Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie
Obsah 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Úvod Principy HPLC Instrumentace Úprava vzorku Analýza drog a jejich metabolitů Závěry
1. Úvod GC – obvykle vyžaduje derivatizaci, bezvodé vzorky HPLC - doplňuje a nyní i nahrazuje GC Výhody – 85 % všech látek lze stanovit (tepelně labilních, polárních, nízko- i vysokomolekulárních), přímá analýza bez derivatizace – časová úspora, přímý nástřik vodných vzorků Ve spojení s citlivou detekcí – MS – možnost identifikace a kvantifikace Nevýhody: pomalá difúze v kapalinách, nižší účinnost než GC, vyšší finanční náklady na analýzu (nákladnější přístroj, rozpouštědla)
2. Principy HPLC • Mobilní fáze:
kapalina složení mobilní fáze ovlivňuje separaci • Stacionární fáze: chemicky vázané fáze adsorbenty měniče iontů gely (pro SEC) afinitní fáze Vysoká účinnost a rychlost analýzy – vysoké tlaky a malé částice s jednotnou velikostí, homogenně naplněné v koloně
Chromatogram (kvalita, kvantita, účinnost separace) tR – retenční čas, t´R – redukovaný čas, plocha nebo výška píku, w – šířka píku
Závislost H na lineární průtokové rychlosti mobilní fáze u H (výškový ekvivalent teoret. patra) = L/n n (počet pater) = 16(tR/w)2 H
A + B/u + Cu
B/u Cu A
u
Závislost H na velikosti částic Čím < velikost částic, tím < H a tím > účinnost separace
8 m 5 m 3 m
2 m
Volba kolony Náplně: • zcela porézní částice 2- 10 m, velikost pórů 10 – 50 nm, pravidelného kulovitého tvaru, homogenně naplněné v koloně • pelikulární – polopropustné (nepropustné jádro, tenká pórovitá vrstva • nepórovité – rychlá sorpce, malá zátěž, póry 0,2 – 0,4 nm nedostupné pro solut • monolitické kolony, vtištěné polymery Specifický povrch zátěž (dávkování) póry 10 nm 170 m2 30 nm 100 m2 nepórovité 0,6 – 6 m2/g
Miniaturizace ( HPLC) Zmenšování velikosti částic a průměru kolony Výhody: • snížení spotřeby a odpadu rozpouštědel, stacionární fáze a vzorku • vyšší účinnost separace • vyšší citlivost detekce • kompatibilita s MS detekcí Průměr kolony 4,5 mm 1 mm 0,25 mm
Průtok 1 mL/min 0,047 mL/min 0,003 mL/min
Chemicky vázané fáze • Univerzální, vhodné pro biologické vzorky, rychlé ustavování rovnováhy- vysoká separační účinnost • Nosič (silikagel, organický polymer) s navázanými funkčními skupinami: alkyly, zejména oktyl, oktadecyl, fenyl – nepolární (reverzní) fáze – nejvýznamnější (RPLC) normální fáze – polární – méně používané iontově výměnné skupiny -SO3H, - COOH, -NH2, -N+(R)3 chirální stacionární fáze (cyklodextriny a další)
Struktura chemicky vázaných fází
Mobilní fáze • Mobilní fáze není inertní, ovlivňuje separaci • Možnosti změny složení mobilní fáze jsou prakticky neomezené • Obecné požadavky: dobrá rozpustnost pro soluty, kompatibilita s detekcí (UV hrana), toxicita, viskosita, těkavost • reverzní fáze – voda + organická rozpouštědla (pufry, pH, iontově párová činidla…) retence (log k) ~ obsah org. rozpouštědla • nepolární fáze – nepolární organické rozpouštědlo + polární modifikátor (<1 %) • měniče iontů – pufry Izokratická vs. gradientová eluce (obdoba programování teploty v GC)
Derivatizace • Derivatizací měníme fyzikální a chemické vlastnosti analytů. Hlavní důvody pro převedení analytů na deriváty jsou tyto: • zlepšení detekovatelnosti (nejčastěji v kombinaci s fluorescenčním detektorem) • zvýšení těkavosti (v GC) • zlepšení chromatografických vlastností (např. změna polarity), • zlepšení stability analytů, • umožnění chirální separace, • změna matrice pro lepší separaci.
Kvalitativní analýza k = (tR – tM) /tM
(retenční poměr)
r12 = 12 = t´R2/t´R1 = k2/k1 (relativní retence, selektivita) Reprodukovatelnost: složení mobilní fáze, pracovní teplota, příprava stacionární fáze
Kvantitativní analýza Zdroje chyb: • • • •
Odběr reprezentativního vzorku Úprava vzorku (nejvýznamnější) Dávkování (1-2 %) Stacionární fáze
• Instrumentace, zpracování signálu a interpretace
Pracovní techniky při vyhodnocování chromatogramů • Vnitřní normalizace:
A – plocha m – množství Vi, Vs – objemy při ředění vi,vs – dávkované objemy vzorku a stand. RMR – relativní mol. odezva
xi = (Ai / Aj ) 100
• Absolutní kalibrace mi = (Ai/As) ms • Vnitřní standardizace
mi = (RMRsr/RMRir) (Ai/As) (Vs/ Vi) ms • Metoda standardního přídavku mi
Vs ms Vi Ais vi V 1 s Ai vis Vi
1
3. Instrumentace Blokové schéma chromatografu 1 - zdroj mobilní fáze, 2 – čerpadlo, 3 – dávkovač, 4 - kolona, 5 - detektor, 6,7 - zařízení pro zpracování signálu detektoru
• Zásobník m.f. – uzavřená nádoba, odplynit • čerpadla – bezpulzní, vysokotlaká, průtoky od l/min po mL/min • dávkovače – smyčkové (vzorky v l) automatické dávkovače • kolony – preparativní či analytické, náplňové i kapilární, vnitřní průměr od desítek m po jednotky mm, nerezové či skleněné • detektory – spektrofotometrický (diode-array) refraktometrický, elektrochemický, fluorescenční, hmotnostní • vyhodnocovací zařízení
Čerpadlo reciprokační
Schéma šesticestného dávkovacího ventilu se smyčkou a - plnění smyčky, b - vymývání smyčky do kolony 1, 4 - připojení smyčky, 2 - přívod mobilní fáze od čerpadla, 3 připojení kolony, 5, 6 - odpad; nástřik v poloze 4
Kolony: • • • •
náplňové 3 – 5 mm, ~ 1 mL/min mikronáplňové ~ 1 mm, ~ 20 - 60 L/min kapilární ~ 10 m, ~ nl/min Materiály: silikagel (pH 2-8, endcapping) alumina (pro bazické látky) organické polymery Monolitické kolony Vtištěné polymery
Monolitické kolony • až 97 % objemu kolony zaujímá stacionární fáze (oproti ca 70 % u náplňových kolon) • vyšší účinnost separace • velká porozita vysoký průtok, rychlé analýzy makropóry – 2 m mesopóry – 13 nm
velký průtok, malý tlakový spád velký povrch pro sorpci analytů
• na bázi silikagelu nebo organických polymerů
Detektory • UV/VIS – nejběžnější, s diodovým polem (DAD), téměř univerzální • fluorescenční – citlivý, selektivní, derivatizace • elektrochemický- citlivý i selektivní, omezené použití • hmotnostní – nejvyšší vypovídací schopnost (kvalita i kvantita), vysoká citlivost a selektivita
UV/VIS detektor
(a) schéma, (b) uspořádání mřížky
Schéma fluorescenčního detektoru 1, 2 - vstup a výstup mobilní fáze, 3 - excitační záření, 4 - emitované záření, 5 - vnější plášť cely, 6 - optický systém, 7 - cela (5 l), 8 - držák
Blokové schéma hmotnostního spektrometru
• Iontový zdroj - převedení analytu do ionizovaného stavu, fragmentace. • Hmotnostní analyzátor rozděluje v prostoru nebo čase směs iontů o různých poměrech hmotnosti ku náboji (m/z), produkovanou v iontovém zdroji. • Detektor poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. • Po digitalizaci převeden do počítače a zpracován do hmotnostních spekter. • Hmotnostní spektrometr pracuje za velmi nízkých tlaků - výkonný vakuový čerpací systém. • Vstup umožňující převedení vzorku do iontového zdroje. • GC-MS nebo HPC-MS vhodné rozhraní (interface) snižující podíl mobilní fáze
Iontové zdroje • Ionizační energie 7-16 eV • Výtěžek ionizace kolem 0,01% • Ionizační techniky měkké (nízká fragmentace) a tvrdé (vysoká fragmentace)
GC • Ionizace elektronem (electron ionization, EI) • Chemická ionizace (chemical ionization, CI)
HPLC Sprejové ionizační techniky v kapalné fázi, měkké • termosprejová ionizace (thermospray, TS) • elektrosprejová ionizace (electrospray, ES) • chemické ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure chemical ionization, APCI )
Schéma iontového zdroje ES
Schéma iontového zdroje APCI
Analyzátory • • • •
Magnetický hmotnostní analyzátor Kvadrupólový analyzátor Iontová past (ion-trap) Průletový analyzátor (time of flight, TOF)
Interface • Rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem (moving belt interface) • sprejové ionizace – většina těkavých látek odvedena mimo MS – bez interface • mikroHPLC - přímý vstup
MS/MS-LC • systém se třemi kvadrupóly: První pro výběr mateřského iontu, do druhého se přivádí pod tlakem inertní plyn a slouží jako kolizní cela pro řízenou fragmentaci mateřského iontu, skenováním třetího kvadrupólu se rozdělí vzniklé dceřiné ionty
Rozhraní (interface) s pohybující se kovovou smyčkou
Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr s dvojicí kvadrupólů a průletovým hmotnostním analyzátorem
Požadavky na HPLC-MS systém • Kolona – malý průměr, malé průtokové rychlosti přímý převod do MS (bez interface)
• Mobilní fáze těkavá, omezit obsah solí, protože snižují výtěžek ionizace a zanášejí iontový zdroj • Vhodnější methanol než acetonitril, vyšší výtěžek ionizace
4. Úprava vzorku – přečištění, zakoncentrování Kapalné vzorky (moč, serum, sliny): • extrakce kapalinou (LLE) • extrakce tuhou fází (SPE) – nejběžnější materiály: chemicky vázané fáze, ionexy, SEC fáze, vtištěné polymery, atd. • mikroextrakce na vláknech nebo v kapiláře (SPME) Tuhé vzorky (tkáně, vlasy): • Soxhlet • zrychlená extrakce rozpouštědly (ASE) • extrakce ultrazvukem • extrakce nadkritickými tekutinami (SFE)
SPME Solid phase microextraction
a-SPME extrakce, b-desorpce v GC, c-desorpce v HPLC
Přímé spojení SPME v kapiláře s HPLC a) extrakce
b) Desorpce
Příprava vtištěných polymerů
5. Analýza drog a jejich metabolitů Analýza tělních tekutin • • • • • •
Analýza krve - deproteinizace extrakce rozpouštědly (LLE) extrakce tuhou fází (SPE, SPME) přečištění extraktu na měničích iontů zakoncentrování odpařením vlastní analýza HPLC-ESI (API)-MS
Analýza vlasů • Odběr vzorku – velká variabilita (místo odběru, stáří, pohlaví) - 10 – 250 mg vzorku • dekontaminace vlasů (kosmetické přípravky, prach a pod.) • extrakce, přečištění extraktu, zakoncentrování • vlastní analýza
(A) Chromatogram extraktu z krve oběti předávkované amobarbitalem (B) hmotnostní spektrum této látky
Rychlá HPLC-ESI-MS identifikace a kvantifikace významných nox Podmínky analýzy • Gradientová eluce metanolem s 0,1% HCOOH • Monolitická kolona Chromolith • Detekce ESI-MS • Doba analýzy 5 min. včetně stabilizace • Všech 14 látek (neutrální, bazické, kyselé) jsou účinně ionizovány pozitivní ESI • Detekční limity 10,0 až 50,0 ng/ml (K. Pihlainen et al., J. Chromatogr. A, 994 (2003) 93–102)
(I)
amfetamin, (II) 3,4-MDMA, (III) buprenorfin, (IV) clenbuterol, (V) salbutamol, (VI) LSD, (VII) metandienon, (VIII) nandrolon, (IX) stanozolol, (X) testosteron, (XI) morfin, (XII) fenobarbital, (XIII) psilocybin, (XIV) temazepam
MS–MS spektra amfetaminu a 3,4-MDMA
A p-OH-AP, B p-OH-MA, C norefedrin D, efedrin, E AP; F 3,4methylendioxyamfetamin (MDA), G 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA), H MA, I methoxyfenamin, J DMA. K dibenzylamin (I.S.)
Rekonstruovaný iontový chromatogram (1) psilocybin (2) morfin (3) salbutamol (4) amfetamin (5) 3,4-MDMA (6) clenbuterol (7) LSD (8) fenobarbital (9) buprenorfin (10) temazepam (11) nandrolon, (12) metandienon (13) testosteron (14) stanozolol
Analýza amfetaminů Mikroextrakce monolitickou kapilárou on-line s HPLC (UV detekce) pro analýzu amfetaminu, methamfetaminu a jejich methylendioxy- derivátů v moči
D.L. 1.4–4.0 ng/mL. Vysoká reprodukovatelnost (RSD < 2.9%) v rozsahu 0.05–5 g/mL, doba analýzy 25 min. (Yi F. et al., J.Chromatogr.A, 1074 (2005) 9–16.)
Amfetamin (PA), methamfetamin (MPA), 3,4-methylendioxoamfetamin (MDA), 3,4-methylendioxomethamfetamin (MDMA)
Analýza vzorku s PA,MDA,MPA, MDMA (1 g/mL) s SPME (a) a přímý nástřik (b)
Analýza moči 3 osob podezřelých ze závislosti na amfetaminech
Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího DMA
4 – MA 5 – AP 6 – DMA-N-oxid 7 –DMA
Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího selegilin
1 - SG-N-oxid 2 – desmethylselegilin 3 – ethylamfetamin 4 – MA 5 - AP
Struktura Fen, Norf a N-Fen N-Fen v čínských přípravcích k hubnutí – Fen a Norfmetabolity, škodlivé účinky, zakázané
A – extrakt vlasů, B – extrakt vlasů se 100 pg/mg norfenfluraminu a 230 pg/mg fenfluraminu, C - extrakt 1 vlasu pacienta (HPLC s fluorescenční detekcí po derivatizaci)
Stanovení meprobamatu ve vlasech Předběžná úprava: 1 M HCl přes noc při 60 oC Extrakce: LL s fosfátovým pufrem (pH 5,5) a chloroformem Analytická metoda: HPLC-MS nebo GC-MS pro derivatizaci s trimethylfenylamonium hydroxide Měřené koncentrace 3,32 and 4,21 ng/mg (2 osoby) DL 0,2 ng/mg [28] Dávka: 400 mg 4,27–6,08 ng/mg. 800 mg 8,54–13,01 ng/mg 1200 mg 11,89–17,64 ng/mg
Sulfonylmočovinové antidiabetikum glibenclamid
Extrahovaný iontový chromatogram m/z 221, celkový iontový chromatogram a hmotnostní spektrum ethylglukuronidu (metabolit ethanolu)
Tetrodoxin - toxin z ryby ježíka
Stanovení halucinogeních aminů • Psilocybin (4-fosforyloxy-N-dimethyltryptamin) • Psilocin (4-hydroxy-N,N-dimethyltryptamin) • HPLC s elektrochemickou detekcí, + 1,0 V (Ag/AgCl), mobilní fáze 0,1 M fosfátový pufr, pH 3,8 + 10 v/v ethanolu Obsah v houbě Psilocybe bohemica Šebek Psilocybin 0,57 % Psilocin 0,061 %
HPLC analýza extraktu houby Psilocybe bohemica Šebek s UV a elektrochemickou detekcí (R.Kysilka a spol., J.Chromatogr. 320, 414 (1985))
Antiepileptika – HPLC-MS (API-ES positive) kafein, fenylethylmalonamid,ethosuximid, primidon, fenobarbital, methylfenylsukcimid, karbamazepinepoxid, fenoytoin,karbamazepin)
HPLC-UV analýza Ginko biloby (SPE –C18, gradientová eluce methanol-H3PO4 -voda
HPLC-DAD analýza extraktu rostliny Ephedra Sinica Stamp (extrakce etherem, gradientová eluce acetonitril, H3PO4,voda)
Chirální separace • Důležité ve farmaceutickém průmyslu, ale i při stanvoení metabolitů • Derivatizace s chirálním činidlem v kombinaci s nechirální stacionární fází • Chirální stacionární fáze – chemicky vázaný cyklodextrin, ergotalkaloidy, albumin atd.
Extase (ADAM, E, XTC) • MDMA – 3,4-methylendioxymethamfetamin • 1912 – vyvinuto firmou Merck jako anoretikum, neuvedeno na trh • euforické a stimulující účinky • enantimery, S+ forma je potentnější než R- forma • chirální separace s chemicky vázanou fází (cyklodextrin)
Extrahovaný chromatogram (A) moči a MS spektra L-AP (B) a L-MA (C) 1, D-AP; 2, L-AP; 3, D-MA, 4 L-MA
Závěry • HPLC-MS stává rutinní metodou v analytické toxikologie • Umožňuje identifikaci a stanovení drog a jejich metabolitů ve stopových koncentrací ve složité matrici • Miniaturizace usnadňuje spojení HLPC-MS • Nové stacionární fáze: zrychlení analýzy, vyšší selektivita
• Doporučená literatura • V. Pacáková, K. Štulík, Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SNTL, Praha 1986. • K.Štulík a kol., Analytické separační metody, Karolinum, Praha 2004
