflavones : biological effects and relevance to human health. J. Nutr. 129: 767-785 Setchell KDR. 2001. Bioavailability of pure isoflavones in healthy humans and analysis of commercial soy isoflavone supplements. J.of Nutrition. 131: 362-1375. Shahidi,F. and Naczk. 1995. Food Phenolic. Technomic pub.Co. Inc. LancesterBas.
Soeatmaji, D.W.1998. Peran Stress Oksidatif dalam Patogenesis Angiopati Mikro dan Makro DM. Medica.5 (24) : 318-325 Somaatmojo et al., 1985. Kedelai. Badan Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Bogor. Sri Kumalaningsih, 2006. Sumber, Manfaat, dan Penyajian Antioksidan Alami. Trubus Agrisarana. Jakarta. Suryo dan Imam Tohari. 1995. Aktivitas Antioksidan Buah Jambu Mete dan Penerapannya pada Abon. Biosains. 1(7): 50-61
xci
Susanto T, B Zubaidah, S.B.Wijanarko.. 1998. Studi Tentang Aktivitas Antioksidan pada Tempe Terhadap Lama Fermentasi, Jenis Pelarut dan Ketahanan Terhadap Proses Pemanasan. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya Malang. Suwahyono,U. 1989. Ringkasan Makalah Kongres Nasional V. Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia. Yogyakarta. 4-6 Desember. 107-267. Suwaryono,O dan Ismeini,Y.1988. Fermentasi Bahan Makanan Tradisional. PAU Pangan Gizi..22-25. Taher A. 2003. Peran fitoestrogen kedelai sebagai antioksidan dalam penanggulangan aterosklerosis (tesis). Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Trilaksani, W. 2003. Antioksidan : Jenis, Sumber, Mekanisme Kerja dan Peran terhadap Kesehatan. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Tsukamoto C, Shimada S, Igita K, Kudou S, Kokubun M, Okubo K, Kitamura K. 1995. Factors affecting isoflavones content in soybean seeds : changes in isoflavones, saponins, and compotition of fatty acids at different temperatures during seed development. J. Agric. Food Chem. 43:11841192. Wang H, Murphy PA. 1994. Isoflavon compotition of American and Japanese soybeans in lowa : effects of variety, crop year, and location. J. Agric. Food Chem. 42 : 1674-1677. Ziliken, F.I. 1987. Production of Novel Isoflavons. Material Meeting. BMBF, Bonn, Germany. Zuheid, Noor.1989. Senyawa Antigizi (skripsi). Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
xcii
